CN1906184A - 麦考酚酸吗乙酯杂质 - Google Patents

Abstract

提供了麦考酚酸吗乙酯的杂质，它的制备方法和作为参考的用途。

Description

麦考酚酸吗乙酯杂质 相关申请的相互参考

本申请要求以下美国临时专利申请的权益：2004年4月27日提交的第60/566,056号、2004年5月20日提交的第60/572,985号、2004年7月19日提交的第60/589,400号、2004年12月23日提交的第60/638,478号、2004年12月22日提交的第60/639,151号、2005年1月10日提交的第60/642,867号、2005年3月15日提交的第60/661,485号，它们的全部内容通过引用整体结合到本文中。

                    发明领域

本发明涉及(E)-6-(1，3-二氢-4-[2-(4-吗啉基)乙氧基]-6-甲氧基-7-甲基-3-氧代-异苯并呋喃-5-基)-4-甲基-己-4-烯酸2-(4-吗啉基)乙酯(化合物1)，一种麦考酚酸吗乙酯的杂质、它的制备和分离方法以及作为参考标记的用途。本发明还涉及具有少量化合物1的麦考酚酸吗乙酯，以及鉴定其的HPLC方法。

                    发明背景

麦考酚酸，化学名6-[4-羟基-6-甲氧基-7-甲基-3-氧代-5-phthalanyl]-4-甲基-己-4-烯酸，6-[1，3-二氢-4-羟基-6-甲氧基-7-甲基-3-氧代-异苯并呋喃-5-基]-4-甲基-己-4-烯酸，分子式C₁₇H₂₀O₆，分子量320.35，CAS登记号24280-93-1，结构为：

麦考酚酸(MPA)由Gosio于1893年分离，是第一种良好鉴定的抗生素(Bentley 2001)。它由若干种青霉菌所产生，包括短密青霉(P.brevi-compactum)、P.scabrum、P.nagemi、娄地青霉(P.roqueforti)、P.patris-mei和纯绿色青霉(P.viridicatum)(Clutterbuck et al.1932，Jens和Filtenborg 1983)。

MPA除了抗菌活性(Abraham 1945)，也具有抗真菌(Gilliver1946)、抗病毒(Ando et al.1968)和抗肿瘤性质(Noto et al.1969)，在临床上已被用于治疗牛皮癣(Johnson 1972)。最近，认识到其是一种强效的免疫抑制剂(Bentley 2000)。

MPA药理性质的至少一个原因是，在若干生物系统中它在单磷酸次黄嘌呤核苷脱氢酶(IMPD)水平上干扰鸟嘌呤的生物合成。因此，MPA对核酸合成具有显著的抑制效应(Franklin和Cook 1969)。IMPD的抑制作用也是MPA的淋巴细胞特异性免疫抑制效应的基础。因为淋巴细胞主要依赖于鸟嘌呤的从头生物合成，这种途径的减少导致抑制T和B淋巴细胞增殖。

MPA被撤出是因为它副作用的高发生率(原发感染如带状疱疹和胃肠副作用如胃部不适)。2-吗啉代乙酯衍生物麦考酚酸吗乙酯(CellCept^_)没有这些缺点，并比麦考酚酸具有更好的生物利用度。麦考酚酸吗乙酯最近被批准(1995年在美国，1996年在欧洲)用于预防接受同种肾脏移植患者的器官排斥(Shaw和Nowak 1995，Sollinger1995)。经口服给药后，酯形式快速水解为游离酸。然后MPA主要转化为非活性的葡萄糖醛酸代谢产物，其通过尿排泄被清除(Bentley2001，Wiwattanawongsa et al.2001)。

化学上，麦考酚酸吗乙酯(简写为MMF)为(E)-6-(1，3-二氢-4-羟基-6-甲氧基-7-甲基-3-氧代-异苯并呋喃-5-基)-4-甲基-己-4-烯酸2-(4-吗啉基)乙酯，它的首次合成公开于美国专利第4,753,935号。

                麦考酚酸吗乙酯

另一个专利美国专利第5,543,408号公开了麦考酚酸吗乙酯的无水结晶盐形式、一水合盐形式和无定形盐形式。这些形式为它们的熔点和/或差示扫描热计(DSC)结果和/或粉末X射线衍射图所鉴定。

反应的产物混合物很少是纯度足以适应药物标准的单一化合物。在大多数情况下，存在反应的副产品或副产物和用于反应的其它反应物。在将包含在产物混合物中的麦考酚酸吗乙酯加工成活性药物成分(″API″)期间的某个阶段，必须分析麦考酚酸吗乙酯的纯度，典型的通过HPLC或GC分析，以确定它是否适用于继续加工或最终用于药物产品。麦考酚酸吗乙酯不需要绝对纯。绝对纯是理论上的想法，是不可达到的。而且，具有纯度标准以保证API在临床应用时不由于存在杂质而造成较低的安全性。

美国食品和药品监督管理局药品评价和研究中心(CDER)公布了指导方针，其推荐药物申请者鉴定的有机杂质在活性成分中为0.1％或更少。″Guideline on Impurities in New Drug Substances，″61 Fed.Reg.371(1996)；″Guidance for Industry ANDAs：Impurities in DrugSubstances，″64 Fed.Reg.67917(1999)。除非已测试了杂质的安全性，证明组合物中的杂质在临床试验中是安全的，或人体代谢产物是安全的，CDER还推荐药物申请者将活性成分中的杂质量降低到0.1％以下。因此，为了研究这种杂质的药理和毒理，需要分离药物中的杂质。

