CN1899339B - 一种治疗急、慢性结膜炎的眼用药物组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种治疗急、慢性结膜炎的眼用药物组合物，具体地，它是由中药野菊花Chrysanthemum indicum L.的提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的眼用制剂，本发明还提供了该药物组合物的制备方法。本发明眼用药物组合物，药物来源广泛，疗效确切，质量稳定可控，副作用小，有效提取成分不易产生耐药性。

Description

一种治疗急、慢性结膜炎的眼用药物组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种治疗急、慢性结膜炎的眼用药物组合物及其制备方法，具体地，是以中药材野菊花为原料制备而成的眼用药物组合物及其制备方法，属药物领域。

背景技术

结膜炎是眼科的多发病，占结膜病的首位。其病因不外乎微生物性与非微生物性两大类。就微生物性而言，细菌、病毒、寄生虫等均可引起结膜炎症，而且来源甚为广泛，可直接来自外界，也可来自自身，而自身感染又可能通过血流或淋巴液转移至结膜(结核等)；或由邻近组织，如眼球本身(角膜、巩膜)、眼眶、鼻腔与副鼻窦、泪器、周围的眼睑皮肤直接蔓延而来。就非微生物病因而言，机械的、物理的(热、放射、电)、化学的、以至全身过敏状态和一些全身代谢性障碍(如风湿、痛风)皆可成为致病因素。总之，结膜炎的病因极其复杂，因此，一般通行的结膜炎临床分类也是多种多样的，有的从病因上分类(如过敏性结膜炎)，有的则以临床表现分类，按起病急缓、病程长短又可有急、慢性之分。不同病因有时可有同样的临床表现(如各种病因都可造成慢性卡他性结膜炎)，或同一病因有时又可引起不同的临床症状(如溶血性金黄色葡萄球菌感染时，可表现为急性卡他性结膜炎或假膜性结膜炎)，由于上述诸多原因，这就决定结膜炎的临床表现常常是多种多样、错综复杂的。本病属于中医“红眼”、“火眼”、“天行赤眼”、“目中赤痛”等范畴。

目前治疗结膜炎的药物主要为抗菌药，然而抗菌药的副作用很大，如氯霉素会造成再生障碍性贫血和灰婴综合症；红霉素有很强烈的胃肠道反应等。并且长期使用易产生耐药性。

野菊花是菊科植物野菊Chrysnathemum indicum的干燥头状花序或全草。味苦、性微寒、归肺、肝经。具有清热解毒之功效，主治痈疽疖疔、瘰疬、眼痛等症。药理研究：对金黄色葡萄球菌、结核菌及卡介菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌均有明显的抑菌作用，水剂对大鼠静脉注入，对ADP诱导的血小板聚集有明显的抑制作用。临床作用：对高脂血症、急性支气管炎、颈淋巴结核、流行性腮腺炎、口腔溃疡、菌痢、肠炎、前列腺炎、盆腔炎、肛窦炎、肛乳头炎等均有良好疗效。(见：刘国应，野菊花的药理研究及临床应用进展，山东中医杂志，1990，9(6)；刘国立，野菊花的药理研究及临床应用概况，时珍国药研究，1991，2(3))目前，野菊花为原料的制剂有口服制剂，野菊花注射液，具有解表解毒。用于外感热病、目赤肿痛、器喉疼痛；上呼吸道感染、急性扁桃体炎属热毒上攻者。沈丽珍，菊花在眼科的临床应用，中国中医眼科杂志，2001，11(2)，报道了菊花(白菊、黄菊、野菊)，治疗外眼热性疾病，如急、慢性结膜炎，其中野菊花多针对各种化学伤、热烧伤等热毒壅盛之疾病，但由于原料成分复杂，不同的药材提取方法可能产生不同的药效。虽然野菊花注射剂亦有报道用于眼科疾病，但注射剂与滴眼液的质量要求不同，附加剂的选择不同，针对眼用环境的特殊性，不能将注射剂直接用于滴眼液，目前尚无野菊花为原料制备眼用制剂的报道，亦没有形成相关的产品的报道。

发明内容

本发明的解决方案是提供了一种治疗急、慢性结膜炎的眼用药物组合物，本发明的另一技术方案是提供了该药物组合物的制备方法。

本发明提供了一种治疗急、慢性结膜炎的眼用药物组合物它是由中药野菊花Chrysanthemum indicum L.的提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的眼用制剂，其中，每制剂单位中含总黄酮以芦丁C₂₇H₃₀O₁₆计不低于0.2mg；每制剂单位含野菊花以蒙花苷C₂₈H₃₂O₁₄计，不低于0.05mg；每制剂单位含绿原酸C₁₆H₁₈O₉应不低于10μg。

由于通过试验证明，芦丁、蒙花苷、绿原酸均可作为本发明野菊花滴眼液的质量控制指标，对三种成分中的一种或任意两种或三种同时测定，均能确保有效的控制药物制剂质量，保证临床用药安全有效的目的。

进一步地，每制剂单位中含总黄酮以芦丁C₂₇H₃₀O₁₆计应为0.2～15.0mg；每制剂单位含野菊花以蒙花苷C₂₈H₃₂O₁₄计应为0.05～10.0mg；每制剂单位含绿原酸C₁₆H₁₈O₉应为10～400μg。所述的每制剂单位是指液体制剂的每ml；固体制剂的每g。

其中，所述的野菊花提取物是由如下方法提取：将野菊花加水，二次蒸馏，收集重蒸馏液；药渣加水煎煮，50％～90％乙醇精制，回收乙醇，与重蒸馏液混合，即为野菊花提取物。

所述的制剂是：液体制剂、半固体制剂。

进一步地，其中，所述的半固体制剂是：眼膏剂、眼用膜剂、眼用凝胶剂；所述的液体制剂为：滴眼液、缓释滴眼液、眼用即型凝胶剂。

所述的滴眼液是由下述重量配比的原料及辅料制备而成：

野菊花1500～500份、渗透压调节剂0-10份、抑菌剂0-8份、黏度调整剂0-50份、增溶剂0.2-20份、稳定剂0-30份、助溶剂0-50份。

其中，所述的渗透压调节剂为氯化钠、硼酸、硼砂、甘油中的一种或混合；所述的助增溶剂：为聚氧乙烯40硬脂酸酯、司盘20或40吐温80、吐温20、聚氧乙烯40硬脂酸酯、司盘20或40中的一种或混合；所述的pH调节剂为氢氧化钠或钾溶液、枸橼酸钠溶液、磷酸盐缓冲液、硼酸、硼砂、氯化钾、醋酸、盐酸溶液中的一种或混合；所述的抑菌剂为苯扎氯铵、苯扎溴铵、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、硝酸苯汞、氧氩化汞、三氯叔丁醇、苯乙醇、洗必泰中的一种或混合；所述的黏度调整剂为羟丙甲纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、卡波姆中的一种或混合；所述的稳定剂为焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、硫代次亚硫酸钠、抗坏血酸、维生素C、乙二氨四乙酸二钠、甘油中的一种或混合。

