CN100464751C - 苦参碱滴眼液及其生产方法 - Google Patents

Abstract

一种具有抗菌消炎、抗病毒药效的苦参碱滴眼液及其生产方法，其技术要点在于：先将80%注射用水加热至75-90℃，在搅拌下分别加入0.05%～0.8%的苦参碱、0.5%～1.2%的氯化钠至溶解，调节pH值范围为6.5～7.5；在搅拌下加入0.01%～1%的对羟基苯甲酸乙酯至溶解，然后再加入0.01%～1%透明质酸钠溶液，加注射用水至全量，搅拌使均匀；煮沸15-30分钟，经0.1μm无菌滤器过滤，降至常温在无菌条件下灌装后，经包装，即为苦参碱滴眼液成品。本发明的苦参碱滴眼液主治细菌性及病毒性角膜、结膜炎。由于苦参碱具有改善微循环的作用，因此对老年眼底动脉硬化引起的各种眼病也有较好的疗效。处方中玻璃酸钠的使用，不但使本品具缓释特点，而且对干眼病也有非常好的治疗效果。

Description

苦参碱滴眼液及其生产方法

技术领域

本发明涉及人用药品技术领域，具体地说是一种苦参碱滴眼液及其生产方法。

背景技术

众所周知，角膜炎、结膜炎是由细菌或病毒引起的眼病，严重地影响着人眼部的健康和视力。目前临床上治疗细菌性结膜炎和角膜炎一般需用抗生素类合并皮质激素类药物；如为病毒性眼部感染则用抗病毒药合并抗生素以控制继发感染。液体在正常人结膜囊内的最大容量为20～30μl，除10μl正常泪液外，最多能容纳20μl药液。与泪液混合的药液，只有小部分通过角膜转入眼内，大部分从泪小管排出，所以生物利用度很低。两种滴眼液同时应用不仅体积大，也使患者深感不便。因此寻找一种集抗菌消炎、抗病毒于一体的滴眼液迫在眉睫。

苦参碱是从植物苦豆子中提取的生物碱，现已人工合成。近年来，国内对苦参碱的研究报道较多。由于斯巴特康注射液(苦参碱注射液)与心律宁(苦参总碱片)的缘故，因此在一段时间内，对苦参碱的研究大都集中在治疗各种肝炎和心血管疾病上。

随着国外对苦参碱研究的深入，国内对苦参碱的研究范围也越来越广，尤其是对其杀菌、抗病毒方面的研究，倍受业内人士关注。

上海第二军医大学长征医院等研究苦参碱注射液的治疗作用表明，苦参碱不但对病毒性肝炎、肿瘤、银屑病、变态反应性疾病有较好的治疗效果，而且苦参碱对细菌、寄生虫感染等亦有较好的治疗作用。并且经过对苦参碱滴鼻液及苦参碱气雾剂研究表明，苦参碱对粘膜无刺激性。

据相关资料报导，苦参碱对损伤的胃粘膜具有保护作用。在辩证用药的基础上加用苦参碱治疗42例病毒性心肌炎与对照组比较在抗心律失常及治疗心包炎上，均可明显缩短用药时间，疗效显著。

部颁标准收载的经粘膜吸收的苦参总碱类制剂有“妇得康泡沫剂”，功能主治为清热燥湿，杀虫。用于慢性宫颈炎、宫颈糜烂、阴道炎之湿热下注证；“苦参栓”功能主治为抗菌消炎药。用于宫颈糜烂，赤白带下，滴虫性阴道炎及阴道霉菌感染等妇科慢性炎症。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗菌、消炎、抗病毒作用的苦参碱滴眼液及其生产方法。该滴眼液经粘膜吸收较好，对粘膜溃疡有修复作用且对粘膜无刺激性。

本发明的目的是这样实现的：先将80％注射用水加热至75-90℃，在搅拌下分别加入一定量的苦参碱、氯化钠至溶解，调节pH值范围为6.5～7.5；在搅拌下加入一定量的对羟基苯甲酸乙酯至溶解，然后再加入透明质酸钠溶液，加注射用水至全量，搅拌使均匀，pH值范围为6.5～7.5；煮沸15-30分钟，经0.1μm无菌滤器过滤，降至常温，在无菌条件下灌装后，经包装，即为苦参碱滴眼液成品；

上述成份的重量百分比是：苦参碱0.05％～0.8％，氯化钠0.5％～1.2％，透明质酸钠0.01％～1％，对羟基苯甲酸乙酯(亦称：羟苯乙酯)0.01％～1％，余量为注射用水。

本发明所述的成份及重量优选百分比为：苦参碱0.25％，氯化钠0.83％，透明质酸钠0.1％，对羟基苯甲酸乙酯0.03％，余量为注射用水。

上述的氯化钠根据需要或者采用氯化钾、氯化钙、氯化钠的混合液(林格氏液)。

上述的对羟基苯甲酸乙酯根据需要或采用对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、及三氯叔丁醇、山梨酸或洗必泰眼用制剂的防腐剂。

本发明的优选设计依据

(1)苦参碱为主药，根据药效学和眼刺激性试验研究结果，确定苦参碱的处方量为0.25％。

(2)氯化钠为渗透压调节剂。泪液与血浆渗透压相同，0.25％苦参碱的氯化钠等渗当量为0.0588％(M＝248.37)；0.03％羟苯乙酯的氯化钠等渗当量为0.0106％M＝166.18)；0.1％透明质酸钠所产生的渗透压可忽略不计(M＝500000～730000)。若使本品与泪液等渗，则氯化钠的处方量应为：0.9％-0.0588％-0.0106％＝0.83％。

(3)透明质酸钠(亦称：玻璃酸钠、SH)为增稠剂。一是物理增稠作用，该作用是所有增稠物质均有的，通过增加药液的黏稠度，延长药液在眼内的滞留时间来提高药物的利用度；二是膜亲和作用，以透明质酸钠为媒介，在药液黏度较低的情况下，所发挥的增效作用比其他增稠剂要好得多，即使后者的黏度明显高。第三：以透明质酸钠为媒介，还可使药物的药效峰值滞后，在眼内缓慢释放，起到缓释作用。

