CN1906162A

CN1906162A - 用于治疗戈谢病的羟基哌啶衍生物

Info

Publication number: CN1906162A
Application number: CNA2004800402432A
Authority: CN
Inventors: 樊建强; X·朱; K·谢斯
Original assignee: Amicus Therapeutics Inc
Current assignee: Amicus Therapeutics Inc
Priority date: 2003-11-12
Filing date: 2004-11-12
Publication date: 2007-01-31
Anticipated expiration: 2024-11-12
Also published as: CA2545435C; IL175444A; EP1682504A4; US7741340B2; AU2004289328A1; BRPI0416216A; WO2005046611A2; AU2004289328B2; JP2007510753A; CN1906162B; CN1901907A; US20050130972A1; IL175444A0; EP1682134A2; ES2402182T3; EP1682504A2; BRPI0416217A8; WO2005046612A2; EP1682504B1; JP4767172B2

Abstract

本发明提供了新的羟基哌啶(HP)衍生物和其药学上可接受的盐，所述的羟基哌啶衍生物具有(i)在相当于吡喃糖环端基异构位的位置上的正电荷；(ii)发源于吡喃糖中环氧的相应位置的短的柔性连接基团；和(iii)与该连接基团连接的亲脂性部分。如果亲脂性部分相当于直链长度为6个或更多个碳的烃链，则连接基团可不存在。本发明进一步提供了通过给予新的HP衍生物作为与戈谢病有关的突变型葡糖脑苷脂酶的“活性位点特异性伴侣”而治疗患有该疾病的个体的方法。

Description

用于治疗戈谢病的羟基哌啶衍生物

本申请要求了2003年11月12日提交的临时申请60/519,496的优先权，将其引入本文作为参考。

技术领域

本发明提供了新的羟基哌啶(HP)衍生物和其药学上可接受的盐，所述的羟基哌啶衍生物具有(i)在相当于吡喃糖环端基异构位的位置上的正电荷；(ii)发源于吡喃糖中环氧的相应位置的短的柔性连接基团；和(iii)与该连接基团连接的亲脂性部分。或者，如果亲脂性部分相当于直链长度(linearlength)为6个或更多个碳的烃链，则连接基团可不存在。本发明进一步提供了通过给予新的HP衍生物作为与戈谢病有关的突变型葡糖脑苷脂酶的“活性位点特异性伴侣(chaperone)”而治疗患有该疾病的个体的方法。

背景技术

蛋白质折叠

蛋白质是在细胞质中合成的，新合成的蛋白质以大部分未折叠的状态被分泌到内质网(ER)腔内。一般而言，蛋白质折叠是由自我装配原理控制的。根据它们的氨基酸序列，新合成的多肽折叠成它们天然的构象(Anfinsen等人，Adv.Protein Chem.1975；29：205-300)。在体内，蛋白质折叠是复杂的，因为环境温度和高蛋白质浓度的组合刺激聚集过程，其中通常埋藏在疏水性核中的氨基酸非特异性地与它们的邻居相互作用。为了避免这种问题，蛋白质折叠通常被一组特殊的被称为分子伴侣(molecularchaperone)的蛋白质促进，所述的分子伴侣防止初生多肽链聚集，并且与未折叠的蛋白质结合，以便蛋白质重新折叠成天然的构象(Hartl，Nature1996；381：571-580)。

分子伴侣事实上存在于所有类型的细胞和大多数细胞腔室中。一些分子伴侣参与蛋白质的转运，并使细胞在应激如热激和葡萄糖饥饿下存活下来。在分子伴侣中(Gething等人，Nature 1992；355：33-45；Caplan，TrendsCell.Biol.1999；9：262-268；Lin等人，Mol.Biol.Cell.1993；4：109-1119；Bergeron等人，Trends Biochem.Sci.1994；19：124-128)，Bip(免疫球蛋白重链结合蛋白，Grp78)是被最佳表征的ER伴侣(Haas，Cur.Top.Microbiol.Immunol.1991；167：71-82)。象其它分子伴侣一样，Bip与ER内的许多分泌性和膜蛋白质相互作用，在它们的整个成熟过程中均可相互作用，但是在折叠顺利进行时该相互作用通常是微弱的和短暂的。一旦达到天然的蛋白质构象，分子伴侣不再与蛋白质相互作用。与不能折叠、装配或恰当糖基化的蛋白质结合的Bip变得稳定，通常之后发生该蛋白质通过ER-相关性降解作用的降解。这种过程充当ER中的“质量控制”系统，确保只有那些恰当折叠和装配的蛋白质被转运出ER供进一步成熟，而不恰当折叠的蛋白质被留下来进行随后的降解(Hurtley等人，Annu.Rev.Cell.Biol.1989；5：277-307)。

某些错义突变导致改变天然和恰当的蛋白质折叠的氨基酸取代。为了纠正这些错折叠，研究人员已经试图使用各种分子作为人工伴侣。已经表明高浓度的甘油、二甲基亚砜、三甲胺N-氧化物或重水在若干疾病中使突变型蛋白稳定，并且增加突变型蛋白的细胞内运输(Brown等人，Cell StressChaperones 1996；1：117-125；Burrows等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2000；97：1796-801)。认为这些化合物是提高一般蛋白质折叠的非特异性化学伴侣，但是其起作用的机理仍然是未知的。这类化合物需要高剂量才能达到功效，这使它们难以或不适合临床使用，尽管它们可用于细胞内蛋白质折叠缺损的生化检查。另外，它们也缺乏特异性。

酶的活性位点特异性伴侣

引入本文作为参考的共同拥有的美国专利No.6,274,597和6,774,135公开了法布里病的新治疗策略，法布里病是一种由溶酶体α-半乳糖苷酶A(α-Gal A)活性不足所导致的溶酶体贮积障碍(LSD)。α-Gal A缺乏经常是由编码导致折叠缺陷的突变型蛋白的基因突变造成的。发现给予1-脱氧半乳糖野尻霉素(DGJ)(一种有力的竞争性α-Gal A抑制剂)可有效增加突变α-Gal A(R301Q)在中性pH下的体外稳定性。在具有R301Q或Q279E突变的从法布里患者建立的淋巴母细胞中也观察到了这些结果。令人吃惊的是，用亚抑制浓度的DGJ培养细胞导致残余酶活性的大幅度增加。此外，对过度表达突变型(R301Q)α-Gal A的转基因小鼠口服给予DGJ大大升高了主要器官中的酶活性(Fan等人，Nat.Med.1999；5：112-115)。

这种策略的原理如下。由于突变型酶似乎在pH为中性的ER中不恰当地折叠，这已经被其在pH 7.0下的体外不稳定性证明(Ishii等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.1993；197：1585-1589)，所以该酶将在从ER到高尔基体正常转运途径中被阻滞并被迅速降解。如果突变型酶能够被有效转运至溶酶体，它可以保留正常或接近正常的动力学性质，并且将保留活性，因为突变型酶在pH 5.0以下是充分稳定的。因此，目标是诱导突变型酶以调整在ER中的恰当构象。具体而言，能够诱导该酶的稳定分子构象的化合物就能用作“活性位点特异性伴侣”(ASSC)或“药理学伴侣”，使突变型酶稳定在恰当的构象，供转运至溶酶体。在酶的情况下，出人意料地发现这类化合物是该酶的竞争性抑制剂。已知酶的竞争性抑制剂占据恰当折叠酶的催化位点，导致其正确构象在体外的稳定化。发现它们也可用作体内诱导恰当酶折叠的ASSC或药理学伴侣，从而从ER质量控制系统中挽救突变型酶。

共同拥有的美国专利6,583,158、6,589,964、6,599,919和Fan等人的美国申请No.10/304,395例举了对于包括戈谢病在内的许多其它溶酶体贮积疾病的ASSC策略。这些发现证明，这种使用有力的竞争性抑制剂作为ASSC以增加患者细胞中残余酶活性的治疗策略不限于法布里病，也能够应用于这种类型的酶缺乏疾病，特别是溶酶体贮积障碍。一般而言，与特定疾病有关的特定酶的有效ASSC是该酶的有力的竞争性抑制剂。出人意料的是，对于突变型酶而言，越有力的酶抑制剂可作为越好的ASSC(Fan，Trends Pharmacol Sci.2003；24：355-60)。

有力的β-葡糖脑苷脂酶抑制剂

β-葡糖脑苷脂酶(GCase或酸性β-葡糖苷酶)是一种溶酶体水解酶，它催化葡萄糖从葡糖神经酰胺上通过水解裂解下来(Brady等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.1965；18：221-225)。该酶活性的不足导致葡糖神经酰胺(红细胞糖苷脂和神经节苷脂分解代谢中的一种正常中间体)在巨噬细胞溶酶体中的进行性蓄积，引起戈谢病—最常见的溶酶体贮积障碍(Beutler等人，The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease，第8版，McGraw-Hill，纽约2001，3635-3668)。

关于该疾病和治疗性处置的细节将在下文描述。Sawkar等人已经报道了向成纤维细胞培养基加入GCase抑制剂引起N370S GCase活性增加2倍，这表明有力的GCase抑制剂可能在戈谢病的治疗中具有治疗意义，但是由于细胞毒性高，该特定的抑制剂尚不足以作为治疗剂(Sawkar A.R.等人，Proc Natl Acad Sci USA.2002；99(24)：15428-33)。因此，人们已经在努力设计和合成有力的GCase抑制剂。

据信，β-糖苷酶的催化机理是经由共价葡糖基酶中间体和在端基异构位生成的正电荷进行的(Ichikawa等人，J.Am.Chem.Soc.1998；120：3007-3018；Heightman等人，1999；Angew.Chem.Int.Ed.1999；38：750-770)。Ichikawa等人已经设计出了一类有力的β-糖苷酶抑制剂，即1-N-亚氨基糖类，其中氮原子位于单糖的端基异构位(结构1A，Isofagomine或羟基哌啶)。在初步研究中，D-葡萄糖型1-N-亚氨基糖(isofagomine或羟基哌啶1)已经显示是有力的GCase抑制剂(Fan等人的美国专利6,583,158)。1-脱氧野尻霉素(DNJ)的N-烷基衍生物也是有力的GCase抑制剂，特别是具有更长烷基(大于C₆的烷基链)的那些，但是DNJ本身和那些具有短链的N-烷基DNJ不具有抑制作用(结构1B，N-壬基1-脱氧野尻霉素)(美国专利6,583,158)。但是，这些抑制剂对于GCase不是足够特异性的或者不是足够有效力的，不适合用于治疗戈谢病。基于这些发现，已经认识到GCase可能在催化结构域中含有两个底物结合位点：一个识别葡糖基残基；另一个识别神经酰胺部分(结构1C，6-C-壬基羟基哌啶，RD-1：识别结构域1；RD-2：识别结构域2)。GCase的晶体结构测定显示在单糖结合位点的入口周围存在疏水性残基环(Dvir等人，EMBO reports 2003；4：1-6)，表明对于与疏水性氨基酸残基的相互作用而言，需要与具有长烷基链的糖残基连接的疏水性部分。

结构1：有力的人GCase抑制剂。1(A)Isofagomine或羟基哌啶；1(B)N-壬基1-脱氧野尻霉素；1(C)6-C-壬基羟基哌啶，RD-1：识别结构域1；RD-2：识别结构域2。

因此，在本领域中，仍然需要设计或鉴别酶的特异性竞争性抑制剂，并且对它们作为与许多LSD有关的相应突变型酶的伴侣的能力进行评价，特别是与戈谢病和其它由错折叠的蛋白质导致的障碍有关的Gcase的抑制剂。

发明概述

本发明提供了式I化合物：

其中A、B、R¹、R²、R⁵和L如下文所述。本发明还提供了式I化合物的盐、酯和前体药物。

另外，本发明描述了合成式I化合物的方法。

本发明进一步提供了增强哺乳动物细胞中GCase活性的方法，该方法使细胞与增强GCase活性有效量、即非抑制量的式I化合物接触。

本发明还提供了使哺乳动物细胞中GCase稳定的方法，该方法使细胞与稳定GCase有效量的式I化合物接触。

本发明还提供了包含式I化合物和药学上可接受的载体的组合物。

还提供了通过对需要这类治疗的个体给予药物组合物而治疗戈谢病的方法，所述组合物包含增强GCase活性有效量的式I化合物。

另外，本发明提供了在以抑制浓度使用时抑制哺乳动物细胞中GCase的方法，该方法使细胞与式I化合物接触。

本发明提供了在以抑制浓度使用时体外抑制GCase的方法，该方法使酶与式I化合物接触。

本发明提供了在以抑制浓度使用时抑制哺乳动物细胞中β-葡糖苷酶的方法，该方法使细胞与抑制浓度的式I化合物接触。

本发明提供了在以抑制浓度使用时体外抑制β-葡糖苷酶的方法，该方法使该酶与式I化合物接触。

附图简要说明

图1：GCase-特异性化合物的结构。(a)DNJ，1-脱氧野尻霉素；(b)IFG，isofagomine；(c)N-壬基DNJ，N-壬基1-脱氧野尻霉素；(d)6-壬基HP或6-壬基isofagomine。

图2：HP的6-烷基衍生物的合成。通过以下方法将L-木糖转化为α-苄基木糖苷(1)：在酸存在下、于50℃下与苄醇一起进行搅拌，然后在0℃下使α-端基异构体从叔丁基甲基醚中结晶。通过在THF中进行酸催化的2-甲氧基丙烯的反式-缩醛化生成苄基α-木糖苷的2，3-O-亚异丙基衍生物。将剩余的游离4-羟基转化为被保护的苄基α-木糖苷丙酮化物(2)的相应三氟甲磺酸酯，以合成上有用的收率得到化合物3。随后在无水DMF中用氰化钾和18-冠醚-6处理，得到腈(4)。向该腈中加入有机金属化合物，例如格氏试剂，然后还原中间体亚胺，得到胺(5-10)。将化合物5-10在Pd(OH)₂/C存在下进行氢解，然后将亚异丙基去保护，得到各个6-烷基HP衍生物。