为了获得新药的市场认可，制造商必须递交规定的权威证据，证明产品给予人体是可接受的。这种递交必须包括，除了别的之外，显示产物的杂质状况的分析数据，以证明杂质不存在或以可忽略量存在。因此，需要检测杂质的分析方法，鉴定和测定这些杂质的参照标准。

通常，通过分光光谱和其它的物理方法鉴定杂质(副产物、副产品和其它反应物)，然后将杂质与色谱图中的峰位(或TLC板上的斑点)关联。(Strobel p.953)(Strobel，H.A.；Heineman，W.R.，ChemicalInstrumentation：A Systematic Approach，3^rd dd.(Wiley & Sons：NewYork 1989))。此后，通过在色谱图中的位置鉴定杂质，其通常以样品注入柱到具体组分洗脱液通过检测器之间的分钟数进行测量，称为“保留时间”。这个时间期限基于设备条件和许多其它因素而经常变化。为了减轻这种变化对精确鉴定杂质产生的影响，从业者使用“相对保留时间”(“RRT”)来鉴定杂质。(Strobel p.922)。杂质的RRT是杂质的保留时间除以某些参考标记的保留时间。理论上，麦考酚酸吗乙酯本身就可以作为参考标记，但作为实践，其在混合物中占有压倒性的比例，趋向于饱和柱，这就导致不能再现保留时间，即对应麦考酚酸吗乙酯的最大峰容易发生漂移(Strobel Fig.24.8(b)p.879，包含当柱过载时观察到的这类不对称峰的插图)。因此，有时希望选择替代性化合物，其以足以被检测到的量加到或存在于混合物中以，并充分低而不饱和柱，使用这种化合物作为参考标记。

药物制造业中的研究者和开发者明白，相对纯状态的化合物可用作“参考标准”以在未知的混合物中对该化合物定量(“参考标记”类似于参照标准，但前者用于定性分析)。当该化合物被用作“外标”时，通过与未知混合物相同的技术分析已知浓度的化合物溶液。(Strobel p.924，Snyder p.549)(Snyder，L.R.；Kirkland，JJ.Introductionto Modern Liquid Chromatography，2nd ed.(John Wiley & Sons：NewYork 1979))。通过比较检测器响应的大小可测定混合物中的化合物量。也参见美国专利第6,333,198号，其通过引用结合到本文中。

假如已预先测定了补偿检测器对两种化合物的敏感性差异的“响应因子”，参照标准化合物也可用于定量混合物中的另外化合物。(Strobel p.894)。对于此目的，可直接向混合物中添加参照标准化合物，在此情况中它被称为“内标”(Strobel p.925，Snyder p.552)。

当未知混合物含有一些参照标准化合物时，通过使用称为“标准添加”的技术，参照标准化合物甚至可用作内标，其中通过添加已知和不同量的内标制备至少两种样品(Strobel pp.391-393，Snyder pp.571，572)。由于原本存在于混合物中的参照标准化合物，可通过将检测器响应相对于加入到各个样品中的参照标准化合物量的曲线外推至零，测定检测器响应的比例(如Strobel，Fig.11.4p.392)。

MPA的酯化是已知的。(如Synthetic Organic Chemistry by R.B.Wagner和H.D.Zook，Wiley，New York，1956，see pages 479-532中)。美国专利第4753935首次公开了麦考酚酸吗乙酯。然而，制备酯的合成方法导致各种杂质。

2003年10月15卷第四期的PHARMAEUROPA公布了麦考酚酸吗乙酯可能的杂质的列表(从A至H)。本发明涉及新的杂质，在麦考酚酸吗乙酯中发现了它的存在，而它不包括在此列表中。该杂质作为参照标准用于制备高纯度的麦考酚酸吗乙酯。

                    发明概述

一方面，本发明涉及麦考酚酸吗乙酯的4-氧-烷基化杂质(E)-6-(1，3-二氢-4-[2-(4-吗啉基)乙氧基]-6-甲氧基-7-甲基-3-氧代-异苯并呋喃-5-基)-4-甲基-己-4-烯酸2-(4-吗啉基)乙酯，命名为化合物1，具有下式化学结构：

                    化合物1

化合物1具有下列¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ(ppm)：1.73、2.10、2.21、2.32、2.39、2.49、2.74、3.38、3.60、3.64、3.69、4.08、4.26、5.05、5.09；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)6(ppm)：11.35、16.15、23.33、32.78、34.27、53.60、53.70、56.88、58.38、60.75、61.21、66.66、66.68、68.11、71.91、112.41、119.89、123.57、128.90、133.51、146.55、155.32、162.68、168.78、172.89；MS(Da)：[M+H]⁺ 547.29、[M+Na]⁺569.27、[M+K]⁺ 585.25、[2M+Na]⁺1115.61。

另一方面，本发明涉及通过麦考酚酸吗乙酯与N-乙基吗啉衍生物的反应合成化合物1的方法。

化合物1也可通过从含有化合物1的麦考酚酸吗乙酯样品中分离得到，通过：a)提供合适溶剂中的麦考酚酸吗乙酯溶液；b)使用酸性水溶液洗涤麦考酚酸吗乙酯溶液获得两相系统；c)将含有麦考酚酸吗乙酯的有机相与酸性水相分离；d)向酸性水相添加碱性水溶液；e)回收化合物1。