滴眼剂合适的黏度在4.0～5.0cPa.s之间。透明质酸钠溶液浓度小于0.05％时，分子大多独立存在，当溶液浓度大于0.1％时，部分交织成网状结构，黏度较大。

    表1-1.不含玻璃酸钠的苦参碱滴眼液的黏度

     表1-2.不同浓度玻璃酸钠水溶液的黏度

表1-3.不同浓度玻璃酸钠苦参碱滴眼液的黏度(加透明质酸钠前预先调pH)

表1-4.不同浓度玻璃酸钠苦参碱滴眼液的黏度(加透明质酸钠前调pH)

    表1-5三批苦参碱滴眼液样品的黏度

注：(1)毛细管内径0.8mm黏度计常数K＝0.02187mm²/s²；

(2)毛细管内径1.0mm黏度计常数K＝0.07432mm²/s²；

(3)三批苦参碱滴眼液的相对密度分别是1.0071、1.0080、1.0081。

(4)1Pa·s＝1000cPa·s

试验结果表明：(1)透明质酸钠在纯水溶液中的黏度最大，在电解质溶液中黏度大幅度下降(见表1-2及表1-4)；(2)加玻璃酸钠时溶液最好预先调pH值至7左右，否则溶液的pH值过高可使玻璃酸钠的黏度发生不可逆的下降；(3)玻璃酸钠作为滴眼剂媒介浓度在0.1％时，运动黏度为4.12～5.51mm²/s，动力黏度为4.15～5.55cPa·s，黏度合适(见表1-5)。故确定本处方含玻璃酸钠为0.1％。

(4)对羟基苯甲酸乙酯(亦称；羟苯乙酯)为抑菌剂。其对霉菌及酵母菌有较强的抑制力。对羟基苯甲酸乙酯毒性低，对眼组织刺激性小，滴眼剂常用浓度为0.03％～0.06％。本方拟选最小用量0.03％。

  表2-2.三批样品微生物限度检查结果

 

批号	20040101	20040102	20040103	备注
					微生物限度检查结果	合格	合格	合格	符合2000版药典附录XI J规定

试验结果表明，三批样品的微生物限度均符合中国药典2000年版XIJ的规定，因此，确定羟苯乙酯的处方量为0.03％。

3.溶剂的选择

滴眼液以配成水溶液最方便、安全、有效。处方中各成分的水溶性分析：苦参碱在水中溶解，在热水略溶。羟苯乙酯溶于热水，氯化钠易溶于水，透明质酸钠在水和生理盐水中溶解，故选择注射用水为溶剂制备苦参碱滴眼液可行。

4.pH值范围的确定

常眼可耐受的pH为5.0～9.0，pH6～8时无不舒适感觉。分析处方中各药的稳定pH值：滴眼液的pH值对未解离型苦参碱浓度具有很大影响。苦参碱水溶液的酸碱度为pH值9.5～10.5，溶液的pH值越低，解离型分子越多，溶液性质越稳定，但对角膜的通透性也越差；pH值大于7.0时，未解离型分子增多，溶液偏碱性，有利于透过角膜，更易发挥药物的作用；透明质酸钠在pH值7时黏度最大；羟苯乙酯在弱酸和中性溶液中稳定；正常泪液生理pH值为7.2～7.4。综合考虑，确定本品的pH值范围为6.5～7.5。

烯塑料滴眼剂瓶，并进行相应的稳定性考查。

本发明的苦参碱滴眼液主治细菌性及病毒性角膜、结膜炎。由于苦参碱具有改善微循环的作用，因此对老年眼底动脉硬化引起的各种眼病也有较好的疗效。处方中玻璃酸钠的使用，不但使本品具缓释特点，而且对干眼病也有非常好的治疗效果。

滴眼剂眼内透性好、使用方便，是治疗外眼部疾病的首选剂型。苦参碱适合制成溶液剂，临床使用的有苦参碱注射液及苦参碱氯化钠注射液等。苦参碱通过粘膜吸收较好，刺激性小。因此确定苦参碱眼用剂型为滴眼剂。

本发明主要的优点是：将处方中其它药物调配好后，调节pH值近中性再加入透明质酸钠，保证溶液的黏度在4.0～5.0cPa.s之间。

与之相近的已知药品或制法有何缺点：现在以透明质酸钠为辅料的滴眼液，工艺过程中均未考虑加入方法及条件对透明质酸钠黏度的影响也不控制溶液的黏度。因此不能充分发挥透明质酸钠的增稠作用，影响药效。

本发明的关键发明点是：

(1)处方：苦参碱制成滴眼液国内外尚无先例，苦参碱与透明质酸钠配伍国内外未见报道和相关专利。

(2)工艺：透明质酸钠加入方法与条件属国内外首创。未见相关专利报导。

(3)适应症：本品为抗菌、消炎、抗病毒药。能治疗细菌性急、慢性结膜炎、角膜炎；治疗单纯疱疹病毒及腺病毒引起的急性角膜炎及流行性角膜炎；治疗眼球无泪液、干燥性角膜炎、结膜炎和非感染性虹膜睫状体炎等。

(4)适应症说明：在此之前，没有一种滴眼液即能治疗细菌性感染又能治疗病毒性感染，而且还能治疗干眼病，缓解眼疲劳。

图1为本发明的工艺流程图

具体实施方式

下面将通过实例对本发明做进一步说明，但下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利范围。该权利范围以权利要求书为准。