图3：HP的6-衍生物的替代合成法。如上所述制备化合物4。向腈(4)中加入格氏试剂(烯丙基溴化镁)，然后用NaBH₄还原(或者，可以使用1)，得到胺化合物(17)。将化合物17用氯甲酸苄基酯保护，然后进行末端烯烃的臭氧分解、用乙二醇进行醛缩合并进行氢解，得到化合物18。用HOAc水溶液进行亚异丙基的选择性去保护，得到化合物19。将化合物19用NaH、再用对-甲氧基苄基溴处理，生成N，O-保护的化合物，然后用三氟乙酸水解，生成醛(20)。化合物20可以通过下列方法之一被转化为化合物21：1)使化合物20与胺在还原条件下反应；2)使化合物20与维悌希试剂反应；或者3)将化合物20用还原剂还原，然后用SOCl₂和亲核试剂处理。将化合物21去保护，得到化合物22。

图4：6-壬基HP对GCase的抑制活性。如下文实施例中所述测定酶活性。计算相对酶活性，为无抑制剂反应酶活性的百分比。利用Prism S形图计算IC₅₀。▲＝IFG；○＝N-壬基DNJ；●＝6-壬基HP。

图5：戈谢(Gaucher)成纤维细胞中残余GCase活性的伴侣挽救。将具有N370S/N370S突变的由戈谢病患者建立的成纤维细胞用本发明的化合物处理，如实施例中所述测定GCase活性。细胞溶解产物中的蛋白质浓度也利用来自Pierce的微量BCA蛋白质测定试剂盒进行测定。◆＝6-壬基HP；■＝isofagomine(IFG)。

发明详述

本发明提供了一类新的有力的竞争性GCase抑制剂、即葡萄糖的6-烷基羟基哌啶(HP)衍生物的设计和合成，证明了它们增加具有N370S突变的来自戈谢病患者的成纤维细胞中残余酶活性的能力。

戈谢病

戈谢病是一种由β-葡糖脑苷脂酶(以下称为GCase)的活性不足和其未降解的底物葡糖神经酰胺(葡糖脑苷脂)(红细胞糖苷脂和神经节苷脂分解代谢中的一种正常中间体)的蓄积所引起溶酶体贮积障碍(Beutler等人，TheMetabolic and Molecular Bases of Inherited Disease，第8版.2001；Scriver，C.R.，Beaudet，A.L.，Sly，W.S.和Valle，D.编辑)第3635-3668页，McGraw-Hill，纽约)。在一些情况下，GCase的活性不足是由GCase基因的突变引起的，导致ER中基因产物的错折叠和随后的降解。根据初步神经病学涉及的程度和发病的年龄，一般分为三种临床表型：(i)非神经元病性(non-neuronopathic)变型(1型或成人型)；(ii)急性神经元病性变型(2型或婴儿型)；和(iii)亚急性神经元病性变型(3型或少年型)。以肝脾大、继发性脾机能亢进和骨骼牵连为特征的1型戈谢病是最普遍的形式，这种变型的严重性和临床过程特别不均匀，从早期发病至没有临床表现不一(Grabowski，Gaucher disease：Enzymology，genetics，and treatment.1993，Plenum Press，纽约)。相反，具有神经病学形式(2型和3型)的患者很少。临床严重性与基因型的相关性表明呈现残余酶活性的轻微突变经常导致1型疾病，而严重或无突变导致3型或2型疾病。

在世界的所有地区均已发现了戈谢病患者。特别是该疾病最常见于北欧(Ashkenazi)犹太人，其中导致戈谢病的等人位基因的频率为大约0.0343(Beutler等人，同上)。据估计发病率为1∶4,000(Mathoth等人，Am J MedGenet.1987；27：561-5)。通过对五种最常见的突变进行筛选，可以检测到北欧犹太人中大约97％的GCase突变和非犹太人中75％的GCase突变。在现在已有记载的很多突变中，仅导致1型戈谢病的N370S突变是最常见的突变，据报道其存在于约6％的北欧犹太人中(Beutler等人，Blood 1992；79：1662-6)。在纯合体中导致3型疾病的L444P突变在瑞典北部以多形态水平存在(Dahl等人，Am J Hum Genet.1990；47：275-8)。在cDNA的84位核苷酸上的G插入是第二常见的犹太人突变，见于大约0.6％的犹太人中。这种突变甚至在成熟蛋白质的N-末端之前导致移码，携带这种突变的等位基因不产生酶活性，导致2型疾病(Beutler等人，Proc Natl Acad Sci USA.1991；88：10544-7)。

编码GCase的基因已被定位于染色体1的q21(Ginns等人，Proc NatlAcad Sci USA 1985；82：7101-5)。GCase的基因长度为大约7kb，含有11个外显子。GCase cDNA长度为约2kb，从cDNA在各种真核细胞中的体内翻译可以产生活性酶，所述真核细胞包括感染有杆状病毒的COS细胞和昆虫细胞(Grabowski等人，Enzyme 1989；41：131-42)。人GCase是一种同聚(homomeric)糖蛋白。成熟的多肽是497个氨基酸，计算的分子量为55,575。来自胎盘的糖基化酶具有约65kD的分子量。在荷负电的磷脂的存在下，Saposin C体外激活GCase。

目前的治疗。1型戈谢病患者目前可使用酶替代疗法。已经证明静脉内输注人胎盘GCase或重组GCase(经修饰以暴露被覆盖的甘露糖残基)可有效逆转1型戈谢病患者的很多特征性临床表现(Kay等人，Trans Assoc.Am.Phys.1991；104：258-264；和Grabowski等人，Pediatr.Res.1993；33：139A)。对于涉及神经病学的2型或3型患者，酶替代疗法(ERT)不太有效，因为在静脉内输注后酶不会穿过血脑屏障。

治疗戈谢病的另一种方法是使用GCase抑制剂来降低葡糖神经酰胺和糖脂的水平(Inokuchi等人，Lipid Res.1987；28：565-71；Platt等人，Biochem.Pharmacol.1998；56：421-430；和Radin等人，Glycoconjugate J.1996；13：153-157)。这被称为底物减少疗法(SRT)。在用小分子葡萄糖衍生物治疗一年后观察到患者的临床症状有适度改善(Cox等人，Lancet 2000；355：1481-1485)。使用小分子抑制剂来防止病原性底物合成的SRT正在就一些LSD进行评价，N-丁基1-脱氧野尻霉素(NB-DNJ)在欧洲和美国已经获得了有条件的上市许可，用于治疗戈谢病(Butters等人，Philos Trans RSoc Lond B Biol Sci.2003；358：927-945)。与ERT相比，该治疗的一个优点是小分子抑制剂有可能穿过血脑屏障，防止底物在脑中的蓄积。最常见的不利作用是腹泻，这在治疗开始后不久发生于79％的患者中。尚不确定糖脂的长期减少是否将具有其它不利作用。

正如上文所讨论的那样，最近开发的另一种小分子方法被称为活性位点特异性伴侣(ASSC)疗法(Fan等人，Nat Med.1999；5：112-115；Fan，Trends Pharmacol Sci.2003；24：355-360)。ASSC使用低浓度的有力酶抑制剂，以改善具有LSD的患者中突变型蛋白的折叠和活性，所述酶抑制剂对突变型(或野生型)酶是特异性的。由于ASSC中所用的活性位点抑制剂对致病的酶是特异性的，所以该疗法靶向于单一的蛋白质和特定的代谢途径，不象SRT那样抑制整个合成途径。象SRT一样，用于ASSC的小分子抑制剂具有穿过血脑屏障的潜力，因此能够用于治疗神经病学LSD形式。有力的GCase抑制剂的设计和合成以及用于戈谢病的有效的ASSC

对于突变型酶而言，越有力的酶抑制剂可作为越好的ASSC(Fan，Trends Pharmacol Sci.2003；24：355-60)。因此，本发明设计和合成了一类新的有力的GCase抑制剂，并且使用这些抑制剂作为ASSC来增强源自戈谢病患者的细胞中的残余酶活性。

Fan等人还已经确定，ASSC疗法能够用于使用葡糖并咪唑(GIZ)和多羟基环己烯基胺(PHCA)衍生物治疗戈谢病，它们可以作为与疾病有关的突变型葡糖脑苷脂酶的“活性位点特异性伴侣”被给予患有戈谢病的个体(2004年11月12日提交的名称为“用于治疗戈谢病的葡糖并咪唑和多羟基环己烯基胺衍生物(Glucoimidazole and Polyhydroxycyclohexenyl AmineDerivatives to Treat Gaucher Disease)”的美国专利申请)。

除了增强与LSD有关的突变型(或野生型)酶的活性以外，ASSC还已经被证明可增强相应野生型酶的活性(参见Fan等人的美国专利6,589,964)，从而提示了它们在LSD患者中作为酶替代疗法和基因疗法中的辅助疗法的用途。

本发明也涵盖对β-葡糖脑苷脂酶(GCase)的抑制作用。这类抑制作用例如可用于研究动物模型中β-葡糖脑苷脂酶缺乏的影响。由于哺乳动物β-葡糖脑苷脂酶的靶向缺失是致命性的，所以不能为了评价戈谢病状态而产生剔除型小鼠。本发明涵盖对动物给予抑制量的β-葡糖苷酶抑制剂以模拟戈谢病表型。

定义

本文所用的下列术语具有以下定义。

化学术语

术语“烷基”表示直链或支链的C₁-C₂₀烃基，其仅由碳和氢原子组成，不含不饱和度，通过单键与分子其余部分连接，例如甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1，1-二甲基乙基(叔丁基)。本文所用的烷基优选地是C₁-C₈烷基。

术语“链烯基”表示含有至少一条碳-碳双键的C₂-C₂₀脂族烃基，并且其可以是直链或支链的，例如乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基(烯丙基)、异丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基。

术语“炔基”表示具有至少一条碳-碳叁键的C₂-C₂₀直链或支链的烃基，例如乙炔基、丙炔基、丁炔基。

术语“环烷基”表示不饱和的非芳族单环或多环的烃环系，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基。多环环烷基的实例包括全氢萘基、金刚烷基和降冰片基(norbornyl)桥连的环状基团或螺二环基团，例如螺(4，4)壬-2-基。

术语“环烯基”表示含有3至约14个碳原子的环状含环原子团，例如环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基。

术语“环烷基烷基”表示直接与如上所定义的烷基连接的如上所定义的环烷基，这导致稳定结构的产生，例如环丙基甲基、环丁基乙基、环戊基乙基。

术语“芳基”表示具有约6至约14个碳原子的芳族原子团，例如苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、联苯基。

术语“芳基烷基”表示直接与如上所定义的烷基键合的如上所定义的芳基，例如-CH₂C₆H₅和-C₂H₄C₆H₅。

术语“杂环”表示稳定的由碳原子和一至五个选自氮、磷、氧和硫的杂原子组成的3-至15-元环原子团。对于本发明的目的，杂环原子团可以是单环、二环或三环环系，其可以包括稠合、桥连或螺环系，杂环中的氮、磷、碳、氧或硫原子可以任选地被氧化为各种氧化态。另外，氮原子可以任选地被季铵化；环原子团可以是部分或完全饱和的(即，杂芳族的或杂芳基芳族的)。这类杂环原子团的实例包括但不限于氮杂环丁烷基、吖啶基、苯并间二氧杂环戊烯基、苯并二烷基、苯并呋喃基、咔唑基、噌啉基、二氧戊环基、吲嗪基、萘啶基、全氢氮杂基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩嗪基、酞嗪基、吡啶基、蝶啶基、嘌呤基、喹唑啉基、喹喔啉基、喹啉基、异喹啉基、四唑基、咪唑基、四氢异喹啉基(tetrahydroisouinolyl)、哌啶基、哌嗪基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、2-氧代氮杂基、氮杂基、吡咯基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、唑基、唑啉基、唑烷基、三唑基、茚满基、异唑基、异唑烷基、吗啉基、噻唑基、噻唑啉基、噻唑烷基、异噻唑基、奎宁环基、异噻唑烷基、吲哚基、异吲哚基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、喹啉基、异喹啉基、十氢异喹啉基、苯并咪唑基、噻二唑基、苯并吡喃基、苯并噻唑基、苯并唑基、呋喃基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、噻吩基、苯并噻吩基、硫吗啉基、硫吗啉基亚砜、硫吗啉基砜、二氧磷杂环戊烷基、二唑基、苯并二氢吡喃基、异苯并二氢吡喃基。