本发明也提供了测定麦考酚酸吗乙酯纯度的方法，包括将麦考酚酸吗乙酯的纯度与作为参照标准，特别是作为参考标记的化合物1进行比较。

另一方面，本发明提供的麦考酚酸吗乙酯经HPLC分析化合物1的％面积为约0.01至约0.1％。也提供了包含所述麦考酚酸吗乙酯的药物剂型，和治疗具有器官移植排斥风险病人的方法，该方法包括给予有需要的病人药物组合物。

再另一方面，本发明提供了分析和测定麦考酚酸吗乙酯的HPLC方法。

                    附图简述

图1为化合物1的代表性¹H NMR谱。

图2为化合物1的代表性¹³C NMR谱。

图3为化合物1的代表性¹³C NMR波谱数据。

图4为化合物1的代表性质谱数据。

图5为描述了合成化合物1的方法。

                    发明详述

本文使用的术语“参照标准”是指可用于有效药物成分定量和定性分析的化合物。例如，在HPLC中化合物的保留时间可允许设置相对保留时间，因此使得定性分析变得可能。在注入HPLC柱之前，溶液中化合物的浓度允许比较HPLC色谱图中的峰下面积，因此使得定量分析变得可能。

“参考标记”用于定性分析以基于它们的位置鉴定混合物的组分，例如，它们在色谱图或薄层色谱(TLC)板上的位置(Strobel pp.921，922，953)。对于此目的，假如混合物中存在该化合物时不需要向混合物中添加化合物。“参考标记”只用于定性分析，而“参照标准”可用于定量或定性分析，或两者皆可。因此，参考标记是参照标准的子集，包括在参照标准的定义中。

尽管本领域中关于参照标准的一些知识已在本点上描述为通用术语，本领域技术人员也明白，检测器响应可以是，例如，获得自以下的色谱图的峰高或积分峰面积：如HPLC系统洗脱液的UV或折光率检测，或如气相色谱的火焰离子化检测或导热率检测，或其它响应如荧光TLC板上斑点的UV吸收。参照标准的位置可用于计算麦考酚酸吗乙酯和其它杂质的相对保留时间。

本发明提供了麦考酚酸吗乙酯(MMF)的杂质，命名为化合物1。此杂质用作参照标准，更具体而言为参考标记。

化合物1或(E)-6-(1，3-二氢-4-[2-(4-吗啉基)乙氧基]-6-甲氧基-7-甲基-3-氧代-异苯并呋喃-5-基)-4-甲基-己-4-烯酸2-(4-吗啉基)乙酯，具有下面的化学结构：

                    化合物1

化合物1的¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ(ppm)：1.73、2.10、2.21、2.32、2.39、2.49、2.74、3.38、3.60、3.64、3.69、4.08、4.26、5.05、5.09；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ(ppm)：11.35、16.15、23.33、32.78、34.27、53.60、53.70、56.88、58.38、60.75、61.21、66.66、66.68、68.11、71.91、112.41、119.89、123.57、128.90、133.51、146.55、155.32、162.68、168.78、172.89；MS(Da)：[M+H]⁺ 547.29、[M+Na]⁺569.27、[M+K]⁺585.25、[2M+Na]⁺1115.61。

另一方面，本发明包括合成化合物1的方法。通过合成化合物和来自麦考酚酸吗乙酯制品的分离化合物的结构分析，确定了化合物1的结构。通过独立的化学合成制备的麦考酚酸吗乙酯杂质，不能区别于从含有麦考酚酸吗乙酯的反应混合物中分离到的杂质。通过显著增加反应结束后制备麦考酚酸吗乙酯的反应时间，有可能获得相对大量的这种杂质。

可通过麦考酚酸吗乙酯与N-乙基吗啉衍生物的反应合成化合物1。

该方法包括：a)碱存在下将质子惰性有机溶剂中的麦考酚酸吗乙酯与盐酸4-(2-氯乙基)-吗啉混合，以获得混合物；b)维持该混合物至少1天以产生化合物1；c)使用水不混溶的有机溶剂萃取化合物1；d)回收化合物1。

用于步骤a)中的质子惰性有机溶剂可以是二氯甲烷、四氢呋喃或二甲基甲酰胺，优选为二甲基甲酰胺。碱可以是有机碱(例如三乙胺、咪唑)或无机碱(例如氢化钠、碳酸钠或碳酸钾)，优选碳酸钾。步骤c)中的水不混溶有机溶剂可以是二氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸异丁酯或甲苯，优选甲苯。

可通过本领已知的任何方法回收化合物1，如洗涤和干燥有机萃取物，随后蒸发有机溶剂。

另一方面，本发明包括制备化合物1的方法，包括a)将N-(2-羟乙基)吗啉转化为N-(2-甲磺酰乙基)吗啉；b)将麦考酚酸吗乙酯与N-(2-甲磺酰乙基)吗啉混合，形成化合物1。

优选第一步反应步骤a)在有机碱和溶剂存在下进行，有机碱为C₃-C₉烷基胺如三乙胺，溶剂如甲苯、二氯乙烷，或优选二氯甲烷(DCM)。更优选的是，步骤a)在存在三乙胺(Et₃N)和DCM下进行。这个反应可通过添加甲磺酰氯、甲苯磺酰氯(TsCl)或三氟甲磺酸酐而进行。优选添加甲磺酰氯。可将反应混合物冷却到0℃，这时添加甲磺酰氯。优选将反应混合物搅拌过夜，然后使用水猝灭。