实施例1：操作方法

(1)配液容器中加总量80％的注射用水，加热至80℃；

(2)加入苦参碱、氯化钠，搅拌使溶解；调pH值至7.0±0.3

(3)加入对羟基苯甲酸乙酯，搅拌使溶解；

(4)加入透明质酸钠溶液(预先用少量注射用水溶胀并溶解)；

(5)加注射用水至全量，搅拌均匀；

(6)溶液pH值应为6.7～7.3，如有必要，用稀盐酸或氢氧化钠调节；

(7)中间产品检查合格后，煮沸15分钟；

(8)0.1μm无菌滤器过滤；

(9)无菌条件下灌装于8ml塑料滴眼剂瓶中，盖好防盗冒。

(10)澄明度检查，包装即得。

上述成份及重量百分比为：苦参碱0.25％，氯化钠0.83％，透明质酸钠0.1％，对羟基苯甲酸乙酯0.03％，余量为注射用水。

注意事项：

1、实验结果表明，pH值过高、过低或电解质浓度过大可使透明质酸钠的黏度发生不可逆的下降，因此应将处方中药物配好后，调节pH值近中性后加入透明质酸钠。

2、羟苯乙酯遇弱碱易水解，故应在调节溶液pH值近中性后，在透明质酸钠前加入。

四、药品包装容器的选择

选择8ml无毒聚乙烯塑料滴眼剂瓶，并进行相应的稳定性考查。

五、样品试制

按拟申报工艺试制三批苦参碱滴眼液样品，结果如下。

    表2-3.苦参碱滴眼液样品试制结果

按拟定临床研究用质量标准检测，三批样品均符合规定。此样品用于质量研究。

质量研究结果表明，拟定处方及工艺基本合理，因此放大试制三批苦参碱滴眼液样品。

       表2-4.苦参碱滴眼液样品放大试验记录

三批放大试验样品均符合临床研究用质量标准，进一步证明了苦参碱滴眼液工艺稳定，重复性好。此三批样品用于稳定性研究。

一、本发明用于治疗细菌性角膜炎、结膜炎临床药效学试验

摘要：通过对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌的抗菌试验研究表明：苦参碱滴眼液对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌有较好的抑菌效果。对细菌性角膜炎及结膜炎均具有一定的治疗作用。

引言：据文献报道，在我国角膜与结膜感染的病原微生物主要有细菌、真菌及棘阿米巴。其中细菌是主要致病菌，特别是绿脓杆菌角膜溃疡仍为重要致盲眼病。目前耐药菌、条件致病菌、真菌等所致角膜炎和结膜炎日益增多。抗生素的应用使细菌性角膜炎及结膜炎的治愈大有改观，但滥用抗生素使治疗失败的病例屡见不鲜。因此筛选能够替代抗生素的眼用抗菌药非常必要。

苦参碱(Matrine)为豆科植物苦参Sophoraflavescents Ait.，苦豆子S.alopecuroides及广豆根LS.subprostrata Chun et T.chen中的主要生物碱，现已人工合成。苦参碱为抗菌、消炎、抗病毒药物。研究证明苦参碱还具有抗肿瘤、抗心率失常、利尿和正性肌力作用，临床用于治疗病毒性肝炎、心率失常、阴道炎、癌症、白细胞减少症、支气管哮喘和喘息型慢性气管炎等。

本试验将对苦参碱滴眼液治疗家兔细菌性角膜炎和结膜炎的实际疗效进行观察。

试验目的：通过体外、体内染菌动物模型，评价苦参碱滴眼液对金黄色葡萄球菌ATCC25925、铜绿假单胞菌ATCC27853、大肠杆菌ATCC25922感染所致角膜炎和结膜炎的治疗作用。

受试药物：苦参碱(Matrine)为白色针状结晶粉末，无臭，味苦，久置空气中，有引湿性，并变为淡黄色。在乙醇、氯仿、甲苯及苯中极易溶解，在丙酮中易溶，在热水、石油醚中略溶。比旋度为

苦参碱滴眼液，是由0.25％苦参碱粉末(纯度不少于98.0％)、透明质酸钠(1000μg·ml^-1、对羟基苯甲酸乙酯(300μg·ml^-1)加氯化钠调节渗透压配制而成的制剂。由长春长庆药业集团有限公司提供，批号:040102。

剂量选择：体外试验，自78.625μg·ml^-1～40000μg·ml^-1设10个梯度为试验浓度，测定苦参碱滴眼液的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)和最小杀菌浓度(minimal bactericidal concentration，MBC)。体内试验，根据苦参碱滴眼液单次刺激和多次刺激实验测定结果设试验浓度分别为：低剂量组2000μg·ml^-1、中剂量组4000μg·ml^-1、高剂量组10000μg·ml^-1。苦参碱滴眼液制备见配制方法。

配制方法：体外试验，将苦参碱粉末、透明质酸钠及对羟基苯甲酸乙酯用LB液体培养基配制，经高压无菌滤膜(0.22μm)过滤成试验用各浓度(见体外抗菌实验)待用，使苦参碱含量达到试验要求。

体内试验，根据上述设定的试验浓度配制，低剂量组用生理盐水将苦参碱粉末200mg，透明质酸钠100mg，对羟基苯甲酸乙酯30mg定容至100ml；中剂量组用生理盐水将苦参碱粉末400mg，透明质酸钠100mg，对羟基苯甲酸乙酯30mg定容至100ml；高剂量组用生理盐水将苦参碱粉末1000mg，透明质酸钠100mg，对羟基苯甲酸乙酯30mg定容至100ml待用。

仪器：恒温振荡培养箱，HZQ-X100，太仓市实验设备厂；SARTORIUS GMBH GOTTINGEN精密天平(精度：0.00001)，德国；双人超净工作台，SW-CT-ZF型，中国苏州；低速离心机LD4-2A，中国北京；电热鼓风干燥箱，101A-2型，中国上海；真空冷冻干燥机，MRK，日本；家用冷藏冰箱，BCD-226型，美菱，中国合肥。

试剂：氯化钠(分析纯)，北京化工厂；Bacto Tryptone，OXOID，英国；Bacto YeastExtract，OXOID，英国；琼脂粉，上海化学试剂采购供应站试剂厂，批号：77-07-14；高活性干酵母，广东东莞糖厂酵母粉厂；盐酸布比卡因，上海禾丰制药有限公司，批号0306031。

阳性对照药物：氯霉素滴眼液(Chloramphenicol Eye Drops)(仅体内试验用)，天津市万嘉药业有限公司，批号：H12020113，规格：8ml:20mg。

细菌菌株：

金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)ATCC25925；

铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)ATCC27853；

大肠杆菌(col ibacil lus)ATCC25922。

以上三种菌株均由吉林省疾病预防控制中心提供。

培养基：5％酵母液：5g干酵母粉，用100ml生理盐水稀释，高压灭菌后，4℃保存备用。LB液体培养基：10g Bacto Tryptone，5g Bacto Yeast Extract，5g NaCl，加蒸馏水定容至1L，用1mol/L NaOH调节pH至7.4，高压灭菌后备用。LB固体培养基：10g BactoTryptone，5g Bacto Yeast Extract，5g NaCl，15g琼脂粉，加蒸馏水定容至1L，用1mol/LNaOH调节pH至7.4，高压灭菌后，铺成无菌培养平板，4℃保存备用。