杂环原子团可以在任何导致稳定结构产生的杂原子或碳原子上与主结构连接。

术语“杂芳基烷基”表示直接与烷基键合的如上所定义的杂芳基环原子团。杂芳基烷基原子团可以在任何导致稳定结构产生的烷基碳原子上与主结构连接。

术语“杂环基”表示如上所定义的杂环原子团。杂环基环原子团可以在任何导致稳定结构产生的杂原子或碳原子上与主结构连接。

术语“杂环基烷基”表示直接与烷基键合的如上所定义的杂环原子团。杂环基烷基原子团可以在任何导致稳定结构产生的烷基碳原子上与主结构连接。

“取代的烷基”、“取代的链烯基”、“取代的炔基”、“取代的环烷基”、“取代的环烷基烷基”、“取代的环烯基”、“取代的芳基烷基”、“取代的芳基”、“取代的杂环”、“取代的杂芳基环”、“取代的杂芳基烷基”或“取代的杂环基烷基环”中的取代基可以是相同或不同的，一个或多个选自下组的基团：氢、羟基、卤素、羧基、氰基、氨基、硝基、氧代基(＝O)、硫代基(＝S)或任选地被取代的选自以下的基团：烷基、烷氧基、链烯基、炔基、芳基、芳基烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环、-COOR^x、-C(O)R^x、-C(S)R^x、-C(O)NR^xR^y、-C(O)ONR^xR^y、-NR^xCONR^yR^z、-N(R^x)SOR^y、-N(R^x)SO₂R^y、-(＝N-N(R^x)R^y)、-NR^xC(O)OR^y、-NR^xR^y、-NR^xC(O)R^y、-NR^xC(S)R^y、-NR^xC(S)NR^yR^z、-SONR^xR^y、-SO₂NR^xR^y、-OR^x、-OR^xC(O)NR^yR^z、-OR^xC(O)OR^y、-OC(O)R^x、-OC(O)NR^xR^y、-R^xNR^yR^z、-R^xR^yR^z、-R^xCF₃、-R^xNR^yC(O)R^z、-R^xOR^y、-R^xC(O)OR^y、-R^xC(O)NR^yR^z、-R^xC(O)R^x、-R^xOC(O)R^y、-SR^x、-SOR^x、-SO₂R^x、-ONO₂，其中以上各基团中的R^x、R^y和R^z可以是氢原子、取代或未取代的烷基、卤代烷基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的环烷基烷基、取代或未取代的杂环、取代或未取代的杂环基烷基、取代或未取代的杂芳基或者取代或未取代的杂芳基烷基。

术语“亲脂性的”表示能够与疏水性氨基酸残基相互作用的功能残基。亲脂性基团的实例包括但不限于C₁-C₁₂的取代或未取代的烷基、取代或未取代的链烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的环烯基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环、取代或未取代的杂环烷基和取代或未取代的杂芳基烷基。

术语“卤素”表示氟、氯、溴和碘的原子团。

术语“可氢化的保护基”表示能够被氢化条件除去的保护基，例如苄基和4-甲氧基苄基。

术语“酸”表示路易斯酸，例如硫酸、氢氯化物或由酰氯与醇反应所生成的氢氯化物。

术语“有机酸”表示有机路易斯酸，例如对-甲苯磺酸、樟脑磺酸。

术语“冠醚”表示以规则模式含有若干氧原子的大环化合物，例如12-冠醚-4、15-冠醚-5、18-冠醚-6、二环己并(hexano)-18-冠醚-6。

术语“有机金属试剂”表示在碳与金属原子之间含有一条键的化合物，例如有机锂、有机锌、有机铜、格氏试剂。

术语“氢解条件”表示在氢源存在下用催化剂进行的催化氢解，所述催化剂例如但不限于Pd(OH)₂/C、Pd/C、Pt或阮内镍。

术语“氢化”表示其中通过在氢源存在下用催化剂使氢原子与之连接而还原碳原子之间的不饱和键的化学反应，所述催化剂例如但不限于Pd(OH)₂/C、Pd/C、Pt或阮内镍。

术语“还原剂”表示将分子中的官能团从一种氧化态转化为较低态的试剂，例如LiAlH₄、NaBH₄、Zn(BH₄)₂、i-Bu₂AlH和Li-s-Bu₃H。

术语“离去基团”表示能够被亲核试剂取代的基团，例如TsO-、TfO-、MsO-、Cl、Br、I。

术语“N-保护基”表示暂时保护胺或亚胺基团以避免进一步反应的基团，例如但不限于4-甲氧基苄基、苄基、叔丁氧羰基、苄氧羰基。

术语“O-保护基”表示暂时保护羟基以避免进一步反应的基团，例如但不限于4-甲氧基苄基、苄基和三甲基硅烷基。

术语“碱”表示有机路易斯碱，例如吡啶、三乙胺、二异丙基乙基胺。

术语“亲核部分和亲核试剂”表示通过提供两个键合电子与其反应配偶体(亲电试剂)形成一条键的试剂，例如醇、硫醇或1-炔烃的金属盐。

术语“短的柔性连接基团”表示直链长度约6至约12、优选约9的连接基团。

生物学术语

本文所用的术语“活性位点特异性伴侣”(ASSC)表示特异性地可逆地与蛋白质的活性位点相互作用并增强稳定分子构象形成的任何分子，包括但不限于蛋白质、肽、核酸、碳水化合物。本文所用的“ASSC”不包括细胞ER中存在的内源性一般伴侣如Bip、钙连接蛋白或钙网蛋白或者一般的非特异性化学伴侣如重水、DMSO或TMAO。

本文所用的术语“活性位点”表示与底物或结合配偶体结合并贡献直接参与化学键制造和断裂的氨基酸残基的蛋白质的区域。根据本发明，活性位点涵盖GCase的催化结构域。

术语“野生型活性”表示细胞中GCase的正常生理功能。这类功能性可以通过任何已知的建立蛋白质、特别是酶的功能性的手段进行检验。某些检验可以评价蛋白质的属性，其可能相当于或不相当于其实际的体内功能，但是是蛋白质功能性的综合代表，这类试验中的野生型行为是本发明蛋白质折叠挽救技术的可接受的结果。根据本发明的一种这类活性是从内质网适当转运至细胞中GCase的特定目的地，即溶酶体。

术语“功能性GCase蛋白”表示具有以恰当构象折叠、在细胞中达到其天然位置的能力并且对葡糖脑苷脂和其它脂质底物具有分解代谢活性的GCase蛋白。功能性GCase蛋白包括野生型GCase蛋白(参见下文的定义)，例如，如SEQ ID NO：2所描绘的。

本文所用的术语“突变型GCase”表示从含有一个或多个基因突变的基因翻译的GCase，这些突变导致产生在ER中正常存在的条件下不会达到其天然构象的改变的蛋白质序列。不能达到这种构象会导致GCase被降解，而不是通过蛋白质转运系统中的其正常途径被转运至细胞内其恰当的位置。

这类GCase突变的一些具体体现是N370S突变和L444P突变。

术语“增强GCase的活性”表示使ER中突变型GCase蛋白的恰当构象稳定，以便以恰当的构象折叠、在细胞中达到其天然位置并对脑苷脂(其脂质底物)具有分解代谢活性。该术语也表示增加外源性给予的GCase蛋白的野生型活性，即，增加野生型GCase的稳定性和延长体内半衰期，从而延长其活性。

术语“使恰当的构象稳定/稳定恰当的构象”表示本发明化合物诱导突变型GCase构象或者使其稳定的能力，与是否处于ER或其它细胞腔室中无关，所述构象在功能上等同于野生型酶的构象。“功能上等同”在本发明中意味着可以在构象上有微小的差异(实际上几乎所有的蛋白质在它们的生理状态下都表现出一些构象上的灵活性)，但是该构象灵活性不会导致(1)聚集，(2)通过与内质网相关的降解作用进行消除，(3)酶功能受损，和/或(4)细胞内不恰当的转运。该术语也表示化合物在外源性加入GCase之后在体内或者在酶制剂中在体外使野生型GCase的恰当构象稳定的能力。

“野生型GCase基因”表示编码能够在体内具有功能性生物学活性的ASM蛋白的核酸序列。野生型GCase核酸序列可含有与已知的、已公布的序列例如SEQ ID NO：1不同的核苷酸变化，只要这些变化所产生的氨基酸取代对生物学活性几乎没有或者没有影响即可。本文所用的术语野生型也可以包括被加工用来编码能够相对于内源性或天然GCase蛋白增加或增强活性的GCase蛋白的GCase核酸序列。

“野生型GCase蛋白”表示当在体内被表达或引入时能够具有功能性生物学活性的野生型基因所编码的任何蛋白质。

分子生物学术语

根据本发明，可以采用本领域常规的分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这类技术在文献中有详尽解释。例如参见Sambrook，Fritsch &Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版(1989)ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，纽约(本文称为“Sambrook等，1989”)；DNA Cloning：A Practical Approach，第I和II卷(D.N.Glover编辑，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑，1984)；Nucleic Acid Hybridization；B.D.Hames & S.J.Higgins编辑(1985)；Transcription And Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins编辑，1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编辑，1986)；Immobilized Cells AndEnzymes；IRL Press，(1986)；B.Perbal，A Practical Guide To MolecularCloning(1984)；F.M.Ausubel等(编辑)，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，Inc.(1994)。

本文所用的术语“分离的”意味着所提到的材料是被从其正常见到的环境中移出的。因而，分离的生物材料可能不含细胞组分，即，在其中该材料被见到或生成的细胞的组分。在核酸分子的情况下，分离的核酸包括PCR产物、分离的mRNA、cDNA或限制片段。在另一个实施方案中，分离的核酸优选地是从在其中可发现核酸的染色体中切下的，更优选地其不再与非调节性、非编码区域或与其它基因连接，所述基因位于在见于染色体中时分离的核酸分子所含有的基因的上游或下游。在另一个实施方案中，分离的核酸缺乏一个或多个内含子。分离的核酸分子包括被插入到质粒、粘粒、人工染色体等中的序列。因此，在一个具体的实施方案中，重组核酸是一种分离的核酸。分离的蛋白质可以与其它在细胞中与之结合的蛋白质或核酸或此二者结合，或者与细胞膜结合，如果它是一种膜结合蛋白质的话。在一个具体的实施方案中，分离的GCase蛋白是由表达载体表达的重组GCase蛋白。分离的材料可以但不必须被纯化。

本文所用的术语“纯化”表示已经在减少或消除无关材料、即污染物的条件下被分离的材料。例如，纯化GCase蛋白优选地基本上不含有其它在正常情况下GCase在细胞中与之结合的蛋白质或核酸。本文所用的术语“基本上不含”在操作上用在材料的分析性检测环境中。优选地，基本上不含污染物的纯化ASM的纯度是至少50％，更优选至少90％，进而更优选至少99％。可以通过色谱法、凝胶电泳、免疫测定、组成分析、生物测定和本领域已知的其它方法对纯度进行评估。

术语“约”和“大约”一般应当表示在给定测量性质或精度下测量的量的可接受的误差程度。通常，举例性误差程度在给定数值或数值范围的20个百分比(％)以内，优选在10％以内，更优选在5％以内。或者，特别是在生物学系统中，术语“约”和“大约”可以表示在给定数值的数量级内的数值，优选在给定数值的10-或5-倍以内，更优选在给定数值的2-倍以内。除非另有说明，否则本文给出的数字量均是大约值，这意味着在没有明确规定时，可以推断具有术语“约”或“大约”的含义。

术语“宿主细胞”表示以任何方式选择、修饰、转化、生长、使用或处理的任何生物的任何细胞，用于由该细胞产生物质，例如由该细胞表达突变型或功能性哺乳动物的GCase基因(包括DNA或RNA序列)或者GCase酶。宿主细胞可以进一步用于初步评价ASSC概念的其它测定。“重组DNA分子”是进行了分子生物学处理或加工的DNA分子。

“基因”是编码“基因产物”的核苷酸的序列。一般而言，基因产物是蛋白质。但是，基因产物也可以是细胞中另一种类型的分子，例如RNA(例如tRNA或rRNA)。对于本发明的目的，基因产物也表示可以在细胞中见到的mRNA序列。本文所用的基因表示编码野生型或突变型GCase的核苷酸序列。

术语“表达”表示允许或导致GCase基因或DNA序列中的信息显现出来，例如通过激活相应GCase基因或DNA序列(即，编码GCase的序列)转录和翻译中所涉及的细胞功能来产生RNA(例如rRNA或mRNA)或GCase蛋白。GCaseDNA序列被细胞表达形成“表达产物”，例如GCaseRNA(例如mRNA或rRNA)或GCase蛋白。表达产物本身、例如所得的GCase RNA或蛋白质也可以被称为是被细胞“表达”的。

术语“转染”表示向细胞中引入外来核酸。术语“转化”也表示向宿主细胞中引入“外来”(即，外部的或细胞外的)基因、DNA或RNA序列，以便使宿主细胞表达所引入的基因或序列，从而产生所需的物质，在本发明中通常为被所引入的基因或序列所编码的RNA，但是也可以是被所引入的基因或序列所编码的蛋白质或酶。所引入的基因或序列也可以被称为“克隆”或“外来”基因或序列，可以包括调节或控制序列(例如起始序列、终止序列、启动子序列、信号序列、分泌序列或细胞遗传机构所使用的其它序列)。基因或序列可以包括无功能序列或者无已知功能的序列。接收和表达所引入的DNA或RNA的宿主细胞已经被“转化”并且是“转化体”或“克隆”。被引入宿主细胞的DNA或RNA可以来自任何来源，包括与宿主细胞相同种属或种类的细胞或者不同种属或种类的细胞。本文所用的转染或转化将包括在具有突变的内源性GCase基因的个体中引入编码功能性GCase的序列。

术语“载体(vector)”、“克隆载体”和“表达载体”表示GCase DNA或RNA序列(例如，外来基因)可以通过其被引入到宿主细胞中以转化宿主和促进所引入的序列表达(例如，转录和翻译)的媒介物。载体包括在与恰当的控制元件结合时能够复制并且能够在细胞间转移GCase基因序列的任何遗传元件，例如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒体等。因此，该术语包括克隆和表达载体，以及病毒载体。

术语“表达系统”表示宿主细胞和在适合条件下的相容性载体，它们例如适合用于表达被载体携带的外来DNA所编码和被引入到宿主细胞中的GCase蛋白。常见的表达系统包括大肠杆菌宿主细胞和质粒载体、昆虫宿主细胞如Sf9、Hi5或S2细胞和杆状病毒载体以及表达系统，和哺乳动物宿主细胞和载体。