第一步反应的产物N-(2-甲磺酰乙基)吗啉可通过使用乙酸乙酯、甲苯或优选DCM萃取而得到分离。分离也可包括洗涤、干燥和/或浓缩N-(2-甲磺酰乙基)吗啉。例如，可使用盐水洗涤N-(2-甲磺酰乙基)吗啉，MgSO₄干燥，减压浓缩。

对于第二步反应步骤b)，可将麦考酚酸吗乙酯与合适的溶剂和碱混合，溶剂优选DMF，碱如氢化钠，例如矿物油中的60％氢化钠。优选在10分钟内向麦考酚酸吗乙酯分部加入氢化钠。可在室温下搅拌第二步反应混合物约25分钟，然后，可加入N-(2-甲磺酰乙基)吗啉，优选室温下搅拌约24小时。可将该反应混合物加热到约25℃至约70℃，优选约50℃。例如，可将该混合物在油浴中加热到50℃，维持约14小时。也可冷却该反应混合物。例如，可允许该混合物冷却至约室温。

第二反应步骤生产化合物1，其可通过使用C₃-C₇酯或酮如甲基乙基酮(MEK)或优选乙酸乙酯萃取而分离。萃取之前可使用水稀释。分离也可包括洗涤、干燥和/或浓缩化合物1。例如，化合物1可使用盐水洗涤、干燥和减压浓缩。

也可例如通过柱色谱纯化化合物1。例如，可通过硅胶柱色谱，使用DCM∶MeOH(95∶5)洗脱进行纯化。

一方面，本发明包括从制备麦考酚酸吗乙酯期间获得的反应混合物中分离化合物1的方法。该方法包括：a)提供合适溶剂中的麦考酚酸吗乙酯溶液；b)使用酸性水溶液洗涤麦考酚酸吗乙酯溶液，获得两相系统；c)将含有麦考酚酸吗乙酯的有机相与酸性水相分离；d)向酸性水相添加碱性水溶液；e)回收化合物1。

术语“合适溶剂”是指任何不与水混溶的有机溶剂或溶剂混合物，其中反应物质是可溶的。合适溶剂的实例包括，但不限于，乙酸烷基酯、氯化烃如二氯甲烷、氯仿等和芳族烃如甲苯。优选使用乙酸异丁酯。

用于洗涤的酸性水溶液中的酸可以是无机或有机酸。无机酸的实例包括，但不限于，盐酸、硫酸或磷酸的至少一种。合适有机酸的实例包括，但不限于，羧酸如乙酸、或取代羧酸如三氟乙酸、磺酸如甲磺酸、取代磺酸如三氟甲磺酸的至少一种。优选使用乙酸。优选的pH范围为约3至约6，更优选约4至约5。

用于洗涤的碱性水溶液中的碱可以是无机碱或有机碱。合适无机碱的实例包括，但不限于，碳酸盐、氢氧化物或碳酸氢盐的至少一种。合适的有机碱可以是例如三乙胺。优选使用碳酸氢钠。优选的pH范围为约8至约11。

依据本领域任何已知的方法，如共有的美国申请系列号11/[K&Kref.：2664/61005，2005年4月26日提交]中所描述的酯化方法，可从麦考酚酸制备麦考酚酸吗乙酯。这种方法包括：

存在催化剂下使下式的麦考酚酸与C₁-C₄醇或4-(2-羟乙基)吗啉反应

获得下式的麦考酚酸的酯

其中，R为C₁-C₄烷基或 基团。

另一方面，本发明涉及麦考酚酸吗乙酯，经HPLC分析化合物1的量为约0.01至约0.1％面积。这种麦考酚酸吗乙酯可依据上述方法通过麦考酚酸的酯化制备。

通过改变反应条件，可将反应混合物中的化合物1的量增加到多至10％(HPLC)，以便于化合物1的分离。对强迫反应(如更高温度和/或更长反应时间)中获得的反应混合物进行HPLC分析，产生的结果显示于表1中。

表1

起始物质	HEM(摩尔当量)	SnCl2·2H2O(mol％)	温度(℃)	反应时间(小时)	化合物1(HPLC a％)
						MPA	6	10	160	4	0.60
MPA	6	15	160	4	0.33
						MPA	6	15	140	12	0.15
MPA	6	3	170	4	2.37
						MPA	3	15	160	4	0.85
MPA	2	20	165	4	0.61
						MPA	3	15	180	4	4.16
MPA	3	3	160	4	0.70
						MPA	4	--	160	6	0.17
MPA	6.8	---	160	107	6.8
						MMF	3.8	---	160	114	9.3
MPA-Me*	6.8	---	160	107	5.9

^*MPA-Me：麦考酚酸甲酯

使用其它催化剂的实验结果概述于表2。

表2

起始物质	HEM(摩尔当量)	催化剂(mol％)	温度(℃)	反应时间(小时)	化合物1(HPLC a％)
						MPA	4	CAS(3)	150	8	0.24
MPA	6	PTSA(3)	190	6	0.63
						MPA	4	PTSA(20)	165	4	0.78
MPA	6	FeCl3(3)	190	6	5.7
						MPA	6	CaCl2(1)	160	6	1.20
MPA	4	K2S2O5(10)	160	5	0.42
						MPA	6	ZnSO4·7H2O(3)	165	4	0.27
MPA	4	KAl(SO4)·12H2O(3)	165	8	1.50
						MPA	6	HCOOH(400)	165	4	1.10
MPA	6	MgSO4(3)	165	4	0.24
						MPA	4	KH2PO4(3)	165	3	030

