CN1863599A - 具不同可湿性的样品呈递装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在进行分析测量时有用的样品呈递装置。将这些装置配置成能够进行多方面液体处理诸如滞留、贮存、转运、浓缩、定位和转移。此外,这些装置能够增强分析物的检测和鉴定。本发明的样品呈递装置由一个或多个具有多个不同可湿性区域的基底组成。本文公开了使用本发明样品呈递装置分析样品的方法以及制造样品呈递装的方法。
Description
发明背景
发明领域
本发明涉及在进行分析测量中有用的样品呈递装置。此外,本发明涉及该样品呈递装置的制造和用法。
背景
涉及对样品进行某种化学和生物分析的大多数科学领域要求研究人员能够鉴定和测量水溶液中存在的复合物或分析物(例如血浆中蛋白质的测量或溪流径流中杀虫剂的测量)。本文中,分析物通常指研究者感兴趣的液体样品的成分。一般地,将包含分析物的流体样品借助于容器(如:试管、多孔板或比色杯)或其它呈递装置(如:载玻片或生物芯片)呈递到分析测量仪器上。由于最重要的目的在于快速测量大量样品(因此称为样品的“高通量”测量),所以将许多注意力用于开发能与自动化分析仪器连用的标准化容器和装置上。例如,在药物研发领域,对筛选候选药物感兴趣的研究者经常使用各种分析技术(如:荧光偏振检测)筛选数千甚至数百万种可能的候选药物,其中许多分析技术用标准的384孔板来容纳包含候选药物的样品溶液。同样地,在从基因组学和蛋白质组学、药物研制、临床诊断到环境或生物毒素或制剂分析(如评估环境污染和筛选可能用于生物恐怖主义的物质)的大范围的科学领域中,样品呈递装置构成了研究者的分析设备中非常重要的组成部分。
例如,在基因组学和蛋白质组学中,其焦点分别是鉴定和研究DNA/RNA和蛋白质/肽。这些领域共同涉及对活的生物体中的化学和生物部分、它们之间的相互作用以及辨别它们的分析技术进行系统研究。了解复杂的生命系统而非单个细胞成分是两个领域中当前生物学和生物医学研究的主要焦点。具体而言,基因组学的首要目的是测序和产生整个生物体基因含量的庞大数据库。已经编译出细菌、酵母、线虫和果蝇的基因组并且最近已编译出人类基因组。相似地,蛋白质组学是对细胞中特定时期表达的所有蛋白质进行研究,其首要目的是获得能用于使用数据库匹配工具鉴定整个蛋白质的部分蛋白质氨基酸序列,这与蛋白质完全测序不同。蛋白质的鉴定许可进行蛋白质表达的研究(重要的是鉴定在不同条件下差异表达的蛋白质和代表疾病状态的生物标记)以及对蛋白质相互作用进行作图(这有助于完善细胞结构图)。因为蛋白质是生物物质的主要成分并且行使几乎所有关键的生物功能(从调节反应到运输氧,再到提供细胞和细胞外结构),所以了解蛋白质的作用对于我们了解生命系统至关重要。和基因组学一样,发展中的蛋白质组学领域已经产生了关于人类和其它生物蛋白质组的信息,并且虽然这些信息还不完整但是许多这类信息已储存于或者即将储存于数据库中。预计我们可以从这些基因组和蛋白质组数据库中获得许多对生命系统未来的理解。
在临床诊断学领域,研究者集中于鉴定和测量大范围的分析物。目的分析物可以是实际的候选药物,例如在临床试验中开展的生物利用度研究中,该研究揭示了候选药物在生物体各处存在的程度。备选地,目的分析物可以反映对候选药物产生的生理反应,例如在测量激酶的酶反应中磷酸化反应产物存在与否的例子中。由于激酶在细胞生长和繁殖中是重要的,所以在患有生长异常疾病(如癌症)的病人体内可观察到高水平的激酶活性。因此能降低激酶活性的药物是可能的抗癌治疗剂,并且检测此类候选药物疗效的分析方法通常集中于测量激酶反应产物形式的分析物的存在与否。对临床诊断和药物研发中重要分析物进行的此类以及其它类型的直接和间接测量方法依赖于利于该测量方法的分析技术和样品呈递装置的存在。
样品呈递装置的重要性决不仅仅局限在生物医学方面。例如,对测量环境污染(或复育)程度感兴趣的研究者需要能够监测各种环境样品,包括水、空气和土壤样品。许多用于分析此类样品的分析技术涉及对液体样品的分析,如水质研究例子中的样品或者土壤样品,其中所述土壤样品是通过在有机和/或无机溶剂中稀释以除去多种成分而提取出来的。因此,能呈递液体样品进行分析的样品呈递装置是完成这些分析测量的重要工具。
在后9.11世界,各国政府面临着在军事和国内场合需要易于化学和生物试剂检测的平台和分析技术。对生物战侦查的挑战包括样品收集以及对无毒和有毒的有机体的辨别。当前对于生物制剂的战场技术是利用热分解使生物化合物转变为更易于用质谱分析法(MS)检测的小分子。然而,由于依赖于蛋白质或肽生物标记的技术比目前已知的方法更为特异,所以可以预期该种依赖于蛋白质或肽生物标记的技术会发展并且能够同呼吸试验、尿分析或血液抽提技术联合使用以确定对战剂的潜在的暴露。诸如报警装置的独立生物传感器在战场和公共场所中的用途令人具有极大的兴趣。所有这些方法都显示出对样品收集、预处理和向检测器进行样品呈递方面的挑战。
为了鉴定和测量液体样品中的目的化合物如血清中的DNA、RNA、蛋白质和肽、环境样品中的环境毒素和试剂,已经开发出多种分析技术。在这些分析技术的每一种各自有用的同时,每项技术都至少部分地依赖于所采用样品呈递装置的类型。因此,这些装置的内在局限性可能对于使用这些分析技术测量目的化合物产生不利影响。
此外,许多聚焦于鉴定、分离或测量液体样品中分析物的分析技术要求样品经过分开的预处理步骤—即在使用特定分析技术分析样品以确定目的分析物存在及其数量之前处理样品。例如,许多蛋白质细胞提取技术产生复杂的蛋白质混合物并掺入去污剂和盐,而所掺入的去污剂和盐会干扰质谱分析,因此必须在分析蛋白质之前去除。当前的分级分离和纯化方法是耗时的。其它纯化方法(如用于纯化蛋白质的液相层析法和凝胶电泳法)一般涉及体积大于10μL的样品回收,这迫使在用多种蛋白质检测技术(如MALDI-MS)分析之前进行额外的浓缩。对当前已知分析技术—以及与它们相连的样品呈递装置—的需求强化了样品纯化、样品制备、自动化数据采集和自动化数据分析的重要性。
例如,在蛋白质组学领域中最常用和最优选的质谱分析法是基质辅助激光解吸电离质谱分析法(MALDI-MS)。MALDI-MS是标准激光解吸飞行时间质谱分析法的变种,其中在大量摩尔过量的酸性、吸收紫外线的化学基质(例如,烟酸)存在下将相对高分子量的蛋白质沉积在表面上。该技术使得这些高分子量的不稳定大分子以完整状态进行解吸。因为质谱分析法以适中的费用提供了微量样品的质量准确度、敏感监测和快速分析,所以其已经成为蛋白质组学工作中重要的分析工具。
然而,MALDI-MS存在多种缺陷,尤其是与样品制备有关的问题。因为它们不能容下多于2μL的样品体积,所以当今的MALDI-MS样品支持物全部受到严格的样品体积限制。通常使用高达2μL的体积,并且提供直径为1mm-2mm的干点(dried-droplet)(Karas,M.和Hillenkamp,F.,Anal.Chem.1988,60,2299-2301,本文整合作为参考)。由于在单点数据采集过程中激光只照射干点的一小部分(0.015mm2-0.030mm2),所以不能保证样品中的所有蛋白质都被检测到。此外,样品体积(高达2μL)明显小于常规样品纯化后所回收的体积,这迫使在MALDI-MS之前进行进一步的浓缩;例如,通过液相层析和电泳方法纯化的肽和蛋白质样品通常回收于大于10μL的体积中。结果,在MALDI-MS之前必须对该样品进行进一步的浓缩。许多样品还包含干扰质谱分析的去污剂和盐,这迫使在MALDI-MS之前除去这些物质。
缺乏样品同质性是伴随MALDI-MS的另一个缺陷。当使用干点法点样时,由于样品异质性使得即使小至2μL的体积也存在问题。常规使用0.5-2.0μL的样品体积并进行干燥,其提供直径为1mm-2mm的干点(Karas,M.和Hillenkamp,F.Anal.Chem.1988,60,2299-2301,本文整合作为参考)。结果,只有干点中的小一部分(0.015mm2-0.030mm2)在单点数据采集过程中被激光照射到。不幸地,即使0.5-2.0μL的小体积也已知能造成样品异质性(分析物的异质性沉积),这导致当激光聚焦在干点的不同区域时会引起峰存在、强度、分辨率和质量准确度发生显著变化(Strupat,K.;Karas,M.;Hillenkamp,F.Int′l.J.Mass Spectrom.Ion Processes1991,111,89-102;Cohen,S.L.和Chait,B.T.Anal.Chem.1996,68,31-37;以及Amado,F.M.L.;Domingues,P.;Santana-Marques,M.G.;Ferrer-Correia,A.J.;Tomer,K.B.Rapid Commun.Mass Spectrom.1997,11,1347-1352,本文整合作为参考)。这些现象导致必须积累每个样品的大量单点波谱又要对质谱数据进行严格检查。因此,每台仪器每天仅能分析几百个样品,并且还常常避免采用自动数据采集。
已经证实当斑点直径降低至激光直径的数量级时能够使样品异质性的问题最小化。在该情况下,大部分样品能够被同时照射到,因此提高了灵敏度和可重复性(Little,D.P.;Cornish,T.J.;ODonnell,M.J.;Braun,A.;Cotter,R.J.;Koster,H.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1997,69,4540-4546;以及Gobom,J.;Nordhoff,E.;Mirgorodskaya,E.;Ekman,R.;Roepstorff,P.J.Mass Spectrom.1999,34,105-116,本文整合作为参考)。在美国专利号6,287,872中描述的样品支持物得到进一步的描述(Schuerenberg,M.;Lubbert,C.;Eickhoff,H.;Kalkum,M.;Lehrach,H;Nordhoff,E.Anal.Chem.2000,72,3436-3442,本文整合作为参考),其中显示将分析物限制沉积至小的斑点直径内不仅减少了与样品异质性相伴的问题,而且明显提高了检测灵敏度。其缺陷是要获得该预期的斑点大小,必须将样品体积减少至低于2μL。
为了克服这些样品体积和杂质问题,研究者已经使用了经设计的样品支持物或者用于样品预处理的小型柱。此类样品支持物的实例是商业可得的,如来自Bruker Daltonics GmbH的AnchorChipTM。该AnchorChipTM产品通过在精确限定的位置浓缩样品而提高MALDI-MS的灵敏度,并且具体而言,该产品包含携带可湿性亲水点阵列的不可湿性疏水材料薄层。与AnchorChipTM使用相伴的主要局限性是要求应用于每个锚定点(anchor)的液体样品体积限制在0.5μL-3.0μL(关于AnchorChipTM靶的样品制备的十一条通则中的第一条,见AnchorChipTM技术,第1.6版,Bruker DaltonicsGmbH,2000年11月,本文整合作为参考);该厂商在该产品的文献中提供的实例进一步将液体样品滴的体积限制在或者0.5μL或者1.0μL。另一局限性是分析物和污染物(盐、去污剂)经常在激光照射区域被浓缩。因此,如上所述,样品在应用到质谱仪样品支持物上之前首先必须脱盐和/或在ZipTip或相似的小型柱样品制备设备上进行浓缩(Millipor公司生产的ZipTips是用于样品浓缩和脱盐的微型柱,它是通过用反向层析介质填塞移液管移取尖而制备的(Rusconi,F.;Schmitter,J.-M.;Rossier,J.;le Maire,M.Anal.Chem.1998,70,3046-3052,本文整合作为参考))。然而,使用国产的微型柱或商品化的ZipTips是耗时的、成本相当高、并证明难以自动化并且通常只能实现样品材料的中等回收。因此,AnchorChipTM具有与当今其它MALDI-MS样品支持物相关的许多相同局限性。
已经开发出用于血清样品蛋白质剖析(protein profiling)的MALDI-MS备选技术。该技术称作表面增强激光解吸电离质谱分析法(SELDI-MS),并且其已在发现卵巢癌生物标记及前列腺癌分化和良性前列腺增生生物标记方面取得结果。在开展SELDI-MS时,首先将分析物选择性地滞留在作为亲和捕获装置的样品支持物上,其中所述样品支持物具有功能化表面。然后在捕获位点通过激光解吸将滞留的分析物电离以便能够对它们进行检测,其不需要像其它液相层析-质谱联用方法那样要求实现它们从滞留表面的回收。SELDI-MS描述于美国专利号5,719,060、5,894,063、6,020,208、6,027,942、6,124,137、6,225,047和6,579,719,本文全部整合作为参考。不管最近报道的结果如何,SELDI-MS方法经常在操作过程中出现问题,这是因为在激光解吸电离过程中在滞留生物分析物方面最佳的表面在分析物的呈递方面不是最佳。
还使用了其它用于分离和纯化诸如蛋白质的分析物的技术。例如,通过双向凝胶电泳和多维液相层析的耗时技术进行生物样品分级分离和纯化的方法是众所周知的,其是较快的、低灵敏度的技术,如带有层析床的消耗性柱或移液管移取尖。用于分离蛋白质混合物的凝胶电泳可以是一维的或二维的。在一维凝胶电泳(也称作SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳))中,蛋白质混合物仅通过它们的分子量进行分离。在二维凝胶电泳(也称作2D-PAGE)中,混合物先通过它们的等电点进行分离,随后通过它们的分子量进行分离。该技术的一个缺陷是此方法的分辨率低,即每个分辨点可能包含一种以上的蛋白质。另一缺点是用于观察分离的染料不能够对所有蛋白质染色。液相层析(LC)以“高效液相层析”(HPLC)或“多维液相层析”(如果使用了不止一根层析柱)为人们所熟知。LC的优点通常在于可以利用不同的柱化学作用。与不能有效分离更小的肽的凝胶电泳相比,LC能用于从酶消化物中分离肽混合物。固相萃取法(SPE)提供了快捷方式的纯化并且其用于从有机合成到环境样品采集的许多领域。该方法比液-液萃取法或HPLC更快,其消耗更少量的溶剂并且能用于从气体或液体样品中提取分析物。SPE技术在多种装置中提供,列举一些如移液管移取尖、柱、膜和384-孔板。
在药物研发过程中,还开发出在已知分析方法中使用的其它样品呈递装置。例如,ADMET(吸收、分布、代谢、排泄、毒性)研究中使用的Empore卡(http://www.3m.com/empore),这是包埋在膜中的C18RP(反向)吸附剂,其声称能够减少样品纯化步骤的次数,并且由于加载的样品保持干燥,所以还可以存档和浓缩。样品纯化需要三个步骤:加载样品至卡上,将卡转移到洗脱仪并且将100%的样品直接洗脱到质谱仪中。如果洗脱体积能够尽可能低,则Empore卡能用于将肽消化物样品加载到MS上,否则低浓度肽将低于检测限度。
因此,需要这样一种样品呈递装置,其能连接各种分析方法以便高灵敏度检测生物和化学部分。此外,还需要这样一种样品呈递装置,其与从液相层析和电泳分离以及其它分离/纯化技术中常规回收的样品体积兼容、将包含分析物的液体样品指向所限制区域以便使与样品异质性相伴的问题最小化、导致检测灵敏度增加。如果能得到此种样品呈递装置,则能够实现样品处理的自动化,例如,生命科学产业的标准化多孔板处理器和液体处理机器人。更重要地,它们还能够直接收集层析洗脱物并随后用MALDI-MS分析。而且,这些能力将共同提高使用多种本领域技术人员已知的分析技术对生物和化学部分进行通量检测和测量。本发明的这些好处及其它好处在下文中进行更详细的描述。
发明概述
对于在鉴定化学个体和生物体的各种分析方法中使用的已知的样品呈递装置而言,本发明的样品呈递装置提供了具有吸引力的替代选择。此外,本发明提供了制造该样品呈递装置的方法以及使用它们对包含于液体样品中的分析物进行大范围分析测量的方法。本发明的样品呈递装置独特的性质在于克服了伴随已知分析技术和与它们相连的样品呈递装置或容器的许多缺点(如上所述)。