进一步地，所述的滴眼液每1000ml是由下述配比的原料药材及辅料制备而成：

野菊花500～1500g、吐温802～10ml、硼酸4～12g、苯扎氯铵0.01～0.5g余量为注射用水，适量氢氧化钠调pH值。

更进一步地，所述的滴眼液每1000ml是由下述配比的原料药材及辅料制备而成：

野菊花1000g、吐温80 5ml、硼酸8g、苯扎氯铵0.05g，余量为注射用水。

其中，所述的液体制剂的pH值为6.0～7.5，进一步优选地，pH值为7.0～7.4。

本发明还提供了该眼用药物组合物的制备方法，它包括如下步骤：

a、取药材野菊花Chrysanthemum indicum L.的干燥头状花序或全草，加水浸泡、用水蒸气蒸馏法经蒸馏、重蒸馏，收集重蒸馏液，备用；收集药渣中的提取液，滤过，备用，剩余药渣进行下一步操作；

b、将a步骤的药渣加水煎煮，过滤，与a步骤中滤液合并，浓缩，加乙醇使含醇量为50％～90％，静置，过滤，回收乙醇，再浓缩，加乙醇使含醇量为50％～90％，静置，如此反复醇沉2-3次，过滤，滤液备用；

c、取b步中滤液，减压回收乙醇并浓缩至无醇味，加注射用水，冷藏，滤过，滤液加入0.3％活性炭吸附，滤过；

d、将a步骤的重蒸馏液与c步骤的滤液混合，加入药学上可接受的眼用制剂的辅料或辅助性成分制备而成的药学上常用的眼用制剂。

本发明眼用药物组合物，药物来源广泛，疗效确切，且通过多种指标成分控制制剂的质量，稳定可控，副作用小，有效提取成分不易产生耐药性，且通过药效学试验证明，采用本发明原料提取方法制备而成的眼用制剂比原普通注射剂在相同的原料用量下，药效明显优于原注射剂，满足眼用制剂的质量要求，为临床提供了治疗急、慢性结膜炎的药物新选择。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

实施例1本发明药物滴眼液的制备

一、原料：野菊花1000g、吐温80 5ml、硼酸8g、苯扎氯铵0.05g、20％氢氧化钠适量配制1000ml

二、制备工艺

1、取野菊花1000g，加10量水浸泡1小时，水蒸汽蒸馏，收集初馏液1000ml，再重蒸馏，收集重蒸馏液500ml，备用；

2、收集药渣中的煎煮液，滤过，药渣加8量水，煎煮二次，每次1小时，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为1.20～1.24(40～70℃)的清膏，加乙醇使含醇量达65％，冷藏，静置16小时；

3、滤过，减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.18～2.22(40～70℃)的清膏，放冷，加乙醇使含醇量达85％，搅匀，冷藏放置16小时。滤过，滤液回收乙醇并浓缩至无醇味，加注射用水至500ml，冷藏12小时，滤过，滤液加热至80～90℃，加入0.3％活性炭，搅拌均匀，保持80～90℃30分钟；

4、滤过，滤液用0.45μm精滤，加入吐温后加热至沸，冷至室温，加入重蒸馏液500ml，混匀，加入其余附加剂，用20％氢氧化钠调节PH至7.0～7.4，加注射用水至1000ml，0.22μm滤过，无菌灌装，即得。

上述制备工艺中，辅料的选择和pH值的范围是本发明制备方法的关键因素。

实验例2本发明药物滴眼液的制备

a、取药材野菊花Chrysanthemum indicum L.的全草1000g，加水浸泡、用水蒸气蒸馏法经蒸馏、重蒸馏，收集重蒸馏液，备用；收集药渣中的提取液，滤过，备用，剩余药渣进行下一步操作；

b、将a步骤的药渣加水煎煮，过滤，与a步中滤液合并，浓缩，加乙醇使含醇量为50％，静置，过滤，回收乙醇，再浓缩，加乙醇使含醇量为50％，静置，如此反复醇沉3次，过滤，滤液备用；

c、取b步中滤液，减压回收乙醇并浓缩至无醇味，加注射用水至500ml，冷藏12小时，滤过，滤液加入0.3％活性炭吸附，滤过；

加入吐温80 10ml、苯扎氯铵0.5g、20％氢氧化钠适量、硼酸12g，制备成滴眼液。

实验例3本发明药物滴眼液的制备

a、取药材野菊花1000g，加水浸泡、用水蒸气蒸馏法经蒸馏、重蒸馏，收集重蒸馏液，备用；收集药渣中的提取液，滤过，备用，剩余药渣进行下一步操作；

b、将a步骤的药渣加水煎煮，过滤，与a步骤中滤液合并，浓缩，加乙醇使含醇量为90％，静置，过滤，回收乙醇，再浓缩，加乙醇使含醇量为90％，静置，如此反复醇沉2次，过滤，滤液备用；

c、取b步中滤液，减压回收乙醇并浓缩至无醇味，加注射用水至500ml，冷藏12小时，滤过，滤液加入0.3％活性炭吸附，滤过；混合蒸馏液及滤液，加入吐温802ml、苯扎氯铵0.01g、20％氢氧化钠适量、硼酸4g，制备成滴眼液。

实验例4本发明药物滴眼液的制备

制备工艺同实施例1，只是用量有变化：野菊花1000g、吐温80 6ml、20％氢氧化钠适量、硼酸6g。

实验例5本发明药物滴眼液的制备

制备工艺同实施例1，只是用量有变化：野菊花1000～800g、吐温80 5ml、甘油7ml、20％氢氧化钠适量、硼酸8g。

实验例6本发明药物滴眼液的制备

制备工艺同实施例1，只是用量和辅料有变化：野菊花1000g、吐温20 7ml、十二烷基硫酸钠6ml、磷酸适量、硼酸7g。

实验例7本发明药物滴眼液的制备

制备工艺同实施例1，只是用量和辅料有变化：野菊花1200～800g、十二烷基硫酸钠4ml、甘油9ml、20％氢氧化钠适量、氯化钠7g、杜灭芬0.8ml。

实验例8本发明药物缓释滴眼液的制备

制备工艺同实施例1，只是用量和辅料有变化：野菊花1000g、卡波姆2.2g、羟丙甲基纤维素15.0g、磷酸氢二钠2.5g、磷酸二氢钠5.0g、氯化钠5.0g、尼泊金乙酯0.3g、1M氢氧化钠适量。

实验例9本发明药物缓释滴眼液的制备

制备工艺同实施例1，只是用量和辅料有变化：野菊花1000g；卡波姆5g、羟丙甲基纤维素10g、磷酸氢二钠2.5g、磷酸二氢钠2.5g、氯化钠3.0g、尼泊金乙酯0.3g、1M氢氧化钠适量。

实验例10本发明药物眼用凝胶的制备

制备工艺同实施例1，只是用量和辅料有变化：野菊花1000g；玻璃酸钠5.2g、羟丙甲基纤维素10g、硼酸2.5g、氯化钠3.0g、尼泊金乙酯0.3g、1M氢氧化钠适量；苯乙醇1.5ml。

实验例11本发明药物眼用凝胶的制备

制备工艺同实施例1，只是用量和辅料有变化：野菊花1000g；玻璃酸钠5.2g、羟丙甲基纤维素10g、卡波姆3.5g；硼酸2.5g、氯化钠3.0g、尼泊金乙酯0.6g。

实验例12本发明药物眼用制剂中附加剂选择的实验依据

附加剂的筛选依据：

1、助溶辅料的选择

本发明滴眼液含挥发油，在水中溶解度小。为防止挥发油析出，参照野菊花注射剂原工艺进行了预试，选用0.5％聚山梨酯80增加挥发油的溶解度，增加制剂的稳定性。试验结果表明，其增溶效果较好。

2、pH调整剂的选择

pH值对滴眼液有重要的影响。pH值的确定不仅与人体生理特性有关，还与原料、辅料的理化性质，制剂的稳定性、安全性均关系。人体正常泪液的pH值为7.4，当pH值为6～8时无不舒适感受。确定滴眼液的pH值，主要从药物的溶解度、稳定性、刺激性等方面考虑。野菊花重蒸馏液的pH值常为4.0左右，必须添加适量碱性pH调节剂。常用的碱性pH调节剂有氢氧化钠(钾)溶液、枸橼酸钠溶液、磷酸盐缓冲液等。考虑到本发明滴眼液中含黄酮类成分，用氢氧化钠溶液调节pH可增加其溶解度，并参照野菊花注射剂原工艺，选用20％氢氧化钠溶液作为本发明滴眼液的pH调节剂，并对pH调节范围进行了选择。而硼酸水溶液有pH缓冲，增加主药溶解度，调节渗透压等作用。又有抑制细菌和霉菌作用，增加本发明药物的疗效和稳定性。故选用1％硼酸为本发明滴眼液和pH调节剂和稳定剂，并用氢氧化钠调节pH值至规定值，以增加黄酮类成分的溶解度。