通过将样品进行色谱获得数据，并将数据与化合物1的色谱数据比较，化合物1可用于分析麦考酚酸吗乙酯样品的方法。使用的该杂质可以具有或不具有麦考酚酸吗乙酯，即可同时(作为同一溶液/色谱图的部分)或各自产生杂质和麦考酚酸吗乙酯的数据。本领域技术人员可制备含有化合物1的麦考酚酸吗乙酯溶液，将该溶液进行高压液相色谱以获得色谱图，对比色谱图中获得的峰与化合物1引起的峰。此外，本领域技术人员可制备含有化合物1的麦考酚酸吗乙酯溶液，将该溶液进行薄层色谱以获得色谱图，对比色谱图中获得的条带或斑点与降解产物引起的峰或条带。在生产和制造期间的不同阶段，杂质也可用于选择具有高纯度的所需批次。

本发明也提供了梯度洗脱的HPLC方法，用于通过面积百分比定量存在于麦考酚酸吗乙酯样品中的所有杂质的量。测定麦考酚酸吗乙酯纯度的方法包括：(a)制备乙腈中的麦考酚酸吗乙酯样品溶液；(b)将样品溶液注入HPLC柱，优选C8柱；(c)使用溶剂洗脱样品，优选乙腈和水的混合物；(d)加入碱，如三乙胺，调节pH至约6；(e)使用检测器测量各杂质的量(附加合适的记录装置)。

测定麦考酚酸吗乙酯样品中杂质量的方法优选包括以下步骤：(a)制备乙腈中的麦考酚酸吗乙酯样品的样品溶液；(b)将样品溶液(约10μL)注入约250.0mm×4.6mm、5μm的C8 HPLC柱；(c)使用乙腈(约350mL)和水(约650mL)的混合物梯度洗脱样品；(d)加入约2.0mL三乙胺，使用稀磷酸调节pH至约6(优选5.9)(A洗脱液)，B洗脱液的缓冲液∶乙腈比例约为15∶85；(e)使用UV检测器在250nm波长处测量各杂质的量(具有合适的记录装置)。

可通过将约1L水与约3.0mL三乙胺混合，并使用稀磷酸调节pH至5.9，制备缓冲液。

测定麦考酚酸吗乙酯纯度的HPLC状况例举于表3中。

表3：HPLC梯度

流速(mL/min)	时间(min)	A洗脱液(V/V％)	B洗脱液(V/V％)
				1.5	0	100	0
1.5	15	100	0
				1.5	377	28	72
1.5	37.1	100	0
				1.5	40	100	0

在上述方法中，麦考酚酸吗乙酯的保留时间约为20.8分钟。

另一方面，本发明包括测定麦考酚酸吗乙酯纯度的方法，所述方法包括使用化合物1作为参考标记。

可将药物组合物制成药品以进行口服、胃肠外、直肠、透皮、口颊或经鼻给药。用于口服给药的合适剂型包括片剂、压制的或包衣的丸剂、锭剂、囊剂、硬胶囊或明胶胶囊、舌下片剂、糖浆剂和悬浮剂。胃肠外给药的合适剂型包括水或非水溶液或乳剂，而用于直肠给药的合适剂型包括具有亲水或疏水载体的栓剂。对于局部给药，本发明提供了本领域已知的合适透皮递药系统，对于经鼻递药提供了本领域已知的合适气溶胶递药系统。

本发明的药物组合物含有包含化合物1的麦考酚酸吗乙酯，化合物1经HPLC分析量为约0.01％至约0.1％面积。除了活性成分，本发明的药物组合物可含有一种或多种赋形剂或辅料。制剂科学家依据经验、考虑标准程序和参照本领域的著作，可轻易地决定赋形剂的选择和量。

稀释剂增加了固体药物组合物的体积，可使得含有组合物的药物剂型较易被患者和护理人员处理。用于固体组合物的稀释剂包括，例如，微晶纤维素(例如Avicel_)、超细纤维素、乳糖、淀粉、预胶化淀粉、碳酸钙、硫酸钙、蔗糖、葡萄糖结合剂、糊精、右旋糖、二水合磷酸氢钙、磷酸钙、高岭土、碳酸镁、氧化镁、麦芽糊精、甘露醇、聚甲基丙烯酸酯(例如Eudragit_)、氯化钾、粉状纤维素、氯化钠、山梨醇和滑石粉。

被压成如片剂的剂型的固体药物组合物，可包含赋形剂，其功能包括有助于使活性成分与其它赋形剂经压缩后结合在一起。用于固体药物组合物的粘合剂包括阿拉伯胶、海藻酸、卡波姆(例如聚羧乙烯)、羧甲基纤维素钠、糊精、乙基纤维素、明胶、瓜尔胶、氢化植物油、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素(例如Klucel_)、羟丙基甲基纤维素(例如Methocel_)、液状葡萄糖、硅酸镁铝、麦芽糊精、甲基纤维素、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮(例如Kollidon_，Plasdone_)、预胶化淀粉、海藻酸钠和淀粉。