在诸如基因组学、蛋白质组学、药物研发、临床诊断学、生物传感器以及环境毒素和试剂检测领域,用于鉴定化学和生物部分的技术是质谱分析法,其中通常只能得到极少量样品并且期望对大量样品进行快速通量处理。其它的分析物检测方法如荧光偏振、免疫荧光光谱法、凝胶层析法、离子交换层析法、亲和层析法也能够用作生物和化学部分的高通量检测,因此也能与本发明的样品呈递装置联用。
本发明的样品呈递装置提供了在多种分析方法中使用的已知样品呈递装置的具有吸引力的替代选择。例如,本发明使体积高达100μL的分析物选择性地滞留并浓缩于生物芯片表面上。此外,由于分析物是从设计成基本上不结合或抵抗结合的样品呈递装置的一部分进行检测,所以与在基于生物芯片的亲和捕获装置表面上直接检测或者在其表面对分析物具有明显亲和性的其它样品呈递装置表面上直接检测相比,其检测灵敏度更高。
由于在优选实施方案中发明的样品呈递装置只需要一次液体操作,所以本发明进一步使伴随分析物从一个表面转移至另一表面过程的潜在损失最小化。这与样品呈递装置表面低抗分析物的性质一起导致目的分析物损失的降低,而在已知的方法中存在这种目的分析物的损失。与SELDI-MS不同,本发明不涉及所结合分析物从亲和捕获装置的捕获位点的解吸过程,而是使用这样一种样品呈递装置,其中分析物是从分析物对其没有可感知亲和性或没有结合的表面进行解吸的。
此外,液体样品能以可控方式在本发明的样品呈递装置上进行操作和移动。这使得样品能够浓缩于分析物与样品呈递装置基本上不结合的分析区域。而且,这还允许将包含分析物的样品移动至表面的不同区域,其中每一区域对于分析物而言具有不同的性质,这使得能在检测之前对分析物进行纯化、分离和/或修饰。此外,本发明涉及这样的样品呈递装置,其表面不同部分的性质可以响应不同化学或物理刺激(如,热、紫外辐射)而变化,以致于可以在样品处理过程中操纵这种对于分析物而言的表面性质。可以将表面性质的此种变化设计成可逆的或不可逆的。
本发明样品呈递装置的这些性质及其它特征在下文中进行更详细的描述。本发明包含样品呈递装置、制造样品呈递装置的方法以及使用样品呈递装置的方法。
样品呈递装置
本发明涉及在进行分析测量中有用的样品呈递装置。在一个实施方案中,本发明涉及具有一个或多个对于待分析的各种样品而言可湿性不同区域的样品呈递装置。这些不同可湿性区域导致区域之间在滞留、浓缩和移动液体样品中分析物的能力不同。这些区域可以是多种形状和大小,并且可以彼此连续或不连续。
本发明的样品呈递装置可以由不同区域组成,其中一个区域在滞留液体样品方面是最佳的。本发明的样品呈递装置还可以包含不同可湿性的区域,其中一个区域在分析物的高灵敏度检测方面是最佳的。
本发明的样品呈递装置可以包含二维或三维的表面,其中每一表面都具有二个或多个不同可湿性的区域。
本发明的样品呈递装置包含可用多种材料制作的基底,这些材料包括但不局限于例如玻璃、半导体、金属、聚合物(例如塑料)和其它羟基化材料如硅上SiO2、铝上Al2O3等。基底优选金属(例如金)或者半导体(例如硅)。
本发明的样品呈递装置还包含这样的基底,即为了在基底表面产生多种区域已经通过本领域普通技术人员已知的方法对其进行了表面修饰,这些区域在可湿性方面具有不同性质。此种表面修饰包括但不局限于向基底添加自组装单层(SAM)、聚合物(线性的或分支的)和Langmuir-Blodgett组装物。以SAM为例,当将其加至基底后,SAM就形成了液体样品将要接触的样品呈递装置表面。依赖于所使用特殊SAM的组成,本发明样品呈递装置的表面在可湿性方面以及在对液体样品中分析物亲和性(或缺乏亲和性)方面具有不同的性质。可以以产生不同区域的方式将SAM加至本发明的样品呈递装置上,其中在特定区域中其性质反映了所使用的SAM。本领域技术人员已知的其它表面修饰技术也包含于本发明之中。
至于本样品呈递装置表面可以包括的区域种类,它们主要是依靠它们对被分析样品而言的不同可湿性来表征的,反过来,可湿性的不同又导致产生了滞留或结合液体样品中分析物能力不同的区域。将这些区域广义地称作“边界区”、“液体滞留区”和“分析区”。虽然本发明也考虑包含两种以上类型的区域,但本发明仅需要存在两种类型的区域。本发明还可以包括每一种类中的一个以上的区域—例如,样品呈递装置可以包含多个液体滞留区,其中每一区域对于液体样品和/或其中所包含分析物性质不同。
第一类区域被称为“边界区”,并且其包括对待分析样品而言基本上不可湿的区域。与其它区域相比,边界区是具有最高样品接触角的区域。
对于待分析的样品,第二类区域(被称为“液体滞留区”)可湿性比边界区可湿性相对更高(并且与分析区相比可湿性相对较差,下述)。液体滞留区的接触角相对低于边界区的接触角(并且接触角相对高于分析区的接触角,下述)。液体滞留区起初还可以具有等于或低于分析区的接触角,但是由于化学或物理刺激使得液体滞留区呈现出比化学或物理刺激前的分析区更高的接触角,所以就导致将液体样品指向了比另一个区域优选的一个区域。
可以将液体滞留区分为两个亚类。在一个亚类中,将液体滞留区设计成能够实现液体样品滞留的目的,同时又基本上抵抗分析物的结合。在第二个亚类中,将液体滞留区设计成不但能够滞留液体样品而且还能够基本上结合液体样品中的分析物,由于其能够捕获分析物因此将其称作“捕获区”。该第二亚类还可以包括这样一种表面,即能够相当大的结合分析物,但当受到诸如紫外辐射、电流或热的化学或刺激物理后变为基本上不结合的表面。
第三类区域被称为“分析区”,并且其是与其它区域相比对于样品的可湿性最大(并且具有最低的接触角)的区域。分析区被设计成为分析物结合抵抗的。可以根据大小、形状和表面性质优化分析区以便提高对目的分析物的分析灵敏度。
本发明样品呈递装置的液体容量取决于区域的大小。对于3mm直径的圆形区域,其液体容量可以高达大约100μL。该样品呈递装置能够容纳该数量的液体样品而无需物理边界、储蓄器或孔。各种区域可以被精确定位,以便易于多种分析仪器如质谱分析仪上的高通量自动装置或者与其兼容。
在本发明样品呈递装置的另一个实施方案中,样品呈递装置被称为“靶芯片(target chip)”,简写为Tn,其中“n”是关于样品呈递装置表面上不同区域的数量的数字标记,并且其中“n”可以是从2至无穷大之间的任意数字。因此,例如,T2靶芯片具有两个区域,T3靶芯片具有三个区域,等等。本发明考虑了包含许多多于2个或3个区域的样品呈递装置,并且本发明不以任何方式将区域限制于特定数量。随着区域数量的增加,总的效果接近于梯度。靶芯片是由被设计成对抵抗分析物结合的一个或多个区域组成的样品呈递装置。
例如,至于T2靶芯片,该样品呈递装置包含两个区域—即边界区和分析区。将接触液体样品的区域表面设计成分析物结合抵抗的—即分析区是分析物结合抵抗的。在分析之前的干燥步骤期间,接触液体样品的区域表面有效地限制了分析物。
至于T3靶芯片,样品呈递装置包含三个区域-即边界区、液体滞留区和分析区。将接触液体样品的区域表面设计成分析物结合抵抗的-即液体滞留区和分析区是分析物结合抵抗的。在干燥步骤期间,接触液体样品的区域表面有效地将分析物浓缩至分析区。
因此,本发明的样品呈递装置可以包含不同的区域,其中每一区域表现出对分析物最低限度的吸附。
在本发明样品呈递装置的另一个实施方案中,可以将样品呈递装置称作“捕获芯片”或“捕获/浓缩芯片”,并简写为Xn,其中“n”是关于样品呈递装置表面上区域数量的数字标记,并且“n”可以是从2至无穷大之间的任意数字。因此,例如,X2靶芯片具有两个区域,X3靶芯片具有三个区域,等等。本发明考虑了包含许多多于2个或3个区域的样品呈递装置,并且本发明不以任何方式将区域局限于特定数量。随着区域数量的增加,总的效果接近于梯度。捕获芯片和捕获/浓缩芯片是由设计成结合分析物的一个或多个区域组成的样品呈递装置。
例如,至于X2捕获芯片,样品呈递装置包含两个区域—即边界区和捕获区。基于捕获区表面的化学或生物性质将接触液体样品的区域表面设计成能够捕获分析物—即捕获区结合分析物。在分析之前的干燥步骤期间,接触液体样品的区域表面有效地限制了分析物。
至于X3捕获/浓缩芯片,样品呈递装置包含三个区域—即边界区、捕获区和分析区。将边界区设计成基本上不可湿的。将捕获区设计成能够捕获和结合分析物。将分析区设计成分析物结合抵抗的。在通过多种已知分析检测方法之一进行分析之前,将分析物在捕获区和分析区之间转移。在分析之前的干燥步骤期间,包含液体样品的分析区表面有效地限制了分析物。利用捕获区表面的性质可以实现液体样品从捕获区到分析区的转移—即,如果捕获区比分析区的可湿性程度低,那么不需要物理干预液体样品也将从捕获区移动至分析区。备选地,也可以对捕获区进行设计,使其性质能够响应化学或物理刺激(如热、紫外辐射)而发生变化,从而导致捕获区的可湿性程度低于分析区,并因此导致液体样品从捕获区移动至分析区。
在本发明样品呈递装置的另一个实施方案中,样品呈递装置可以是上述靶芯片和捕获芯片的组合。在该实施方案中,样品呈递装置由具有不同功能性的表面组成。这些类型的样品呈递装置涉及通过机械方法(如通过移液管移取)或其它方法(如通过区域之间可湿性的不同)将液体样品从一个区域转移至另一个区域。作为实例,“捕获-转移-浓缩芯片”(简写为X2-转移-T3)是由X2芯片以及T3芯片组成的样品呈递装置,其中所述的X2芯片由两个区域(即边界区和捕获区)组成,并且所述的的T3芯片由三个区域(即边界区、液体滞留区和分析区)组成。分析物的转移(机械转移或其它)发生于X2芯片的捕获区和T3芯片的液体滞留区之间。此外,涉及捕获区与液体滞留区联合的样品呈递装置的实施方案还可以以联合方式用于在对液体样品中的分析物检测之前对其进行分离、浓缩、纯化和修饰。因此,例如,可将液体样品置于T2芯片上以便将样品中的分析物限制在分析区。然后,将那些样品转移至包含边界区、捕获区和分析区的X3芯片。在该实例中,可将捕获区设计成能够结合(并因此去除)液体样品中的脂类部分,以致于当将样品应用于X3芯片时,其从边界区移至捕获区(其具有更高程度的可湿性),样品中的脂类部分结合于捕获区表面,而剩余的样品移至分析区(因为其具有最高程度的可湿性)。在该实例中,液体样品限制在T2芯片上,并且随后脂类在X3芯片上移动,以致于在分析区分析的最终样品是浓缩的并且是纯化成无脂类的。由于能将捕获区设计成结合多种不同分析物,并且可以使用这些区域的任何多种组合,所以能够创造出具有大范围纯化、浓缩、分离和修饰能力(关于一种或多种分析物)的样品呈递装置。
将液体样品从一个样品呈递装置转移至另一样品呈递装置的机制可以变化。使用以上实例,可机械性地(如通过移液管移取)移去从T2浓缩的样品,并置于分开的X3样品呈递装置上。备选地,通过一个区域来连接T2和X3样品呈递装置,该区域的可湿性会响应化学或物理刺激(如紫外辐射)而发生变化,以致于当T2样品呈递装置分析区和X3装置捕获区之间的区域暴露于紫外辐射时,就会使该区域的可湿性高于T2装置分析区但低于X3装置捕获区,因此在T2样品呈递装置分析区中浓缩的样品便转移至X3装置的捕获区,从而样品从T2转移至X3。再次地,运用巨大数量的表面(具不同的可湿性和不同的分析物结合性质)及其配置能够创造具有大范围纯化、浓缩、分离和修饰能力(关于一种或多种分析物)的样品呈递装置。
本发明的样品呈递装置还提供了具有不同形状或图案的不同可湿性区域。例如,在一实施方案中,样品呈递装置具有同心圆形式的区域,中央区域为分析区,分析区被液体滞留区包围,而液体滞留区被边界区包围。由于可以使用多种光图案化技术产生区域,并且由于已知的光图案化技术能够提供所得图案的极大变化,所以对于多种区域可以有大范围的可能形状、图案和配置。此外,不同可湿性区域的多种性质也许可制造出能将分析物指向表面上单个或多个指定或预先确定位置(例如可寻址位点、道或区域)的样品呈递装置。
本发明的样品呈递装置适于生物和非生物液体样品的处理。他们还适合应用于广范围的分析物检测方法中,这些方法例如(包括但不限于)质谱分析法、多种层析方法、免疫荧光光谱法和检测和测量液体样品中分析物的其它已知分析方法。
将上述变化的每一种都设计成在样品呈递装置的设计和使用中允许最大的灵活度,所述样品呈递装置具有比已知方法更强的呈递分析物进行检测和分析的能力。因此,本发明样品呈递装置具有将分析物指引向设计成能够提高分析物高灵敏度检测的分析区的能力。因此,本发明的样品呈递装置提供了改善的分析物沉积。
样品呈递装置的制造
本发明还有其它实施方案包括生产或制造上述样品呈递装置的方法。
在表面由自组装单层(SAM)组成(其中依赖于所使用SAM之间的差异自组装单层形成了不同的区域)的实施方案中,本发明的样品呈递装置包含通过已知光图案化技术产生的多种SAM区域。因此,本发明还包括使用作为一种优选方法的光图案化技术来制造由SAM组成的样品呈递装置的方法。
本发明样品呈递装置的基底表面一般通过本领域技术人员已知的方法进行修饰或图案化。作为实例,基底的表面可以通过应用自组装单层(SAM)进行修饰或图案化,其中用自组装单层对样品呈递装置基底的表面进行修饰并且其暴露的表面赋予基底特殊的化学性质。为特殊基底选择包括1°、2°、3°或4°成分的多种SAM,这为基底表面提供了独特的表面特征和性质。具体而言,应用多种SAM使基底图案化,以便其包含每一区域具有不同表面特性和性质的多个区域。将SAM图案化的方法是本领域已知的,并且包括紫外线光图案化、照相平板印刷图案化、微印(microstamping)、电子束图案化和反应离子蚀刻法。
在基底表面上产生的区域可以是任意形状的,优选圆形。此外,区域与其它区域或者是连续的或者是不连续的—即区域可以全部彼此相邻或者一个或多个区域与一个或多个其他区域不相邻。在样品呈递装置基底表面上产生的区域优选地具有对待分析样品而言可湿性不同的多个区域。
作为本发明的另一实施方案,其提供了制造能精确定位分析物以便利于自动化数据采集的样品呈递装置的方法。
样品呈递装置的用途和应用
在另一实施方案中,本发明的样品呈递装置在与多种分析技术和方法联用中具有很多用途。因此,本发明包括使用上述样品呈递装置的方法。更加具体而言,本发明包括使用本发明的样品呈递装置或者在一个样品呈递装置上或者在多个样品呈递装置上鉴定样品中分析物的存在以及分析多个样品的方法。
事实上,可以检测、鉴定或测量液体样品中分析物的任何方法都可以用于与本发明的样品呈递装置联用。此类分析方法的实例包括但不限于MALDI-MS或电喷雾电离MS。本样品呈递装置尤其适合与高通量分析测量技术联合使用,例如在MALDI-MS中使用,其中将样品呈递装置分析区以促进高通量数据采集的方式进行配置。
本发明的样品呈递装置还可以用于操作液体样品和其中所包含分析物。基于样品呈递装置表面可以被设计具有的不同可湿性特性和捕获特性,可将样品呈递装置设计用来操作、浓缩、定位、贮存、转移(通过和不通过机械干预)、回收(通过或不通过机械干预)、分析、修饰或加工(通过在样品呈递装置上使用分析物修饰试剂)、或者分级分离液体样品或其中所包含分析物。此外,由于可将本发明的样品呈递装置设计成能够响应化学或物理刺激(如热、紫外辐射、压力、电磁辐射)而完成这些功能的任何功能,所以本发明的样品呈递装置可以可逆或不可逆地实现这些功能,并且还可以响应外部压力进一步完成这些功能的多种组合。
任何液体样品(和分析物)都可以与本发明的样品呈递装置连接使用。例如,本发明可以用于分析从液相层析中回收的级分。本发明能够用于分析从2D凝胶电泳切下的蛋白质点或从亲和层析(即ICAT(同位素亲和标签))收集的级分制备的酶消化物。本发明还能够用于分析从生物传感器回收的样品。本发明还能够用于使用标准的多孔格式机器人技术和分析法进行1∶1样品转移。的确,本发明的样品呈递装置能够用来处理和操作从任何可能来源获得的液体样品,而不管此样品是实验室实验结果(例如上文鉴定的酶消化物和生物传感器样品实例)、还是从环境中获得的(例如来自河流的水质样品)、还是直接从活生物体获得的(例如人类尿样)。
本发明还能够用于为存档目的或为进一步分析而进行的样品贮存。换言之,对液体样品中所包含分析物的检测和分析不需要在将液体样品转移至分析区后立即进行。