试验方法，按以上制备工艺制备，加入0.5％聚山梨酯80后加热至沸，冷至室温，加入重蒸馏液，混匀，再加入1％硼酸，用20％氢氧化钠调节pH值至规定值，室温放置20天，分别在调节前、调节后、放置后考察pH值、性状、绿原酸和总黄酮含量，结果见表1。

表1、野菊花滴眼液pH值调节前后变化结果表

由上表可知，pH调节后，贮藏过程中pH值均有所下降，但不同的pH值对野菊花滴眼液的稳定性影响较大，贮藏过程中指标成分和有效成分均有所下降，因调pH值至7.0～7.5时下降较小，6.0～6.5时药液澄明度较差，总黄酮含量下降也较多，结合稳定性和刺激性等方面进行考虑，选择调pH值至7.0～7.5较适宜。

3、抑菌剂的选择

滴眼液是多剂量制剂，原则上需要加入抑菌剂。考虑到本发明滴眼液所含有效成分本身具有良好的抑菌效果，同时对常用的抑菌剂进行初步筛选，尼泊金类抑菌剂与本发明滴眼液中聚山梨酯80有配伍禁忌，山梨酸不稳定易氧化，而硫柳汞等则考虑其毒性较大。故选用0.1％苯扎氯铵为本发明滴眼液的抑菌剂，并对其抑菌效果进行了考察。

试验方法：按以上工艺制备野菊花滴眼液300ml，0.22μm微孔滤膜滤过；各取100ml，加入不同比例的苯扎氯铵，使溶解，0.22μm微孔滤膜滤过，装入输液瓶中，不加盖，溶液暴露于空气中两小时后，封好瓶盖，振摇0.5小时后，按照《中国药典》2000版一部附录XIIIC微生物限度检查法检查细菌数、霉菌、酵母菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌。实验结果见表2。

表2抑菌剂考察

结论：本滴眼液加0.005％的苯扎氯铵后的抑菌效果能够达到要求。为了减小滴眼液的刺激性，故选择苯扎氯铵的用量为0.005％。

4、黏度调整剂的选择

适当增加滴眼液的黏度，可使药物在眼内停留时间延长，有利于增强药物的疗效，同时黏度增加后亦可减少刺激性。照黏度测定法(《中国药典》2000年版二部附录VI G)第二法对滴眼液黏度进行测定，结果为23mPa·s。综合考虑，本发明滴眼液具有较为合适的黏度，又因本发明滴眼液对高温不稳定，故需要滤过除菌，而加入黏度调整剂后过滤较困难，所以可不加增黏剂。

5、渗透压调整剂的选择

滴眼剂的渗透压应与人的泪液(正常泪液的渗透压值为290mOsm·L)等渗。人眼通常可耐受的渗透压范围相当于0.8％～1.2％的氯化钠溶液，低于或高于此浓度均会产生不适感。

试验方法：按制备工艺制成药液，测定渗透压。试验结果见表3。

表3渗透压考察

结论：经测定0.8％～1.2％氯化钠溶液的渗透压为235～393mOsM，可见本发明滴眼液的渗透压在人正常的耐受范围内，不需加渗透压调节剂。

实施例本发明药物辅料最佳配比筛选试验

一、野菊花滴眼液(三个不同辅料处方)对家兔多次给药的眼刺激性试验

1、目的：观察家兔眼睛多次(2天)接触野菊花滴眼液(三个不同辅料处方)后的刺激反应，筛选最佳辅料配比。

2、试验材料

2.1药物

(1)野菊花滴眼液A，5mL/支，药物浓度为1g生药/mL(每mL相当于含野菊花原生药材1g，处方为：实施例1中野菊花1000g、吐温80 5ml、硼酸8g、苯扎氯铵0.05g、20％氢氧化钠适量，制备成滴眼液)

(2)野菊花滴眼液B，5mL/支，药物浓度为1g生药/mL(每mL相当于含野菊花原生药材1g，处方为：实施例2中吐温80 10ml、苯扎氯铵0.5g、20％氢氧化钠适量、硼酸12g，制备成滴眼液)

(3)野菊花滴眼液C，5mL/支，药物浓度为1g生药/mL(每mL相当于含野菊花原生药材1g，处方为：实施例3中吐温80 2ml、苯扎氯铵0.01g、20％氢氧化钠适量、硼酸4g，制备成滴眼液)以上野菊花滴眼液A、B、C均由成都三明药物研究所提供，由实施例1、2、3制备。

(4)氯化钠注射液：四川美大康佳乐药业有限公司，批号：04101131。

2.2动物

家兔，一级，体重2.1～2.5kg，雌雄兼用。由四川省实验动物专委会养殖场提供，动物合格证号：川实动管质2004-14。

2.3实验动物设施条件

壹级。设施合格证：四川省实验动物管理委员会实验动物设施条件合格证明书：川实动管使第2001-7号。

2.4实验场地

成都中医药大学国家中医药管理局三级中药药理实验室，证书登记编号：TCM-03-043。将动物放在实验动物饲养观察室内给药和观察。室内温度控制在18～22℃。

2.5试验方法

(1)分组

选择角膜、虹膜和结膜均正常无病变的家兔18只。采用同体自身对照方法。于家兔右眼滴入野菊花滴眼液，0.1mL/眼/次，7次/天；以家兔左眼滴入氯化钠注射液0.1mL/眼/次，7次/天作对比观察。将野菊花滴眼液和氯化钠注射液分别滴入家兔两侧眼结膜囊内，每次滴药后使家兔眼睛被动闭合10秒钟，以便使药物充分接触眼睛各部位(角膜、虹膜、球结膜、睑结膜)，每2小时一次，连续给药2天，观察野菊花滴眼液A、B、C三组不同辅料配比对家兔的眼刺激。

(2)观察检查指标

眼刺激反应程度：每天给药7次，每2小时给药1次，分别于每次给药前按眼刺激评分标准综合评分，即在每天药前以及每次给药后1h用放大镜检查双眼并分别记录眼刺激反应程度。连续两日观察双眼并记录眼刺激反应程度。

眼刺激反应程度评分标准及评价标准分别按表4、5进行：

表5眼刺激性评价标准

2.6试验结果

野菊花滴眼液多次用药对家兔眼睛的刺激性程度。结果见表6。

从表6可见，用野菊花滴眼液A、B、C对家兔右眼每天多次(7次/天)滴眼，连续应用2天，分别与家兔左眼滴入氯化钠注射液后比较观察，在用药的第1天5至11小时，可见野菊花滴眼液对部分家兔眼睛有极其轻微的刺激性反应，其刺激性强度为0.17～0.83分，其中以野菊花滴眼液C刺激性最低，A刺激性居中。B刺激性最高；但是按照药物对眼刺激性评分标准判定，其刺激性强度均在0～3.9分之内，属于“无刺激性”。通过以上试验可以看出，野菊花滴眼液A、B、C多次应用对眼睛均无刺激性，但是从辅料的选择方面看，野菊花滴眼液C的辅料刺激最小，A次之。

二、稳定性试验：

将实施例1、2、3的样品分装于输液瓶中，分别于60℃放置10天，放置前后对样品进行考察，以考察药物的稳定性，试验结果见表7、8、9。

表7实施例1放置10天后稳定性实验数据

表8实施例2放置10天后稳定性实验数据

表9实施例3放置10天后稳定性实验数据

通过实验数据表明，以上辅料配比不同的三种野菊花滴眼液其澄明度、PH值、含量均符合规定。实施例1和2制剂放置10天后澄明度、PH值、含量无明显变化，实施例3的PH值变化较大，故实施例1和实施例2的辅料配比较好。

将所述两类试验综合分析，野菊花滴眼液A以及B最为稳定，综合刺激以及稳定性的考虑，故选择野菊花滴眼液A的辅料配比为最佳配比。

上述附加剂的选择可知，本发明药物附加剂虽然是常规用眼用制剂辅料，但并非筛单的组合，附加剂的选择和使用决定了原料提取物的性质，因此，经过创造性的筛选、分析、比较，选择的附加剂及其用量均是不可预知的，并非所有常规附加剂均适合本发明滴眼液，附加剂的选择有效的保证的本发明药物的质量。