术语“基因疗法”表示通过外源性给予一种基因、即GCase基因来改变内源性基因表达的方法。本文所用的基因疗法也表示通过向有需要的个体的体细胞或干细胞中引入相当于有缺陷的GCase基因或缺失GCase基因的功能性基因来代替有缺陷的GCase基因或者代替缺失的GCase基因。基因疗法可以由“离体”方法来完成，其中从个体的机体中移出分化的或未分化的干细胞，然后用病毒载体作为基因递送媒介物向被移出的细胞中引入有缺陷的基因的正常副本。另外，体内直接基因转移是用广泛的病毒载体、脂质体、蛋白质DNA复合物或裸DNA原位向个体细胞中转移基因，目的是实现治疗结果。

术语“重组蛋白”表示载体上携带的治疗性GCase基因所编码的GCase蛋白(基因产物)。一般而言，接收该载体的细胞将缺乏与该重组蛋白相当的任何内源性GCase蛋白的表达和/或活性，或者如果存在这类内源性GCase蛋白的表达，则它是突变的或者非常低水平的。在一个实施方案中，重组蛋白是在用于实验和治疗目的的组织培养物中由细胞产生的。在另一个实施方案中，重组蛋白是在体内由用载体转化的细胞产生的，其中所述载体或包含所述载体的细胞已经被给予受试者，即基因疗法。重组GCase蛋白将有可能与正常个体、即蛋白质没有缺陷或者没有戈谢病的个体中的野生型蛋白没有区别。

治疗和给药

“受试者”或“患者”是已经发展或者有可能发展为戈谢病的人或动物，更特别是哺乳动物，优选啮齿类或灵长类，最优选人。在一个实施方案中，患者是已经被诊断患有戈谢病或者由于GCase基因的遗传突变已经被确定具有增加的发展为戈谢病危险的北欧犹太人的成员。但是，术语“受试者”涵盖世界上患有戈谢病或者在遗传学上具有发展为戈谢病的危险的任何人。

术语“预防”表示防止疾病的发作，这表示预防性干扰导致疾病、例如戈谢病的病理学机理。在本发明的上下文中，该类病理学机理可以是突变型蛋白折叠和GCase表达的增加。

术语“治疗”表示在显示出疾病症状的受试者中对疾病发展进行治疗性干预。在本发明的上下文中，这些症状包括但不限于GCase在溶酶体中的蓄积、肝脾大、精神运动迟滞、肺异常、骨与关节变性和进行性神经变性。

在本文中术语“治疗有效量”用于表示足以增加突变型GCase表达水平的本发明HP衍生物的量或剂量，例如增加至正常细胞中所发现水平的约3-5％、优选约10％、更优选约30％，所述正常细胞即来自没有戈谢病的个体的细胞。优选地，治疗有效量能够改善或防止受试者的临床上显著的不足的GCase活性。或者，治疗有效量足以导致受试者临床显著病症的改善，例如2型和3型戈谢病患者的进行性神经变性的改善。

短语“药学上可接受的”表示这样的分子实体和组合物，它们是生理学上可耐受的，并且在对人给药时通常不会产生变态反应或类似的不希望的反应，例如胃不适(gastric upset)和头晕。优选地，本文所用的术语“药学上可接受的”表示获得联邦或州政府管理机构批准的或者列在美国药典或其它公认药典中的，用于动物，更特别是人。

术语“载体(carrier)”表示与化合物一起给药的稀释剂、助剂、赋形剂或媒介物。这类药物载体可以是无菌的液体，如水和油，包括石油、动物油、植物油或合成来源的油，例如花生油、豆油、矿物油、芝麻油。优选地采用水或水溶液如盐水溶液、葡萄糖水溶液和甘油水溶液作为载体，特别是用于可注射溶液。E.W.Martin在“Remington′s PharmaceuticalSciences”中描述了适合的药用载体。

新化合物和合成

化合物

根据本发明，ASSC是HP的6-衍生物(任选地另外被N-烷基化)，其具有(i)在相当于吡喃糖环端基异构位的位置上的正电荷；(ii)发源于吡喃糖中环氧的相应位置的短的柔性连接基团；和(iii)与该连接基团连接的亲脂性部分。在一个具体的实施方案中，ASSC是6-壬基-HP或者(3R，4R，5R，6S/6R)-5-(羟甲基)-6-正壬基-3，4-二羟基哌啶。因为葡萄糖残基的C-6位不被大多数GCase和β-葡糖苷酶所识别(De Bruyne等人，Eur.J.Biochem.1979；102：257-67)，所以C-6位上的取代基可以是氢、羟基或羟甲基。

更具体而言，本发明提供了以下式I的新化合物：

其中

A代表碳或氮；

B是氢、羟基、N-乙酰胺或卤素；

R¹是氢；取代或未取代的：烷基、链烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、芳基烷基、杂芳基、杂环基、杂环基烷基或杂芳基烷基；-C(O)R³或-S(O)_mR³。优选地，R¹包括H或具有1-12个碳原子的有机部分；

R²是任选的短的柔性连接基团，其直链长度为约6至约12；或者，R²选自C₁-C₆的取代或未取代的：烷基、链烯基或炔基，其任选地被一个或多个选自下组的部分所间断：NH、NHCOO、NHCONH、NHCSO、NHCSNH、CONH、NHCO、NR³、O、S、S(O)_m和-S(O)_mNR³；

R³是氢，或者取代或未取代的：烷基、链烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、芳基烷基、杂芳基、杂环基、杂环基烷基或杂芳基烷基。优选地，R³包括H或者具有1-12个碳原子或者更优选地1-6个碳原子的有机部分；

m是1或2；

R⁵是氢、羟基或羟甲基；

L是具有1-12个碳原子的亲脂性基团，其包括取代或未取代的：烷基、链烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、芳基烷基、杂芳基、杂环基、杂环烷基或杂芳基烷基。

也涵盖式I化合物的药学上可接受的盐和前体药物。

进一步优选地，R¹是氢。

进一步优选地，R²选自C₂-C₆的取代或未取代的烷基，其任选地被一个或多个选自下组的部分所间断：NH、NR³和O；C₂-C₆的取代或未取代的链烯基，其任选地被一个或多个选自下组的部分所间断：NH、NR³和O；C₂-C₆的取代或未取代的链烯基，其任选地被一个或多个选自下组的杂原子所间断：NH、NR³和O；C₂-C₆的取代或未取代的链烯基，其任选地被一个或多个选自下组的杂原子所间断：NH、NR³和O。

进一步优选地，R²选自

进一步优选地，R²不存在，L是未取代的C₁-C₁₂烷基。

还进一步优选地，R²不存在，L是未取代的C₆-C₁₂烷基。

进一步优选地，R²不存在，L是未取代的C₆烷基。

进一步优选地，R²不存在，L是未取代的C₇烷基。

进一步优选地，R²不存在，L是未取代的C₈烷基。

进一步优选地，R²不存在，L是未取代的C₉烷基。

进一步优选地，R²不存在，L是苄基。

进一步优选的本发明化合物是(3R，4R，5R，6S/6R)-5-(羟甲基)-6-正丁基-3，4-二羟基哌啶。

进一步优选的本发明化合物是(3R，4R，5R，6S/6R)-5-(羟甲基)-6-正己基-3，4-二羟基哌啶。

进一步优选的本发明化合物是(3R，4R，5R，6S/6R)-5-(羟甲基)-6-正庚基-3，4-二羟基哌啶。

进一步优选的本发明化合物是(3R，4R，5R，6S/6R)-5-(羟甲基)-6-正辛基-3，4-二羟基哌啶。

进一步优选的本发明化合物是(3R，4R，5R，6S/6R)-5-(羟甲基)-6-正壬基-3，4-二羟基哌啶。

进一步优选的本发明化合物是(3R，4R，5R，6S/6R)-5-(羟甲基)-6-苄基-3，4-二羟基哌啶。

式I化合物在本文中被总称为“HP衍生物”。

本发明的化合物包括式I的药学上可接受的盐和前体药物。构成本发明一部分的药学上可接受的盐包括从无机碱衍生的盐，例如Li、Na、K、Ca、Mg、Fe、Cu、Zn、Mn的盐；有机碱的盐，例如N，N’-二乙酰基乙二胺、葡糖胺、三乙胺、胆碱、氢氧化物、二环己基胺、甲福明、苄胺、三烷基胺、硫胺的盐；手性碱的盐，如烷基苯基胺、glycinol、苯基glycinol的盐；天然氨基酸的盐，例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、酪氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、组氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸的盐；非天然氨基酸如D-异构体或取代的氨基酸的盐；胍、取代的胍的盐，其中所述取代基选自硝基、氨基、烷基、链烯基、炔基；铵或取代的铵盐和铝盐。适当的话，盐可以包括酸加成盐，它们是硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、高氯酸盐、硼酸盐、氢卤酸盐、乙酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、棕榈酸盐(palmoate)、甲磺酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、苯磺酸盐、抗坏血酸盐、甘油磷酸盐、酮戊二酸盐。药学上可接受的溶剂合物可以是水合物或者包含其它结晶用溶剂例如醇。

前体药物是在体内转化为活性形式的化合物(例如参见R.B.Silverman，1992，″The Organic Chemistry of Drug Design and DrugAction″，Academic Press，第8章)。前体药物可以用于改变特定化合物的生物学分布(例如，使得产生通常不进入蛋白酶的反应性位点的化合物)或药动学。例如，羧酸基团可以被酯化，例如用甲基或乙基酯化，得到酯。当将酯给予受试者时，该酯以酶促或非酶促、还原、氧化或水解方式被裂解，露出阴离子基团。可以用可裂解的部分(例如，酰氧基甲酯)将阴离子基团酯化，从而得到一种中间体化合物，其随后分解产生活性化合物。

前体药物的实例和它们的应用是本领域熟知的(例如参见Berge等人(1977)″药用盐(Pharmaceutical Salts)″，J.Pharm.Sci.66：1-19)。前体药物可以在化合物的最后的分离和纯化期间原位制备，或者通过单独使纯化的化合物与适合的衍生剂反应加以制备。例如，可以通过在催化剂存在下用羧酸处理将羟基转化为酯。可裂解的醇前体药物部分的实例包括取代和未取代的、分支或无分支的低级烷基酯部分(例如乙酯)、低级链烯基酯、二-低级烷基-氨基低级烷基酯(例如二甲氨基乙酯)、酰氨基低级烷基酯、酰氧基低级烷基酯(例如新戊酰氧基甲酯)、芳基酯(例如苯酯)、芳基-低级烷基酯(例如苄酯)、取代(例如被甲基、卤代基或甲氧基取代基取代)的芳基和芳基-低级烷基酯、酰胺、低级烷基酰胺、二-低级烷基酰胺和羟基酰胺。

合成

另外，本发明描述了合成式I化合物的方法，其包括下列步骤：

a)在酸的存在下，使L-木糖与可氢化的保护基前体化合物反应，生成式II化合物：

其中P¹是可氢化的保护基；

b)在有机酸或无机催化剂的存在下，使式II化合物与缩醛、缩酮或环状硼酸酯(cycloborate)例如2-甲氧基丙烯或1，1-二甲氧基环己烷反应，生成式III化合物：

其中X，Y＝H、烷基、芳基、环烷基，或者可以经由C5-C6烷基连接；

c)在选自叔胺或吡啶的有机碱的存在下，使式III化合物与三氟甲磺酸酐反应，生成式IV化合物：

d)在冠醚的存在下，使式IV化合物与其中M选自Li、K和Na的MCN反应，生成式V化合物：

e)使式V化合物与式VI的有机金属试剂反应：

L-R²M²

其中R²和L如权利要求1中所述，M²选自MgBr、MgCl、Li、CuLi、ZnBr，然后与还原剂反应，生成式VII化合物：

f)将式VII化合物去保护和重排，然后环化和用氢化条件还原，该反应在路易斯酸或无机催化剂的存在下进行，生成式VIII化合物(式VIII代表L-R²取代基的R和S构型)：

g)任选地在还原剂例如三乙酰氧基硼氢化钠、氰基硼氢化钠、H₂/Pd/C或H₂/Pd(OH)₂/C的存在下，使式VIII化合物与羰基化合物例如醛或酮反应，或者与其中R¹如权利要求1中所述且X是离去基团的R¹X反应，生成式IX化合物：

本发明进一步描述了合成式I化合物的替代方法，其包括下列步骤：

a)在酰氯的存在下，使L-木糖与可氢化的保护基前体化合物反应，生成式II化合物：

其中P¹是可氢化的保护基；

b)在有机或无机酸的存在下，用缩醛、缩酮或环状硼酸酯例如2-甲氧基丙烯或1，1-二甲氧基环己烷保护式II化合物，生成式III化合物：

其中X，Y＝H、烷基、芳基、环烷基，或者可以经由C₅-C₆烷基连接；

c)在选自叔胺碱和吡啶的碱的存在下，使式III化合物与三氟甲磺酸酐反应，生成式IV化合物：

e)使式V化合物与式X化合物反应：

其中X选自Br和Cl；然后与还原剂反应，生成式XI化合物：

f)保护式XI化合物中的氨基，然后进行双键的臭氧分解、醛的保护和氢化，生成式XII化合物：

g)用乙酸水溶液将式XII的各个缩醛、缩酮或环状硼酸酯基团选择性地去保护，生成式XIII化合物：

h)用保护基例如4-甲氧基苄基进行N-和O-保护，生成式XIV化合物：

其中P²、P³、P⁴和P⁵是相同或不同的保护基；

i)在酸性条件例如HOAc、HCl、CF₃COOH下，水解式XIV化合物，生成式XV化合物：

j)使式XV化合物与还原剂例如硼氢化钠、氢化铝锂反应，然后将所得的醇转化为离去基团卤代基、OMs、OTf，生成式XVI化合物：

其中Lv是离去基团；

k)在还原条件下使式XV化合物与胺反应，或者使式XV化合物与维悌希试剂反应，或者使式XVI化合物与R⁶-Z反应，其中R⁶是选自下组的亲核部分：

任选地，然后用硝酸高铈铵(ceric ammonium nitrate)或Pd(OH)₂/C/H₂去保护，生成式XVII化合物(式XVII代表连接基团亲脂性部分的R和S构型)：