因此,本发明的多种实施方案提供了能起到多种液体处理功能作用的样品呈递装置,其中这些功能包括但不限于样品/分析物处理以及液体沉积、滞留、转移、定位和再定位和贮存。
特征和优势
本发明除了上面发明概述部分所描述的许多特征和优势外,还至少包括下列额外的特征和优势:
检测存在于液体样品中分析物的分析方法(如MALDI-MS)能够在基本上不结合分析物的单一表面上进行,这导致分析灵敏度增加、结果可重复性增加并且来自不同捕获区的结果是可比的。
关于样品液体处理,其能够分析增加了的样品体积(对于3mm直径区域可多达大约100μL),能够将表面图案化为具有SBS(生物分子筛选学会(Society for Biomolecular Screening))的标准孔版式(即96/384/1536孔版式),并且因此其能够与常用机器人技术和其它高通量分析方法相接。
其能够使多种分析方法(例如MALDI-MS)的通量增加,因为为了进行高通量的数据采集区域被精确放置。至于MALDI-MS,其分析区为最佳大小(即小于2mm2,并且优选小于1mm2)。其样品/基质改善了结晶作用,这导致改善了分析区内电离一致性。与干点分析相比,其具有更小的分析区,导致被检测的面积更小,这可以实现高通量分析。
本发明的样品呈递装置能够通过在分析区将分析物浓缩来分析稀释的样品。
可以不需要多重分离步骤而分离液体样品中的分析物,多重分离步骤诸如将分析物结合于离子交换层析柱上然后不得不在随后的洗脱步骤中从柱上分离分析物。的确,通过使用具有不同表面化学性质的SAM(被设计成结合不同分析物)能够高特异性地分离和纯化特定分析物。
通过本发明的样品呈递装置能够处理大批液体样品和分析物,这避免了上述已知呈递装置和分析方法的缺陷。如下所述,虽然本发明样品呈递装置尤其适用于蛋白质组学领域和激光解吸电离质谱分析法,但是请求保护的装置的用途不以任何方式仅仅局限于那个领域。
附图简述
从对附图的详细说明中可以使本发明的上述目标以及其它目标变得明显,其中:
图1a描绘了本发明的样品呈递装置,其中中央的分析区和周围的液体滞留区为彼此同中心的,并且其中液体滞留区被边界区包围。图1b描绘的是图1a中所描绘样品呈递装置的横断面视图。
图2描绘了本发明样品呈递装置的表面,其中该表面进一步由16对分析区和液体滞留区组成,其中所述分析区和液体滞留区为彼此同中心的,并且其中成对的分析区和液体滞留区被共同的边界区包围。在该情况下,本样品呈递装置按照对应于标准96孔板的几何形状进行组织。
图3描绘了本发明样品呈递装置的表面,其中部分分析区和部分液体滞留区彼此相邻,其中分析区和液体滞留区的彼此不相邻部分被共同的边界区包围,并且其中分析区的表面面积小于液体滞留区的表面面积。
图4a描绘了本发明样品呈递装置的表面,其中已经将分析区形状设计成易于质谱数据的自动化采集。图4b描绘了分析区的放大图,显示在测量为大约100μm2内的36个区域,并且这些区域对应着在质谱分析法中被激光取样的单个区域。
图5描绘了本发明样品呈递装置的表面,其中该表面进一步由96对分析区和液体滞留区组成,其中分析区和液体滞留区为彼此同中心的,并且其中成对的分析区和液体滞留区被共同的边界区包围。在该情况下,本样品呈递装置按照对应于标准96-孔板的几何形状进行组织。将液体滞留区拉长以使液体容纳能力最大并使邻近区域之间的距离最小。覆盖在样品呈递装置前两排上的蜿蜒图样显示了通过在自动化级分收集过程中层析洗脱液的液体流沉积所描绘的路线。
图6a至图6h阐明了制造本发明样品呈递装置所涉及的步骤,其中金上的烷基硫醇(alkylthiol)用于表面修饰并且紫外线光图案化技术用于表面图案化。
图7a至图71阐明了制造本发明样品呈递装置所涉及的步骤,其中金上的烷基硫醇用于表面修饰并且照相平版印刷术用于表面图案化。
图8a至图81阐明了制造本发明样品呈递装置所涉及的步骤,其中硅上的烷基硅烷(alkylsilanes)用于表面修饰而照相平板印刷术用于表面图案化。
图9a至图9f描绘了处理过程中的不同阶段,由此沉积在本发明样品呈递装置表面的大体积水溶性样品在对应于分析区的区域内干燥。
图10a至图10d描绘了与具液体滞留区而无分析区的样品呈递装置相关的表面和液滴干燥特性。图10e至图10h描绘了与具分析区而无液体滞留区的样品呈递装置相关的表面和液滴干燥特性。
图11a至图11h描绘了在本发明样品呈递装置表面上的液滴干燥期间视频接触角装置所记录的图像,其中经测量分析区直径为0.6mm并且液体滞留区直径为1.5mm。
图12是总结与图11a至图11h中所描绘图像相关的接触角、液滴宽度和液滴高度的曲线图。
图13是在其上沉积有5μL-70μL体积的液体的本发明样品呈递装置的照片。
图14a是将5μL-40μL液体沉积在本发明样品呈递装置上后立即采集的照片。每个液滴包含相等数量的α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)。图14b是由于样品在图14a中所描绘的样品呈递装置上干燥而被浓缩并指引向分析区的HCCA照片。对同中心区的可见参考添加于干燥HCCA的上方。
对优选实施方案的详细描述
定义
除非另外定义,本文中使用的所有技术和科学术语具有该发明所属领域技术人员通常理解的意义。如本文所使用,下列术语具有归属它们的含义,除非另外指出。
“分析物”指所期望检测样品的组分。该术语可以指样品中的单一组分或多种组分。
“样品”指呈现在样品呈递装置表面上的来自于生物或非生物来源的任何物质。该样品可以以其原始、未处理形式和/或进行处理后应用于样品呈递装置,其中所述的处理包括但不限于修饰、分级分离、抽提以及浓缩。本发明的样品可以是液体或非液体样品。
“基底”指能够呈递或支持表面的物质。
“表面”指主体或基底的外部或上部边界。
“基本上不结合”或“结合抵抗”或“分析物结合抵抗”指与本发明样品呈递装置有关的某些表面的特性,其没有表现出可感知亲和性或者没有表现出分析物与表面的结合。虽然可能发生一些结合,但可以对这些表面进行特殊设计以便将结合减少至低于所用分析方法检测限的水平。
“表面张力”指液体的性质,其中沉积在表面上的液滴由于表面附近分子内聚力的不平衡而趋向于收缩成最小的可能接触面积。
“可湿性”指固体表面被液体样品润湿的程度。除非另外指出,液体样品性质上是水溶性的。
“接触角”指固体表面平面和起源于三相接触(固体/液体/蒸汽)点的液滴边界切线之间的角度。
“基质”指在诸如MALDI-MS或SELDI-MS的质谱分析技术中使用的材料,其用于吸收激光的能量并转移该能量至分析物分子,使不稳定大分子能够电离。在SELDI-MS中,该基质称作“EAM”或“能量吸收分子”。经常作为生物学分析物检测的基质使用的试剂包括但不限于反式-3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸(芥子酸,SA)、α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)和2,5-二羟基苯甲酸(DHBA)。其它适宜的基质为本领域技术人员所知。
“SAM”指自组装单层。SAM是通过将适当基底浸没在溶于有机溶剂内的活性表面活性剂的溶液中而自发形成的分子装配物。
对本发明样品呈递装置的描述
在下列对本发明样品呈递装置的描述提供了比上文发明简述更加详细的介绍。而且,本发明样品呈递装置通过涉及附图、本发明样品呈递装置的制造方法以及本发明样品呈递装置的用途和应用(其中每一个在下详述)进行进一步的描述。
如上面所提到,对于在化学个体和生物体鉴定的各种分析方法中使用的已知样品呈递装置而言,本发明的样品呈递装置提供了具有吸引力的替代选择。此外,本发明提供了制造该样品呈递装置的方法以及使用它们对包含于液体样品中的分析物进行大范围分析测量的方法。本发明样品呈递装置的独特性质克服了伴随已知分析技术和与它们相连使用的样品呈递装置或容器的许多缺点(描述于上面的背景部分)。
更加具体而言,本发明的样品呈递装置提供了在广范围分析方法中使用的已知样品呈递装置的具有吸引力的替代选择。它们具有额外的好处,例如,其使液体样品中的分析物以多达100μL的体积选择性滞留并浓缩于生物芯片表面。此外,由于分析物是从被设计成基本上不结合或抵抗结合的样品呈递装置的一部分进行检测,所以与在基于生物芯片的亲和捕获装置表面上或者其表面对分析物具有明显亲和性的其它样品呈递装置的表面上的直接检测相比,其检测灵敏度更高。
由于在优选的实施方案中本发明的样品呈递装置只需要一次液体操作,所以本发明进一步使伴随分析物从一个表面转移至另一表面过程的潜在损失最小化。
此外,由于分析物像在例如SELDI-MS生物芯片中一样不结合到亲和捕获装置上,所以液体样品能够以可控方式在本发明样品呈递装置表面上进行操作和移动。这使得样品能够浓缩于分析物基本上不结合的样品呈递装置的分析区。而且,这还允许将包含分析物的样品移动至表面上的不同区域,其中每一区域对于分析物而言具有不同的特性,这使得能在检测之前对分析物进行纯化、分离和/或修饰。
本发明涉及这样的样品呈递装置,即其表面不同部分的性质可以响应多种化学或物理刺激(例如,热、紫外辐射)而变化,以致于可以在样品处理过程中操纵对于分析物而言的此种表面性质。可以将表面性质的此种变化设计成可逆的或不可逆的。
因此,本发明涉及用于开展分析测量的样品呈递装置。在一个实施方案中,本发明涉及这样的样品呈递装置,即其表面具有一个或多个对不同的待分析样品而言可湿性不同的区域。具有不同可湿性的这些区域导致产生了滞留、浓缩和移动液体样品中分析物能力不同的区域。这些区域可以是多种形状和大小,并且可以相互连续或不连续。本发明的样品呈递装置可以包含二维或三维的表面,其中每一表面都具有两个或多个不同可湿性的区域。
本发明的样品呈递装置包含可用多种材料制作的基底,这些材料包括但不限于例如,玻璃、硅酸盐、半导体、金属、聚合物(例如塑料)和其它诸如硅上的SiO2、铝上的Al2O3等的羟基化材料。优选地,基底为金属(例如金)或者半导体(例如硅)。本发明样品呈递装置还包含这样的一种基底,即为了在基底表面产生多种区域已经通过本领域普通技术人员已知的方法进行了表面修饰,这些区域在可湿性方面具有不同性质。此种表面修饰包括但不限于在基底上添加自组装单层(SAM)、聚合物(线性的或分支的)和Langmuir-Blodgett组装物。以SAM为例,当将其添加至基底后,SAM就形成了液体样品可能会接触的样品呈递装置表面。取决于所使用特定SAM的组成,本发明的样品呈递装置的表面在可湿性方面以及对液体样品中分析物的亲和性(或其缺乏亲和性)方面具有不同的性质。可以通过产生不同区域(区域的性质反映了特定区域所使用的SAM)的方式将SAM添加在本发明的样品呈递装置上。本领域技术人员已知的其它表面修饰技术也包含于本发明中。
本发明的样品呈递装置由不同的区域组成,其中之一在滞留液体样品方面是最佳的。本发明的样品呈递装置还可以包含可湿性不同的区域,其中之一在分析物的高灵敏度检测方面是最佳的。
至于本样品呈递装置表面可以包括的区域种类,它们主要是依靠它们对被分析样品而言的不同可湿性来表征的,反过来,可湿性的不同又导致产生了滞留或结合液体样品中分析物能力不同的区域。将这些区域被广义地称为“边界区”、“液体滞留区”和“分析区”。虽然本发明也考虑包含两种以上类型的区域,但本发明仅需要存在两种类型的区域。本发明还包括每一类中的一个以上的区域—例如,样品呈递装置可以包含多个液体滞留区,其中每一区域对于液体样品和/或其中所包含分析物性质不同。为了便于多种分析仪器上(例如质谱分析仪)的高通量自动装置或为了与其兼容,可以将多种区域精确定位。
“边界区”涉及对待分析样品而言为基本不可湿的区域。与其它区域相比,边界区具有对样品而言的最高接触角。
就待分析的样品而言,“液体滞留区”的可湿性比边界区相对较大(且比分析区相对较差,下述)。液体滞留区的接触角相对低于边界区的接触角(且相对高于分析区的接触角,下述)。起初,液体滞留区具有等于或低于分析区接触角的接触角,但由于化学或物理刺激使得液体滞留区呈现出比化学或物理刺激前分析区接触角更高的接触角,这导致了液体样品被指引向一个比另一个区域优选的区域。此外,液体滞留区可以有两个亚类。在一个亚类中,将液体滞留区设计成在基本抵抗分析物结合的同时也起到了液体样品滞留的作用。在第二亚类中,将液体滞留区设计成既能够滞留液体样品但又对液体样品中的分析物具有相当大的结合,因此由于其能够捕获分析物所以被称为“捕获区”。该第二亚类还包括这样的表面,即该表面对分析物具有基本上结合,但该表面在接受化学或物理刺激(诸如紫外辐射、电流或热)时变成对分析物基本上不结合。
与其它区域相比,“分析区”是一个对于样品而言可湿性最大(并且具有最低接触角)的区域。分析区被设计成能够抵抗分析物的结合。在大小、形状以及表面性质方面对分析区进行优化以便提高对目的分析物分析的灵敏度。
在其它益处当中,由于本发明样品呈递装置的区域间可湿性不同,使得其与在样品处理中所使用的其它生物芯片相比能够滞留和处理更大体积的液体样品。虽然本发明样品呈递装置的液体容量取决于区域的大小;但是对于3mm直径的圆形区域,其液体容量可以高达大约100μL,且至少可达大约70μL。样品呈递装置能够容纳该数量的液体样品而不需要物理边界、储蓄器或孔。
在本发明样品呈递装置的另一个实施方案中,可以将样品呈递装置称为“靶芯片”并简写为Tn,其中“n”是关于样品呈递装置表面上不同区域数量的数字标记,并且“n”可以是从2至无穷大之间的任意数字。因此,例如T2靶芯片具有两个区域,T3靶芯片具有三个区域,等等。本发明考虑了包含许多多于2或3个区域的样品呈递装置,并且本发明不以任何方式受限于区域的特定数量。随着区域数量增加,总体效果接近于一个梯度。靶芯片是由一个或多个被设计成能够抵抗分析物结合的区域组成的样品呈递装置。例如,至于T2靶芯片,该样品呈递装置包含两个区域—即边界区和分析区。将接触液体样品的区域表面设计成分析物结合抵抗的—即分析区是分析物结合抵抗的。在分析之前的干燥步骤期间,接触液体样品的区域表面有效地限制了分析物。至于T3靶芯片,该样品呈递装置包含三个区域—即边界区、液体滞留区和分析区。将接触液体样品的区域表面设计成分析物结合抵抗的—即液体滞留区和分析区是分析物结合抵抗的。在干燥步骤期间,接触液体样品的区域表面有效地将分析物浓缩至分析区。因此,本发明的样品呈递装置可以包含不同区域,其中每一区域呈现出对分析物的最低吸附。
在本发明样品呈递装置的另一个实施方案中,可以将样品呈递装置称为“捕获芯片”或“捕获/浓缩芯片”并简写为Xn,其中“n”是关于该样品呈递装置表面区域数量的数字标记,并且“n”可以是从2至无穷大之间的任意数字。因此,例如,X2靶芯片具有两个区域,X3靶芯片具有三个区域,等等。本发明考虑了包含许多多于2或3个区域的样品呈递装置,并且本发明不以任何方式受限于区域的特定数量。随着区域数量的增加,总体效果接近于一个梯度。捕获芯片和捕获/浓缩芯片是由一个或多个被设计成结合分析物的区域组成的样品呈递装置。负责捕获分析物的部分一般包含特殊的表面修饰,这是捕获区的区别性特征。这些表面修饰包括以特异性(如单克隆抗体)或非特异性(如基于静电吸引结合的带电基团)或者此种引力的任何组合结合分析物的生物或化学部分。这些表面修饰除了具有捕获目的分析物的能力以外,还可以滞留液体样品中的分析物以便进行随后的修饰作用。因此,例如,包含单克隆抗体表面修饰的捕获区的本发明样品呈递装置可以结合液体样品中的互补抗原,并当通过物理转移或可湿性不同将液体样品的剩余部分移动至装置表面的其它部分时,其可以滞留该抗原。通过向样品呈递装置捕获区加入其它化合物(例如加入切除部分抗原的酶)来修饰所滞留抗原。然后,将经修饰的抗原转移至样品呈递装置的其它部分进行进一步处理,或将其移出装置用于通过已知技术进行分析。