实施例12本发明药物的质量控制方法

总黄酮照紫外-可见分光光度法(中国药典2005版一部附录VA)测定。

对照品溶液的制备精密称取在120℃干燥至恒重的芦丁对照品20mg，置100ml量瓶中，加70％乙醇70ml，置水浴上微热使溶解，放冷，加70％乙醇至刻度，摇匀，即得(每1ml中含无水芦丁0.2mg)。

标准曲线的制备精密量取对照品溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml，分别置25ml量瓶中，加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟；以相应的溶液为空白。照紫外-可见分光光度法(中国药典2005版一部附录VA)，在500nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线。

测定法精密吸取本发明滴眼液(实施例1-11制备)5ml，置25ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密吸取1ml，置25ml量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加水至6ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的重量，计算，即得。

本发明滴眼液每1ml含总黄酮以芦丁(C₂₇H₃₀O₁₆)计，不得少于2.0mg。

蒙花苷照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定。

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇∶水∶冰醋酸(26∶23∶1)为流动相；检测波长为327nm。理论塔板数按蒙花苷峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备取经五氧化二磷减压(50℃)干燥至恒重的蒙花苷对照品适量，加甲醇使溶解(必要时加热)，制成每1ml含35μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备精密量取本发明滴眼液1ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本发明滴眼液每1ml含野菊花以蒙花苷(C₂₈H₃₂O₁₄)计，应不得少于0.55mg。

绿原酸照高效液相色谱法(《中国药典》2000年版一部附录VI D)测定。

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.4％磷酸溶液(10∶90)为流动相；检测波长为327nm。理论塔板数按绿原酸峰计算应不低于2500。

对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品适量，置棕色容量瓶中，加50％甲醇制成每1ml含30μg的溶液，即得(10℃以下保存)。

供试品溶液的制备取本发明滴眼液2g，精密称定。加甲醇40ml回流提取3次，每次1小时，合并提取液，减压浓缩至适量，转移至25ml量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，滤过。取续滤液作为供试品溶液。

测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪，测定，即得。

本发明滴眼液含绿原酸(C₁₆H₁₈O₉)应不得少于0.02％。

野菊花中成分复杂，主要含有总黄酮和绿原酸、蒙花苷，由于绿原酸不稳定，仅以绿原酸为质量控制指标不能有效达到质量控制的目的。且由于野菊花作为眼部用药，不能明确其中有效成分，仅仅能通过可控指标进行质量控制。通过选择三类成分进行控制，通过控制其中一种或两种或三种成分同时控制，既达到质量控制的目的，保证制剂稳定，其用量的多少又直接反映了药物的药效。

以下通过药效学试验证明本发明的有益效果。

试验例1野菊花滴眼液急性毒性试验

1、试验材料

1.1受试药物

野菊花滴眼液(200％，为制剂中最大等渗浓度)，5mL/支，药物浓度为2g生药/mL(每mL相当于含野菊花原生药材2g，测定结果显示：每制剂单位中含总黄酮以芦丁C₂₇H₃₀O₁₆计为15.0mg，每制剂单位含蒙花苷C₂₈H₃₂O₁₄为10.0mg；每制剂单位含绿原酸C₁₆H₁₈O₉为400μg)，由成都三明药物研究所提供，按实施例1的方法制备，批号：040704。功能主治：清热解毒，清肝明目，用于外感风热所致的暴风客热、赤丝虬脉，症见白睛红赤或有少许赤丝、瘙痒不适、异物感、久视易疲劳，急、慢性卡他性结膜炎见于上述症候者。用法用量：外用。滴眼，每次1～2滴，一日3～5次。

1.2动物

家兔，红眼，白毛，一级，体重1.7～2.1kg，雌雄兼用。由四川省实验动物专委会养殖场提供，动物合格证号：川实动管质2004-14。

1.3实验动物设施条件

壹级。设施合格证：四川省实验动物管理委员会实验动物设施条件合格证明书：川实动管使第2001-7号。

1.4实验场地

成都中医药大学国家中医药管理局三级中药药理实验室，证书登记编号：TCM-03-043。将动物放在实验动物饲养观察室内饲养和给药。室内温度控制在18～22℃。

2、试验方法^[1，2]

取家兔12只，雌雄各半。按体重均匀分为2组，即正常对照组和野菊花滴眼液组，在1日内分8次对家兔滴眼给予野菊花滴眼液(2g生药/mL，每次0.05ml/眼/只，双眼给药，每1小时1次)，总剂量达0.8g生药/kg体重。给药后常规饲养和观察7天。

3、试验结果

(1)外观症状观察：家兔在各次给野菊花滴眼液后无萎靡症状，呼吸、饮食、毛发正常，粪便正常，无腹泻，眼球粘膜未见病变。7天内无明显中毒症状，动物无死亡。

(2)对家兔的体重增长的影响：结果见表10

表10野菊花滴眼液对急性毒性试验家兔体重的影响(体重：x±s，kg)

注：与正常对照组比较，*P＜0.05

从表10可见，在1日内分8次对家兔给野菊花滴眼液较大浓度(容量)，7天内家兔体重增加均匀，和正常对照组相比较无明显差异(P＞0.05)。表明野菊花滴眼液较大剂量被吸收进入机体血液循环后，对全身的急性毒性极低，可见在1日内分8次对家兔滴眼给予野菊花滴眼液最大等渗浓度(每制剂单位中含总黄酮以芦丁C₁₆H₁₈O₉为15.0mg，检验测定每制剂单位含野菊花以蒙花苷C₁₆H₁₈O₉计为10.0mg；每制剂单位含绿原酸C₁₆H₁₈O₉为400μg)，总剂量达0.8g生药/kg体重。7天内家兔未出现明显中毒症状，家兔无死亡，体重增加均匀，和正常对照组相比较无显著差异(P＞0.05)，表明即使野菊花滴眼液较大剂量被吸收进入机体血液循环后，对全身的急性毒性反应亦极低，应用安全，故制剂上限定为每制剂单位中含总黄酮以芦丁C₁₆H₁₈O₉计应为15.0mg，每制剂单位含野菊花以蒙花苷C₁₆H₁₈O₉计应为10.0mg；每制剂单位含绿原酸C₁₆H₁₈O₉应为400μg 。

试验例2野菊花眼液的体外抗病毒作用

1、实验材料

1.1药物：

(1)野菊花滴眼液1：规格：5mL/支，药物浓度为1g生药/mL(每制剂单位中含总黄酮以芦丁C₁₆H₁₈O₉计为10mg；每制剂单位含野菊花以蒙花苷C₁₆H₁₈O₉计为8mg；每制剂单位含绿原酸C₁₆H₁₈O₉为200μg)。功能主治：清热，解毒，明目。用于急慢性卡他性结膜炎。批号：040401，按实施例1方法制备。

(2)野菊花注射液：棕黄色液体，药物浓度为1g生药/ml(每1ml相当于野菊花1g)，批号040301，由雅安三九药业有限公司生产。

(3)阿昔洛韦滴眼液：本品为无色的澄明液体。适应症：抗病毒药。国药准字H42021090，批号200304292，由武汉五景药业有限公司生产。

(4)空白组(基质组)：蒸馏水.