其中X选自O、NH、NHCOO、NHCONH、NHCSO、NHCSNH、CONH、NHCO、NR、S、CH₂、HC＝CH和C≡C。

本发明进一步描述了合成式XV化合物的方法：

任选存在的R¹和R²是短的柔性连接基团，其直链长度为约6至约12，优选约9。R¹和R²也可以独立地选自C₁-C₆的取代或未取代的：烷基、链烯基或炔基，其任选地被一个或多个选自下组的部分所间断：NH、NHCOO、NHCONH、NHCSO、NHCSNH、CONH、NHCO、NR³、O、S、S(O)_m和-S(O)_mNR³；C₁-C₆；m是1或2；另外，如果R²-L²或R¹-L¹不是氢，则R¹-L¹或R²-L²可以是氢；

L¹和L²是选自下组的亲脂性基团：C₁-C₁₂的取代或未取代的烷基、取代或未取代的链烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的环烯基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的杂芳基烷基；

R³每次出现独立地选自氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的链烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的环烯基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环基烷基、取代或未取代的杂芳基烷基、与C₁-C₆的取代或未取代的烷基连接的-C(O)；该方法包括下列步骤：

a)在极性非质子溶剂中，使其中P₁、P₂、P₃和P₄是O-保护基的式XX化合物

与N-碘琥珀酰亚胺反应，或者进行从式XXII中选择性除去3-碘基团的另外的反应，得到式XXI、XXII或XXIII化合物：

b)在钯催化剂例如Pd(PPh₃)₄的存在下，在极性非质子溶剂中，使式XXI、XXII或XXIII化合物与其中L是L¹或L²且R是R¹或R²的式XXIV或XXV化合物反应：

得到式XXVI化合物：

和

c)将O-保护基去保护，得到式XV：

治疗应用

本发明进一步提供了预防或治疗戈谢病的方法，该方法包括在需要这类治疗的受试者或患者中增加突变型GCase的表达或活性，或者增加或稳定重组野生型替代GCase的活性(即，ERT或基因疗法)。

根据本发明，“治疗有效量”也表示增强而不抑制GCase蛋白活性的HP衍生物的量，即，有效量的增强作用大于抑制作用，因此净效应是增强。这一般在细胞内低于该抑制剂对GCase的IC₅₀值，或者在培养基中低于约50μM。

增加GCase表达或活性的小分子类似物有利地与药学上可接受的载体一起被配制在药物组合物中。在这种情况下，HP衍生物是活性成分或治疗剂。

如下文所讨论的那样，活性成分的浓度或量取决于所需的剂量和给药方案。小分子类似物的适合的剂量范围可以包括约10μg/kg至约100mg/kg体重/天。

组合疗法

HP伴侣和蛋白质替代。除了本发明的HP衍生物以外，本发明的药物组合物还可以包含其它生物学活性化合物。例如，在一个实施方案中，在替代疗法的酶输注中，小分子可以与替代物、即野生型(或者功能性)重组GCase一起以溶液形式给药。蛋白质替代疗法通过以输注方式外源性引入野生型或生物学功能性蛋白质来增加蛋白质的量。这种疗法已被开发用于很多遗传障碍，包括戈谢病。野生型酶是从重组细胞表达系统(例如，哺乳动物细胞或昆虫细胞，参见美国专利：Desnick等人的5,580,757、Selden等人的6,395,884和6,458,574、Calhoun等人的6,461,609、Miyamura等人的6,210,666、Selden等人的6,083,725、Rasmussen等人的6,451,600、Rasmussen等人的5,236,838和Ginns等人的5,879,680)、人胎盘或动物乳(参见Reuser等人的美国专利No.6,188,045)纯化获得的。

输注后，预期外源性GCase通过非特异性或受体特异性机理被组织吸收。一般而言，吸收效率不高，并且外源性蛋白质的循环时间短。另外，外源性GCase是不稳定的，迅速发生细胞内降解。

因此，预期与用作酶伴侣的本发明的HP化合物共同给药将提高外源性给药的GCase的稳定性并防止其降解。

在另一个实施方案中，小分子类似物也可以与重组野生型或者功能性GCase蛋白联合给药，但是不必须在同一个组合物中。在该实施方案中，替代GCase蛋白和本发明的HP化合物被配制在分开的组合物中。HP衍生物和替代GCase可以按照相同途径给药，例如静脉内输注，或者按照不同途径给药，例如替代蛋白质为静脉内输注，HP化合物为口服给药。

HP衍生物和基因疗法。另外，本发明的HP组合物可以与编码野生型或者功能性GCase基因的重组载体联合给药，即与基因疗法联合使用。最近，重组基因疗法正在进行溶酶体贮积障碍的临床或临床前开发，例如参见关于针对法布里病的重组α-半乳糖苷酶A疗法的美国专利No.5,658,567；关于作为融合蛋白的生物学活性α-半乳糖苷酶A的克隆和表达的美国专利No.5,580,757；关于治疗溶酶体贮积疾病的组合物和方法的美国专利No.6,066,626；关于表达人α-半乳糖苷酶A蛋白的转染人细胞的美国专利No.6,083,725；关于使用重组腺-相关性病毒病毒体递送DNA至肌细胞以治疗溶酶体贮积疾病的方法的美国专利No.6,335,011；Bishop，D.F.等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA 1986；83：4859-4863；Medin，J.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996；93：7917-7922；Novo，F.J.，Gene Therapy1997；4：488-492，；Ohshima，T.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997；94：2540-2544；Sugimoto Y.等人，Human Gene Therapy 1995；6：905-915；Sly等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2002；99(9)：5760-2；Raben等人，Curr.Mol.Med 2002；2(2)：145-66；Eto等人，Curr.Mol.Med.2002；2(1)：83-9；Vogler等人，Pediatr.Dev.Pathol.2001；4(5)：421-33；Barranger等人，Expert Opin.Biol.Ther.2001；1(5)：857-67；Yew等人，Curr.Opin.Mol.Ther.2001；3(4)：399-406；Caillaud等人，Biomed.Pharmacother.2000；54(10)：505-12和Ioannu等人，J.Am.Soc.Nephrol.2000；11(8)：1542-7。

重要的是注意：除了使所表达的GCase酶稳定以外，HP衍生物也稳定和增强因阻止ER中的恰当折叠和加工的突变而产生缺陷的任何内源性突变型GCase的表达。

制剂和给药

根据本发明，本发明的药物组合物、例如HP衍生物可以被胃肠外、透粘膜例如口服(经口)、鼻、直肠或透皮引入。胃肠外途径包括静脉内、小动脉内、肌内、皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内给药。

关于与蛋白质替代的组合疗法，在其中HP衍生物与替代GCase酶在同一组合物中被给药的实施方案中，制剂优选地适合于胃肠外给药，包括静脉内、皮下和腹膜内给药，但是，也涵盖适合于其它给药途径例如口服、鼻内或透皮给药的制剂。

在一个实施方案中，透皮给药是通过脂质体实现的。脂质双层囊是封闭的、充满流体的微观球体，其主要由具有极性(亲水性)和非极性(亲脂性)部分的各个分子构成。亲水性部分可包括磷酸基、甘油磷酸基、羧基、磺基、氨基、羟基、胆碱或其它极性基团。亲脂性基团的实例有饱和或不饱和的烃，例如烷基、链烯基或其它脂质基团。也可以包括甾醇(例如胆甾醇)和其它药学上可接受的助剂(包括抗氧化剂，例如α-生育酚)，以提高囊的稳定性或者赋予其其它需要的特性。

脂质体是这些双层囊的子集，主要由含有两个由脂肪酸链组成的疏水性尾部的磷脂分子组成。在与水接触时，这些分子自发地排列形成球形双层膜，在各层中分子的亲脂性末端在膜中心结合，相对的极性末端形成双层膜的各内表面和外表面。因此，膜的每一侧均呈现亲水性表面，而膜的内部包含亲脂性介质。这些膜可以以与洋葱层不同的方式围绕内部水性空间排列成一系列被水薄层分隔开的同心的球形膜。施加剪切力时这些多层囊(MLV)可以被转化成单层囊(UV)。

适合于注射使用的药物制剂包括无菌水性溶液(若为水溶性的)或分散物和临时制备无菌可注射溶液或分散物的无菌粉末。在所有情况下，剂型必须是无菌的，并且必须是以容易注射的程度存在的流体。在制备和贮存条件下它必须是稳定的，并且必须被保护不受微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和聚乙二醇)、其适合的混合物和植物油。可以例如通过使用包衣如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持所需的粒径和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来防止微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚和山梨酸。在很多情况下，优选包含等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合中使用延迟吸收的物质例如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射组合物的延长吸收。根据本发明的方法使用脂质体递送神经酰胺和鞘磷脂类似物的优点是脂质体可穿过血脑屏障。由于2型和3型戈谢病是以由葡糖神经酰胺蓄积引起的神经变性为特征的，所以对于任何治疗而言，有效靶向于脑是很关键的。

无菌的可注射溶液是这样制备的，将所需量的纯化的GCase和HP衍生物掺入含有所需的上文列举的各种其它成分的适宜溶剂中，然后过滤或最终灭菌。一般而言，分散物是这样制备的，将各种灭菌的活性成分掺入无菌媒介物中，所述媒介物含有基本分散介质和来自上文所列举的那些成分中的所需的其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，通过该技术从前面无菌过滤的溶液可得到活性成分加任何另外所需成分的粉末。

优选地，制剂含有赋形剂。可以包括在制剂中的药学上可接受的赋形剂有缓冲剂，例如柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂和碳酸氢盐缓冲剂；氨基酸；脲；醇；抗坏血酸；磷脂；蛋白质，例如血清白蛋白、胶原和明胶；盐，例如EDTA或EGTA和氯化钠；脂质体；聚乙烯吡咯烷酮；糖，例如葡聚糖、甘露醇、山梨醇和甘油；丙二醇和聚乙二醇(例如PEG-4000、PEG-6000)；甘油；甘氨酸或其它氨基酸；和脂质。用于制剂的缓冲系统包括柠檬酸盐、乙酸盐、碳酸氢盐和磷酸盐缓冲剂。磷酸盐缓冲剂是优选的实施方案。

制剂还优选地含有非离子型洗涤剂。优选的非离子型洗涤剂包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Triton X-100、Triton X-114、Nonidet P-40、辛基α-葡糖苷、辛基β-葡糖苷、Brij 35、Pluronic和吐温20。

就GCase和HP的冷冻干燥制剂而言，酶浓度可以是0.1-10mg/mL。可以向冷冻干燥混合物中加入填充剂，例如甘氨酸、甘露醇、白蛋白和葡聚糖。另外，可以向冷冻干燥混合物中加入可能的冷冻保护剂，例如二糖、氨基酸和PEG。也可以加入上文所列举的任何缓冲剂、赋形剂和洗涤剂。

用于吸入给药的HP化合物制剂(含有或没有GCase)可以含有乳糖或其它赋形剂，或者可以是可含有聚氧乙烯-9-月桂基醚、甘氨胆酸盐或deoxycocholate的水溶液。一种优选的吸入气雾剂的特征是具有小质量密度和大尺寸的粒子。质量密度小于0.4克/立方厘米且平均直径超过5μm的粒子可将吸入的治疗剂有效递送入体循环中。这类粒子被深吸入肺，避开肺的天然清除机理，直至所吸入的粒子递送它们的治疗有效负荷量(Edwards等人，Science 1997；276：1868-1872)。本发明的替代蛋白质制剂可以以雾化形式给药，例如利用美国专利No.5,654,007、5,780,014和5,814,607所述的制备方法和制剂来进行给药，将这些文献各自引入本文作为参考。鼻内给药制剂可以包括以滴鼻剂形式给药的油性溶液或者鼻内应用的凝胶。

用于皮肤表面局部给药的制剂可以通过用皮肤病学可接受的载体例如洗剂、乳膏剂、软膏剂或肥皂(soap)分散组合物来制备。特别有用的是能够在皮肤上形成膜或层从而可以定位应用和抑制移开的载体。就内部组织表面的局部给药而言，可以将组合物分散在液体组织胶粘剂或已知可增强对组织表面的吸附的其它物质中。或者，可以使用组织包衣溶液，例如含有果胶的制剂。

在优选的实施方案中，本发明的制剂在位于可方便地将预定剂量的制剂进行给药的装置中的液体或粉末制剂中被供给；这类装置的实例包括用于皮下或肌内注射的无针头注射器和计量气雾剂递送装置。在其它情况中，制剂可以以适于缓释的形式被供给，如应用于皮肤用于透皮给药的贴剂或敷料，或者用于透粘膜给药的可侵蚀装置。在其中制剂、例如HP以片剂或胶囊形式被口服给药的情况中，制剂可以在具有活动盖的瓶中被供给或者可以以泡罩板的形式被供给。