例如,至于X2捕获芯片,样品呈递装置包含两个区域—即边界区和捕获区。基于捕获区表面的化学或生物性质将接触液体样品的区域表面设计成能够捕获分析物—即捕获区结合分析物。在分析之前的干燥步骤期间,接触液体样品的区域表面有效地限制了分析物。至于X3捕获/浓缩芯片,样品呈递装置包含三个区域—即边界区、捕获区和分析区。将边界区设计成基本上不可湿的。将捕获区设计成能够捕获和结合分析物。将分析区设计成分析物结合抵抗的。在通过多种已知分析检测方法之一开展分析之前,将分析物在捕获区和分析区之间转移。在分析之前的干燥步骤期间,包含液体样品的分析区表面有效地限制了分析物。利用捕获区表面的性质可以完成液体样品从捕获区到分析区的转移—也就是说,如果捕获区的可湿性程度比分析区的可湿性程度低,则不需要物理干预液体样品也将从捕获区移动至分析区。备选地,可以对捕获区进行设计从而使其性质能够响应化学或物理刺激(例如热、紫外辐射)发生变化,导致捕获区的可湿性程度低于分析区,并因此导致液体样品从捕获区移动至分析区。
在本发明样品呈递装置的另一个实施方案中,样品呈递装置可以是上述靶芯片和捕获芯片的组合。在该实施方案中,样品呈递装置由具有不同功能性的表面组成。这些类型的样品呈递装置涉及通过机械方法(例如通过移液管移取移取)或其它方法(例如通过区域之间可湿性的不同)将液体样品从一个区域转移至另一个区域。作为实例,“捕获-转移-浓缩芯片”(简写为X2-转移-T3)是由包含两个区域(即边界区和捕获区)的X2芯片以及包含三个区域(即边界区、液体滞留区和分析区)的T3芯片组成的样品呈递装置。分析物的转移(机械转移或其它方式转移)发生在X2芯片的捕获区和T3芯片的液体滞留区之间。
这些样品呈递装置涉及一个以上的“捕获区”,以致于其表面可以呈现对一种或多种分析物的结合亲和性。本发明的一个特征在于在液体样品从样品呈递装置表面上的一个区域移动至另一区域的过程中其具有逐一结合分析物的能力,这易于对液体样品的多个不同级分进行分析,而不需要使用机械干预进行物理性分离。替换地,本发明样品呈递装置的不同可湿性性质将液体样品指引向装置的不同区域,在此过程中留下了与不同的捕获区结合的分析物,并因此得以依次地处理液体样品。
更加具体而言,涉及捕获区与液体滞留区组合的样品呈递装置的实施方案可以进一步地用于以组合方式在对液体样品中的分析物进行检测之前分离、浓缩、纯化和修饰这些分析物。因此,例如,可将液体样品置于T2芯片之上以便将样品中的分析物限制在分析区。然后,将这些样品转移至包含边界区、捕获区和分析区的X3芯片。在该实例中,将捕获区设计成能够从液体样品中结合(并因此去除)脂质部分,以致于当样品应用于X3芯片时,其从边界区移向捕获区(其具有更高程度的可湿性),样品中的脂质部分结合于捕获区表面,而剩余样品移至分析区(因为其具有最高程度的可湿性)。在该实例中,将液体样品限制在T2芯片上,并随后将脂类在X3芯片上移动,这就使在分析区分析的最终样品是得到浓缩的和纯化成无脂类的。由于可以将捕获区设计成能够结合多种不同的分析物,并且由于还可以使用这些区域的任意的多种组合,所以能够创造出具有大范围纯化、浓缩、分离和修饰能力(关于一种或多种分析物)的样品呈递装置。
将液体样品从一个样品呈递装置转移至另一个样品呈递装置的机制可以变化。使用上述实例,可机械性地移去(例如通过移液管移取)来自T2的浓缩样品,并置于分开的X3样品呈递装置上。备选地,通过一个可湿性会响应化学或物理刺激(如紫外辐射)而发生变化的区域来连接T2和X3样品呈递装置,以致于当T2装置分析区和X3装置捕获区之间的区域暴露于紫外辐射下时导致该区域的可湿性高于T2装置分析区但低于X3装置捕获区,因此T2样品呈递装置分析区中的浓缩样品转移至X3装置的捕获区。再次地,运用大量表面(具有不同的可湿性和不同的分析物结合特性)及其配置可以创造出具有大范围纯化、浓缩、分离和修饰能力(关于一种或多种分析物)的样品呈递装置。
本发明样品呈递装置(在上述每个实施方案中)可以进一步提供具有不同形状或图案的不同可湿性区域(其中的少许实例在附图中描绘)。例如,在一个实施方案中,样品呈递装置具有同心圆形式的区域,中央区域为分析区,分析区被液体滞留区包围,而被液体滞留区被边界区包围。由于区域可以通过使用多种光图案化技术来制造,并且由于已知的光图案化技术对于所得到的图案提供了极大变化,所以这里存在可以通过本领域技术人员进行设计的大范围可能形状、图案和配置的多种区域。此外,可湿性不同区域的多种性质使得可以制造出能够将分析物指引至表面上的单个或多个指定位置或预先确定的位置(例如可寻址位点、道或区域)的样品呈递装置。在本文中“可寻址的”简单地指:预先确定的位点、道或区域能够通过与本发明样品呈递装置协同工作的自动处理装置来指定,以致于滞留于这些指定位置的液体样品或分析物可以通过分析设备处理以便测量目的分析物。此外,可以将存在于那些预先确定位置的液体样品或分析物从样品呈递装置移出用于通过另一种样品呈递装置进行后续处理或操作(例如修饰、纯化、浓缩等等)。
本发明的样品呈递装置适于处理生物和非生物液体样品。他们也适合在广泛的分析物检测方法中应用,其中所述检测方法例如(包括但不限于)质谱分析法、多种层析方法、免疫荧光光谱法以及检测和测量液体样品中分析物的其它已知分析方法。
将上述变化的每一种均设计成在对样品呈递装置的设计和使用上允许最大的灵活度,所述样品呈递装置具有强于已知方法的呈递分析物用于检测和分析的能力。因此,本发明样品呈递装置具有将分析物指引至被设计成能够增强分析物高灵敏度检测的分析区的能力。因此,本发明的样品呈递装置提供了改进的分析物沉积。
本发明的样品呈递装置进一步包含能够接受和滞留液体样品体积达大约100μL并且至少达大约70μL的装置。本发明样品呈递装置还可以作为样品定位装置使用,该装置指引分析物沉积至经测量小于大约2平方厘米(2mm2)并且优选地小于大约1mm2的表面区域。指引分析物沉积至经测量小于大约1mm2的表面区域内利于改进分析物沉积,同时伴随着自动化数据采集和检测灵敏度两方面的提高。因此,本发明样品呈递装置提供了在液体滞留能力和分析物可控沉积方面都表现出巨大用途的表面。在优选的实施方案中,该种属性的组合使检测灵敏度增加,与已知的样品支持物相比灵敏度增加大约4倍至大约100倍以上。
在一个实施方案中,本发明的样品呈递装置由基底组成,其中所述基底的表面进一步由按同中心排列进行组织的三个相邻区域组成,其中中央的分析区被液体滞留区包围,并且其中液体滞留区被边界区包围。备选地,本发明的样品呈递装置可以由基底组成,其中表面进一步由按临近排列进行组织的三个相邻区域组成,其中部分分析区和部分液体滞留区彼此相邻,并且其中分析区和液体滞留区彼此不相邻的那些部分由共同的边界区包围。
在本发明样品呈递装置的实施方案中,分析区的表面具有优选小于大约40°、更优选小于大约30°、并且最优选小于大约20°的接触角。分析区的表面优选地呈现出对分析物具有最低亲和性或结合。液体滞留区的表面具有优选在大约40°至大约95°范围内、更优选在大约60°至大约95°范围内、最优选在80°至95°范围内的接触角,并且进一步优选地呈现出对分析物具有最低亲和性和结合。边界区的表面具有优选大于大约95°、更优选大于大约105°、最优选大于大约115°的接触角,并且进一步优选地呈现出对液体样品具有最小的可湿性。
在本发明样品呈递装置的另一个实施方案中,分析区的接触角比液体滞留区的接触角低至少大约10°、优选至少大约20°、更优选至少大约30°、并且最优选至少大约40°,其中液体滞留区的接触角比边界区的接触角优选地低至少大约10°、更优选至少大约15°、并且最优选至少大约20°。在本发明样品呈递装置的实施方案中,液体滞留区的表面面积比分析区的表面面积优选地大至少大约4倍、更优选至少大约10倍、并且最优选至少大约50倍,并且分析区的表面面积优选小于大约1mm2、更优选在大约0.2mm2至大约0.8mm2的范围内、并且最优选在大约0.4mm2至大约0.6mm2的范围内。
本发明的样品呈递装置可以进一步由基底组成,其中该基底的表面可以进一步由(但不限于)1-1536对的分析区和液体滞留区组成,其中分析区和液体滞留区对或者排列成同中心的或者排列成相临的,并且其中分析区和液体滞留区对被共同的边界区包围。由多对分析区和液体滞留区组成的样品呈递装置优选地以类似于标准96-孔板、384-孔板和1536-孔板的方式进行配置,以便与多孔板处理器和实验室液体处理机器人兼容。
附图描述
下列描述仅仅是代表性的,是对在别处阐明的发明公开的补充,并且其不限制本发明的范围。
关于图1a和1b,其阐明了本发明的样品呈递装置,其显示基底1,其中基底表面进一步由按同中心排列进行组织的三个相邻区域组成,其中中央的分析区2被液体滞留区3包围,并且其中液体滞留区3被边界区4包围。分析区2的表面具有优选小于大约40°、更优选小于大约30°、且最优选小于大约20°的接触角,并且进一步优选地呈现出对分析物具有最低结合。液体滞留区3的表面呈现优选在大约40°至大约95°范围内、更优选在大约60°至大约95°范围内、最优选在80°至95°范围内的接触角,并且进一步优选地呈现出对分析物具有最低结合。边界区4的表面呈现优选大于大约95°、更优选大于大约105°、最优选大于大约115°的接触角,并且进一步优选地呈现出对液体样品具有最小可湿性。
进一步地关于图1a和图1b,本发明样品呈递装置的优选实施方案是其中分析区2的接触角比液体滞留区3的接触角低优选至少大约10°、更优选至少大约20°、更优选至少大约30°、并且最优选至少大约40°,其中液体滞留区3的接触角比边界区4的接触角低优选至少大约10°、更优选至少大约15°、并且最优选至少大约20°,其中液体滞留区3的表面面积比分析区2的表面面积大优选至少大约4倍、更优选至少大约10倍、并且最优选至少大约50倍,并且其中分析区2的表面面积优选小于大约2mm2、更优选在大约0.2mm2至大约1.8mm2的范围内、并且最优选在大约0.4mm2至大约1.6mm2的范围内。
关于图2,本发明的样品呈递装置由基底5组成,其中表面进一步由分析区6和液体滞留区7的16个同中心对组成,其中所有分析区和液体滞留区对被共同的边界区8包围。在该情况下,靶区和液体滞留区对排列在9mm中心上,这将允许将六个这样的装置组合成为对应于标准96-孔板的格式。
进一步地关于图2,本发明样品呈递装置的优选实施方案是其中分析区6的接触角比液体滞留区7的接触角低优选至少大约10°、更优选至少大约20°、更优选至少大约30°、并且最优选至少大约40°,其中液体滞留区7的接触角比边界区8的接触角低优选至少大约10°、更优选至少大约15°、并且最优选至少大约20°,其中液体滞留区7的表面面积比分析区6的表面面积大优选至少大约4倍、更优选至少大约10倍、并且最优选至少大约50倍,并且其中分析区6的表面面积优选小于大约2mm2、更优选在大约0.2mm2至大约1.8mm2的范围内、并且最优选在大约0.4mm2至大约1.6mm2的范围内。
重要的是需要指出:分析区和液体滞留区在形状上都不必是如图1a中所图解说明的圆形。分析区和液体滞留区均可以采取为了使样品呈递装置对于特定应用具有最佳表现而需要的多种形状。此外,重要的是需要指出:分析区和液体滞留区都不必是如图1a和图2所图解说明的那种彼此同中心的形式。分析区和液体滞留区可以按照为了使样品呈递装置对于特定应用具有最佳表现的需要而进行相应地位置安排。
关于图3,本发明的样品呈递装置由基底9组成,所述基底的表面进一步由按临近排列进行组织的三个相邻区域组成,其中分析区10的一部分和液体滞留区11的一部分彼此相邻,其中分析区和液体滞留区彼此不相邻的那些部分被共同的边界区12包围。分析区10的表面呈现出优选小于大约40°、更优选小于大约30°、并且最优选小于大约20°的接触角,并且进一步优选地呈现出对分析物具有最小限度的结合。液体滞留区11的表面呈现出优选在大约40°至大约95°范围内、更优选在大约60°至大约95°范围内、最优选在大约80°至大约95°范围内的接触角,并且进一步优选地呈现出对分析物具有最小限度的结合。边界区12的表面呈现出优选大于大约95°、更优选大于大约105°、最优选大于大约115°的接触角,并且进一步优选地呈现出对液体样品具有最小可湿性。
进一步地关于图3,本发明样品呈递装置的优选实施方案是其中分析区10的接触角比液体滞留区11的接触角低优选至少大约10°、更优选至少大约20°、更优选至少大约30°、并且最优选至少大约40°,其中液体滞留区11的接触角比边界区12的接触角低优选至少大约10°、更优选至少大约15°、并且最优选至少大约20°,其中液体滞留区11的表面面积比分析区10的表面面积大优选至少大约4倍、更优选至少大约10倍、并且最优选至少大约50倍,并且其中分析区10的表面面积优选小于大约1mm2、更优选在大约0.2mm2至大约0.8mm2的范围内、并且最优选在大约0.4mm2至大约0.6mm2的范围内。
重要的是需要指出:分析区和液体滞留区在形状上都不必是如图1a、图2和图3中所图解说明的圆形。分析区和液体滞留区均可以采取为了使样品呈递装置对于特定应用具有最佳表现而需要的多种形状。
关于图4a,本发明的样品呈递装置由基底13组成,其中所述基底的表面进一步由按同中心排列进行组织的三个相邻区域组成,其中中央的分析区14被液体滞留区15包围,并且其中液体滞留区15被边界区16包围。关于图4b,分析区14的形状(正方形)利于质谱数据的自动采集,这是因为其在大小上对应36个区域的光栅。
关于图5,本发明的样品呈递装置由基底17组成,其中所述基底由96对分析区18和液体滞留区19组成,所有的分析区和液体滞留区对由共同的边界区20包围。在该情况下,将同中心的成对区域排列在对应于标准96-孔板的9mm中心上。将液体滞留区19拉长以使液体容纳能力最大并使每排中相邻区域间的距离最小。覆盖在样品呈递装置前两排上的蜿蜒图样显示了通过在自动化级分收集过程中层析洗脱液的液体流沉积所描绘的路线。
进一步地关于图5,本发明样品呈递装置的优选实施方案是其中分析区18的接触角比液体滞留区19的接触角低优选至少大约10°、更优选至少大约20°、更优选至少大约30°、并且最优选至少大约40°,其中液体滞留区19的接触角比边界区20的接触角低优选至少大约10°、更优选至少大约15°、并且最优选至少大约20°,其中液体滞留区19的表面面积比分析区18的表面面积大优选至少大约4倍、更优选至少大约10倍、并且最优选至少大约50倍,并且其中分析区18的表面面积优选小于大约2mm2、更优选在大约0.2mm2至大约1.8mm2的范围内、并且最优选在大约0.4mm2至大约1.6mm2的范围内。
样品呈递装置的制作
本发明的其它实施方案包括产生或制作上述样品呈递装置的方法。例如,在表面由一种或多种自组装单层(SAM)(依赖于所使用SAM的不同而形成不同区域)组成的实施方案中,本发明的样品呈递装置可以包含通过已知光图案化技术产生的多种SAM区域。因此,本发明进一步包括用作为一种优选方法的光图案化技术产生由SAM组成的样品呈递装置的方法。
更一般而言,本发明样品呈递装置的基底表面一般通过本领域人员已知的方法进行修饰或图案化。作为实例,基底的表面可以通过应用一种或多种自组装单层(SAM)进行修饰或图案化,所述自组装单层修饰样品呈递装置的基底表面并且其暴露表面可以赋予基底特殊的化学性质。为特殊基底选择包括1°、2°、3°或4°成分在内的不同SAM则为基底表面提供了独特的表面特征和性质。具体而言,应用多个SAM进行基底图案化,以致于其可以包含每一区域表面特性和性质不同的多个区域。图案化SAM的方法为本领域所知,并且包括UV光图案化、照相平板印刷图案化、微印、电子束图案化和反应离子蚀刻术。
在基底表面产生的区域可以是任意形状,优选圆形。此外,区域可以与其它区域连续或不连续—即区域可以全部彼此相邻或者一个或多个区域与一个或多个其它区域不相邻。在样品呈递装置的基底表面产生的区域优选具有对待分析样品而言可湿性不同的多个区域。
作为本发明的另一个实施方案,其提供了制作能够精确定位分析物以便利于自动化数据采集的样品呈递装置的方法。
更加具体而言,下文描述了表面图案化的方法、适宜基底的选择、自组装单层的制备以及表面修饰的其它方法。这些描述仅仅是代表性的,其并不限制本发明的范围。