1.2病毒株：腺病毒(AdV)3型、AdV 4型、AdV 7型、AdV 8型及单纯疱疹病毒(HSV)1型，分别由首都儿研所和四川省人民医院病毒室临床分离提供。

1.3细胞株：Hep-2细胞：汕头市永恒辉生物工程有限公司出品。

1.4生化试剂：Eagles液及小牛血清，由日本和德国进口。

2、试验方法^[1]

(1)药物对细胞的毒性测定

①药物配制方法：用Hanks液将野菊花滴眼液、原野菊花注射液、滴眼剂基质液及阿昔洛韦滴眼液原液从1∶10～1∶80作倍比稀释。

野菊花滴眼液、原野菊花注射液稀释后浓度为原液(1g生药/mL)1∶10(0.1g生药/mL)、1∶20(0.05g生药/mL)、1∶40(0.025g生药/mL)和1∶80(0.0125g生药/mL)。

阿昔洛韦滴眼液稀释后的浓度分别为原液(1mg/mL)1∶10(0.1mg/mL)、1∶20(0.05mg/mL)、1∶40(0.025mg/mL)和1∶80(0.0125mg/mL)。

②药物对细胞的毒性测定：取野菊花滴眼液、原野菊花注射液、滴眼剂基质液及阿昔洛韦滴眼液原液及1∶10～1∶80药液分别接种于已形成单层细胞的Hep-2细胞各2支，同步并列设置细胞对照管、空白对照(以Hanks液代替药液)管，加足Eagles维持液。置37℃温箱中孵育，每天观察细胞的毒性反应，计算半数有毒浓度(TD₅₀)和最大无毒浓度(TD₀)，并重复试验。

(2)病毒对细胞的毒力测定

用Hanks液将AdV3型、AdV4型、AdV7型、AdV8型及HSV1型分别从10^-1～10^-9作连续稀释。取AdV3型、AdV7型10^-3～10^-6、AdV4型、AdV8型10^-3～10^-8、HSV10^-3～10^-9。各病毒液体分别接种4支Hep-2细胞管，同步并列设置细胞对照管，加足Eagles维持液。置37℃温箱，每天观察细胞病变，计算半数细胞感染量(TCID₅₀)。

(3)野菊花滴眼液抗病毒作用测定

取100TCID₅₀腺病毒AdV3型、AdV7型、AdV4型、AdV8型及HSV1型病毒液分别接种Hep-2细胞管2支，吸附1小时后，分别洗去病毒液。然后分别加入野菊花滴眼液、原野菊花注射液、滴眼剂基质液及阿昔洛韦滴眼液原液的1∶10～1∶80药液吸附45分钟后，加足Eagles维持液。同步并列设置病毒对照管、细胞对照管，以Hanks液代替药液做空白对照。置37℃温箱，逐日观察细胞病变。当病毒对照出现+++～++++(75-100％病变)可终止该试验。并重复试验后，计算抑制病毒作用的最小有效浓度(MIC)及半数有效浓度(IC₅₀)和治疗指数(TI)。

3、试验结果

(1)4组滴眼液等药物对细胞的毒性作用：结果见表11。

表114组滴眼液等药物对Hep-2细胞的毒性作用

注：“+++”表示2管细胞有毒性。“-”表示2管细胞无毒性。

从表11可见，野菊花滴眼液在原浓度和稀释10、20倍的浓度对Hep-2细胞有明显毒性，稀释40倍以上对Hep-2细胞无任何毒性反应；野菊花注射液原液对Hep-2细胞有毒性，而在野菊花注射液稀释10倍以上的各种浓度(1∶10～1∶80)对Hep-2细胞均无任何毒性反应；阿昔洛韦滴眼液原液和滴眼剂基质液原液对Hep-2细胞均无任何毒性反应。由表11可见野菊花滴眼液对Hep-2细胞有明显毒性，效果优于野菊花注射液，且以原液(每制剂单位中含总黄酮以芦丁C₁₆H₁₈O₉计为10mg；每制剂单位含野菊花以蒙花苷C₁₆H₁₈O₉计为8mg；每制剂单位含绿原酸C₁₆H₁₈O₉为200μg)效果最好，稀释20倍以后效果逐渐降低，故：本滴眼液原液为临床浓度效果最佳，即每制剂单位中含总黄酮以芦丁C₁₆H₁₈O₉计为10mg；每制剂单位含野菊花以蒙花苷C₁₆H₁₈O₉计为8mg；每制剂单位含绿原酸C₁₆H₁₈O₉为200μg。

(2)病毒对细胞的毒力作用：病毒AdV3型、AdV7型、AdV4型、AdV8型及HSV1型，在Hep-2细胞内分别加10倍稀释的4～7种不同浓度病毒后。根据细胞病变结果，用Read-maench法计算病毒半数感染量(TCID₅₀)，结果见表12-1。

表12-1各类病毒的半数感染细胞量(TCID₅₀)

(3)4组药液在体外试验的抗病毒作用

①4组药液在体外试验的抗病毒作用：结果见表12-2。

表12-2  4组药液等药物体外抗病毒作用

注：“-”表示2管细胞无病变，“++-+++”表示2管细胞病变程度。

从表12-2可见，野菊花滴眼液和野菊花注射液对AdV3型、AdV7型、AdV8型及HSV1型均有不同程度抑制细胞内病变作用，但野菊花滴眼液效果优于野菊花注射液。其中1∶20(0.05g生药/mL)药液对AdV3型、AdV7型及HSV1型均有较好的抑制作用。1∶10(0.1g生药/mL)药液对AdV8型有抑制作用。1∶10～1∶80药液对AdV4型均无抑制作用。

阳性对照药阿昔洛韦滴眼液原液(1mg/mL)对AdV8型、HSV1型有抑制细胞内病变作用，其他浓度药液对AdV8、HSV1无抑制作用。阿昔洛韦滴眼液原液(1mg/mL)～1∶80药液对AdV3型、AdV7型和AdV4型均无抑制作用。

滴眼剂基质液对AdV3型、AdV7型、AdV4型、AdV8型及HSV1均无抑制作用。空白对照(Hanks液)对以上病毒亦均无抑制作用。

由表12见野菊花滴眼液效果优于野菊花注射液，且以原液(每制剂单位中含总黄酮以芦丁C₁₆H₁₈O₉计为10mg；每制剂单位含野菊花以蒙花苷C₁₆H₁₈O₉计为8mg；每制剂单位含绿原酸C₁₆H₁₈O₉为200μg)效果最好，所以本滴眼液以原液(1g生药/mL)为临床浓度效果最佳，即每制剂单位中含总黄酮以芦丁C₁₆H₁₈O₉计为10mg；每制剂单位含野菊花以蒙花苷C₁₆H₁₈O₉计为8mg；每制剂单位含绿原酸C₁₆H₁₈O₉为200μg最佳。

②野菊花滴眼液抗病毒作用的最小有效浓度(MIC)、半数有效浓度(IC₅₀)、最大无毒浓度TD₀和治疗指数(TI)。

根据野菊花滴眼液等体外抗病毒结果，按Read-maench法，计算出野菊花滴眼液抗病毒作用的最小有效浓度(MIC)、半数有效浓度(IC₅₀)、最大无毒浓度TD₀和治疗指数(TI)。结果见表13。

表13野菊花滴眼液及阿昔洛韦滴眼液的抗病毒作用

从表13可见，野菊花滴眼液的最大无毒浓度TD0为1∶1，最小有效浓度(MIC)为1∶40，其中AdV8的最小有效浓度(MIC)为1∶20，故野菊花滴眼液的含量的下限按AdV8的最小有效浓度定为：每制剂单位中含总黄酮以芦丁C₁₆H₁₈O₉计为0.2mg；每制剂单位含野菊花以蒙花苷C₁₆H₁₈O₉计为0.05mg；每制剂单位含绿原酸C₁₆H₁₈O₉为10μg。

试验例3对家兔实验性金黄色葡萄球菌感染性结膜炎的治疗作用

1、试验材料

1.1试验药物

(1)受试药物

野菊花滴眼液，5mL/支，药物浓度分别为2g生药/mL(每mL相当于含野菊花原生药材2g，)，批号：040704；1g生药/mL(每mL相当于含野菊花原生药材1g，)，批号：040703；0.5g生药/mL(每mL相当于含野菊花原生药材0.5g，)，批号：040705。以上野菊花滴眼液各个浓度药液由成都三明药物研究所提供，按实施例1的方法制备，1g生药/mL野菊花滴眼液为临床剂量。