实验动物：日本大耳白兔96只，雌雄各半，体重2-2.5kg，等级:普通，购于吉林大学基础医学院实验动物中心。合格证号：(吉)2003-0001；动物饲养合格证号:(吉)2003-0001；饲料合格证号：(吉)2004-0004。

实验主要步骤和结果

一、体外抗菌实验

1.最低抑菌浓度(MIC)测定：以试管稀释法测定苦参碱对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌的MIC。以试管二倍稀释法将苦参碱用LB液体培养基分别配制成40000、20000、10000、5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.125μg·ml^-1。实验设21组，1-10组分别加入上述40000μg·ml^-1～78.125μg·ml^-1 10个浓度的药液，同时加入1ml菌液，每组5只平行对照管；11-20组为只加上述相同浓度苦参碱药液不加菌液组，做为观察药物是否污染的药物对照组，每组5只平行对照管；21组为不加苦参碱药液只加细菌的对照组，同时设5只平行对照管。上述各组试验管置37℃恒温振荡培养箱内培养16～18小时后，观察未见细菌生长(药液管仍为澄清)的最低药物浓度为该药物最低抑菌浓度(MIC)。分别将各管内液体稀释适宜倍数涂平板，37℃孵箱内培养过夜。菌落计数并拍照，分别计算各浓度药液的抑菌率。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌的MIC测定方法一致。测定结果见表1。

2.最低杀菌浓度(MBC)测定：以试管二倍稀释法将苦参碱用LB液体培养基分别配制成40000、20000、10000、5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.125μg·ml^-1共10个浓度。分别置于小试管中，每个浓度设5只平行对照管，经接种菌液后，置37℃恒温振荡培养箱内培养16～18小时。观察药物最低抑菌浓度(MIC)以上的各试验管培养物，分别吸取0.1ml，移至普通平板琼脂培养基上，用玻璃棒涂匀菌液，置37℃培养过夜，平板培养基中，计数少于5个菌落者作为该药物的最低杀菌浓度(MBC)。

3.结果与分析；苦参碱对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和大肠杆菌有较好的抑菌杀菌效果：苦参碱对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和大肠杆菌的MIC均为10000μg·ml^-1。苦参碱对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和大肠杆菌的MBC均为20000μg·ml^-1。

二、体内抗菌实验

1、家兔细菌性角膜炎及结膜炎的模型制作：试验动物饲养一周，检查其双眼均未见异常，开始参照角膜环钻法[7]造模(正常对照组除外):实验前称重，用0.75％盐酸布比卡因注射液滴眼2～3滴，轻轻按摩片刻，用环钻压迫角膜无反应，先后用5mm和3mm直径角膜环钻轻轻按压角膜顺时针旋转，造成环行创伤。拉开眼睑成杯形，5ml注射器分别吸取金黄色葡萄球菌(33×10⁷·ml^-1)、铜绿假单胞菌(23×10⁷·ml^-1)、大肠杆菌(30×10⁷·ml^-1)菌液滴于兔眼0.1ml/眼，闭合眼睑并按摩1min，感染单眼。金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌感染组在第一次感染后1天出现角膜及结膜炎症状：畏光、流泪、眼睑红肿，分泌物增多，角膜散在或弥漫性混浊，球结膜充血并红肿。大肠杆菌感染组在第一次感染后2天出现角膜及结膜炎症状。造模成功即开始治疗，治疗周期为10天。

2、实验分组及给药：试验动物随机分成16组，每组6只。第1组为正常对照组；第2、3、4组分别为金黄色葡萄球菌感染对照组、绿脓杆菌感染对照组、大肠杆菌感染对照组；第5、6、7组分别为金黄色葡萄球菌感染组阳性药治疗对照组、绿脓杆菌感染组阳性药治疗对照组、大肠杆菌感染组阳性药治疗对照组；第8组到第16组为药物试验组。分别为：第8组金黄色葡萄球菌感染组苦参碱滴眼液高剂量组(10000μg·ml^-1)，第9组金黄色葡萄球菌感染组苦参碱滴眼液中剂量组(4000μg·ml^-1)，第10组金黄色葡萄球菌感染组苦参碱滴眼液低剂量组(2000μg·ml^-1)，第11组绿脓杆菌感染组苦参碱滴眼液高剂量组(10000μg·ml^-1)，第12组绿脓杆菌感染组苦参碱滴眼液中剂量组(4000μg·ml^-1)，第13组绿脓杆菌感染组苦参碱滴眼液低剂量组(2000μg·ml^-1)，第14组大肠杆菌感染组苦参碱滴眼液高剂量组(10000μg·ml^-1)，第15组大肠杆菌感染组苦参碱滴眼液中剂量组(4000μg·ml^-1)，第16组大肠杆菌感染组苦参碱滴眼液低剂量组(2000μg·ml^-1)。各组兔每眼每2小时给药一次，每日给药6次，每次0.1ml，连续给药10天。细菌感染对照组每日给生理盐水。

3、病变判断标准:每天进行观察，以单眼为观察对象，综合多种症状进行评分，评分标准见表2和表3。运用独立样本组间比较进行统计学处理。

4、试验结果:

4.1 疗效标准

显效：全部症状消失或主要症状体征消失，疗效率≥60％；有效:主要症状体征基本消失，疗效率≥30％；无效:各方面症状体征无改善，疗效率<30％。疗效率＝(1-治疗后积分/治疗前积分)×100％(见表4、5、6、7、8、9)。并对最终治疗效果(见表10和表11)进行统计学评价。

4.2 对细菌性角膜炎治疗效果的评价

4.2.1 金葡球菌感染所致角膜炎各组中，苦参碱治疗组低、中、高浓度组显效率分别为66.7％，66.7％，88.3％，有效率均为100％，阳性药物治疗组显效率为66.7％，有效率为100％。治疗组给药后第2天角膜炎症状开始得到控制和缓解。第3天分泌物减少，流泪、畏光现象得到控制。第4天角膜和结膜的症状得到有效的治疗。第5天基本治愈。继续给药到10天痊愈。细菌对照组第一次感染后1天出现角膜炎症状：畏光、流泪、眼睑红肿，分泌物增多，角膜散在或弥漫性混浊，球结膜充血并红肿。第2天各种角膜炎症状加重，角膜明显混浊，畏光眯眼。第3天角膜炎症状继续加重，眼睑红肿明显，球结膜充血严重。第5天达到最重，畏光闭眼，流泪较多，有大量黄色分泌物，球结膜混合性充血，不能分辨出血管。统计学结果见表12。