本发明样品呈递装置的表面可以通过几种方法之一进行图案化,所述方法优选地包括(但不限于):(1)从货币金属表面上的烷基硫醇制备的自组装单层(SAM)的UV-光图案化;(2)从货币金属表面上的烷基硫醇制备的SAM的照相平板印刷图案化;(3)从货币金属表面上的烷基硫醇制备的SAM的微印;和(4)从硅或玻璃表面上的烷基硅烷制备的SAM的照相平板印刷图案化;(5)电子束图案化和(6)反应离子蚀刻术。优选地,样品呈递装置表面的图案化或者通过应用描述于美国专利号5,514,501中的UV-光图案化方法实现或者通过描述于美国专利号5,512,131中的微印方法实现,该两个专利在本文整合作为参考。备选地,样品呈递装置表面的图案化可以通过文献中描述的并为本领域技术人员了解的照相平板印刷图案化方法实现。
关于图6a至6h,描绘了对由金上的烷基硫醇所组成的SAM进行UV-光图案化的逐步过程。最初,通过联合使用湿润过程和氩等离子体蚀刻将诸如硅片(750μm)的适宜基底21进行适当清洁。首先将铬或钛与钨(9∶1)的附着层(25-50nm)应用于薄片表面,随后覆以金的薄膜22(100-1000nm)。金属沉积通过溅射(蒸镀)过程完成,该过程已经对每单位时间的金属沉积(厚度)进行了校准。喷射过程可以用完整的薄片进行或者用从薄片切下的单个小块进行。
关于图6b,通过将基底在包含溶于乙醇中的0.05-5mM烷基硫醇的溶液中孵育1-24小时将第一个单层23组装至金表面上。然后用乙醇洗涤表面被修饰的基底以除去多余的烷基硫醇,并将基底在氮流下干燥。第一个单层23由这样的烷基硫醇制备,即其提供的表面呈现出大于大约100°的接触角并进一步呈现出对于液体样品而言可湿性最小。
关于图6c,通过在氧存在下暴露于经过第一个掩模24的紫外线光源对表面被修饰的基底进行光图案化,以致于将曝光区内的单体氧化,由此产生对金表面表现为低亲和性的单体磺酸盐。掩模中的开口25导致对应于液体滞留区的大小和形状特征的产生。
关于图6d和图6e,随后洗涤金表面移去单体磺酸盐,并且提供了金的未修饰区域26。通过将基底在包含溶于乙醇的0.05-5mM烷基硫醇的溶液中孵育1-24小时使第二个单层27组装至金表面之上。然后将表面被修饰的基底用乙醇洗涤以除去多余烷基硫醇,并在氮流下干燥。第二个单层27由这样的烷基硫醇制备,即该烷基硫醇提供的表面呈现出大约40°至大约95°范围内的接触角,并且还呈现出对分析物具有最小限度的结合。
关于图6f,通过在氧存在下暴露于经过第二个掩模28的紫外线光源对已经图案化的基底进行进一步的光图案化,以致于将曝光区内的单体氧化,由此产生了对金表面表现为低亲和性的单体磺酸盐。掩模中的开口29导致对应于分析区的大小和形状特征的产生。
关于图6g和图6h,随后洗涤金表面移去单体磺酸盐,并且提供了金上的未修饰区域30。通过将基底在包含溶于乙醇的大约0.05至大约5mM烷基硫醇的溶液中孵育1-24小时使第三个单层31组装至金表面之上。然后将表面被修饰的基底用乙醇洗涤以除去多余烷基硫醇,并在氮流下干燥。第三个单层31由这样的烷基硫醇制备,即该烷基硫醇提供的表面呈现出小于大约40°的接触角,并且还呈现出对分析物具有最小限度的结合。
通过这种方式,通过采用从金上的烷基硫醇制备的自组装单层的UV-光图案化的逐步过程来制备本发明的样品呈递装置。上述由金上烷基硫醇制备的自组装单层的UV-光图案化方法是代表性的,并且本发明不仅限于所述方法。
关于图7a至图7h,描绘了对由金上烷基硫醇所组成的SAM进行照相平板印刷图案化的逐步过程。适当清洁诸如硅片的适宜基底32,并在其上喷一附着层和一金薄膜33(100-1000nm)。
关于图7b,将基底在包含溶于乙醇的0.05-5mM烷基硫醇的溶液中孵育1-24小时使第一个单层34组装至金表面上。然后将表面被修饰的基底用乙醇洗涤以除去多余的烷基硫醇并在氮流下干燥。第一个单层34是由这样的烷基硫醇制备的,该烷基硫醇提供的表面呈现出小于40°的接触角并且进一步呈现出对分析物具有最低限度的结合。
关于图7c,在平版印刷之前,在表面被修饰的基底上涂一层光阻剂35。光阻剂可以是调阴的或者调阳的。阴性光阻剂导致在曝光区域内光阻剂溶解度下降,因此给出相对于掩模的负像。阳性光阻剂导致在曝光区域内光阻剂溶解度增加,因此给出相对于掩模的正像。此处描绘了阳性光阻剂的使用。可以通过插件型(dip-type)方法应用光阻剂,但优选使用旋转涂层机进行应用。可以以制造厂商给出的关于光阻剂厚度和加工时间的建议作为指导。
关于图7d,通过将表面被修饰的基底暴露于与所采用特定光阻剂联合使用所需要的紫外线光源下而对其进行光图案化。光掩模36可以用多种常用材料(包含但不限于镀铬石英、Mylar、醋酸盐和金属模板)制备。掩模中的开口37导致对应于分析区的大小和形状的特征的产生。
关于图7e,起初使用对所采用光阻剂特异的商品化溶液处理基底,该溶液溶解曝光区域的光阻剂,而那些未暴露于紫外线光源下的区域38维持相对不溶。在移去曝光的光阻剂后,采用氧等离子体或UV/臭氧处理使曝光区域内的烷基硫醇单体氧化,进而产生对金表面表现为低亲和性的单体磺酸盐。随后,洗涤金表面以移去磺酸盐单体并提供未修饰的金区域39。
关于图7f,将基底在包含溶于乙醇的0.05-5mM烷基硫醇的溶液中孵育1-24小时使第二个单层40组装至金表面上。然后将基底用乙醇洗涤以除去多余烷基硫醇,并在氮流下干燥。第二个单层40由这样的烷基硫醇制备,即该烷基硫醇提供的表面呈现出从40°至95°范围内的接触角并进一步呈现出对分析物具有最低限度的结合。
关于图7g和图7h,用几种已知的溶解未曝光光阻剂的有机溶剂(例如丙酮、1-甲基-2-吡咯烷酮等)之一进一步洗涤以除去剩余的光阻剂38,并且如上所述,将现已由两个不同区域组成的已图案化的基底在平版印刷之前涂上一层新光阻剂41。
关于图7i和图7j,如上所述,通过将其暴露于经过第二个光掩模42的紫外线光源下,将图案化的基底进行光图案化。掩模中的开口43导致对应于液体滞留区大小和形状特征的产生。最初用对采用光阻剂特异的商品化溶液处理基底,该溶液溶解曝光区域的光阻剂,而那些未暴露于紫外线光源的区域44维持相对不溶。去除曝光的光阻剂后,采用氧等离子体或UV/臭氧处理以氧化曝光区域内的烷基硫醇单体,由此产生对金表面表现为低亲和性的单体磺酸盐。随后洗涤金表面以便去除单体磺酸盐并提供未修饰的金区域45。
关于图7k和图71,将基底在包含溶于乙醇的0.05-5mM烷基硫醇的溶液中孵育1-24小时使第三个单层46组装至金表面上。将基底用乙醇洗涤以除去多余烷基硫醇并在氮流下干燥。第三个单层46是用这样的烷基硫醇制备的,即该烷基硫醇提供的表面呈现出大于100°的接触角并进一步呈现出对液体样品具有最小可湿性。最后,用几种已知溶解未曝光光阻剂的有机溶剂之一进一步洗涤以除去剩余的光阻剂44,由此提供了由三个不同区域组成的已图案化表面。
通过这种方式,采用由金上烷基硫醇组成的SAM的照相平板印刷图案化逐步过程制备本发明的样品呈递装置。应当指出,所描绘的图案化顺序(先是分析区,接着是液体滞留区,再接着是边界区)是任意选择的,而且证明相反的顺序(先是边界区,接着是液体滞留区,再接着是分析区)与所图解说明的顺序一样适合。上述由金上烷基硫醇制备的自组装单层的照相平板印刷图案化过程是代表性的,并且本发明不仅限于所述方法。
许多烷基硫醇单体适合用于制备本发明的样品呈递装置。关于烷基硫醇单体合成、它们向单层的组装以及它们在所组装表面的表面张力方面的分类均已有描述(Laibinis,P.E.;Palmer,B.J.;Lee,S.-W.;Jennings,G.K.(1998)“The Synthesis of Organothiols and Their Assembly intoMonolayers on Gold”,在Thin Films,第24卷(Ulman,A.编)第1-41页,Academic Press,San Diego,CA,本处整合作为参考)。
上述综述文章已经就所组装表面的表面能量对与烷基硫醇SAM相关的末端部分进行分类。能够提供高度可湿性表面并因此适合制备分析区单体的部分包含但不限于:CO2H、B(OH)2、PO3H2、CONH2和OH。已有报道每个上述部分都能提供接触角小于大约40°的表面。一般而言,提供高度可湿性表面的部分由氢键受体、氢键供体及其组合组成。提供中度可湿性并因此适于制备液体滞留区单体的末端部分包括但不限于:CN(60°,10),O2CCH3(63°,11),CO2CH3(67°,10),NHCOCH3(68°,11),SCOCH3(70°,11),OCH3(74°,11),CONHCH3(76°,11),NHCOCF3(77°,11)和CO2CH2CH3(89°,10)。括号中显示的是与所组装表面有关的接触角和相应的烷基链长度。一般而言,提供中度可湿性表面的部分趋向于由参与偶极-偶极相互作用的官能度(functionality)组成。提供最小可湿性表面并因此适于制备边界区单体的末端部分包括但不限于:O(CH2)2CH3(104°,11)、O(CH2)3CH3(113°,16)、NHCO(CF2)7CF3(114.5°,2)、O(CH2)4CH3(115°,16)、O(CH2)5CH3(115°,16)、OCH2CF2CF3(118°,11)和(CF2)5CF3(118°,2)。括号中显示的是与所组装表面相关的接触角和相应的烷基链长度。一般而言,提供最小可湿性表面的部分趋向于由疏水和疏油官能度组成。
优选地,本发明样品呈递装置的靶区和液体滞留区均由能够赋予所组装表面抵抗蛋白质的单体制备。已经对从金上烷基硫醇制备的大量SAM就蛋白质吸附方面进行了明确的特征描述。迄今报道的抵抗蛋白质最强的表面是源自表现为寡(乙烯氧化物)(OCH2CH2)单位单体的那些表面。Prime和Whitesides首先描述了这些表面的用途(Prime,K.L.和Whitesides,G.M.J.Am.Chem.Soc.,1993,115,10714-21,文本引用作为参考)。已经公开了关于抵抗蛋白质吸附的表面的结构-性质关系的调查(Ostuni,E.;Chapman,R.G.;Holmlin,R.E.;Takayama,S.;Whitesides,G.M.Langmuir,2001,17,5605-5620,本文整合作为参考)。最近,已证实许多两性离子SAM表现出对蛋白质吸附的良好抵抗(Holmlin,R.E.;Chen,X.;Chapman,R.G.;Takayama,S.;Whitesides,G.M.Langmuir,2001,17,2841-50,本文整合作为参考),并且由于它们组合了表面高度可湿性和对蛋白质吸附的良好抵抗所以具有作为分析区的潜在用途。
在优选实施方案中,本发明样品呈递装置的分析区由通式I:HS(CH2)11-(OCH2CH2)mOH(其中m在3至7之间)的单体制备。该通式的单体提供的表面呈现出大约30°至大约38°范围内的接触角。虽然这些表面不能呈现最低的可能接触角,但由于它们在蛋白质最低限度结合方面具有上佳表现所以优选使用它们。此外,优选地将通式I的分析区单体与能够提供接触角大于大约60°的表面的液体滞留区单体联合使用。
相似且优选地,本发明样品呈递装置的液体滞留区由通式II:HS(CH2)11-(OCH2CH2)mR的单体制备,其中m=3-7,并且其中基团R是影响表面张力和可湿性的末端部分。优选但非排外地,基团R选自OCH3、OCH2CN、CO2CH3、CONHCH3和CO2CH2CH3部分中的一个。上述末端部分中的每一个提供的表面呈现出大约62°至大约89°范围内的接触角。
备选且优选地,本样品呈递装置的液体滞留区可以由分子式为HS(CH2)11OCH2C6H5的单体制备。其末端苄基部分(CH2C6H5)对溶于有机溶剂的样品而言具有特殊用途,且其提供的表面呈现大约90°的接触角。
在优选的实施方案中,本样品呈递装置的边界区由对液体样品而言具有最小可湿性的单体制备,其中分析物溶于水溶性缓冲液、有机溶剂以及它们的混合物。已经证实具有全氟化末端部分的单体在这点上具有特殊用途(Naud,C.;Calas,P.;Blancou,H.;Commeyras,A.J.Fluorine Chem.,2000,104,173-183,本文整合作为参考)。
本发明的优选实施方案是其中分析区由分子式为HS(CH2)11(OCH2CH2)3OH的单体制备、液体滞留区由分子式为HS(CH2)11(OCH2CH2)3OCH3的单体制备并且边界区由分子式为HS(CH2)11OCH2CH2(CF2)5CF3的单体制备。这些单体组合所提供表面的分析区接触角、液体滞留区接触角和边界区接触角分别为大约38°、62°和117°。
本发明的另一个优选方案是其中分析区由分子式为HS(CH2)11(OCH2CH2)3OH的单体制备、液体滞留区由分子式为HS(CH2)11OCH2C6H5的单体制备并且边界区由分子式为HS(CH2)11OCH2CH2(CF2)5CF3的单体制备。这些单体组合所提供表面的分析区接触角、液体滞留区接触角和边界区接触角分别为大约38°、91°和117°。
已经采用了由两种烷基硫醇单体制备的混合(二元)自组装单层来精确控制表面的接触角和可湿性。(Semal,S.;Bauthier,C.;Voué,M.;VandenEynde,J.J.;Gouttebaron,R.;De Coninck,J.J Phys.Chem.B,2000,104,6225-6232,本文整合作为参考)。通过将用来制备高度可湿性和中度可湿性表面的单体混合将接触角调整为大于40°的范围。优选地,采用双元SAM或者制备分析区或者制备液体滞留区。备选地,也能用三元和四元自组装单层或者制备分析区或者制备液体滞留区。三元和四元SAM分别由取代烷基硫醇和杂取代不对称烷基二硫化物的二元混合物(即:HS(CH2)11R1和R2(CH2)11S-S(CH2)11R3)或两个杂取代不对称烷基二硫化物的二元混合物(即:R1(CH2)11S-S(CH2)11R2和R3(CH2)11S-S(CH2)11R4)制备。
关于图8a至图81,描绘了由硅上烷基硅烷组成的SAM的照相平板印刷图案化的逐步过程。通过与烷基二甲基氯硅烷、烷基二甲基烷氧基硅烷、烷基三卤硅烷或者烷基三烷氧基硅烷反应对硅或玻璃的修饰在文献中有所描述并且为本领域技术人员所了解。
关于图8a,先去除表面污染物,随后将表面氧化以产生硅烷醇(Si-OH)部分,通过这些步骤适当活化适宜基底47(如硅片、玻璃薄片或二氧化硅沉积其上的金属基底)以便共价连接烷基硅烷。优选地,简单地用氧等离子体处理、用氧化溶液(Piranha溶液)洗涤、然后再次用氧等离子体处理的底基能够提供平均硅烷醇密度接近4.9Si-OH/nm2的活化表面48。
关于图8b,在表面活化后将第一个烷基硅烷单层49组装至硅表面。通过溶液镀或蒸镀精确地完成硅烷化。第一个烷基硅烷单层49优选地由能够提供接触角大于100°且对于液体样品可湿度最低的表面的烷基硅烷制备。
关于图8c,在平版印刷之前向硅烷化的基底涂上一层光阻剂50。该光阻剂或者是调阴的或者是调阳的。阴性光阻剂导致曝光区域内的光阻剂溶解度降低,因此给出相对于掩模的负像。阳性光阻剂导致曝光区域内的光阻剂溶解度增加,因此给出相对于掩模的正像。阳性光阻剂的用途描述于图6。可以通过插件型过程应用光阻剂,但优选使用旋转涂层机应用光阻剂。制造商关于光阻剂厚度和加工时间的建议可以用作指导。
关于图8d,通过将基底暴露于与所采用特定光阻剂联合使用所需要的紫外线光源下而对其进行光图案化。光掩模51可以用多种常用材料(包含但不限于镀铬石英、Mylar、醋酸盐和金属模板)制备。掩模中的开口52导致对应液体滞留区大小和形状特征的产生
关于图8e和图8f,最初用对所采用光阻剂特异的商品化溶液处理基底,该溶液溶解曝光区域的光阻剂,而那些未暴露于紫外线光源的区域53的光阻剂维持相对不溶。在除去曝光的光阻剂之后,采用氧等离子体处理来活化表面54,准备进一步的硅烷化。在活化的硅表面上组装第二个烷基硅烷单层55。硅烷化可以通过溶液镀或蒸镀精确地实现。第二个烷基硅烷单层55由能够提供接触角在大约40°至大约90°范围内且对于分析物的结合最低的表面的烷基硅烷制备。