野菊花注射液1g生药/mL(每mL相当于含野菊花原生药材1g)，由雅安三九药业有限公司提供，批号040301。

(2)阳性对照药物

氯霉素滴眼液。8mL(20mg)/支。由四川泰华堂制药有限公司生产，批号：040212。

1.2.细菌株

金黄色葡萄球菌ATCC25923，浓度为1×10⁸个菌/mL。由成都中医药大学微生物学教研室进行细菌培养、制备和提供。

1.3动物

家兔，红眼，白毛，一级，体重1.95～2.25kg，雌雄兼用。由四川省实验动物专委会养殖场提供，动物合格证号：川实动管质2004-14。

3、试验方法

1.结膜炎模型的复制方法：按照文献介绍的方法^[1]，对家兔双眼的下眼脸与球结膜交界处注射金黄色葡萄球菌的混悬液(浓度为1×10⁸个菌/mL)0.1mL/眼，造成金黄色葡萄球菌感染性结膜炎模型。

2.分组与药物剂量：注射金黄色葡萄球菌造成结膜炎模型24小时后(第2天)根据病情轻重程度将家兔40只按性别均匀搭配分成8组，每组5只(雌雄兼用)共10只眼用于实验。分别作为：①正常对照组：生理盐水等体积滴眼；②模型对照组：生理盐水等体积滴眼；③氯霉素滴眼液(阳性对照药物)组：0.24mg/kg(浓度为2.5mg/mL，两眼滴药，24μL/眼/次，4次/天)；④～⑥野菊花滴眼液高、中、低三种剂量组：0.192、0.096、0.048g生药/kg(两眼滴药，24μL/眼/次，4次/天。)；⑦～⑧原剂型野菊花注射液高、低剂量组：0.096、0.048g生药/kg(两眼滴药，24μL/眼/次，高剂量4次/天，低剂量2次/天。)。

3.给药途经与方法：在注射金黄色葡萄球菌造成结膜炎模型24小时后(第2天)根据病情轻重程度均匀分组，然后开始用生理盐水、野菊花滴眼液、原剂型野菊花注射液和氯霉素滴眼液滴眼，连续7日。

4.观察指标：每天上午第1次滴眼药液之前，先按眼刺激综合评分标准进行观察和记录结膜炎程度后再分别给予滴眼液。

按文献^[2]采用综合评分，结膜炎程度分级评分标准：

①充血：血管正常：0分；血管充血呈鲜红色：1分；血管充血呈深红色，血管不易分辨：2分；弥漫性充血呈紫红色：3分。

②水肿：无水肿：0分；轻微水肿：1分；明显水肿，伴有部分眼睑外翻：2分；水肿至眼睑近半闭合：3分；水肿至眼睑超过半闭合：4分。

③分泌物：无分泌物：0分；少量分泌物：1分；分泌物使眼睑和睫毛潮湿或粘着：2分；分泌物使整个眼区和睫毛潮湿或粘着：3分。

5、统计学方法：数据用x±S表示，两组之间的比较用Dunnett t检验。

6、试验结果

结果见表14，通过数据可见，对家兔两只眼睛的下眼脸与球结膜交界处注射金黄色葡萄球菌的混悬液(浓度为1×10⁸个菌/mL)0.1mL/眼，造成金黄色葡萄球菌感染性结膜炎模型。致炎24小时后，可见球结膜和睑结膜弥漫性充血呈紫红色，水肿异常严重(模型对照组7天后与正常对照组比较病变仍明显)，眼睛充血，炎症分泌物多(尤其感染后1～3天)。野菊花滴眼液及阳性对照药物氯霉素滴眼液具有显著的治疗作用。野菊花滴眼液高剂量组治疗3天后即可使结膜炎充血、水肿、分泌物等症状显著减轻(P＜0.05)；野菊花滴眼液中(临床剂量)、低剂量组和原剂型野菊花注射液治疗5天后可使结膜炎充血、水肿、分泌物等症状显著减轻(P＜0.05)。说明野菊花滴眼液与原剂型注射液对金黄色葡萄球菌感染所致家兔结膜炎均具有治疗作用，治疗7天后可治愈(与正常对照组比较，P＞0.05)。

试验例4野菊花滴眼液对家兔病毒性结膜炎的作用

1试验材料

1.1试验药物

(1)受试药物

野菊花滴眼液，5mL/支，药物浓度分别为2g生药/mL(每mL相当于含野菊花原生药材2g)，批号：040704；1g生药/mL(每mL相当于含野菊花原生药材1g)，批号：040703；0.5g生药/mL(每mL相当于含野菊花原生药材0.5g)，批号：040705。以上野菊花滴眼液各个浓度药液由成都三明药物研究所提供，1g生药/mL野菊花滴眼液为临床剂量。

野菊花注射液1g生药/mL(每mL相当于含野菊花原生药材1g)，批号040301，由雅安三九药业有限公司提供。

(2)阳性对照药物：阿昔洛韦滴眼液，8ml:8mg，本品为无色的澄明液体。批号20030509，由湖北潜江制药厂生产。

1.2病毒株

单纯疱疹病毒I型(HSV-I)，TCID₅₀为10^-9，由北京药品生物制品检定所提供。

1.3动物

家兔，红眼，白毛，一级，体重2.25～2.50kg，雌雄兼用。由四川省实验动物专委会养殖场提供，动物合格证号：川实动管质2004-14。

2、试验方法

(1)结膜炎模型的复制方法：按照文献介绍的方法^[3]，对家兔两只眼的下眼脸与球结膜交界处注射单纯疱疹病毒I型的混悬液(TCID₅₀为10^-9)0.1mL/眼，造成感染性单纯疱疹病毒I型结膜炎模型。

(2)分组与药物剂量：在注射单纯疱疹病毒I型造成结膜炎模型24小时后(第2天)根据病情轻重程度将家兔40只按性别均匀搭配分成8组，每组5只(雌雄兼用)共10只眼用于实验。分别作为：①正常对照组：生理盐水等体积滴眼；②模型对照组：生理盐水等体积滴眼；③阿昔洛韦滴眼液(阳性对照药物)组：0.096mg/kg(浓度为1mg/mL，两眼滴药，24μL/眼/次，4次/天)；④～⑥野菊花滴眼液高、中、低三种剂量组：0.192、0.096、0.048g生药/kg(两眼滴药，24μL/眼/次，4次/天。)；⑦～⑧原剂型野菊花注射液高、低剂量组：0.096、0.048g生药/kg(两眼滴药，24μL/眼/次，高剂量4次/天，低剂量2次/天。)。

(3)给药途经与方法：在注射单纯疱疹病毒I型造成结膜炎模型24小时后(第2天)根据病情轻重程度均匀搭配分组，然后开始用生理盐水、野菊花滴眼液、原剂型野菊花注射液和阿昔洛韦滴眼液滴眼，连续7日。

(4)观察指标：每天上午第1次滴眼药水之前，先按综合评分方法观察和记录结膜炎症程度分值后再分别滴眼药液。

采用综合评分^[2]，结膜炎程度分级评分标准：

①充血：血管正常：0分；血管充血呈鲜红色：1分；血管充血呈深红色，血管不易分辨：2分；弥漫性充血呈紫红色：3分。

②水肿：无水肿：0分；轻微水肿：1分；明显水肿，伴有部分眼睑外翻：2分；水肿至眼睑近半闭合：3分；水肿至眼睑超过半闭合：4分。

③分泌物：无分泌物：0分；少量分泌物：1分；分泌物使眼睑和睫毛潮湿或粘着：2分；分泌物使整个眼区和睫毛潮湿或粘着：3分。

(5)统计学方法：数据用x±S表示，两组之间的比较用Dunnett t检验。

3、试验结果

结果见表15，从表15及试验中可见，对家兔两只眼睛的下眼脸与球结膜交界处注射单纯疱疹病毒I型的混悬液(TCID₅₀为10^-9)0.1mL/眼，造成单纯疱疹病毒I型感染性结膜炎模型。致炎24小时后，可见眼结膜充血，炎性分泌物多(尤其治疗3～5天)。野菊花滴眼液及阳性对照药物阿昔洛韦滴眼液具有显著的治疗作用。野菊花滴眼液高、中剂量(临床剂量)组治疗5天后即可使结膜炎充血、水肿、分泌物等症状显著减轻(p＜0.05)；而原剂型野菊花注射液对单纯疱疹病毒I型感染性家兔结膜炎模型无治疗作用(p＞0.05)。说明在治疗单纯疱疹病毒I型感染所致家兔结膜炎上，野菊花滴眼液优于原剂型野菊花注射液。