4.2.2 绿脓杆菌感染所致角膜炎各组中，苦参碱治疗组低、中、高浓度组的显效率均为66.7％，明显高于阳性药物治疗组(50％)，各组有效率同为100％。给药后第2天角膜炎症状开始得到控制和缓解。第3天分泌物减少。第4天流泪、畏光现象得到控制。第5天角膜和结膜的症状得到有效的治疗。第6天基本治愈。继续给药到10天痊愈。细菌对照组第一次感染后1天出现角膜炎症状：畏光、流泪、眼睑红肿，分泌物增多，角膜散在或弥漫性混浊，球结膜充血并红肿。第2天各种角膜炎症状加重，角膜严重混浊，眼睑红肿明显。第3天角膜严重混浊，分泌物使整个眼区潮湿或粘着，部分感染严重的转变成绿脓杆菌性角膜溃疡。到第5天6只家兔中有4只转变为绿脓杆菌性角膜溃疡：眼睑痉挛肿胀，球结膜混合性充血并高度水肿，角膜表面呈现灰白色混浊，前房结构无法窥见，前房及层间积脓，有大量的角膜上皮细胞坏死，组织脱落，有大量黄绿色脓性分泌物，眼睛失明。统计学结果见表13。

4.2.3 大肠杆菌感染所致角膜炎各组中，苦参碱治疗组低、中、高剂量浓度组的显效率均为88.3％，有效率均为100％，阳性药物治疗组显效率为66.7％，有效率为100％。给药后当天角膜炎症状开始得到控制和缓解。第2天分泌物减少。第3天流泪、畏光现象得到控制，角膜和结膜的症状得到有效的治疗。第4天基本治愈。继续给药到10天痊愈。细菌对照组第一次感染后2天出现角膜炎症状：畏光、流泪、眼睑红肿，分泌物增多，角膜散在或弥漫性混浊，球结膜充血并红肿。第3天各种角膜炎症状加重，眼睑红肿明显，角膜水肿混浊。第5天达到最重，畏光眯眼，流泪较多，结膜充血严重。统计学结果见表14。

4.3 对细菌性结膜炎治疗效果的评价

4.3.1 金葡球菌感染所致结膜炎各组中，苦参碱治疗组低浓度组的显效率均为83.3％，中、高浓度组的显效率为100％，明显高于阳性药物治疗组(66.7％)，各组有效率同为100％。

4.3.2 绿脓杆菌感染所致各组中，苦参碱治疗组低、中浓度组显效率分别为88.3％，88.3％，高浓度组为100％，有效率均为100％，阳性药物治疗组显效率为50％，有效率为100％。

4.3.3 大肠杆菌感染所致结膜炎各组中，苦参碱治疗组低、中、高浓度组的显效率均为100％，组间未见明显差异，明显高于阳性药物治疗组(83.3％)，各组有效率同为100％。

三种细菌感染所致结膜炎：药物治疗组在给药当天结膜充血症状即得到缓解。第2天分泌物明显减少。第3天结膜水肿症状得到有效治疗。第4天基本治愈。继续给药到10天痊愈；细菌对照组中金葡球菌和绿脓杆菌在第1次感染后1天出现结膜充血、结膜水肿和分泌物增多等结膜炎症状。第2天症状加重，结膜明显水肿伴有部分眼睑外翻。到第4天达到最重，结膜弥散性充血呈紫红色，结膜水肿至眼睑近半闭合，有大量的脓性分泌物使眼区潮湿或粘着。大肠杆菌在第1次感染后2天出现结膜充血、结膜水肿和分泌物增多等结膜炎症状。第3天症状加重，结膜充血呈深红色。到第4天达到最重，结膜弥散性充血呈紫红色，无法分辨出血管，结膜水肿明显，部分眼睑外翻。统计学结果分别见表15、16、17。

试验结论

上述试验结果表明，苦参碱滴眼液对金葡球菌、绿脓杆菌和大肠杆菌均具有较强的抑制作用。研究表明，苦参碱滴眼液对细菌性角膜炎具有一定的治疗作用。对细菌性结膜炎有很好的治疗作用。

提示：苦参碱滴眼液可作为治疗细菌性角膜炎和细菌性结膜炎的临床应用药物。

   表1 各稀释浓度苦参碱的抑菌率(％)(单位：μg·ml^-1  x±S n＝5)

     表2 细菌性角膜炎动物模型症状分级及评分标准

*将症状评分累加，0-4分为无角膜炎症状，5-7分轻度角膜炎，8-12分中度角膜炎，13-16重度角膜炎

    表3 细菌性结膜炎动物模型症状分级及评分标准

*将症状评分累加，0-2分为无角膜炎症状3-4分轻度角膜炎，5-6分中度角膜炎7-9重度角膜炎

   表4 苦参碱滴眼液对金葡球菌感染的角膜炎的疗效率表(％)

      表5 苦参碱滴眼液对绿脓杆菌感染的角膜炎的疗效率表(％)

    表6 苦参碱滴眼液对大肠杆菌感染的角膜炎的疗效率表(％)

    表7 苦参碱滴眼液对金葡球菌感染的结膜炎的疗效率表(％)

   表8 苦参碱滴眼液对绿脓杆菌感染的结膜炎的疗效率表(％)

   表9 苦参碱滴眼液对大肠杆菌感染的结膜炎的疗效率表(％)

    表10 苦参碱滴眼液对兔细菌性角膜炎的治疗效果

*苦参碱滴眼液治疗组与细菌感染对照组的比较：P<0.01

   表11 苦参碱滴眼液对兔细菌性结膜炎的治疗效果

*苦参碱滴眼液治疗组与细菌感染对照组的比较：P<0.01

   表12 苦参碱滴眼液治疗金葡球菌感染兔角膜炎各组症状评分表(x±S n＝6)