关于图8g和图8h,通过用几种已知能溶解未曝光光阻剂的有机溶剂(例如丙酮、1-甲基-2-吡咯烷酮)之一进一步洗涤基底除去剩余的光阻剂53,如上所述,在平版印刷之前将现已由两个不同区域组成的已图案化基底涂上一层光阻剂56。
关于图8i和图8j,如上所述,通过将其暴露于经过光掩模57的紫外线光源下,将图案化的基底进一步光图案化。掩模中的开口58导致对应于分析区大小和形状特征的产生。然后将基底用对于所采用光阻剂特异的商品化溶液处理,所述溶液溶解曝光区域的光阻剂,而那些未暴露于紫外线光源区域59内的光阻剂维持相对不溶。在去除曝光的光阻剂后,采用氧等离子体处理活化表面60,准备进一步的硅烷化。
关于图8k和图81,在活化的硅表面上组装第三个单层61。通过溶液镀或蒸镀精确地完成硅烷化。第三个烷基硅烷单层61由能够提供接触角低于大约40°且对分析物最低限度结合的表面的烷基硅烷制备。最终,通过用几种已知的溶解未曝光光阻剂的有机溶剂之一进一步洗涤基底去除剩余的光阻剂59,由此提供了由三个不同区域组成的图案化的表面。
通过这种方式,本发明的样品呈递装置可以采用由硅上烷基硅烷制备的SAM的照相平板印刷图案化的逐步过程来制备。需要指出的是,所描绘的图案化顺序(先是边界区,接着是液体滞留区,再接着是分析区)是任意选择的,并且已经证明相反的顺序(先是分析区,接着是液体滞留区,再接着是边界区)与所图解说明的顺序一样适用。上述由硅上烷基硅烷制备的自组装单层的照相平板印刷图案化方法是代表性的,并且本发明不仅限于所述方法。
许多烷基硅烷适合用于制备本发明的样品呈递装置。烷基硅烷大都是商业可得的,并且它们的合成以及它们在表面修饰中的用途是有所了解的。(Shriver-Lake,L.C.(1998)“Silane-modified surfaces for biomaterialimmobilization”Immobilized Biomolecules in Analysis:A PracticalApproach(Cass,T.和Ligler,F.S.编)第一章,牛津大学出版社,牛津,英国,本文整合作为参考)。
采用与上文概述略微不同的方法,可以将活化的硅表面用具亲核部分的适当烷基硅烷第一次衍生化,通过附加上能够赋予所需可湿性的末端部分使该亲核部分进一步功能化。备选地,当可以得到具有适宜末端部分的烷基硅烷时,可以用一个步骤对表面进行修饰。适宜制备本发明的样品呈递装置的末端部分包括(但不限于)上面所述的那些。
在优选的实施方案中,最初用3-氨基丙基三甲氧基硅烷制备本样品呈递装置的分析区,然后进一步将其功能化以提供通式III:(XO)3Si-CH2CH2CH2NHCOCH2(OCH2CH2)nOH的固定化硅烷,其中X或者连接于硅表面或者连接于邻近的固定化硅烷上,并且其中n在4-8之间。通式III的单体提供了接触角在大约30°至大约40°范围内的表面。虽然这些表面不能呈现出最低的可能接触角,但由于它们在最低限度结合蛋白质方面具有上佳表现所以优选使用它们。此外,优选地将通式III的分析区单体与能提供接触角大于60°的表面的液体滞留区单体联合使用。
相似且优选地,本发明样品呈递装置的液体滞留区最初由3-氨基丙基三甲氧基硅烷制备,然后进一步功能化以提供通式IV:(XO)3SiCH2CH2CH2NHCOCH2(OCH2CH2)nR’的固定化硅烷,其中X或者连接于基底或者连接于邻近的单体上,其中n在4-8之间,并且其中R’为影响表面张力和可湿性的末端部分。优选但非排外地,基团R’选自CH3、CH2CN、CH2CO2CH3、CH2CONHCH3和CH2CO2CH2CH3部分中的一个。上述末端部分的每一个都提供接触角在大约60°至大约90°范围内的表面。
在优选的实施方案中,本发明样品呈递装置的边界区用单一步骤从通式V为:(CH3)2(X’)SiCH2CH2-(CF2)7CF3(其中X’是表面反应部分)烷基硅烷制备,其中所述的烷基硅烷对水溶性样品具有最小的可湿性。
可以采用多种备选的表面修饰化学方法和表面图案化方法来制备本发明的样品呈递装置。最近,对于蛋白质抵抗表面的图案化方面,物质的聚合成分引起人们的兴趣。由烷基硫醇或者烷基硅烷SAM最初制备的图案化表面可以通过向表面移植聚合成分或者在表面上形成聚合成分来进一步功能化(例如,Husemann,M.;Mecerreyes,D.;Hawker,J.L.;Hedrick,R.S.;Abbott,N.L.Angew.Chem.Int.Ed.1999,38,647-649;Shah,R.R.;Merreceyes,D.;Husemann,M.;Rees,I.;Abbott,N.L.;Hawker,C.J.;Hedrick,J.L.Macromolecules 2000,33,597-605以及Hyun,J.和Chilkoti,A.Macromolecules 2001,34,5644-5652,本文全部整合作为参考)。最近,公开了关于通过封闭性共聚物的吸附进行表面图案化的第一个报道(Deng,T.;Ha,Y.-H.;Cheng,J,Y.;Ross,C.A.;Thomas,E.L.Langmuir,2002,18,6719-6722,本文整合作为参考)。已经证实,移植至SAM的聚合薄膜抵抗蛋白质的吸附的程度与存在三(乙二醇)基的SAM相当或者比其更好(Chapman,R.G.;Ostuni,E.;Liang,M.N.;Meluleni,G.;Kim,E.;Yan,L.;Pier,G.;Warren,H.S.;Whitesides,G.M.Langmuir 2001,17,1225-1233,本文整合作为参考)。
应当理解,即使可湿性最小的表面也仍然滞留液体样品中的某些部分,即使仅仅在非特异方式下也是如此。事实上,此种表面通过例如增强其浓缩分析物的能力(通过去除在随后分析中不是靶分子的那些部分)促成了本发明样品呈递装置的优势。这在可能干扰分析物分析的非生物部分滞留的情况下特别有用。然而,本样品呈递装置的表面不仅限于该实例,而是还可以包含这样的表面,即在分析区之外的区域内结合部分,从而该部分可以独立于包含分析物的样品进行处理或加工。的确,使用本发明的样品呈递装置能够对任何能用分析性生物化学方法分析的部分进行滞留、贮存、转运和随后分析。因此,本发明能够使部分滞留于具有最高程度可湿性区域之外的区域,并且对这些部分的后续分析是值得做的。然而,相当数量的目的分析物一般不滞留于具有最高程度可湿性的区域之外的区域。因此,在通过激光解吸光谱法对分析物进行分析的实例情况下,滞留于最大可湿性区域的目的分析物不是以与样品呈递装置表面结合的状态进行解吸的。
样品呈递装置的用途和应用
下文关于本发明样品呈递装置的多种用途和应用的描述仅仅是代表性的,其并不限制本发明的范围。
本发明的样品呈递装置在与多种分析技术和程序联用上具有很多用途。因此,本发明包括使用上述样品呈递装置的方法。更加具体而言,本发明包括使用本发明的样品呈递装置在一个样品呈递装置上或在多个样品呈递装置上鉴定样品中分析物存在以及分析多个样品的方法。
事实上,本发明的样品呈递装置能够与检测、鉴定或测量液体样品中分析物的任何方法联合使用。此类分析方法的例子包括但不限于MALDI-MS或电喷雾电离MS。本样品呈递装置尤其适合与高通量分析测量技术联合,例如在MALDI-MS中使用,在其中本样品呈递装置分析区以利于高通量数据采集方式进行配置。
本发明的样品呈递装置还可以用于操作液体样品以及其中所包含的分析物。基于样品呈递装置表面所能够设计成的不同可湿性性质和捕获性质,可将样品呈递装置设计用来操作、浓缩、定位、贮存、转移(通过和不通过机械干预)、回收(通过或不通过机械干预)、分析、修饰或加工(通过在样品呈递装置上使用分析物修饰试剂)、或者分级分离液体样品或其中所包含的分析物。此外,由于可将本发明的样品呈递装置设计成能够通过响应化学或物理刺激(例如,热、紫外辐射、压力、电磁辐射)来实现这些功能中的任意功能,所以本发明的样品呈递装置可以可逆或不可逆地实现这些功能,还可以进一步通过响应外力实现这些功能的多种组合。
事实上,任何液体样品(和分析物)都能够与本发明的样品呈递装置连接使用。例如,本发明能够用于分析从液相层析法中回收的级分。本发明能够用于分析从2D凝胶电泳切下的蛋白质点或从亲和层析法(即ICAT)收集的级分制备的酶消化物。本发明还能够用于分析从表面等离子体共振生物传感器回收的样品。本发明还能够用于使用标准多孔版式机器人技术和分析法进行1∶1样品转移。的确,本发明的样品呈递装置能够用来处理和操作从几乎任何来源获得的液体样品,而不管此样品是实验室实验结果(例如上文确定的酶消化物和表面等离子体共振生物传感器样品实例)、还是从环境中获得的(例如来自河流的水质样品),还是直接从活生物体获得的(例如人类尿样)。
本发明还能够用于样品贮存以便存档或进一步分析。换言之,即在液体样品转移至分析区后不需要立即对液体样品所包含分析物进行检测和分析。
因此,本发明的多种实施方案提供了行使多种液体处理功能的样品呈递装置,所述功能包括但不限于样品/分析物处理以及液体沉积、滞留、转移、定位和再定位以及贮存。本文提供了本发明样品呈递装置该多种用途的一些实例。
关于图9a至图9f,阐述了样品干燥过程中的多个步骤。本发明样品呈递装置的横断面视图显示了沉积在基底62上的表面,该表面由三个不同的区域组成,其中中央的分析区63被液体滞留区64包围,并且其中液体滞留区64进一步被边界区65包围。
关于图9b,将液体样品滴66点在样品呈递装置表面,最初样品液滴的体积被同时局限在分析区63和液体滞留区64的表面。对样品液滴的限制来自与边界区65的有限可湿性相关的表面张力。当沉积时,样品液滴的接触角近似地等于专一性地存在于液体滞留区上的液滴的接触角。
关于图9c至图9e,在样品液滴由于蒸发而干燥的同时,液滴的半径和接触角都降低,直至液滴半径到达相当于分析区的半径。
关于图9f,当样品液滴67的半径和分析区63的半径相符时,可以发现样品液滴的接触角近似等于存在于分析区上的液滴的接触角。在样品液滴由于蒸发而继续干燥的同时,样品液滴的半径不再进一步下降,而是保持恒定,此时分析物在分析区表面上沉积为一薄层。通过该方式,当沉积在样品呈递装置表面上的高达大约100μL的各种体积水溶性样品干燥时,可以提供被限制在相当于分析区区域内的一薄层分析物。
例如,具有直径3.0mm(表面积大约7.069mm2)液体滞留区和直径0.5mm(表面积大约0.196mm2)分析区的本发明样品呈递装置可以将分析物的沉积限制在比液体滞留区表面积小大约36倍的分析区表面积内,因此平均分析物表面浓度相应增加大约36倍。结果,原则上上述样品液滴干躁过程潜在地将灵敏度提高大约36倍。
关于图10a至图10d,在缺乏分析区时(只存在液体滞留区68和边界区69),样品液滴70干燥时半径没有显著降低,导致分析物在大部分液体滞留区表面沉积71。关于图10e至图10h,在缺乏液体滞留区时(只存在分析区72和边界区73),样品液滴74的体积受分析区72的液体容纳能力的限制。样品液滴74干燥时半径没有显著降低,导致分析物在大部分分析区表面沉积75。
在图9b至图9f中所述的方法使检测灵敏度显著增加。参考图9a至图9d以及图10a至图10d能更好地理解这种现象。在缺乏分析区的情况下(见图10a),在图10a中描绘的液体滞留区68中每单位面积的平均分析物表面浓度等于总的分析物浓度除以表面积。然而,在图9a描绘的分析区存在情况下,分析物的沉积限制在分析区,其中每单位面积平均分析物表面浓度等于总的分析物浓度除以分析区表面积。因此,图9a中所描绘的分析区63的存在使得分析物的平均面积浓度增加,浓度的增加等于图10a中所描绘液体滞留区68的表面积与图9a中所描绘分析区63的表面积之比值。由于分析区的表面积显著地小于液体滞留区的表面积,所以限制分析物沉积在分析区的表面区域就导致呈递至质谱仪的分析物的平均表面浓度显著增加,检测灵敏度相应地随之增加。
例如,具有直径3.0mm(表面积大约7.069mm2)液体滞留区和直径0.5mm(表面积大约0.196mm2)分析区的本发明样品呈递装置可以将分析物的沉积限制在比液体滞留区表面积小大约36倍的分析区表面积内,因此平均分析物表面浓度相应增加大约36倍。结果,原则上上述样品液滴干躁过程潜在地将灵敏度提高大约36倍。
图11a至图11h中显示的视频接触角图像证实了分析区的分析物限制性质,该性质使检测灵敏度增加。关于图11a,用测量为大约1.6mm OD的液体滞留区和测量为大约0.7mm OD的分析区制备本发明的样品呈递装置。为了易于观察聚焦效果,分析区偏离中心放置。将一滴水应用于生物芯片表面后,可以观察到其迅速地将自身限制在对应液体滞留区和分析区的表面积。记录最初的左侧和右侧接触角,发现两个接触角都是57.1°,该数值对应于由液体滞留区单体专有制备的表面所表现出的数值。在液滴由于蒸发而干躁的过程中(见图11b至图11h),所观察的半径和接触角都降低,直至液滴半径相当于分析区半径。此外,在液滴干燥过程中,可以观察到液滴中心向右移动以致于允许液滴将其自身集中于分析区。在图11h中记录了左侧和右侧接触角,发现它们都是35.4°,该数值对应于由分析区单体专有制备的表面所表现出的数值。在图12中绘图总结了与图11a至图11h所描绘图像采集同时记录的液滴高度、宽度和接触角数据。
图13证实了液体滞留区出色的液体容纳能力。本发明的16-位点样品呈递装置的照片显示了体积为5μL-70μL的样品液滴的滞留。相邻的分析区和液体滞留区对的相对接近是显著限制样品液滴体积的唯一因素。
图14a和图14b进一步证实了分析区的分析物限制性质。第一张照片(图14a)是本发明16-位点样品呈递装置的照片,其中在16个位点中的8个位点表面上沉积有5μL-40μL之间体积的样品液滴。每一样品液滴都包含相等数量的可溶性染料。第二张照片(图14b)是同一样品呈递装置在样品液滴干燥后的照片。现在染料沉积在分析区附近的生物芯片表面。为了进行比较,将分析区和液体滞留区的相对大小添加在生物芯片上。在该情况下,需要过量的染料以便能提供可见的材料,其导致强聚焦分析斑的缺乏。
可以采用本发明的样品呈递装置来推动对以下化学和生物分析物的高灵敏度质谱检测,所述分析物选自但不限于:生物大分子诸如肽、蛋白质、酶、酶底物、酶底物类似物、酶抑制剂、多核苷酸、寡核苷酸、核酸、糖类、寡糖、多糖、抗生物素蛋白、链霉抗生物素、凝集素、胃蛋白酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、A蛋白、凝集素、肝素、G蛋白、伴刀豆球蛋白;上述生物大分子的片段诸如核酸片段、肽片段和蛋白质片段;上述生物大分子复合物诸如核酸复合物、蛋白质-DNA复合物、基因转录复合物、基因翻译复合物、膜、脂质体、膜受体、受体配体复合物、信号传导途径复合物、酶-底物、酶抑制剂、肽复合物、蛋白质复合物、糖类复合物和多糖复合物;以及小的生物分子诸如氨基酸、核苷酸、核苷、糖、类固醇、脂类、金属离子、药物、激素、酰胺、胺、羧酸、维生素和辅酶、醇、醛、酮、脂肪酸、卟啉、类胡萝卜素、植物生长调节剂、磷酸酯和核苷二磷酸糖、合成小分子如药用或治疗有效剂、单体、肽类似物、类固醇类似物、抑制剂、诱变剂、致癌剂、抗有丝分裂药物、抗生素、离子载体、抗代谢物、氨基酸类似物、抗菌剂、转运抑制剂、表面活性试剂(表面活性剂)、含胺组合库、染料、毒素、生物素、生物素化化合物、DNA、RNA、赖氨酸、乙酰氨基葡糖、普施安红、谷胱甘肽、腺苷一磷酸、线粒体和叶绿体功能抑制剂、电子供体、载体和受体、合成的蛋白酶底物和类似物、磷酸酶底物和类似物、酯酶和脂肪酶底物和类似物以及蛋白质修饰试剂。此外,通过本发明样品呈递装置处理的分析物可以是非生物物质,其包括但不限于合成的聚合物如寡聚体和共聚物如聚烷撑、聚酰胺、聚(甲基)丙烯酸酯、聚砜、聚苯乙烯、聚醚、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚碳酸酯、聚卤乙烯、聚硅氧烷和上面任何两个或多个的共聚物,以及其它诸如杀虫剂的非生物分析物。