压制的固体药物组合物在患者胃内的溶出率可通过向组合物添加崩解剂而增加。崩解剂包括海藻酸、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠(例如Ac-Di-Sol_，Primellose_)、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮(例如Kollidon_，Polyplasdone_)、瓜尔胶、硅酸镁铝、甲基纤维素、微晶纤维素、波拉克林钾、粉状纤维素、预胶化淀粉、海藻酸钠、淀粉羟乙酸钠(例如Explotab_)和淀粉。

可添加助流剂以改善非压制固体组合物的流动性和改善剂量的精确度。可作为助流剂使用的赋形剂包括胶体二氧化硅、三硅酸镁、粉状纤维素、淀粉、滑石粉和磷酸钙。

当剂型如片剂是由粉末状组合物压制而制成时，组合物受到来自冲头和模的压力。一些赋形剂和活性成分趋向于黏附在冲头和模的表面，这可导致产品具有凹陷和其它的表面不规则。可向组合物添加润滑剂以降低黏附，并易于从模中释放产物。润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、单硬脂酸甘油酯、硬脂酰棕榈酸甘油酯、氢化蓖麻油、氢化植物油、矿物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、月桂基硫酸钠、硬脂酰富马酸钠、硬脂酸、滑石粉和硬脂酸锌。

调味剂和香味增强剂使得剂型对患者更加适口。可包含在本发明组合物中的药品常用调味剂和香味增强剂包括麦芽酚、香草醛、乙基香草醛、薄荷醇、柠檬酸、富马酸、乙基麦芽酚和酒石酸。

也可使用任何药物可接受着色剂对固体或液体组合物染色以改善它们的外观，和/或便于患者鉴别产品和单位剂量水平。

在本发明的液体药物组合物中，将活性成分和任何其它固体赋形剂悬浮于液体载体中，如水、植物油、醇、聚乙二醇、丙二醇或甘油。

液体药物组合物可含有乳化剂，以在组合物中均匀分散不溶于液体载体的活性成分或其它赋形剂。可用于本发明液体组合物的乳化剂包括，例如，明胶、蛋黄、酪蛋白、胆固醇、阿拉伯胶、黄蓍树胶、爱兰苔胶、果胶、甲基纤维素、卡波姆、十八醇十六醇混合物和十六醇。

本发明的液体药物组合物也可含有粘度增强剂，以改善产品的口感和/或涂布胃肠道的内壁。这些试剂包括阿拉伯胶、海藻酸膨润土、卡波姆、羧甲基纤维素钙或钠、十八醇十六醇混合物、甲基纤维素、乙基纤维素、明胶、瓜尔胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、碳酸丙烯、海藻酸丙二醇酯、海藻酸钠、淀粉羟乙酸钠、淀粉、黄蓍树胶和黄原胶。

可添加甜味剂如山梨醇、糖精、糖精钠、蔗糖、阿司帕坦、果糖、甘露醇和转化糖以改善味觉。

可在安全摄入水平上添加防腐剂和螯合剂，如醇、苯甲酸钠、丁羟甲苯、丁羟茴香醚和乙二胺四乙酸，以改善储存稳定性。

依据本发明，液体组合物也可含有缓冲剂如葡萄糖酸、乳酸、柠檬酸或乙酸、葡萄糖酸钠、乳酸钠、柠檬酸钠或乙酸钠。

本发明的固体组合物包括粉末、颗粒、凝聚物和压制组合物。剂量包括适用于口服、口颊、直肠、胃肠外(包括皮下、肌内和静脉)、吸入和眼科用药的剂量。尽管在任何特定情况下最合适的给药将依赖于待处理疾病的性质和严重性，本发明最优选的途径为口服。剂量可方便地以单位剂型呈现，并通过药学领域熟知的任何方法进行制备。

剂型包括固体剂型如片剂、散剂、胶囊剂、栓剂、囊剂、含片和锭剂，以及液体糖浆剂、悬浮剂和酏剂。

本发明的剂型可以是在硬壳或软壳内含有组合物的胶囊剂，优选含有本发明的粉末状或颗粒状固体组合物。胶囊壳可由明胶制得，任选含有增塑剂如甘油和山梨醇，以及遮光剂或着色剂。

依据本领域已知的方法可将活性成分和赋形剂制成组合物和剂型。

可通过湿法制粒制备用于片剂或胶囊填料的组合物。在湿法制粒中，一些或所有活性成分和赋形剂以粉末形式混合，然后存在液体时进一步混合，导致粉末凝聚成颗粒，液体典型为水。过筛和/或粉碎颗粒，干燥，然后过筛和/或粉碎得到希望的粒度。然后可将颗粒制成片，或在制片之前添加其它赋形剂，如助流剂和/或润滑剂。

可通过常规的干法混合制备压片组合物。例如，可将活性成分和赋形剂的混合组合物压成压缩块或片，然后粉碎成紧实的颗粒。随后可将紧实的颗粒压成片剂。

作为干法制粒的替代，可使用直接压片技术将混合的组合物直接压成压制剂型。直接压片法产生了更均匀的片剂而不需要颗粒。非常适合于直接压片的赋形剂包括微晶纤维素、喷雾干燥的乳糖、二水合磷酸氢钙和胶体二氧化硅。直接压片中的这些和其它赋形剂的适合用法，为本领域具有直接压片具体制剂方面的经验和技能的技术人员所已知。