在其中HP衍生物与GCase(或者包含GCase基因的载体)分开给药、作为单一疗法单独给药的实施方案中，化合物可以是适合于任何给药途径的形式，包括但不限于所有上述形式。或者，在一个优选的实施方案中，小分子类似物可以被配制成通过常规手段用药学上可接受的赋形剂制备的片剂或胶囊剂形式供口服给药，所述赋形剂例如粘合剂(例如预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)、填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)、润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅)、崩解剂(例如马铃薯淀粉或淀粉羟乙酸钠)或湿润剂(例如十二烷基硫酸钠)。片剂可以通过本领域熟知的方法进行包衣。

用于HP衍生物口服给药的液体制剂可以采取例如溶液、糖浆或混悬液的形式，或者它们可以以在使用前用水或其它适合的媒介物重构的干燥产品的形式存在。这类液体制剂可以通过常规手段用药学上可接受的添加剂制备，例如悬浮剂(例如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或可食用的氢化脂肪)、乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)、非水性媒介物(例如杏仁油、油性酯、乙醇或分馏植物油)和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)。制剂也可以酌情含有缓冲盐、矫味剂、着色剂和甜味剂。口服给药制剂可以被适当配制用以对活性化合物进行控释。

小分子类似物也可以被配制在直肠组合物中，例如栓剂或保留灌肠剂，它们例如含有常规栓剂基质如可可脂或其它甘油酯。

除上述制剂外，HP衍生物还可以被配制成贮库制剂。这类长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内植入)或肌内注射来进行给药。因此，例如，可以用适宜的聚合性或疏水性物质(如被制备成位于可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂来配制HP衍生物，或者可以将其制备为略溶的衍生物，例如略溶的盐。

时间安排。当替代GCase蛋白和HP衍生物处于分开的制剂中时，可以同时给药，或者HP衍生物可以在GCase替代蛋白之前或之后给药。例如，若替代蛋白质是静脉内给药，则HP衍生物可以在之后0小时至6小时期间给药。或者，HP衍生物可以在蛋白质之前0至6小时给药。

在一个优选的实施方案中，若HP衍生物和替代蛋白质分开给药，并且循环半衰期短(例如小分子)，则HP衍生物可以连续口服给药，例如每天给药，目的是维持恒定的循环水平。这类恒定的水平是已经确定对患者无毒性的并且在给药期间在与目标替代蛋白质的相互作用方面最佳以产生非抑制性治疗作用的水平。

在另一个实施方案中，HP衍生物在替代GCase蛋白翻转所需的时间段内被给药(这将被小分子类似物的给药所延长)。

不管时间安排如何，给药必须使GCase和HP衍生物的浓度使得小分子在体内使蛋白质稳定，但是不阻止或抑制其活性。这也适用于替代蛋白质和小分子在同一制剂中给药的情况。

关于HP衍生物和基因疗法组合治疗的时间安排，本发明小分子的给药一般在GCase基因的递送之后，以便重组酶被靶细胞/组织所表达。由于GCase基因的表达将持续一段时间，只要该基因可表达即可持续，所以HP衍生物作为重组酶的伴侣和稳定剂将保持有效。因此，对于基因表达期而言，伴侣分子的给药是必要的。

在一个优选的实施方案中，由于HP衍生物可能具有短的循环半衰期，所以优选的是将其频繁地口服给药，例如每天给药，目的是维持恒定的循环水平。这类恒定的水平是已经确定对患者无毒性的并且在给药期间在与目标替代蛋白质的相互作用方面最佳以产生非抑制性治疗作用的水平。

根据本发明，由于治疗性GCase基因补充内源性突变型GCase基因的不足活性，所以小分子类似物递送的时间安排变得不太重要，这是因为有效量能够增强内源性突变型GCase的活性以及增加治疗性GCase基因产物的有效性。

对于被给药的GCase基因所编码的GCase而言，存在小分子伴侣、例如本发明的HP衍生物的益处在于可提高在ER中进行合成期间蛋白加工的效率(即，通过防止聚集来提高效率)以及延长GCase在循环和组织中的半衰期，从而在更长的时间内维持有效水平。这将使得在临床上受影响的组织中的表达增加。这为戈谢病患者带来了一些有益作用如缓解作用增强、治疗频率降低和/或GCase基因给药量降低。这还将降低治疗费用。

剂量

本领域技术人员可以确定使所给药的GCase蛋白和/或内源性GCase突变型蛋白稳定的HP化合物的有效量。可以用本领域已知的普通方法获得替代GCase蛋白和小分子类似物的药动学和药效学数据，例如半衰期(t_1/2)、峰值血浆浓度(C_max)、达到峰值血浆浓度的时间(t_max)、用曲线下面积(AUC)测量的暴露量和组织分布，以及关于小分子类似物-替代GCase蛋白结合的数据(亲和常数、结合与离解常数和化合价)，以确定使替代GCase蛋白稳定但不抑制其活性、从而产生治疗作用所需的相容量。

通过标准药学工艺可以测定组合物的毒性和治疗功效，例如细胞培养物测定，或者使用实验动物测定LD₅₀和ED₅₀。参数LD₅₀和ED₅₀是本领域熟知的，分别表示对50％种群致死和对50％种群治疗有效的化合物剂量。毒性与治疗作用之间的剂量比被称为治疗指数，可以表示为LD₅₀/ED₅₀之比。

治疗有效剂量可以首先从细胞培养物测定中进行估算，并在动物模型中公式化，以达到包括IC₅₀的循环浓度范围。化合物的IC₅₀浓度是达到症状的半数最大抑制的浓度(例如从细胞培养物测定中确定)。然后使用这类信息可以更精确地确定用在特定个体、例如人类患者中的适合剂量。

可以通过诸如高效液相色谱法(HPLC)或气相色谱法等技术在个体例如患者中按照常规方法测定血浆中的化合物。

任何治疗中所用的特定剂量可以根据一些因素如所用的特定剂型、给药途径、个体(例如，患者)的状况等在该范围内变化。

根据目前的方法，替代GCase蛋白的浓度在0.05-5.0mg/kg体重之间，通常每周或每两周给药一次。蛋白质的给药剂量可以为0.1μg/kg至约10mg/kg，优选约0.1mg/kg至约2mg/kg。在患者的一生中必须定期重复给予所述蛋白质。皮下注射可以使药物与身体的接触时间更长。GCase优选被静脉内给药，例如静脉内快速浓注、缓慢静脉内推注或者连续静脉内注射。连续静脉内输注(例如，2-6小时的连续静脉内输注)使得可以在血液中维持特定的水平。

可以根据在不会妨碍GCase蛋白活性的情况下在组织或循环中体内稳定重组GCase蛋白所需的量、小分子类似物在组织或循环中的生物利用度以及小分子类似物在组织或循环中的代谢来确定HP衍生物的最佳浓度。例如，可以通过计算C-壬基-HP对GCase的IC₅₀值来确定C-壬基-HP的浓度。考虑所述化合物的生物利用度和代谢，然后，可以根据对GCase活性的影响来对IC₅₀值周围或者略高于IC₅₀值的浓度进行评估，例如，对增加GCase活性或者延长替代GCase活性所需的小分子类似物的量进行评估。

实施例

实施例1：6-烷基-羟基哌啶的合成

a.苄基α-L(+)-吡喃木糖苷

将L(-)-木糖(5.0g，33.3mmol)与25ml苄醇合并，用1ml乙酰氯处理。将所得混合物升温至50℃，搅拌24小时。冷却至室温后，加入80ml叔丁基甲基醚，将混合物在5℃下保持24小时。收集所生成的晶体，用冰冷的叔丁基醚洗涤，得到标题化合物，为α-端基异构体。

m.p.120℃.¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：87.40-7.28(m，5H)，4.93(d，1H，J＝4.8Hz)，4.71(d，1H，J＝3.6Hz)，4.82-4.78(m，2H)，4.65(d，1H，J＝12.4Hz)，4.44(d，1H，J＝12Hz)，3.47-3.38(m，2H)，3.36-3.27(m，3H)，3.25-3.21(m，1H).MS：258[M+NH₄ ⁺].

b.苄基2，3-亚异丙基-L-吡喃木糖苷

将苄基α-L-吡喃木糖苷(15g，62.5mmol)、2-甲氧基丙烯(15ml，156.6mmol)与对-甲苯磺酸一水合物(300mg，1.6mmol)的混合物溶于无水THF，在0℃下搅拌1.5小时。加入三乙胺(1ml)，继续搅拌10分钟。将反应混合物用乙酸乙酯(400ml)稀释，用饱和NaCl水溶液、冰水洗涤，将有机层经Na₂SO₄干燥。过滤后，用旋转蒸发器浓缩溶液，将粗产物用快速色谱柱纯化，用庚烷/EtOAc(4∶1)洗脱。分离标题化合物，为无色糖浆状物。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ7.27-7.20(m，5H)，5.10(d，1H，J＝2.4Hz)，4.70(d，1H，J＝12Hz)，4.53(d，J＝12Hz)，3.92-3.88(m，2H)，3.65(dd，1H，J＝4.8Hz和11.6Hz)，3.38-3.36(m，1H)，3.27(t，1H，J＝9.6Hz)，1.38(s，3H)，1.35(s，3H).MS(ES+)：281[M+1].

c.苄基4-氰基-4-脱氧-2，3-O-亚异丙基-L-吡喃木糖苷

将苄基2，3-亚异丙基-L-吡喃木糖苷(4g，14.3mmol)和吡啶(3.8ml)溶于50ml CH₂Cl₂，进行搅拌并冷却至-78℃。缓慢加入三氟甲磺酸酐(3.2ml，19mmol)，将反应混合物搅拌1.5小时，然后升温至0℃达另外2小时。加入EtOAc(500ml)，将有机溶液依次用饱和NaCl水溶液和冰水洗涤。将有机相干燥(Na₂SO₄)，蒸发。经过快速色谱处理，使用CH₂Cl₂作为洗脱剂，得到所需三氟甲磺酸酯。MS(ES+)：413[M+1]。将上述三氟甲磺酸酯(5.3g，12.9mmol)、KCN(9g，138mmol)、18-冠醚-6(4g)和4A分子筛(10g)合并，并在300ml干燥DMF中、在环境温度下搅拌16小时。加入EtOAc(400ml)，将溶液依次用饱和NaCl水溶液和H₂O洗涤。将有机相干燥(Na₂SO₄)，蒸发。经过快速色谱处理(CH₂Cl₂)，得到标题化合物，为淡黄色糖浆状物。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ7.28-7.22(m，5H)，5.28(d，1H，J＝3Hz)，4.69(d，1H，J＝12Hz)，4.59(d，1H，J＝12Hz)，4.04(dd，1H，J＝4.8Hz和9.6Hz)，3.87-3.80(m，2H)，3.70(dd，1H，J＝3Hz和12Hz)，3.23-3.21(m，1H)，1.42(s，6H).MS(ES+)：290[M+1]，307[M+NH₄ ⁺].

d.苄基4-(1-氨基戊基)-4-脱氧-2，3-亚异丙基-L-吡喃木糖苷

将苄基4-氰基-4-脱氧-2，3-O-亚异丙基-L-吡喃木糖苷(65mg，0.225mmol)溶于1ml无水乙醚，在室温下搅拌。缓慢加入丁基氯化镁(0.225ml，2M的乙醚溶液)，将反应混合物搅拌14小时。加入LiAlH₄(25mg)，将反应混合物在环境温度下搅拌另外5小时。加入水(5ml)和NaOH(1N，5ml)，将混合物搅拌30分钟。将混合物转移至分液漏斗，用叔丁基甲基醚萃取(2×20ml)。将有机相干燥，用旋转蒸发器蒸发。将残余物经色谱法纯化(CH₂Cl₂，然后CH₂Cl₂/MeOH/Et₃N 200∶20∶1)，得到标题化合物，为黄色糖浆状物。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ7.35-7.29(m，5H)，5.13(d，1H，J＝2.4Hz)，4.69(d，1H，J＝12Hz)，4.51(d，1H，J＝12Hz)，4.06(t，1H，J＝10.4Hz)，3.65(dd，1H，J＝4.8Hz和11.6Hz)，3.63-3.55(m，2H)，3.40(dd，1H，J＝2.8和9.6Hz)，2.96-2.90(m，1H)，1.36(s，3H)，1.35(s，3H)，1.20-1.10(m，6H)，0.82(t，3H，J＝6.8Hz).MS(ES+)：350[M+1].

e.苄基4-(1-氨基癸基)-4-脱氧-2，3-亚异丙基-L-吡喃木糖苷

按照与实施例1d所述相似的方式，使n-C₉H₁₉MgBr与苄基4-氰基-4-脱氧-2，3-O-亚异丙基-L-吡喃木糖苷反应，得到标题化合物。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ7.35-7.29(m，5H)，5.24(d，1H，J＝2.8Hz)，4.74(d，1H，J＝12Hz)，4.61(d，1H，J＝12Hz)，4.31(dd，1H，J＝5.2Hz和10.4Hz)，3.80(dd，1H，J＝3.2Hz和9.6Hz)，3.71-3.64(m，2H)，3.43-3.40(m，1H)，2.41-2.38(m，1H)，1.47(s，3H)，1.45(s，3H)，1.29-1.20(m，16H)，0.87(t，3H，J＝6.4Hz).MS(ES+)：420[M+1].