试验例5野菊花滴眼液对家兔非细菌性结膜炎的作用

1、试验材料

1.1试验药物

(1)受试药物

野菊花滴眼液，5mL/支，药物浓度分别为2g生药/mL(每mL相当于含野菊花原生药材2g)，批号：040704；1g生药/mL(每mL相当于含野菊花原生药材1g)，批号：040703；0.5g生药/mL(每mL相当于含野菊花原生药材0.5g)，批号：040705。以上野菊花滴眼液各个浓度药液均由成都三明药物研究所提供，按实施例1方法制备，1g生药/mL野菊花滴眼液为临床剂量。

野菊花注射液1g生药/mL(每mL相当于含野菊花原生药材1g)，由雅安三九药业有限公司提供，批号040301。

(2)阳性对照药物：氯霉素滴眼液。8mL(20mg)/支。由四川泰华堂制药有限公司生产，批号：040212。

1.2致炎剂

巴豆油，由成都中医药大学炮制教研室提供，巴豆油与菜油按1∶20稀释，备用。

1.3动物

家兔，一级，体重1.90～2.20kg，雌雄兼用。由四川省实验动物专委会养殖场提供，动物合格证号：川实动管质2004-14。

2、实验场地

成都中医药大学国家中医药管理局三级中药药理实验室，证书登记编号：TCM-03-043。将动物放在实验动物饲养观察室内饲养和给药。室内温度控制在18～22℃。

3、试验方法

(1)结膜炎模型的复制方法：按照文献介绍的方法^[4]，实验时每只家兔左右眼结膜囊内分别滴入巴豆油0.05ml(巴豆油以菜油按1∶20稀释)，闭合眼睑，轻轻按摩10秒钟，致炎。造成巴豆油性结膜炎模型。

(2)分组与药物剂量：在巴豆油造成结膜炎模型后30分钟，根据病情轻重程度将家兔40只按性别、炎症程度均匀搭配分成8组，每组5只(雌雄兼用)共10只眼用于实验。分别作为：①正常对照组：生理盐水等体积滴眼；②模型对照组：生理盐水等体积滴眼；③氯霉素滴眼液(阳性对照药物)组：0.24mg/kg(浓度为2.5mg/mL，两眼滴药，24μL/眼/次，4次/天)；④～⑥野菊花滴眼液高、中、低三种剂量组：0.192、0.096、0.048g生药/kg(两眼滴药，24μL/眼/次，4次/天。)；⑦～⑧原剂型野菊花注射液高、低剂量组：0.096、0.048g生药/kg(两眼滴药，24μL/眼/次，高剂量4次/天，低剂量2次/天。)。

(3)给药途经与方法：在巴豆油造成结膜炎模型后30分钟，根据病情轻重程度将家兔均匀分组，分别用生理盐水、野菊花滴眼液、氯霉素滴眼液和原剂型野菊花注射液滴眼。

(4)观察指标：于第一次给药后1小时、2小时、4小时、8小时、24小时、48小时检查和记录结膜炎症程度并评分。

采用综合评分^[2]，结膜炎程度分级评分标准：

①充血：血管正常：0分；血管充血呈鲜红色：1分；血管充血呈深红色，血管不易分辨：2分；弥漫性充血呈紫红色：3分。

②水肿：无水肿：0分；轻微水肿：1分；明显水肿，伴有部分眼睑外翻：2分；水肿至眼睑近半闭合：3分；水肿至眼睑超过半闭合：4分。

③分泌物：无分泌物：0分；少量分泌物：1分；分泌物使眼睑和睫毛潮湿或粘着：2分；分泌物使整个眼区和睫毛潮湿或粘着：3分。

(5)统计学方法：数据用x±S表示，两组之间的比较用Dunnett t检验。

4、试验结果

评分结果见表16，表16结果显示，在巴豆油造成结膜炎模型30分钟后，可见眼睛充血、水肿严重，分泌物多，以野菊花滴眼液和原剂型野菊花注射液治疗1小时后，与模型组比较，即可见充血、水肿症状明显减轻，分泌物减少。说明野菊花滴眼液及原剂型野菊花注射液对巴豆油所致的家兔非细菌性结膜炎均有明显的抑制作用(P＜0.05)。野菊花滴眼液临床剂量治疗后48h，基本治愈，与正常对照组相比较，P＞0.05，而原剂型野菊花注射液组与正常对照组相比较，仍有差异，P＜0.05，说明治疗巴豆油所引起的家兔结膜炎，野菊花滴眼液比原剂型野菊花注射液优。

总结：

一、急性毒性试验

在对家兔急性毒性试验中，1日内分8次对家兔滴眼给予野菊花滴眼液最大等渗浓度(每mL相当于含野菊花原生药材2g，测定结果显示：每制剂单位中含总黄酮以芦丁C₁₆H₁₈O₉计为15.0mg，每制剂单位含蒙花苷C₁₆H₁₈O₉为10.0mg；每制剂单位含绿原酸C₁₆H₁₈O₉为400μg)，总剂量达0.8g生药/kg体重滴眼。7天内家兔未出现明显中毒症状，家兔无死亡，体重增加均匀，和正常对照组相比较无显著差异(P＞0.05)，表明即使野菊花滴眼液较大剂量被吸收进入机体血液循环后，对全身的急性毒性反应亦极低，故可以确定，该滴眼液有效成分的含量上限为最大等渗浓度的含量上限，即每制剂单位中含总黄酮以芦丁C₁₆H₁₈O₉计为15.0mg，每制剂单位含蒙花苷C₁₆H₁₈O₉为10.0mg；每制剂单位含绿原酸C₁₆H₁₈O₉为400μg。

二、野菊花滴眼液的体外抗病毒作用

在野菊花滴眼液的体外抗病毒实验中，野菊花滴眼液效果优于野菊花注射液，野菊花滴眼液在原浓度和稀释10、20倍的浓度对Hep-2细胞有明显毒性，且以原液(每制剂单位中含总黄酮以芦丁C₁₆H₁₈O₉计为10mg；每制剂单位含野菊花以蒙花苷C₁₆H₁₈O₉计为8mg；每制剂单位含绿原酸C₁₆H₁₈O₉为200μg)效果最好，稀释20倍以后效果逐渐降低，故：本滴眼液原液为临床浓度效果最佳，即每制剂单位中含总黄酮以芦丁C₁₆H₁₈O₉计为10mg；每制剂单位含野菊花以蒙花苷C₁₆H₁₈O₉计为8mg；每制剂单位含绿原酸C₁₆H₁₈O₉为200μg。

在相应的实验中可以看出：野菊花滴眼液效果以原液(每制剂单位中含总黄酮以芦丁C₁₆H₁₈O₉计为10mg；每制剂单位含野菊花以蒙花苷C₁₆H₁₈O₉计为8mg；每制剂单位含绿原酸C₁₆H₁₈O₉为200μg)效果最好，所以本滴眼液以原液(1g生药/mL)为临床浓度效果最佳，即每制剂单位中含总黄酮以芦丁C₁₆H₁₈O₉计为10mg；每制剂单位含野菊花以蒙花苷C₁₆H₁₈O₉计为8mg；每制剂单位含绿原酸C₁₆H₁₈O₉为200μg最佳。且野菊花滴眼液对腺病毒AdV3型、AdV7型、AdV8型及单纯疱疹病毒HSV1型均有不同程度的抗病毒作用，其最大无毒浓度TD₀为1∶1，最小有效浓度(MIC)为1∶20～1∶40，其中AdV8的最小有效浓度(MIC)为1∶20，半数有效浓度(IC50)为0.015g生药/mL～0.035g生药/mL，治疗指数(TI)为1～2，故野菊花滴眼液的含量的下限按AdV8的最小有效浓度定为：每制剂单位中含总黄酮以芦丁C₁₆H₁₈O₉计为0.2mg；每制剂单位含野菊花以蒙花苷C₁₆H₁₈O₉计为0.05mg；每制剂单位含绿原酸C₁₆H₁₈O₉为10μg。