与对照组比较:*，P>0.05；△，P<0.05；△△，P<0.01

  表13 苦参碱滴眼液治疗绿脓杆菌感染兔角膜炎各组症状评分表(x±S n＝6)

与对照组比较:*，P>0.05；△，P<0.05；△△，P<0.01

  表14 苦参碱滴眼液治疗大肠杆菌感染兔角膜炎各组症状评分表(x±S n＝6)

与对照组比较:*，P>0.05；△，P<0.05；△△，P<0.01

   表15 苦参碱滴眼液治疗金葡球菌感染兔结膜炎各组症状评分表(x±S n＝6)

与对照组比较：*，P>0.05；△，P<0.05；△△，P<0.01

   表16 苦参碱滴眼液治疗绿脓杆菌感染兔结膜炎各组症状评分表(x±S n＝6)

与对照组比较:*，P>0.05；△，P<0.05；△△，P<0.01

  表17 苦参碱滴眼液治疗大肠杆菌感染兔结膜炎各组症状评分表(x±S n＝6)

与对照组比较:*，P>0.05；△，P<0.05；△△，P<0.01

二、本发明用于治疗病毒性角膜炎的药效学试验资料

摘要：通过对单纯疱疹病毒、腺病毒体外、体内感染模型抗病毒试验研究表明：苦参碱滴眼液对单纯疱疹病毒I型(Herpes Simplex Virus，HSV-I)、单纯疱疹病毒II型(HSV-II)、单纯疱疹病毒野株及腺病毒7型(Adenovirus，Ad₇)所至的细胞病变均有较强的抑制作用。提示：苦参碱滴眼液对病毒性角膜炎具有一定的临床治疗作用。

一、试验目的

本实验的目的在于通过体外、体内病毒感染模型，观察苦参碱滴眼液对单纯疱疹病毒I型(Herpes Simplex Virus，HSV-I)、单纯疱疹病毒II型(HSV-II)、单纯疱疹病毒野株及腺病毒7型(Adenoviruses，Ad₇)所引起病毒性角膜炎的治疗作用。

二、试验条件

1、受试药物：苦参碱(Matrine)为白色针状结晶粉末，无臭，味苦，久置空气中，有引湿性，并变为淡黄色。在乙醇、氯仿、甲苯及苯中极易溶解，在丙酮中易溶，在热水、石油醚中略溶。比旋度为+31.0°～+36.0°。苦参碱滴眼液，是由0.25％苦参碱粉末(纯度不少于98.0％)、透明质酸钠(1000μg·ml^-1)、对羟基苯甲酸乙酯(300μg·ml^-1)加氯化钠调节等渗配制而成的复方制剂。由长春长庆药业集团有限公司提供，批号：040102。

2、剂量选择：体外试验，剂量根据各药物对培养细胞的毒性试验结果决定(见表1)。体内试验，根据苦参碱滴眼液单次刺激和多次刺激实验测定结果设试验浓度分别为：低剂量组2000μg·ml^-1、中剂量组4000μg·ml^-1、高剂量组10000μg·ml^-1。

3、药物配制方法：

体外试验：将苦参碱粉末、透明质酸钠及对羟基苯甲酸乙酯用含有2％小牛血清的IMDM细胞培养液配制，经高压无菌滤膜(0.22μm)过滤成试验用各浓度待用，使药物含量符合试验要求。

体内试验：根据上述设定的试验浓度配制，低剂量组用生理盐水将苦参碱粉末200mg，透明质酸钠100mg，对羟基苯甲酸乙酯30mg定容至100ml；中剂量组用生理盐水将苦参碱粉末400mg，透明质酸钠100mg，对羟基苯甲酸乙酯30mg定容至100ml；高剂量组用生理盐水将苦参碱粉末1000mg，透明质酸钠100mg，对羟基苯甲酸乙酯30mg定容至100ml待用。

4、仪器：电子恒温培养箱，HH·B11·500型，中国上海；SARTORIUS GMBH GOTTINGEN精密天平(精度：0.00001)，德国；双人超净工作台，SW-CT-ZF型，中国苏州；低速离心机LD4-2A，中国北京；酶标仪，DG3022型，中国南京；倒置式生物显微镜，XSB-1A型，中国上海；电热鼓风干燥箱，101A-2型，中国上海；真空冷冻干燥机，MRK，日本；手提式蒸汽消毒器，YXQ·SG4b·280型，中国上海；YZ-5F型裂隙灯，中国成都。

5、试剂：IMDM细胞培养液，GIBCO公司，美国；新生小牛血清，大连生化试剂厂；

胰蛋白酶，SIGMA，美国；塞唑蓝[MTT，3-4，5-dimethylthiazo(-2-yl)-2，5-diphenylte-trazoliumdromide]，SIGMA，美国。盐酸布比卡因，上海禾丰制药有限公司，批号：0306031。20％荧光素钠注射液(FluoresceinSodium Injection)，规格：3ml，0.6mg，广西梧州制药公司出品，批号：980223，试验前用蒸馏水配置成2％浓度待用。

6、阳性对照药物：阿昔洛韦滴眼液(Aciclovir Eye Drops)(仅体内试验用)，武汉五景药业有限公司，批号：05010301，规格：8ml：8mg。病毒唑(利巴韦林注射液)，苏州第六制药厂，批号：061027，规格：100mg×10支，临用时以IMDM细胞培养液配制所需浓度(仅体外试验用)。

7、细胞：人羊膜(FL)细胞。由吉林大学再生医学科学研究所病毒研究室提供。

8、病毒株：单纯疱疹病毒I型(Herpes Simplex Virus，HSV-I)、单纯疱疹病毒II型(HSV-II)、单纯疱疹病毒野株(20040517，本室分离)及腺病毒7型(Adenovirus，Ad₇)。均由吉林大学再生医学科学研究所病毒研究室提供。

9、实验动物：日本大耳白兔66只，雌雄各半，体重2-2.5kg，等级：普通，购于吉林大学基础医学院实验动物中心，合格证号：(吉)2003-0001，动物饲养合格证号：(吉)2003-0001，饲料合格证号：(吉)2004-0004。