f.苄基-4-(1-氨基辛基)-4-脱氧-2，3-亚异丙基-L-吡喃木糖苷

按照与实施例1d所述相似的方式，使n-C₇H₁₅MgBr与苄基4-氰基-4-脱氧-2，3-O-亚异丙基-L-吡喃木糖苷反应，得到标题化合物。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ7.20-7.31(m，5H)，5.19(d，1H，J＝2.0Hz)，4.69(d，1H，J＝7.5Hz)，4.56(d，1H，J＝7.75Hz)，4.26(dd，1H，J＝3.0Hz和6.5Hz)，3.79(dd，1H，J＝2.0Hz和6.25Hz)，3.65-3.58(m，2H)，3.24-3.20(m，1H)，2.22-2.15(m，1H)，1.40(s，6H)，1.23-1.15(m，12H)，0.9(t，3H，J＝6.4Hz)；MS(ES+)：329[M+1].

g.苄基-4-(1-氨基庚基)-4-脱氧-2，3-亚异丙基-L-吡喃木糖苷

按照与实施例1d所述相似的方式，使n-C₆H₁₃MgBr与苄基4-氰基-4-脱氧-2，3-O-亚异丙基-L-吡喃木糖苷反应，得到标题化合物。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ7.30-7.20(m，5H)，4.85(d，1H，J＝11.2Hz)，4.65(d，1H，J＝1.6Hz)，4.55(d，1H，J＝11.2Hz)，4.30(t，1H，J＝3.6)，4.09(dd，1H，J＝4.8Hz和11.6Hz)，3.94(dd，1H，J＝2.4Hz和12.8Hz)，3.86(dd，1H，J＝1.6Hz和4.0Hz)，3.75(m，1H)，2.71-2.80(m，1H)，1.40-1.21(m，16H)，0.83(t，3H，J＝6.4Hz).MS(ES+)：378[M+1].

h.苄基-4-(1-氨基壬基)-4-脱氧-2，3-亚异丙基-L-吡喃木糖苷

按照与实施例1d所述相似的方式，使n-C₈H₁₇MgBr与苄基4-氰基-4-脱氧-2，3-O-亚异丙基-L-吡喃木糖苷反应，得到标题化合物。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ7.30-7.20m，5H)，5.20(d，1H，J＝2.0Hz)，4.70(d，1H，J＝8.0Hz)，4.50(d，1H，J-8.0Hz)，4.25(dd，1H，J＝4.0Hz和8.0Hz)，3.74(dd，1H，J＝3.1Hz和9.3Hz)，3.65-3.50(m，2H)，3.25-3.15(m，1H)，2.20-2.10(m，1H)，1.40(s，6H)，1.25-1.15(m，14H)，0.80(t，3H，J＝6.3Hz)；MS(ES+)：406[M+1].

i.苄基-4-(1-氨基-2-苯基乙基)-4-脱氧-2，3-亚异丙基-L-吡喃木糖苷

按照与实施例1d所述相似的方式，使PhCH₂MgCl与苄基4-氰基-4-脱氧-2，3-O-亚异丙基-L-吡喃木糖苷反应，得到标题化合物。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ7.38-7.26(m，10H)，5.24(d，1H，J＝2.8Hz)，4.78(d，1H，J＝13.7Hz)，4.64(d，1H，J＝13.3Hz)，4.34(dd，1H，J＝5.6Hz和11.6Hz)，3.88(m，2H)，3.75(dd，1H，J＝3.3Hz和14.3Hz)，3.55-3.46(m，1H)，3.09(dd，1H，J＝3.0Hz和14.3Hz)，2.41(dd，1H，J＝11.3Hz和14.4Hz)，2.21(m，1H)，2.13(s，2H)，1.45(s，3H)，1.40(s，3H)；MS(ES+)：384[M+1].

j.(3R，4R，5R，6S)-5-(羟甲基)-6-正丁基-3，4-二羟基哌啶

将苄基4-(1-氨基戊基)-4-脱氧-2，3-亚异丙基-L-吡喃木糖苷(27mg)溶于2ml甲醇，搅拌。加入Pd(OH)₂(22mg，20wt％在炭上)，然后加入1滴浓HCl(浓的，1滴)。将混合物在H2气氛下迅速搅拌24小时。将反应混合物通过硅藻土过滤，用旋转蒸发器浓缩滤液。将粗产物经色谱法用AmberliteCG-50离子交换树脂(NH₄ ⁺型)纯化，用0.1N NH₄OH水溶液洗脱，得到标题化合物。

¹H NMR(400MHz，D₂O)：3.91(d，1H，J＝11.6Hz)，3.79(d，1H，J＝12Hz)，3.50-3.43(m，2H)，3.11(dd，1H，J＝2.8和10.5Hz)，2.61(t，1H，9.6Hz)，2.41(t，1H，J＝10Hz)，1.73-1.71(m，1H)，1.43-1.21(m，6H)，0.90(t，3H，J＝6.4Hz).MS(ES+)：204[M+1].

k.(3R，4R，5R，6S)-5-(羟甲基)-6-正庚基-3，4-二羟基哌啶

按照与实施例1j所述相似的方式，将苄基4-(1-氨基辛基)-4-脱氧-2，3-亚异丙基-L-吡喃木糖苷转化为标题化合物。

¹H NMR(400MHz，CD₃OD)：δ3.96(dd，1H，J＝1.5Hz和7.3Hz)，3.63(dd，1H，J＝1.8Hz和7.3Hz)，3.45-3.10(m，2H)，3.35-3.20(m，2H)，3.00-2.95(m，1H)，2.65(t，1H，J＝14.8Hz)，1.90-1.81(m，1H)，1.60-1.25(m，14H)，0.90(t，3H，J＝6.5Hz)；MS(ES+)：246[M+1].

l.(3R，4R，5R，6S)-5-(羟甲基)-6-正己基-3，4-二羟基哌啶

按照与实施例1j所述相似的方式，将苄基4-(1-氨基庚基)-4-脱氧-2，3-亚异丙基-L-吡喃木糖苷转化为标题化合物。

¹H NMR(300MHz，CD₃OD)：δ3.95(dd，1H，J＝2.4Hz和11.4Hz)，3.68(dd，1H，J＝3.0Hz和11.4Hz)，3.49-3.43(m，2H)，3.16(dd，1H，J＝4.2Hz和12Hz)，2.83-2.76(m，1H)，2.51(dd，1H，J＝10.8Hz和12.7Hz)，1.79-1.75(m，1H)，1.46-1.26(m，10H)，0.90(t，3H，J＝6.6Hz)；MS(ES+)：232[M+1]，254[M+Na].

m.(3R，4R，5R，6S)-5-(羟甲基)-6-正辛基-3，4-二羟基哌啶

按照与实施例1j所述相似的方式，将苄基4-(1-氨基壬基)-4-脱氧-2，3-亚异丙基-L-吡喃木糖苷转化为标题化合物。

¹H NMR(400MHz，CD₃OD)：δ4.11(dd，1H，J＝1.3Hz和7.3Hz)，3.79-3.69(m，2H)，3.62(t，1H，J＝12.0Hz)，3.43(dd，1H，J＝3.3Hz和7.8Hz)，3.36-3.31(m，1H)，2.88(t，1H，J＝15.0Hz)，2.06-1.98(m，1H)，1.74-1.7-(m，1H)，1.45-1.40(m，14H)，0.99(t，3H，J＝8.5Hz)；MS(ES+)：260[M+1].

n.(3R，4R，5R，6S)-5-(羟甲基)-6-苄基-3，4-二羟基哌啶

按照与实施例1j所述相似的方式，将苄基4-(1-氨基-2-苯基乙基)-4-脱氧-2，3-亚异丙基-L-吡喃木糖苷转化为标题化合物。

¹H NMR(400MHz，CD₃OD)：δ7.42-7.31(m，5H)，4.12(dd，1H，J＝1.3Hz和7.5Hz)，3.88(dd，1H，J＝2.0Hz和7.3Hz)，3.73-3.66(m，1H)，3.58-3.53(m，2H)，3.49(dd，1H，J＝2.3Hz和9.3Hz)，3.26(dd，1H，J＝2.5Hz和13.5Hz)，2.79(dd，1H，J＝5.3Hz和10.0Hz)，2.68(t，1H，J＝15.0Hz)，1.68(m，1H)；MS(ES+)：238[M+1].

o.(3R，4R，5R，6S)-5-(羟甲基)-6-正壬基-3，4-二羟基哌啶

将苄基4-(1-氨基癸基)-4-脱氧-2，3-O-亚异丙基-α-L-吡喃木糖苷(55mg)溶于THF(2ml)，在大气压下用20％ Pd(OH)₂/C(52mg)氢化21小时。将反应混合物过滤，浓缩，得到亚异丙基保护的产物(31mg)，为淡黄色糖浆状物。将糖浆状物(13mg)用1N HCl(2ml)处理过夜。在真空下除去溶剂，将残余物用C-18柱通过固相萃取纯化。将残余物从水(0.5ml)中冻干，得到标题化合物，为白色泡沫状物。

¹H NMR(400MHz，CD₃OD)：δ3.94(dd，1H，J＝2.1Hz和11.4Hz)，3.60(dd，1H，J＝2.8Hz和11.4Hz)，3.58-3.51(m，1H)，3.45(t，1H，J＝9Hz)，3.26(dd，1H，J＝4.8Hz和12.4Hz)，3.22-3.14(m，1H)，2.71(t，1H，J＝11.6Hz)，1.88-1.81(m，1H)，1.47-1.22(m，16H)，0.82(t，3H，J＝6.4Hz).MS(ES+)：274[M+1].

实施例2：使用连接基团策略的6-烷基-羟基哌啶的合成

a.苄基4-(1-氨基丁-3-烯基)-4-脱氧-2，3-亚异丙基-L-吡喃木糖苷

将苄基4-氰基-4-脱氧-2，3-O-亚异丙基-L(-)-吡喃木糖苷(1.67g，5.79mmol)溶于40ml无水乙醚，在室温下搅拌。滴加烯丙基溴化镁(23ml，1M的乙醚溶液)，将反应混合物搅拌5小时。加入NaBH₄(1.75g)，将反应混合物在环境温度下搅拌过夜。用冰浴冷却，滴加甲醇(10ml)和水(10ml)，将混合物搅拌30分钟。加入叔丁基甲基醚(100ml)，滤出固体。将滤液转移至分液漏斗，用水洗涤(2×20ml)。将有机相干燥，用旋转蒸发器蒸发。将残余物通过色谱法纯化(CH₂Cl₂/EtOAc 10∶1，然后CH₂Cl₂/MeOH 15∶1)，得到标题化合物(0.674g，35％)，为淡黄色糖浆状物。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ7.37-7.26(m，5H)，5.84-5.77(m，1H)，5.24(d，1H，J＝3.3Hz)，5.14-5.08(m，2H)，4.75(d，1H，J＝12Hz)，4.60(d，1H，J＝12Hz)，4.30(dd，1H，J＝4.8Hz和10.2Hz)，3.86(dd，1H，J＝3.3Hz；和9.9Hz)，3.76-3.65(m，2H)，3.36-3.29(m，1H)，2.49-2.41(m，1H)，2.11-1.89(m，2H)，1.45(s，6H).MS(ES+)：334[M+1].

b.(3R，4R，5R，6S)-6-[(1，3-二氧戊环-2-基)甲基]-5-(羟甲基)-3，4-亚异丙二氧基哌啶

将苄基4-(1-氨基丁-3-烯基)-4-脱氧-2，3-亚异丙基-L-吡喃木糖苷用氯甲酸苄酯处理，然后进行末端烯烃的臭氧分解，生成醛。将醛与乙二醇缩合，得到1，3-二氧戊环。进一步氢化，生成标题化合物。

c.2-[(2S，3R，4R，5R)-1-苄基-4，5-双(苄氧基)-3-(苄氧基甲基)哌啶-2-基]乙醛

将(3R，4R，5R，6S)-6-[(1，3-二氧戊环-2-基)甲基]-5-(羟甲基)-3，4-亚异丙二氧基哌啶用乙酸水溶液处理，以选择性裂解丙酮化物。用苄基溴处理后，生成完全苄基保护的产物。可以用三氟乙酸进一步裂解1，3-二氧戊环，得到标题化合物。

d.(3R，4R，5R，6S)-1-6-[2-(己基氨基)乙基]-5-(羟甲基)哌啶-3，4-二醇

使2-[(2S，3R，4R，5R)-1-苄基-4，5-双(苄氧基)-3-(苄氧基甲基)哌啶-2-基]乙醛与己胺在NaBH₃CN存在下反应，然后催化氢化以除去苄基，得到标题化合物。

实施例3：6-壬基HP对GCase的抑制活性

方法。用4-甲基umbelliferyl β-葡糖苷(终浓度为3mM)为底物在反应缓冲液中测定酶活性，所述反应缓冲液由位于McIlvaine缓冲液(0.1M柠檬酸盐和0.2M磷酸盐缓冲液)中的0.25％牛磺胆酸钠、0.1％ Triton X-100组成，pH 5.2。分别以所示终浓度向每个反应混合物中加入化合物。与稀释的人GCase一起在37℃下温育30分钟后，通过加入0.2M pH 10.8的甘氨酸缓冲液终止反应，用荧光计分别在355nm的激发波长和460nm的发射波长下测定所释放的4-甲基繖形酮。计算相对酶活性，为无抑制剂反应的酶活性的百分比。用Prism S形图计算IC₅₀。