本发明的胶囊填料可包含任何以上关于压片所描述的掺合物和颗粒，但它们并不经历最终的压片步骤。

                    实施例

实施例1：N-(2-甲磺酰乙基)吗啉的制备

将5.2g N-(2-羟乙基)吗啉、25ml DCM和5.5ml三乙胺装入带有磁力棒并在顶部装有CaCl₂管的150ml单颈圆底烧瓶中。搅拌混合物，在冰-水浴中冷却，同时在5分钟内加入3.1ml甲磺酰氯。将反应混合物搅拌过夜，然后在20ml水中猝灭。使用两份25ml DCM萃取水相，合并有机萃取物，使用20ml盐水洗涤，MgSO₄干燥，减压浓缩，得到4.1g粗甲磺酸酯，其通过TLC纯化。

实施例2：化合物1的制备

将6.21g麦考酚酸吗乙酯(14.3mmol)和20ml无水DMF装入带有磁力搅拌器和氮气入口管的150ml双颈圆底烧瓶中。10分钟内向搅拌的溶液中分步加入570mg氢化钠(矿物油中60％)，室温下将所得混合物搅拌25分钟。向该反应混合物添加甲磺酰衍生物，2.92g(14mmol)在4ml DMF中。在50℃的油浴中加热反应混合物14小时，然后允许冷却到室温，使用50ml水稀释，使用三份20ml乙酸乙酯萃取。使用盐水(20ml)洗涤合并的有机萃取物，干燥，减压浓缩，得到7g(89％)浅黄色的粘性液体，为纯产物(经TLC分析)。通过在硅胶上柱色谱，使用DCM/MeOH(95∶5)洗脱，可进行进一步纯化

实施例3：化合物1的制备

合并从生产粗MMF获得的酸性洗涤液(5L)，使用固体碳酸氢钠中和。加入乙酸异丁酯(1L)和活性炭(10g)，过滤，分离各相。将有机相蒸发至300ml。加入水(300ml)，使用乙酸调节pH至4-4.5。分离各相后，使用固体碳酸氢钠中和水相，并使用乙酸异丁酯(200ml)萃取。在硫酸钠上干燥有机相，蒸发至干。残留物(0.81g呈褐色的油)的纯度为77a％的化合物1。

将该残留物在硅胶柱上进行色谱(洗脱液：丙酮)，产生糖浆状的产物化合物1(560mg，纯度：95a％)。

实施例4：化合物1的制备

在DMF(40ml)中搅拌MMF(26.04g，60mmol)。加入碳酸钾(33.17g，4当量)和盐酸4-(2-氯乙基)吗啉(14.53g，1.3当量)。将混合物在室温下搅拌3天，用水(400ml)稀释，用甲苯(2×300ml)萃取。使用水(2×300ml)洗涤合并的有机相，硫酸钠上干燥，蒸发至干。残留物为化合物1的浅黄色油(32.5g，纯度：95a％)。

实施例5：纯麦考酚酸吗乙酯的制备

在氮气中二水合氯化锡(II)(20.4g，0.15摩尔当量)存在下，将麦考酚酸(192g，0.6mol)和4-(2-羟乙基)-吗啉(440ml，6摩尔当量)的混合物在150-155℃下搅拌4小时。待完成反应后，允许反应混合物冷却到室温。将获得深色液体倾倒入乙酸异丁酯(4.0L)。使用2％碳酸氢钠水溶液(1.2L，然后2×0.4L)萃取该溶液。第一次添加碳酸氢钠溶液后，使用活性炭(40g)处理形成的两相系统，过滤(滤出乳液)。使用水(1L)萃取溶液。分离相之后，使用水(1L)洗涤有机相，在40-50℃下真空蒸发至干。向固体物质中加入丙酮(400ml)和异丙醇(3.8L)，加热混合物至40-45℃(溶解该物质)。在6小时期间将溶液冷却到-5℃，在此温度下搅拌10-12小时。过滤后，使用2∶19的丙酮/异丙醇混合物(420ml)洗涤晶体。在60℃下真空中干燥粗品化合物。产量为169-195g(65-75％)。HPLC杂质谱：MPA＝0.1％，测定：99.85％。

参照具体的优选实施方案描述了本发明，用实施例进行了说明，本领域的技术人员可以理解，所描述和说明的本发明的变化不背离本说明书中公开的本发明精神和范围。提出实施例是为了帮助理解本发明，而不为了也不应当被解释为以任何方式限制了它的范围。实施例不包括常规方法的详述。所有本文提及的参考文献通过引用整体结合到本文中。

Claims (34)

1.一种具有下式的化合物：

                         化合物1。

2.权利要求1的化合物，所述化合物特征为¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ(ppm)：1.73、2.10、2.21、2.32、2.39、2.49、2.74、3.38、3.60、3.64、3.69、4.08、4.26、5.05和5.09。

3.权利要求1的化合物，所述化合物特征为¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ(ppm)：11.35、16.15、23.33、32.78、34.27、53.60、53.70、56.88、58.38、60.75、61.21、66.66、66.68、68.11、71.91、112.41、119.89、123.57、128.90、133.51、146.55、155.32、162.68、168.78和172.89。

4.权利要求1的化合物，所述化合物特征为MS(Da)：[M+H]⁺547.29、[M+Na]⁺569.27、[M+K]⁺ 585.25、[2M+Na]⁺1115.61。