故由上述两类试验说明本发明滴眼液的含量限度为：每制剂单位中含总黄酮以芦丁C₁₆H₁₈O₉计应为0.2～15.0mg；每制剂单位含野菊花以蒙花昔C₁₆H₁₈O₉计应为0.05～10.0mg；每制剂单位含绿原酸C₁₆H₁₈O₉应为10～400μg。在该限定范围内，药效明确，可控性强。

三、药效学试验

(一)对家兔实验性金黄色葡萄球菌感染性结膜炎的治疗作用

在对家兔实验性金黄色葡萄球菌感染性结膜炎的治疗作用试验中，野菊花滴眼液高剂量组治疗3天后即可使结膜炎充血、水肿、分泌物等症状显著减轻(P＜0.05)；野菊花滴眼液中(临床剂量)、低剂量组和原剂型野菊花注射液治疗5天后可使结膜炎充血、水肿、分泌物等症状显著减轻(P＜0.05)。且治疗7天后可治愈(与正常对照组比较，P＞0.05)。说明野菊花滴眼液与原剂型注射液对金黄色葡萄球菌感染所致家兔结膜炎均具有治疗作用。

(二)野菊花滴眼液对家兔病毒性结膜炎的作用

在野菊花滴眼液对家兔病毒性结膜炎的作用试验中，野菊花滴眼液高、中剂量(临床剂量)组治疗5天后即可使结膜炎充血、水肿、分泌物等症状显著减轻(p＜0.05)；而原剂型野菊花注射液对单纯疱疹病毒I型感染性家兔结膜炎模型无治疗作用(p＞0.05)。说明在治疗单纯疱疹病毒I型感染所致家兔结膜炎上，野菊花滴眼液优于野菊花注射液。

(三)野菊花滴眼液对家兔非细菌性结膜炎的作用

在对家兔非细菌性结膜炎的作用试验中，以野菊花滴眼液和原剂型野菊花注射液治疗1小时后，与模型组比较，即可见充血、水肿症状明显减轻，分泌物减少。说明野菊花滴眼液及原剂型野菊花注射液对巴豆油所致的家兔非细菌性结膜炎均有明显的抑制作用(P＜0.05)。另外，在以野菊花滴眼液高计量治疗后24h，结膜炎基本治愈，与正常对照组相比较，P＞0.05；野菊花滴眼液中计量(临床剂量)治疗后48h，基本治愈，与正常对照组相比较，P＞0.05，而原剂型野菊花注射液组与正常对照组相比较，仍有差异，P＜0.05，说明治疗巴豆油所引起的家兔结膜炎，野菊花滴眼液比原剂型野菊花注射液优。

主要参考文献

1、郑民实.蒲公英滴眼剂治疗实验性家兔单纯疱疹病毒性角膜炎.中国药理学报，1989，10(4)：85

2、中华人民共和国卫生部药政管理局.中药新药研究指南(药学药理学毒理学)

3、谭海波，张湘晖，张明亮，等.目安眼膏治疗实验性家兔单纯疱疹病毒性角膜炎的研究.中国中医眼科杂志，2003，13(1)：12

4、段泾云，于利森.清明眼药水药理作用研究.深圳中西医结合杂志，1999，9(3)：20

表4眼刺激反应评分标准

眼刺激反应	分值
		角膜混浊(以最致密为准)
无混浊	0
		散在或弥漫性混浊，虹膜清晰可见	1
半透明区易分辨，虹膜模糊不清	2
		出现灰白色半透明区，虹膜细节不清，瞳孔大小勉强看清	3
角膜不透明，由于混浊，虹膜无法辨认	4
		虹膜
正常	0
		皱褶明显加深，充血、肿胀、角膜周围有轻度充血，瞳孔对光仍有反应	1
出血、肉眼可见坏死，对光无反应(或出现其中一种反应)	2
		结膜
A.充血(指睑结膜、球结膜部位)：
		血管正常	0
血管充血呈鲜红色	1
		血管充血呈鲜红色，血管不易分辨	2
弥漫性充血呈紫红色	3
		B.水肿
无水肿	0
		轻微水肿	1
明显水肿，伴有部分眼睑外翻	2
		水肿至眼睑近半闭合	3
水肿至眼睑超过半闭合	4
		C.分泌物
无分泌物	0
		少量分泌物	1
分泌物使眼睑和睫毛潮湿或粘着	2
		分泌物使整个眼区和睫毛潮湿或粘着	3
眼刺激反应最高综合评分16分

Claims (6)

1.一种治疗急、慢性结膜炎的眼用药物组合物，其特征在于：它是由中药野菊花Chrysanthemum indicum L.的提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的滴眼液，每1000ml滴眼液是由下述配比的原料药材及辅料制备而成：

野菊花500～1500g、吐温80 2～10ml、硼酸4～12g、苯扎氯铵0.01～0.5g、余量为注射用水；

所述的野菊花的提取物是由如下方法提取：将野菊花加水，二次蒸馏，收集重蒸馏液；药渣加水煎煮、50％～90％乙醇精制，回收乙醇，与重蒸馏液混合，即为野菊花提取物。

2.根据权利要求1所述的治疗急、慢性结膜炎的眼用药物组合物，其特征在于：每1000ml滴眼液是由下述配比的原料药材及辅料制备而成：

野菊花1000g、吐温80 5ml、硼酸8g、苯扎氯铵0.05g，余量为注射用水。

3.根据权利要求1或2所述的治疗急、慢性结膜炎的眼用药物组合物，其特征在于：所述的滴眼液的pH值为6.0～7.5。

4.根据权利要求1所述的治疗急、慢性结膜炎的眼用药物组合物，其特征在于：所述滴眼液每制剂单位中含总黄酮以芦丁C₂₇H₃₀O₁₆计不低于0.2mg；所述滴眼液每制剂单位中含野菊花以蒙花苷C₂₈H₃₂O₁₄计不低于0.05mg；所述滴眼液每制剂单位中含绿原酸C₁₆H₁₈O₉不低于10μg。

5.根据权利要求4所述的治疗急、慢性结膜炎的眼用药物组合物，其特征在于：所述滴眼液每制剂单位中含总黄酮以芦丁C₂₇H₃₀O₁₆计为0.2～15.0mg；所述滴眼液每制剂单位中含野菊花以蒙花苷C₂₈H₃₂O₁₄计为0.05～10.0mg；所述滴眼液每制剂单位中含绿原酸C₁₆H₁₈O₉10～400μg。

6.一种制备权利要求1所述的治疗急、慢性结膜炎的眼用药物组合物的方法，它是有如下步骤组成：

a、取药材野菊花Chrysanthemum indicum L.的干燥头状花序或全草，加水浸泡、用水蒸气蒸馏法经蒸馏、重蒸馏，收集重蒸馏液，备用；收集药渣中的提取液，滤过，备用，剩余药渣进行下一步操作；

b、将a步骤的药渣加水煎煮，过滤，与a步骤中滤液合并，浓缩，加乙醇使含醇量为50％～90％，静置，过滤，回收乙醇，再浓缩，加乙醇使含醇量为50％～90％，静置，如此反复醇沉2-3次，过滤，滤液备用；

c、取b步中滤液，减压回收乙醇并浓缩至无醇味，加注射用水，冷藏，滤过，滤液加入0.3％活性炭吸附，滤过；

d、将a步骤的重蒸馏液与c步骤的滤液混合，加入药学上可接受的辅料制备而成的药学上常用的眼用制剂。