结果。测定HP的6-烷基衍生物对人GCase的抑制活性，并将其总结在表1中。IFG和N-壬基DNJ是已知的有力的GCase抑制剂，IC₅₀值分别为大约50nM和2.5μM(Fan等人，US1；Sawkar等人，Proc Natl Acad SciUSA.，99：15428-33)，对其进行了确认(关于结构，请参见图1)。用丁基或壬基链修饰亚氨基会部分减少抑制活性(IC₅₀值为44μM或更大)，这表明该位置上的正电荷是高效力所需的。向羟基哌啶环的6-C位加入丁基，即6-C-丁基羟基哌啶(11)，不影响对GCase的效力。但是，6-C-己基羟基哌啶(12)显著比IFG更有效力，导致大约13倍的增加。进一步延长碳链的长度会相应地提高效力(化合物13-15)。显然，就我们所知，6-壬基羟基哌啶(15)是最好的人GCase抑制剂，IC₅₀值为0.4nM(图2)。这证明在相当于葡萄糖端基异构碳的位置上的正电荷和从葡萄糖环氧位置延伸的亲脂性部分在GCase的抑制作用中扮演重要角色。由于DNJ的N-烷基衍生物的短烷基链(C＝1-4)没有提高GCase抑制活性，所以预期该位置上的具有连接基团的亲脂性部分(相当于直链长度为大约6个或更多个碳)对额外的抑制活性效力而言是必需的。

表1：对GCase的抑制活性

Entry	抑制剂	IC₅₀(nM)^a	Ki(nM)
Entry	抑制剂	IC₅₀(nM)^a	Ki(nM)	11	羟基哌啶6-C-丁基羟基哌啶	56160	25

12131415

6-C-己基羟基哌啶6-C-庚基羟基哌啶6-C-辛基羟基哌啶6-C-壬基羟基哌啶N-丁基羟基哌啶N-壬基羟基哌啶N-丁基1-脱氧野尻霉素N-壬基1-脱氧野尻霉素

4.21.80.80.444,000＞100,000270,0001,800

^a所有抑制活性都是用4-甲基umbelliferyl β-葡糖苷在3mM浓度下测定的。

人GCase的X-射线结构显示一个疏水性残基环围绕着活性位点的入口(Dvir等人，EMBO reports 2003；4：1-6)。这也印证了本发现，即，具有短的柔性链的亲脂性部分能够与催化性袋入口处的疏水性氨基酸残基相互作用，并且对抑制活性有贡献。

尽管向HP中加入较短的烷基链、例如6-丁基HP与HP(或IFG)相比未获得额外的效力，但是，它们仍然是有力的GCase抑制剂。

实施例4：6-壬基HP对戈谢细胞中GCase的伴侣活性

方法。在5％ CO₂下、于37℃下，在补充有10％胎牛血清和抗生素的DMEM培养基中培养具有N370S/N370S突变的从戈谢病患者建立的成纤维细胞。在测定之前，将C-壬基HP或IFG以所示终浓度加入培养基中达4天。用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞后，收获细胞，在位于McIlvaine缓冲液中的0.25％(w/v)牛磺胆酸钠和0.1％(v/v)Triton X-100(pH 5.2，反应缓冲液)存在下匀化，使用10μl细胞溶解产物进行残余酶活性测定。在37℃下、在反应缓冲液中，用3mM 4-MU-β-Glc测定GCase活性达1小时，如同平行测定中的康杜醇B环氧化物(CBE)-敏感性活性一样，所述测定用1.25mM CBE在室温下进行或不进行30分钟预温育。用来自Pierce的微量BCA蛋白质测定试剂盒测定细胞溶解产物中的蛋白质浓度。

结果。为了检查新化合物从ER降解中挽救突变型酶活性的能力，将上述GCase抑制剂6-壬基HP和IFG以不同浓度加入具有纯合N370S突变的从戈谢病患者建立的成纤维细胞培养基中。显示与抑制剂一起培养的患者细胞中的残余酶活性增加大约2倍，但是每个化合物的最佳浓度因其抑制活性的效力不同而异(图5)。6-壬基HP在大约3nM下具有最低的最佳伴侣活性浓度，而发现IFG的最佳浓度是30μM。已经证明，最佳伴侣活性浓度取决于抑制活性的效力和生物利用度(Fan等人，TrendsPharmacol Sci.2003；24：355-60)。C-壬基HP的最高抑制活性与良好渗透性的组合可能对以较低最佳浓度作为戈谢病中的GCase活性伴侣有贡献。

具有较短链、即小于6个碳的HP的6-烷基衍生物不如具有较长链的HP的6-烷基衍生物那么有效力，但是它们保持了与母体化合物、即HP或IFG相当的效力。这些具有较短6-烷基链的化合物可能是比母体化合物更好的ASSC，因为它们是更加亲脂水性的，与母体化合物相比，这可增加它们的生物利用度和生物可及性(bioaccessibility)。

Claims

1.式I化合物：

其中

A是碳或氮；

B是氢、羟基、N-乙酰胺或卤素；

R¹是氢；取代或未取代的：烷基、链烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、芳基烷基、杂芳基、杂环基、杂环基烷基或杂芳基烷基；-C(O)R³或-S(O)_mR³；

R²是任选的短的柔性连接基团，其直链长度为约6至约12；

R³是氢，或者取代或未取代的：烷基、链烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、芳基烷基、杂芳基、杂环基、杂环基烷基或杂芳基烷基；

m是1或2；

R⁵是氢、羟基或羟甲基；

L是具有1-12个碳原子的亲脂性基团，其包括取代或未取代的：烷基、链烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、芳基烷基、杂芳基、杂环基、杂环烷基或杂芳基烷基；

以及其药学上可接受的盐和前体药物。

2.权利要求1的化合物，其中R²选自C₁-C₆的取代或未取代的：烷基、链烯基或炔基，其任选地被一个或多个选自下组的部分所间断：NH、NHCOO、NHCONH、NHCSO、NHCSNH、CONH、NHCO、NR³、O、S、S(O)_m和-S(O)_mNR³；其中m和R³如上文所定义。

3.权利要求1或2的化合物，其中R¹是氢。

4.权利要求1或2的化合物，其中B是氢。

5.权利要求1或2的化合物，其中R⁵是羟甲基。

6.权利要求3的化合物，其中R²选自C₂-C₆的取代或未取代的：烷基、链烯基或炔基，其任选地被一个或多个选自下组的部分所间断：NH、NHCOO、NHCONH、NHCSO、NHCSNH、CONH、NHCO、NR³和O。

7.权利要求1-6中任意一项的化合物，其中R²选自：

8.权利要求6的化合物，其中R²不存在，L是未取代的C₁-C₁₂烷基。

9.权利要求8的化合物，其中R²不存在，L是未取代的C₄-C₁₂烷基。

10.权利要求1的化合物，其中该化合物是(3R，4R，5R，6S)-5-(羟甲基)-6-正丁基-3，4-二羟基哌啶。

11.权利要求1的化合物，其中该化合物是(3R，4R，5R，6S)-5-(羟甲基)-6-正己基-3，4-二羟基哌啶。

12.权利要求1的化合物，其中该化合物是(3R，4R，5R，6S)-5-(羟甲基)-6-正庚基-3，4-二羟基哌啶。

13.权利要求1的化合物，其中该化合物是(3R，4R，5R，6S)-5-(羟甲基)-6-正辛基-3，4-二羟基哌啶。

14.权利要求1的化合物，其中该化合物是(3R，4R，5R，6S)-5-(羟甲基)-6-正壬基-3，4-二羟基哌啶。

15.权利要求1的化合物，其中该化合物是(3R，4R，5R，6S)-5-(羟甲基)-6-苄基-3，4-二羟基哌啶。

16.合成权利要求2的化合物的方法，其包括下列步骤：

a)在酸的存在下，使L-木糖与可氢化的保护基前体反应，生成式II化合物：

其中P¹是可氢化的保护基；

b)在有机酸的存在下，使式II化合物与缩醛、缩酮或环状硼酸酯反应，生成式III化合物：

其中X和Y＝H、烷基、芳基、环烷基，或者可以经由C₅-C₆烷基部分连接；

c)在选自叔胺碱或吡啶的碱的存在下，使式III化合物与三氟甲磺酸酐反应，生成式IV化合物：

e)使式V化合物与式VI的有机金属试剂反应：

L-R²M² (VI)

其中R²和L如前所述，M²选自MgBr、MgCl、Li、CuLi、ZnBr，然后与还原剂反应，生成式VII化合物：

f)将式VII化合物去保护，然后环化和用氢化条件还原，该反应在酸水溶液的存在下进行，生成式VIII化合物：

和

g)任选地，在还原剂例如氰基硼氢化钠、H₂/Pd/C或H₂/Pd(OH)₂/C的存在下，使式VIII化合物与羰基化合物反应，或者与其中R¹如权利要求1中所定义且X是离去基团的R¹X反应，生成式IX化合物：

17.权利要求16的方法，其中所述的可氢化的前体是苄醇，P¹是苄基。

18.权利要求16的方法，其中所述的有机酸是对-甲苯磺酸一水合物。

19.权利要求16的方法，其中步骤(b)中所述的缩醛、缩酮或环状硼酸酯是2-甲氧基丙烯。

20.权利要求16的方法，其中步骤(c)中所述的碱是吡啶。

21.权利要求16的方法，其中所述的M是K，所述的冠醚是18-冠醚-6。

22.权利要求16的方法，其中M²是MgBr或Li，L-R²是未取代的C₄-C₁₂烷基。

23.权利要求22的方法，其中L-R²是C₄烷基。

24.权利要求22的方法，其中L-R²是C₆烷基。

25.权利要求22的方法，其中L-R²是C₇烷基。

26.权利要求22的方法，其中L-R²是C₈烷基。

27.权利要求22的方法，其中L-R²是C₉烷基。

28.权利要求22的方法，其中L-R²是苄基。

29.权利要求16的方法，其中所述的还原剂是LiAlH₄或NaBH₄。

30.权利要求16的方法，其中所述的氢化条件是在Pd(OH)₂/C存在下的氢。

31.合成权利要求1的化合物的方法，其包括下列步骤：

其中P¹是可氢化的保护基；

b)在有机或无机酸的存在下，用缩醛、缩酮或环状硼酸酯保护式II化合物，生成式III化合物：

e)使式V化合物与式X化合物反应：

其中X选自Br和Cl；然后与还原剂反应，生成式XI化合物：

g)用乙酸水溶液将式XII的各缩醛、缩酮或环状硼酸酯基团选择性地去保护，生成式XIII化合物：

h)用保护基进行N-和O-保护，生成式XIV化合物：

其中P²、P³、P⁴和P⁵是相同或不同的保护基；

其中Lv是离去基团；和

k)在还原条件下使式XV化合物与胺反应，或者使式XV化合物与维悌希试剂反应，或者使式XVI化合物与下式XVI的化合物反应，

R⁶-Z (XVI)

其中R⁶是选自下组的亲核部分：

任选地，然后用硝酸高铈铵或Pd(OH)₂/C/H₂去保护，生成式XVII化合物(式XVII代表连接基团亲脂性部分的R和S构型)：

32.权利要求31的方法，其中步骤b)中的缩醛、缩酮或环状硼酸酯是2-甲氧基丙烯或1，1-二甲氧基环己烷。

33.权利要求31的方法，其中步骤h)中的N-或O-保护基是4-甲氧基苄基。

34.用抑制量的权利要求2所述的化合物体外抑制葡糖脑苷脂酶的方法。

35.抑制哺乳动物细胞中葡糖脑苷脂酶的方法，其包括使细胞与抑制量的权利要求2所述的化合物接触。

36.在哺乳动物细胞中增强葡糖脑苷脂酶活性的方法，其包括使细胞与增强葡糖脑苷脂酶活性有效量的权利要求2所述的化合物接触，其中所述的有效量不抑制葡糖脑苷脂酶活性。

37.使葡糖脑苷脂酶稳定的方法，其包括使葡糖脑苷脂酶与稳定葡糖脑苷脂酶有效量的权利要求2所述的化合物接触，其中化合物可逆性地与葡糖脑苷脂酶结合。

38.药物组合物，其包含权利要求2所述的化合物和药学上可接受的载体。

39.抑制β-葡糖苷酶的方法，其包括使β-葡糖苷酶与抑制β-葡糖苷酶有效量的权利要求2所述的化合物接触。

40.权利要求34-39中任意一项的方法，其中化合物可逆性地与β-葡糖苷酶结合。

41.权利要求34-39中任意一项的方法，其中化合物是(3R，4R，5R，6S)-5-(羟甲基)-6-正丁基-3，4-二羟基哌啶。

42.权利要求34-39中任意一项的方法，其中化合物是(3R，4R，5R，6S)-5-(羟甲基)-6-正己基-3，4-二羟基哌啶。

43.权利要求34-39中任意一项的方法，其中化合物是(3R，4R，5R，6S)-5-(羟甲基)-6-正庚基-3，4-二羟基哌啶。

44.权利要求34-39中任意一项的方法，其中化合物是(3R，4R，5R，6S)-5-(羟甲基)-6-正辛基-3，4-二羟基哌啶。

45.权利要求34-39中任意一项的方法，其中化合物是(3R，4R，5R，6S)-5-(羟甲基)-6-正壬基-3，4-二羟基哌啶。

46.治疗戈谢病的方法，其包括对需要这类治疗的个体给予增强葡糖脑苷脂酶活性有效量的权利要求2所述的药物组分。

47.权利要求71的方法，其中该治疗进一步包括对所述个体给予功能性葡糖脑苷脂酶。

48.权利要求71的方法，其中该治疗进一步包括对所述个体给予包含功能性葡糖脑苷脂酶基因的载体。

49.式XVIII化合物：

其中

A代表碳或氮；

B选自氢、羟基、N-乙酰氨基和卤素；

X含有正电荷；

R²是发源于A的短的柔性连接基团；

R⁵是氢、羟基或羟甲基；且

L是与R²连接的亲脂性部分。

50.羟基哌啶衍生物，其具有短的柔性连接基团，其在相当于吡喃糖环端基异构位的位置上具有正电荷，具有与该连接基团连接的亲脂性部分；和这类衍生物的药学上可接受的盐。