可以将分析物溶于水溶性缓冲液、有机溶剂或它们的混合物中。缓冲液优选地选自那些由挥发性组分制备的缓冲液,所述挥发性组分包括但不限于:乙酸铵、碳酸氢铵、碳酸铵、柠檬酸铵、乙酸三乙铵和碳酸三乙铵、甲酸三乙铵、乙酸三甲铵、碳酸三甲铵和甲酸三甲铵。由于去污剂的存在会抵消分析区的分析物限制性质,所以包含高浓度非挥发性去污剂(>0.1%)的水溶性样品要在分析前脱盐。有机溶剂优选地选自那些已知易与水溶性缓冲液混合并促进生物分析物溶解的有机溶剂,所述有机溶剂包括但不限于:乙酸、丙酮、乙腈、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二甲基亚砜(DMSO)、甲酸、七氟代丁酸、甲醇、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、2,2,2-三氟乙醇和三氟乙酸。
在样品干躁过程中,可以加热样品呈递装置(或者放在加热块的表面、或者置于红外线灯下或者置于热气流下)以便促进高沸点有机溶剂的蒸发或者只是简单地缩短样品干燥所需要的时间。
激光解吸飞行时间质谱分析法(其是使用本发明的样品呈递装置测量分析物的一种优选分析方法)需要在样品呈递装置表面应用一种材料(基质)以便吸收能量进而辅助分析物电离。常常用作生物分析物检测基质的试剂包括反式-3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸(芥子酸,SA)、α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)和2,5-二羟基苯甲酸(DHBA)。由于上述基质在水中的溶解度有限,所以这些试剂的母液通常包含50%-100%的有机溶剂。当与本发明样品呈递装置联合使用时,需要在将样品应用到样品呈递装置之前将包含基质的母液加入到水溶性样品中。备选地,可以在样品沉积和干燥之后将包含基质的母液应用到样品呈递装置表面。在这种情况下,优选使用包含高百分率有机溶剂的母液以便使沉积在分析区表面的分析物向母液中的溶解最小化。
本发明样品呈递装置有许多应用。能够用于本发明的样品类型的实例包括(但不限于)在分析前不进行任何加工而直接分析的样品以及在一些类型加工之后再分析的间接分析样品。
能够在本发明中使用并且属于在分析前不进行任何加工的直接分析类的样品类型实例包括(但不限于)生物流体;组织和细胞提取物及级分、细胞、细菌、病毒;培养基;环境流体;环境空气采样;环境介质提取物(土壤提取物、固体废物提取物、擦拭洗脱物、空气过滤洗脱物);法医样品;和库(组合化学库、寡核苷酸库、肽库、糖类库、脂类库、细胞及成分库;染色体库和病毒库以及其它大蛋白质和核蛋白质装配物库)。
能在本发明中使用并且属于间接分析类(即在一些类型的加工后分析)的样品类型实例包括(但不限于)液相层析(LC)排出物;气相层析(GC)排出物;凝胶洗脱物;LC排出物或凝胶洗脱物的消化样品;质谱排出物;表面等离子体共振(SPR)或其它生物传感器的洗脱物;脱盐柱排出物;固相提取排出物;液相分馏的环境样品;上述任何样品的衍生样品;以及其它化学或物理处理及其任何组合。
本发明的样品呈递装置进一步利于从分级分离方案(或者采用柱液相层析或者采用电泳)回收的生物分析物的质谱分析。具体而言,其效用源自装置的液体容纳能力(这使得能够不经过预先的样品体积缩小而直接收集层析级分、电泳纯化样品、从样品呈递装置回收的样品和从生物传感器回收的样品)和样品的精确定位以及检测灵敏度的提高(这使得能够自动采集数据)的组合。本发明的样品呈递装置提供的液体容纳能力使得能够直接收集从下列技术(但不限于下列技术):亲和层析、疏水作用层析、离子交换层析、固定化金属离子亲和层析和大小排阻层析回收的级分以及从涉及连续利用所列举的两种或多种层析方法的正交分离回收的级分。此外,样品呈递装置在标准的96-孔、384-孔和1536-孔版式中的有效性使得基于生物芯片的样品收集和在多孔板加工装置以及实验室液体处理机器人上的加工成为可能。因此,可以采用本样品呈递装置使高通量质谱分析平台成为可能,为了支持蛋白质组学和化学和生物技术的其它重要领域的出现,需要该高通量质谱分析平台。
当代的蛋白质鉴定通常涉及通过柱液相层析纯化的蛋白质或者从2-维电泳凝胶切割下来的蛋白质的酶消化物。蛋白质消化物通常需要在质谱分析之前用反向液相层析(RPLC)或固相提取(SPE)脱盐。当前发明的样品呈递装置适用于对通过高效RPLC或SPE脱盐的蛋白质消化物的直接收集和后续分析。
作为特殊实例,表面等离子体共振(SPR)生物传感器采用固定化蛋白质来研究蛋白质-蛋白质相互作用以及其它生物学相互作用。不幸的是,从生物传感器回收分析物需要大体积的洗脱液,并且对于最佳质谱分析,样品中分析物的浓度太低。本发明的样品呈递装置适于直接收集从生物传感器系统回收的分析物;它可以装配成标准96-孔版式以致于与内置生物传感器系统的样品收集装置兼容并能够自动收集样品用于质谱分析以及能够浓缩大体积液体样品。
与已知质谱仪样品呈递装置相伴的液体容纳局限性促进了多种微型柱液相层析方法的发展,所述方法涉及使用填塞有微量层析介质的小型移液管移取尖(如ZipTips)。据报道,能够在蛋白质消化物脱盐过程中伴随着样品体积减少的微型柱方法足以使样品直接应用在用于滞留样品的在先技术质谱仪上。本发明样品呈递装置适合对通过微型柱RPLC脱盐的蛋白质消化物进行直接收集和后续分析。
通常,对于上述样品,可以使用本发明样品呈递装置完成下列过程:浓缩;稀释;定位;转运;贮存;分析呈递;分级分离;洗涤;和应用后加工(包括消化、衍生化和洗脱)。应当理解,该清单并不详尽并且仅仅概括性地提供了本发明样品呈递装置所能够使用的多种应用的实例。
一旦样品应用于本发明的样品呈递装置上并且对于其上液体样品的移动进行了任何上面确定的操作,那么就能够在样品呈递装置上或从装置上移出后进行下列应用:MALDI-MS;其他质谱分析技术;表面等离子体共振(SPR);荧光;原子力显微镜(AFM);光谱法;生物发光和化学发光;x射线光电子能谱;椭圆偏振技术;电化学检测;磷光以及UV光谱法、可见光谱法和红外(IR)光谱法。应当意识到这仅仅是此类应用的部分清单。还应当理解,任何上述分析均可以是组合的和/或串联的,并且可以根据适合情况直接或间接地对分析物进行这些分析。
预期本发明的样品呈递装置能够应用于许多领域,并且这些领域包括含但不限于诸如基因组学、蛋白质组学、药物基因组学、生理组学(physiomics)、毒物组学(toxinomics)、代谢组学(metabonomics)、药物发现/药物研发/临床试验监控、毒物学、诊断学、环境、生物传感器以及生物和化学武器/生物恐怖主义。下文描述了应用本样品呈递装置的少数几个特殊实施例。下文的描述仅仅是代表性的,并且不限制本发明的范围。
基因组学:将质谱分析法应用至基因型和表型方面有个基本前提:即在电离之前对核酸分析物脱盐。传统上,在样品置于MALDI源上之前进行脱盐。在一个实施方案中,X3版式的样品呈递装置能够完成脱盐,同时浓缩核酸分析物。该实施方案由反相捕获区和抵抗分析物结合的分析区组成。另一个实施方案由X4组成,其中使用了两个捕获区和单一分析区。在同中心排列中,外部的捕获区将通过与固定的捕获探针互补杂交而特异地结合多核苷酸分析物;内部捕获区则行使上述脱盐功能,而分析区呈递分析物用于检测。在这两个实施方案中,为了分析而在同一芯片上进行脱盐和呈递提高了通量、使样品损失降到最小并降低了成本。
药物发现/研发/临床试验监控:许多药物仅对部分人群有效。赫赛汀(Herceptin)就是该现象的一个例子,其仅对大约30%的乳腺癌病人有效。以赫赛汀为例,对于药物设计,灵敏度的遗传基础和蛋白质基础是必备的;但在大部分情况中并不能在昂贵和漫长的临床试验之前就将人群分为可能的反应者和非反应者。解释该临床试验结果的主要挑战之一是理解反应和非反应的生物学和/或化学基础。因此那些知识可用于目标人群的确定和药物自身的进一步精制。
解决该问题的一种方法是在治疗前、治疗过程中和治疗后从病人获得剖析资料(profile)(例如蛋白质、糖类、脂类),并将这些剖析资料与治疗效果关联起来。本装置的几个实施方案能够应用于此研究。将从病人获得的样品(例如血液、尿液、组织)用上文描述部分中所列举的一种或多种预处理方法(诸如多维液相层析)进行处理,并将通过上述方法制备的经分级分离的物质应用于本装置以便浓缩和呈递给质谱进行分析。备选地,经过最小程度处理的样品可以应用于带有已知特异性捕获区的一个或多个本发明装置。然后将分析物或者在转移至分析区之前先转移至具互补特异性的捕获区,或者直接转移至分析区。以该种方式,具不同特异性的表面可以在自动方式下串联使用或并行使用,将分级分离的分析物呈递至鉴定分析区域进行质谱分析。
质谱分析法提供了剖析资料(完整的质谱)并能清楚鉴定目的特异性分子部分。然后,将质谱收集入数据库并通过多因子分析工具对剖析资料和病人反应关联起来。通过这个方式,人们可以发现剖析资料和/或特异分子实体内的模式,其能够预测治疗反应、监控治疗反应和鉴定影响治疗反应的分子实体,从而可以进行日益复杂的药物设计。
同本文所述的其它研究领域一样,该领域的科学研究依赖于对液体溶液中分析物的大量测量能力。本发明的样品呈递装置以及本文所述的用途给出了一种能够用来进行进一步研究的重要工具。
环境方面:分析环境样品中污染物的存在是世界性的工作。此研究面临的具体问题是分析物的低浓度和所必须分析样品的多样性,这是因为污染物可能存在于气体、液体和固体材料中。通常,此分析涉及收集、提取、衍生、分级分离和检测步骤。
本装置可以以多种方式应用于环境样品的分析。这些例子具代表性,但决非全部。使用具捕获区的装置可以直接从气体或液体介质收集分析物。例如,可以通过疏水表面将水溶液中的疏水杀虫剂残留物捕获,其可以代替耗时并产生有害废物的液/液抽提。然后将收集的材料直接转移至分析区,或者在转移至分析区之前通过串联或并行转移至互补特异性捕获区进行分级分离,或者将其从装置转移出来以便用上述部分所列举技术中的一种或多种进行分析。质谱分析法通常用来鉴定杀虫剂残留物,但也可以应用诸如免疫测定的其它技术。如先前所述,本发明还可以用来呈递和/或分级分离来自上文所列出的任一环境分析步骤的材料。本发明装置可以用作衍生分析物并呈递它们以改变形式进行分析的平台。例如,可以将甲硅烷基部分和/或乙酰基部分加至固定于装置上的杀虫剂上以便能够对分子结构进行明确鉴定。
生物和化学武器/生物恐怖主义:美国政府面临着在军事和国内场合需要易于化学和生物试剂检测的平台和分析技术。对生物战侦查的挑战包括样品收集以及对无毒和有毒有机体的辨别。当前对于生物制剂的战场技术是利用热分解使生物化合物转变为更易于通过MS检测的小分子。然而,由于依赖于肽生物标记的技术比目前已知的方法更为特异,所以很大程度上预先考虑该种依赖于肽生物标记的技术。用来确定对战剂潜在暴露的个体试验涉及呼吸试验或血液抽提技术。作为报警装置的独立生物传感器在公共场所或战场中的用途引起极大的兴趣。所有这些方法都显示出对使用机器人技术或其它遥控方法进行样品收集、预处理和向检测器呈递样品方面的挑战。能够贮存、操作、浓缩或者纯化样品的技术或那些能与当前使用的气雾剂碰撞采样机(aerosol impactors)偶联的技术对防卫机构具有潜在的吸引力。本装置能够以与所述用于环境样品相似的方式应用于生物战/生物恐怖袭击(bioterror)的侦查。此外,可以将具有常规捕获区的装置设计成能够用来从环境或生物流体样品收集目的微生物、能够处理细胞(或病毒)以释放关键标记以及能够呈递这些标记以便检测。
实施例
下列实施例提供了关于本发明样品呈递装置的组合物、制造和用途的附加细节,但其仅是代表性的并且不以任何方式限制本发明的范围。
实施例I
11-(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟代辛氧基)十一碳-1-烯(1)的制备
在棕色shell小瓶(40mL)中装入3.0mL 1H,1H,2H,2H-全氟辛醇(13.7mmol)并向其中加入1.4mL 50%含水氢氧化钾(13.7mmol)。将溶液加热至80℃,搅拌30分钟并加入3.3mL 11-溴十一碳-1-烯(1.5mmol)。反应在80℃进行52小时,直至TLC分析(己烷)显示原料已耗尽。将产物冷却至室温,加入100mL乙酸乙酯并用水(2×50mL)和盐水(1×50mL)抽提。乙酸乙酯抽提物经过硫酸镁干燥、过滤并在真空中蒸发溶剂后得到油状残渣。残渣在硅胶快速柱上纯化(50×300mm,先是0%乙酸乙酯/己烷,然后是10%乙酸乙酯/己烷)。将包含目的产物的级分合并,蒸发溶剂后得到4.52g(64%)式1化合物的无色油。1H NMR(400MHz,CDCl3):□5.80(m,1H),4.95(m,2H),3.69(t,J=6.8Hz,2H),3.43(t,J=6.8Hz,2H),2.39(m,2H),2.03(m,2H),1.55(m,2H),1.36(m,2H),1.27(宽峰m,10H)。
实施例II
硫代乙酸S-[11-(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟代辛氧基)十一烷基]酯(2)的制备
在氩气下往干燥的圆底烧瓶(100mL)中装入1.0g式1化合物(1.9mmol),并加入10mL干甲醇。向所得溶液中加入426□L硫羟乙酸(6.0mmol),然后加入52mg 2,2′-偶氮(2-甲基丙脒)二盐酸盐(0.2mmol)。反应体系用箔制帐篷遮避,并暴露于低压汞灯光线下。4小时后,TCL分析(5%乙酸乙酯/己烷)显示原料已耗尽。真空蒸发溶剂得到油状残渣。残渣在硅胶快速柱上纯化(40×300mm,先是0%乙酸乙酯/己烷,然后是5%乙酸乙酯/己烷)。将包含目的产物的级分合并,蒸发溶剂后得到856mg(76%)式2化合物的无色油。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.69(t,J=6.8Hz,2H),3.43(t,J=6.8Hz,2H),2.39(m,2H),2.31(s,3H),1.55(m,2H),1.33(m,2H),1.25(宽峰m,10H)。
实施例III
11-(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟代辛氧基)十一烷-1-硫醇(3)的制备
在棕色shell小瓶(20mL)中安装一个具特氟龙(Teflon)线硅隔膜,装入850mg式2化合物(1.1mmol),并加入5mL 3N甲醇氯化氢(15mmol)。将所得溶液加热至40℃并维持4小时。去除溶剂得到782mg(98%)式3化合物的无色油。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.69(t,J=6.8Hz,2H),3.43(t,J=6.6Hz,2H),2.51(dd,J=7.3,7.6Hz,2H),2.39(m,2H),1.58(m,4H),1.32(t,J=8.0Hz,1H),1.25(宽峰m,12H)。
实施例IV
11-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}十一碳-1-烯(4)的制备
在圆底烧瓶(200mL)中装入27.4mL三甘醇一甲基酯(171mmol)和9.1mL 50%含水氢氧化钠(114mmol)。将浅黄色溶液加热至80℃,搅拌30分钟,并逐滴加入26.6mL 11-溴十一碳-1-烯(114mmol)。在80℃下反应7.5小时,直至TLC分析(100%乙酸乙酯)显示原料已耗尽。将产物冷却至室温,用50mL水稀释并用己烷抽提(3×50mL)。合并己烷抽提物,经过硫酸镁干燥、过滤并真空蒸发溶剂后得到20g(56%)式4化合物的澄清、无色油。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.81(m,1H),4.96(m,2H),3.68-3.56(m,12H),3.44(t,J=6.8Hz,2H),3.38(s,3H),2.04(m,2H),1.57(m,2H),1.36(m,2H),1.27(宽峰s,10H)。