三、实验主要步骤和结果

(一)体外抗病毒实验

1.苦参碱滴眼液及利巴韦林注射液对体外培养人羊膜(FL)细胞毒性测定

将苦参碱粉末、透明质酸钠及对羟基苯甲酸乙酯用含有2％FBS的IMDM配制成不同浓度的苦参碱滴眼液，其中苦参碱浓度分别为：600、500、400、300、200、100、50、25μg·ml^-1，各浓度中透明质酸钠浓度均为1000μg·ml^-1，对羟基苯甲酸乙酯浓度均为300μg·ml^-1。将利巴韦林注射液用含有2％FBS的IMDM配制成800μg·ml^-1的溶液。在人的羊膜(FL)细胞上以MTT法分别测定最大无毒剂量(TD₀)和半数中毒剂量(TD₅₀)。苦参碱对人羊膜(FL)细胞的TD₀为625μg·ml^-1，利巴韦林注射液的TD₀为800μg·ml^-1。(结果见表18)

2.实验分组：体外试验设正常细胞对照组、完全病毒感染组、阳性药物利巴韦林注射液对照组和试验组。试验组自TD₀开始分别设600、500、400、300、200、100、50、25μg·ml^-1 8个浓度组，利巴韦林注射液的试验浓度为800μg·ml^-1。

3.抗病毒实验：人的羊膜(FL)细胞2.0×10⁵Cell/0.1ml接种于96孔板，待培养24小时贴壁后，分别以100TCID₅₀的单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、单纯疱疹病毒野株及腺病毒7型感染相应宿主细胞，保持2小时倾出，将待测药物自最大无毒浓度(TD₀)开始分别设：600，500，400，300，200，100，50，25μg·ml^-18个浓度组，加入细胞，阳性对照药物使用TD₀浓度加入细胞，显微镜下观察CPE，根据CPE的破坏程度分为4级，即+———为≤25％，++——为≤50％，+++—为≤75％，++++为≤100％(结果见表19、20)。待病毒对照组CPE为++++时，记录各试验组细胞病变程度、拍照，同时进行病毒繁殖抑制试验，MTT检测结果表明，苦参碱滴眼液对单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、单纯疱疹病毒野株及腺病毒7型均有较强的抑制作用(见表19、20)。以上各试验组均与病毒对照组进行t检验，各药物试验组与病毒对照组比较均具有显著性差异水平(P<0.01)。

(二)体内抗病毒实验

1、兔病毒性角膜炎的动物模型的制备试验动物饲养一周，检查其双眼均未见异常，开始参照角膜环钻法和上皮划痕法造模(正常对照组除外):0.75％利多卡因表面麻醉，6mm环钻在角膜中央作一压痕印记，并在其压痕内作“#”划痕(深度仅限上皮层)。手术刀刮除角膜上皮，用微量取样器取10TCID₅₀的单纯疱疹病毒I型或腺病毒7型50μl病毒悬液，滴入兔眼结膜内，闭合眼睑并按摩1min。HSV-I型感染组在第一次感染后4天出现角膜结膜炎症状：畏光、流泪、角膜散在或弥漫性混浊，基质水肿。Ad₇型感染组在第一次感染后5天出现角膜结膜炎症状。荧光检查：给予2％荧光素钠染色，在裂隙灯下观察角膜着色和混浊范围为原病变范围的1/2到整个角膜。经检验造模成功即开始治疗，治疗周期为10天。

2、实验分组及给药试验动物随机分成11组，每组6只，雌雄各半，分别为：正常对照组；单纯疱疹病毒I型病毒感染对照组；单纯疱疹病毒I型阳性药治疗对照组；单纯疱疹病毒I型苦参碱滴眼液治疗试验组；腺病毒7型病毒感染对照组；腺病毒7型病毒阳性药治疗对照组；腺病毒7型苦参碱滴眼液治疗试验组。各药物治疗试验组中再分别设3个剂量组:苦参碱滴眼液高剂量组(10000μg·ml^-1)，苦参碱滴眼液中剂量组(4000μg·ml^-1)，苦参碱低剂量组(2000μg·ml^-1)。各组兔每眼每2小时给药一次，每日给药6次，每次0.1ml，连续给药10天。病毒感染对照组每日给生理盐水。

3、病变判断标准

3.1症状观察判断标准每天进行观察，以单眼为观察对象，综合多种症状并结合Trouzdale标准(病变面积小于角膜面积的25％为1分；26％～50％为2分；51％～75％为3分；76％～100％为4分)，制定出本实验对角膜炎症状评分标准(见表21)，运用独立样本组间比较进行统计学处理。

3.2荧光素钠染色观察判断标准于给药后第2、4、6、8、10天给予2％荧光素钠染色，在裂隙灯下观察角膜上皮缺损范围并记录后，进行统计学处理。参考Wander等的上皮性角膜炎分级判断标准进行评分：0级：(-)，无着色和混浊；1级：(+)，着色和混浊范围为原病变范围的1/4以内；2级:(++)，着色和混浊范围为原病变范围的1/4～1/2；3级:(+++)，着色和混浊范围为原病变范围的1/2～3/4；4级:(++++)，着色和混浊范围为原病变范围的3/4以上。每度间的病变密度与深度可记为0.5度。

4、试验结果

4.1 疗效标准

显效：全部症状消失或主要症状体征消失，疗效率≥60％；有效:主要症状体征基本消失，疗效率≥30％；无效:各方面症状体征无改善，疗效率<30％。疗效率＝(1-治疗后积分/治疗前积分)×100％(见表22、23)。并对最终治疗效果(见表26)进行统计学评价。

4.2 对病毒性角膜炎治疗效果的评价

症状观察疗效结果单纯疱疹病毒I型感染组中，苦参碱治疗组低、中、高浓度组的显效率分别为88.3％，88.3％，88.3％，有效率均为100％，组间未见差异，阳性药物治疗组显效率为66.7％，有效率为100％。腺病毒7型感染组中，苦参碱治疗组低、中、高浓度组的显效率均为83.3％，明显高于阳性药物治疗组(50％)，各组有效率同为100％。苦参碱滴眼液对单纯疱疹病毒1型感染组及腺病毒7型感染组均有很好的治疗效果。(见表24、25)