5.权利要求1的化合物，其中所述化合物是分离的。

6.一种制备权利要求1的化合物的方法，所述方法包括：

a)碱存在下将质子惰性有机溶剂中的麦考酚酸吗乙酯与N-乙基吗啉衍生物混合，以获得混合物；

b)维持该混合物至少约24小时以产生化合物1；

c)使用水不混溶的有机溶剂萃取化合物1；

d)回收化合物1。

7.权利要求6的方法，其中所述N-乙基吗啉衍生物为盐酸4-(2-氯乙基)-吗啉。

8.权利要求6的方法，其中步骤a)中的质子惰性有机溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃或二甲基甲酰胺。

9.权利要求8的方法，其中步骤a)中的质子惰性有机溶剂为二甲基甲酰胺。

10.权利要求6的方法，其中步骤b)中的碱为有机碱或无机碱。

11.权利要求10的方法，其中所述碱为碳酸钾。

12.权利要求6的方法，其中步骤c)中的水不混溶有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸异丁酯或甲苯。

13.权利要求12的方法，其中步骤c)中的水不混溶有机溶剂为甲苯。

14.权利要求6的方法，其中所述吗啉试剂为N-(2-甲磺酰乙基)吗啉。

15、权利要求14的方法，其中步骤b)中的碱为氢化钠。

16.权利要求14的方法，所述方法还包括加热步骤a)中获得的混合物至约25℃至约70℃的温度，随后将混合物冷却至室温。

17.权利要求16的方法，其中将所述混合物加热到约50℃的温度。

18.权利要求14的方法，其中步骤c)中的水不混溶有机溶剂为C₃-C₇酯或酮。

19.权利要求18的方法，其中所述水不混溶的有机溶剂为乙酸乙酯。

20.权利要求14的方法，其中通过下述方法获得N-(2-甲磺酰乙基)吗啉，所述方法包括：

a)在约0℃下，在溶剂中将N-(2-羟乙基)吗啉和有机碱与甲磺酰氯、甲苯磺酰氯(TsCl)或三氟甲磺酸酐反应；

b)使用乙酸乙酯、甲苯或二氯甲烷萃取步骤a)中获得的产物。

21.一种从包含麦考酚酸吗乙酯和化合物1的混合物中分离权利要求1的化合物1的方法，所述方法包括：

a)提供在溶剂中包含麦考酚酸吗乙酯和化合物1的溶液；

b)使用酸性水溶液洗涤该溶液，以获得两相系统；

c)将含有麦考酚酸吗乙酯的有机相与酸性水相分离；

d)将碱性水溶液添加到酸性水相中；

e)回收化合物1。

22.权利要求21的方法，其中步骤a)中的溶剂选自：乙酸烷基酯、氯代烃和芳族烃。

23.权利要求21的方法，其中所述溶剂为乙酸异丁酯。

24.权利要求21的方法，其中步骤b)中的酸性水溶液含有无机酸或有机酸。

25.权利要求24的方法，其中所述酸性水溶液含有盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸、甲磺酸和三氟甲磺酸的任何之一。

26.权利要求25的方法，其中所述酸性水溶液含有乙酸。

27.权利要求21的方法，步骤d)中的碱性水溶液含有无机或有机碱。

28.权利要求27的方法，其中所述碱性水溶液含有碳酸氢钠。

29.具有权利要求1的化合物1的麦考酚酸吗乙酯，所述化合物1的量经HPLC测定为约0.01至约0.1％面积。

30.一种定量麦考酚酸吗乙酯中权利要求1的化合物1量的HPLC方法，所述方法包括：

a)制备乙腈中的麦考酚酸吗乙酯样品的样品溶液；

b)将样品溶液注入约250.0mm×4.6mm、5μm C8 HPLC柱；

c)依据下表，使用添加了三乙胺并用稀磷酸调节pH至约6的乙腈和水的混合物(A洗脱液)，和缓冲液∶乙腈比率为约15∶85的B洗脱液，梯度洗脱样品；

                            HPLC梯度   流速[mL/min]   时间(min)   A洗脱液(V/V％)   B洗脱液(V/V％)   1.5   0   100   0   1.5   15   100   0   1.5   37   28   72   1.5   37.1   100   0   1.5   40   100   0

d)使用紫外检测器在250nm波长处测量各杂质的量。

32.一种分析麦考酚酸吗乙酯样品的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将样品进行色谱以获得数据；

b)将数据与以权利要求1的化合物的色谱数据进行比较。

33.权利要求32的方法，其中所述方法包括以下步骤：

a)制备含有权利要求1的化合物的麦考酚酸吗乙酯溶液；

b)使所述溶液进行高压液相色谱以获得色谱图；

c)将色谱图中获得的峰与权利要求1的化合物引起的峰进行比较。

34.权利要求32的方法，其中所述方法包括以下步骤：

a)制备含有权利要求1的化合物的麦考酚酸吗乙酯溶液；

b)使溶液进行薄层色谱以获得色谱图；

c)将色谱图中获得的条带或斑点与降解产物引起的峰或条带进行比较。

35.一种测定麦考酚酸吗乙酯的HPLC方法，所述方法包括以下步骤：

a)制备乙腈中的麦考酚酸吗乙酯的样品溶液；

b)将所述样品溶液注入HPLC柱；

c)使用乙腈和水的混合物洗脱样品；

d)添加三乙胺，并调节pH至约6；

e)使用检测器和合适的记录装置测量各杂质的量。

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