荧光素钠染色观察疗效结果

HSV-I型感染各组角膜病变分别在用药后第6天明显好转，荧光素钠染色后，裂隙灯下观察病变范围(荧光素钠着色面积)较治疗前明显缩小，浸润点减少，与HSV-I病毒组比较有极显著差异(P<0.01)。给药10天后各组角膜荧光素钠染色基本无着色和混浊，全部治愈。与阳性药物阿昔洛韦对照组比较，其作用无明显差异(P>0.05)。(见表27)

Ad₇型感染各组角膜病变分别在用药后第4天开始好转，荧光素钠染色后，裂隙灯下观察病变范围(荧光素钠着色面积)较治疗前缩小，染色部位黄绿色荧光变淡，与Ad₇病毒组比较有显著差异(P<0.05)。给药10天后各组角膜荧光素钠染色基本无着色和混浊，全部治愈。与阳性药物阿昔洛韦对照组比较，其作用无明显差异(P>0.05)。(见表28)

5、对靶器官(角膜)病毒繁殖的抑制作用

连续3天以单纯疱疹病毒I型10^-2，腺病毒7型10^-2角膜创伤感染，感染后实验组每天继续按上述剂量给予药物滴眼，10天后活取兔角膜匀浆制成悬液，离心并冷冻真空浓缩上清液，微量滤器滤菌后，定量。按10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6进行稀释接种FL细胞，每天观察CPE，待病毒对照组细胞90％以上出现病变后，计算各实验组角膜悬液中的病毒滴度(TCID₅₀)，与病毒对照组比较，以TCID₅₀降低1个对数值以上判为有效，确定药物在动物体内对病毒颗粒增殖的影响，各实验组与病毒对照组比较，TCID₅₀均降低一个以上对数值，表现出显著差异。表明苦参碱滴眼液对单纯疱疹病毒I型和腺病毒7型引起的病毒性角膜炎均具有较好的治疗作用。(见表29、30)

四、试验结论

体外试验结果表明，苦参碱滴眼液对单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、单纯疱疹病毒野株及腺病毒7型均具有较强的抑止作用。体内研究结果提示:苦参碱滴眼液对病毒性角膜炎具有较好的治疗作用。

表18 各组实验药物对体外培养人羊膜(FL)细胞中毒浓度的计算结果

表19 各组实验药物对HSV-I型及Ad₇病毒繁殖的抑制作用(x±S n＝4)

与病毒对照组比较：*，P<0.01，呈极显著差异。

表20 各组实验药物对HSV-II及HSV野株繁殖的抑制作用(x±S n＝8)

与病毒对照组比较：*，P<0.01，呈极显著差异。

表21 病毒性角膜炎动物模型症状分级及评分标准

*将症状评分累加，0-4分为无角膜炎症状，5-7分轻度角膜炎，8-12分中度角膜炎，13-16重度角膜炎。

表22 苦参碱滴眼液对HSV-I型病毒性角膜炎的疗效率表

表23 苦参碱滴眼液对Ad₇型病毒性角膜炎的疗效率表

表24 HSV-I感染兔角膜炎各组症状评分表(x±S n＝6)

与对照组比较:*，P>0.05；△，P<0.05；△△，P<0.01

表25 Ad₇感染兔角膜炎各组症状评分表(x±S n＝6)

与对照组比较:*，P>0.05；△，P<0.05；△△，P<0.01

表26 苦参碱滴眼液对兔病毒性角膜炎的治疗效果

表27 HSV-I感染兔角膜炎荧光素钠染色评分表(x±S n＝6)

与对照组比较:*，P>0.05；△，P<0.05；△△，P<0.01

表28 Ad₇感染兔角膜炎荧光素钠染色评分表(x±S n＝6)

与对照组比较；*，P>0.05；△，P<0.05；△△，P<0.01

表29  苦参碱滴眼液对兔角膜HSV-I的抑制作用

表30 苦参碱滴眼液对兔角膜Ad₇的抑制作用

Claims (8)

1、一种经粘膜吸收效果好具有抗菌、消炎、抗病毒药效的苦参碱滴眼液，其特征在于：它包括下述成份及重量百分比：苦参碱0.05％～0.8％，氯化钠0.5％～1.2％，透明质酸钠0.01％～1％，对羟基苯甲酸乙酯0.01％～1％，余量为注射用水。

2、根据权利要求1所述的苦参碱滴眼液，其特征在于：所述的成份及重量百分比：苦参碱0.25％，氯化钠0.83％，透明质酸钠0.1％，对羟基苯甲酸乙酯0.03％，余量为注射用水。

3、根据权利要求1或2所述的苦参碱滴眼液，其特征在于：所述的氯化钠或者采用氯化钾、氯化钙、氯化钠的混合液。

4、根据权利要求1或2所述的苦参碱滴眼液，其特征在于：所述的对羟基苯甲酸乙酯或采用季铵盐类、醇类、有机汞类、山梨酸或洗必泰眼用制剂的防腐剂。

5、一种苦参碱滴眼液的生产方法，其特征在于：先将80％注射用水加热至75-90℃，在搅拌下分别加入一定量的苦参碱、氯化钠至溶解，调节pH值范围为6.5～7.5；在搅拌下加入一定量的对羟基苯甲酸乙酯至溶解，然后再加入透明质酸钠溶液，加注射用水至全量，搅拌使均匀，pH值范围为6.5～7.5；煮沸15-30分钟，经0.1μm无菌滤器过滤，降至常温在无菌条件下灌装后，经包装，即为苦参碱滴眼液成品；

上述成份的重量百分比是：苦参碱0.05％～0.8％，氯化钠0.5％～1.2％，透明质酸钠0.01％～1％，对羟基苯甲酸乙酯0.01％～1％，余量为注射用水。

6、根据权利要求5所述的苦参碱滴眼液的生产方法，其特征在于：所述的成份及重量百分比：苦参碱0.25％，氯化钠0.83％，透明质酸钠0.1，对羟基苯甲酸乙酯0.03％，余量为注射用水。

7、根据权利要求5或6所述的苦参碱滴眼液的生产方法，其特征在于：所述的氯化钠或者采用氯化钾、氯化钙、氯化钠的混合液。

8、根据权利要求5或6所述的苦参碱滴眼液的生产方法，其特征在于：所述的对羟基苯甲酸乙酯或采用季铵盐类、醇类、有机汞类、山梨酸或洗必泰眼用制剂的防腐剂。

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