实施例V
硫代乙酸S-(11-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}十一烷基)酯(5)的制备
在氩气下往干燥的圆底烧瓶(200mL)中装入5.0g式4化合物(15.8mmol),并加入10mL干甲醇。向其中加入3.6mL硫羟乙酸(50mmol),然后加入434mg 2,2′-偶氮(2-甲基丙脒)二盐酸盐(1.6mmol)。反应体系用箔制帐篷遮避,并暴露于低压汞灯的光线下。15.5小时后,TCL分析(乙酸乙酯/己烷1∶3)显示原料已耗尽。真空蒸发溶剂得到具有强硫磺样气味的残渣。残渣在硅胶快速柱上纯化(40×300mm,30%乙酸乙酯/己烷,和50%乙酸乙酯/己烷)。将包含目的产物的级分合并,蒸发溶剂得到5.83g(94%)式5化合物的无色油。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.67-3.54(m,12H),3.44(t,J=7.2Hz,2H),3.38(s,3H),2.86(t,J=7.2Hz,2H),2.32(s,3H),1.57(m,4H),1.36-1.26(宽峰m,14H)。
实施例VI
11-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基)十一烷-1-硫醇(6)的制备
在棕色shell小瓶(20mL)中安装具特氟龙弗伦线硅隔膜,装入5.0g式5化合物(12.7mmol)并加入7mL 3N甲醇氯化氢(21mmol)。将所得溶液加热至40℃并维持6小时。然后真空蒸发溶剂得到4.40g(98%)式6化合物的无色蜡质凝胶。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.67-3.54(m,12H),3.44(t,J=6.8Hz,2H),3.37(s,3H),2.51(dd,J=7.3,8.0Hz,2H),1.57(m,4H),1.32(t,J=7.6Hz,1H),1.26(宽峰m,14H)。
实施例VII
2-[2-(2-十一碳-10-烯基氧基乙氧基)乙氧基]乙醇(7)的制备
在圆底烧瓶(250mL)中装入67.0mL的三甘醇(0.5mol),并加入8.0mL50%含水氢氧化钠(8mL,0.1mol)。将热溶液加热至100℃,搅拌30分钟并逐滴加入22.0mL 11-溴十一碳-1-烯(0.1mol)得到产生溴化钠沉淀的深黄色溶液。反应于100℃维持2.5小时,直至TLC分析(甲醇/乙酸乙酯/己烷1∶1∶8)显示原料已耗尽。将反应物冷却至室温,用300mL水稀释并用己烷抽提(3×100mL)。合并有机抽提物,用盐水洗涤(50mL),经过硫酸镁干燥并过滤。真空蒸发溶剂得到油状残渣。残渣在硅胶快速柱上纯化(50×400mm,甲醇/乙酸乙酯/己烷5∶5∶90)。将包含目的产物的级分合并,蒸发溶剂后得到20.8g(69%)式7化合物的澄清油。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.78(m,1H),4.93(m,2H),3.72-3.55(m,12H),3.42(t,J=7.2Hz,2H),2.64(t,J=5.6Hz,1H),2.01(m,2H),1.54(m,2H),1.34(m,2H),1.25(宽峰s,10H)。
实施例VIII
硫代乙酸S-(11-{2-[2-(2-羟乙氧基)乙氧基]乙氧基}十一烷基)酯(8)的制备
在氩气下往干燥的圆底烧瓶(100mL)中装入2.0g式7化合物(6.6mmol),并加入10mL干甲醇。向其中加入2.85mL硫羟乙酸(40mmol),然后加入271mg 2,2′-偶氮(2-甲基丙脒)二盐酸盐(1.0mmol)。将反应体系用箔制帐篷遮避,并暴露于低压汞灯光线下。6小时后,TCL分析(甲醇/乙酸乙酯/己烷1∶1∶8)显示原料已耗尽。真空蒸发溶剂得到黄色的油。该油在硅胶快速柱上纯化(50×300mm,甲醇/乙酸乙酯/己烷1∶1∶8)。将包含目的产物的级分合并,蒸发溶剂得到2.44g(98%)式8化合物的浅黄色油。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ3.71-3.54(m,12H),3.42(t,J=6.6Hz,2H),2.83(t,J=7.2Hz,2H),2.66(宽峰s,1H),2.29(s,3H),1.52(m,4H),1.36-1.23(宽峰m,14H)。
实施例IX
2-{2-[2-(11-巯基十一烷氧基)乙氧基]乙氧基}乙醇(9)的制备
在棕色shell小瓶(20mL)中安装具特氟龙线硅隔膜,装入2.40g式8化合物(6.4mmol)并加入5.0mL 3N甲醇氯化氢(15mmol)。将所得溶液加热至40℃并维持4小时。然后真空蒸发溶剂得到2.05g(95%)式9化合物的无色蜡质凝胶。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.72-3.55(m,12H),3.43(t,J=6.8Hz,2H),2.71(宽峰s,1H),2.50(dd,J=7.6,7.4Hz,2H),1.62-1.52(m,4H),1.31(t,J=7.6Hz,1H),1.26(宽峰m,14H)。
实施例X
十一碳-10-烯基-羟甲基苯(10)的制备
在氩气下向干燥圆底烧瓶(100mL)中装入5.0g十一碳-10-烯-1-醇(29.4mmol)并加入25mL干N,N-二甲基甲酰胺。将所得溶液冷却至0℃并以一部分加入2.16g的溶于矿物油的60%氢化钠(45nmol)。将起泡混合物在氩气下于0℃搅拌30分钟。向冷却、搅拌后的溶液中逐滴加入溶于5mL干N,N-二甲基甲酰胺的7.7g溴甲苯(45mmol)并将反应物搅拌3小时,同时升至室温。通过缓慢加入100mL乙酸乙酯终止反应,并用1N盐酸(2×50mL)和盐水(1×50mL)进行抽提。将有机层经硫酸镁干燥、过滤并蒸发溶剂得到油状残渣(9.5g)。残渣在硅胶快速柱上纯化(50×300mm,94∶5∶1的己烷/甲苯/乙酰乙酯)并将包含目的产物的级分合并。最后,真空蒸发溶剂得到7.1g(93%)式10化合物的无色油。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.32(d,4H),7.28(m,1H),5.81(m,1H),4.95(m,2H),4.49(s,2H),3.46(t,2H),2.03(m,2H),1.61(m,2H),1.35(宽峰m,4H),1.24(宽峰s,10H)。
实施例XI
硫代乙酸S-(11苄氧基十一烷基)酯(11)的制备
在具夹套的光反应容器(250mL)中装入5.0g式10化合物(19.2mmol)和0.520g 2,2′-偶氮((2-甲基丙脒)二盐酸盐(1.92mmol)。将容器密封、抽真空并用氩气反冲(几个循环)。在氩气下时,向反应容器中注入60mL无水甲醇和0.520g硫羟乙酸(92mmol)并搅拌容器内容物。再次对容器抽真空并用氩气反冲(几个循环)。激活UV灯并在氩气下照射混合物,同时持续搅拌3小时。不断冷却(水夹套)反应物并在光反应过程中将温度维持在低于38℃。将反应容器冷却至室温并蒸发溶剂得到浅黄色油(10.8g)。油在硅胶快速柱上纯化(50×300mm,98∶2的己烷/乙酰乙酯)并将包含目的产物的级分合并。最后,真空去除溶剂得到5.0g(77%)式11化合物的无色油。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.32(d,4H),7.28(m,1H),4.49(s,2H),3.46(t,2H),2.86(t,2H),2.31(s,3H),1.50-1.66(m,4H),1.20-1.40(宽峰m,14H)。
实施例XII
11-苄氧基十一烷-1-硫醇(12)的制备
在棕色shell小瓶(40mL)中安装具特氟龙线硅隔膜,先装入3.04g式11化合物(9.03mmol),然后装入2mL二氯甲烷、1mL己烷和12mL 4.9N乙醇氯化氢。将所得溶液加热至40℃并维持4.5小时。然后真空蒸发溶剂得到无色油状残渣(2.8g)。残渣在硅胶快速柱上纯化(25×450mm,9∶1的己烷/氯仿)并将包含目的产物的级分合并。真空蒸发溶剂后得到2.5g(94%)式12化合物的无色油。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.32(d,4H),7.28(m,1H),4.49(s,2H),3.46(t,2H),2.51(q,2H),1.55-1.65(m,4H),1.20-1.40(宽峰m,宽峰t,15H)。
实施例VIII
在涂有金的硅基底上制备自组装单层
将硅片(200mm,P类型,一级硅100)切割成单独的基底并对其进行清洁以提供具有每个基底少于10质点(0.16μm-3000μm)的表面。在CPA9900溅射系统中用5×10-7mm基础压力进行金属沉积。在溅射室中,清洁基底并用氩等离子体蚀刻,并且以5/秒的速率溅射成厚度为250的钛和钨(1∶9)附着层。然后以20/秒的速率溅射高达1000的金。在移出之前,将基底在氩气流下冷却。
在单层组装之前,用氩等离子体在200W下处理300秒对涂有金的基底进行清洁。用乙醇冲洗基底,然后将其转移至溶于乙醇的0.1mM式3化合物(11-(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟代辛氧基)十一烷-1-硫醇)溶液并在室温下孵育1-24小时。最后,从组装浴中移出表面修饰的基底,用乙醇以1000转/分旋转冲洗并在氮气流下干燥。应用到该表面修饰基底上的水滴(0.5μL)的前进接触角介于114°-120°之间。将表面修饰的基底贮存于带有透明棕色抗UV盖的合适塑料容器中。
实施例XIV
图案化样品呈递装置的制备
如上所述,制备24块表面修饰的基底,将其放置在定做的调节夹具中并用具有对应于液体滞留区大小和形状特征的针状对齐(pin-registered)蚀刻不锈钢遮光板(0.002英寸)覆盖。夹具放置在固定有比率为120W/cm2的低压汞灯光源的空气冷却紫外线固化系统的传输带上并在1小时过程中经过该光源45至75次。在UV曝光后,将基底从夹具中取出,用乙醇以1000转/分旋转洗涤并在氮气流下干燥。将已曝光的基底放置在0.1mM的溶于乙醇的式6化合物(11-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基)十一烷-1-硫醇)溶液中并在室温下孵育1至24小时。从组装浴中移出已图案化的表面修饰基底,用乙醇以2400转/分旋转洗涤并在氮气流下干燥。应用至液体滞留区的水滴的前进接触角介于60°-65°之间,而且当液滴应用于边界区时其前进接触角介于110°-119°之间。
将已图案化的表面修饰基底放置在定做的调节夹具中,并用第二块具有对应于分析区大小和形状特征的针状对齐蚀刻不锈钢遮光板覆盖。夹具放置在紫外线固化系统的传输带上并在1小时过程中经过该光源45至75次。在UV曝光后,从夹具中取出基底,用乙醇以1000转/分旋转洗涤并在氮气流下干燥。将已曝光的基底放置在溶于乙醇的0.1mM式9化合物(2-{2-[2-(11-巯基十一烷氧基)乙氧基]乙氧基)乙醇)溶液中并在室温下孵育1至24小时。最后,从夹具中移出两次图案化的表面修饰基底,用乙醇以1000转/分旋转洗涤并在氮气流下干燥。应用于分析区的水滴的前进接触角小于47°。将两次图案化的表面修饰基底贮存于带有棕色透明抗UV盖的合适塑料容器中。
在上文描述本发明多种实施方案的同时,应当理解它们仅以实施例的方式出现,并没有局限性。具体而言,分析区、液体滞留区和边界区的物理排列不受上述实施例限制。因此,本发明的广度和范围不受上述代表性实施方案的限制。
实施例XV
样品容量及定位
能够使检测灵敏度增加的分析区的分析物限制性质在图11a至图11h中显示的视频接触角图像中得到证实。关于图11a,本发明的样品呈递装置由测量为大约1.6mm OD的液体滞留区和测量为大约0.7mm OD的分析区制备。为了便于观察聚焦效果,分析区偏离中心放置。将一滴水应用于生物芯片表面,并观察到其迅速将自身限制在对应液体滞留区和分析区的表面区域内。记录最初的左侧和右侧接触角,发现两个接触角都是57.1°,该数值对应于由液体滞留区单体专有制备的表面所表现出的数值。在液滴由于蒸发而干躁(见图11b至图11h)的过程中,所观察的半径和接触角都降低,直至液滴半径相当于分析区半径。此外,在液滴干燥过程中,液滴中心向右移动以便液滴将其自身集中于分析区。发现图11h中记录的左侧和右侧接触角都是35.4°,该数值对应于由分析区单体专有制备的表面所表现出的数值。在图12中绘图总结了与图11a至图11h所描绘图像采集同时记录的液滴高度、宽度和接触角数据。
实施例XVI
已图案化样品呈递装置的液体容纳能力
液体滞留区出色的液体容纳能力在图13中得到证实。本发明16-位点样品呈递装置的照片显示样品液滴保留体积介于5μL-70μL之间。明显限制样品液滴体积的唯一因素是相邻靶区和液体滞留区对的相对接近。
实施例XVII
分析物指引和浓缩
分析区的分析物限制性质在图14a和图14b中进一步得到证实。第一张照片(图14a)是本发明16-位点样品呈递装置的照片,其中在表面16个位点中的8个位点上沉积有5μL-40μL范围体积的样品液滴。每滴液滴都包含相等数量的HCCA。图14b是由于在图14a所描绘样品呈递装置上进行干燥而已经浓缩并指引向分析区的HCCA的照片。为了进行比较,将分析区和液体滞留区的相对大小添加在生物芯片上。
在上文描述本发明多种实施方案的同时,还应当理解的是它们仅以实施例的方式出现,并没有局限性。具体而言,分析区、液体滞留区和边界区的物理排列不受上述实施例的限制。因此,本发明的广度和范围不受上述代表性实施方案的限制。
Claims (42)
1.用于检测样品中分析物的样品呈递装置,其中所述样品呈递装置包含具有表面的基底,其中表面由多个不同可湿性区域组成,并且检测样品中分析物的区域基本上是分析物结合抵抗的。
2.权利要求1的样品呈递装置,其中不同可湿性区域之一在样品滞留方面是最佳的。
3.权利要求1的样品呈递装置,其中不同可湿性区域之一在分析物的高灵敏度检测方面是最佳的。
4.权利要求1的样品呈递装置,其中基底选自玻璃、半导体、金属、聚合物、塑料、硅上SiO2和铝上Al2O3中的一种或多种。
5.权利要求1的样品呈递装置,其中一个或多个不同可湿性区域由自组装单层组成。
6.权利要求1的样品呈递装置,其还包含基本上不可湿的边界区和一个或多个附加区域,其中所述的每一附加区域比边界区更加可湿。
7.权利要求6的样品呈递装置,其中一个或多个附加区域包含比边界区更加可湿的液体滞留区和比液体滞留区更加可湿的分析区。
8.权利要求6的样品呈递装置,其中边界区具有比一个或多个附加区域中的每一区域的接触角更高的接触角。
9.权利要求7的样品呈递装置,其中边界区具有比液体滞留区接触角更高的接触角,并且其中液体滞留区具有比分析区接触角更高的接触角。
10.权利要求1的样品呈递装置,其中多个不同可湿性区域包含基本上不可湿的边界区和至少一个基本上结合分析物的可湿区域。
11.用于贮存来自样品的分析物的样品呈递装置,其中所述样品呈递装置包含具有表面的基底,其中表面由多个不同可湿性区域组成,并且其中贮存来自样品的分析物的区域基本上是分析物结合抵抗的。
12.用于贮存来自样品的分析物的样品呈递装置,其中所述样品呈递装置包含具有表面的基底,其中表面由多个不同可湿性区域组成,并且其中贮存来自样品的分析物的区域基本上结合分析物。
13.权利要求1的样品呈递装置,其中样品体积小于或等于100μL。
14.权利要求1的样品呈递装置,其中样品体积小于或等于70μL。
15.制造用于检测样品中分析物的样品呈递装置的方法,其中样品呈递装置包含具有表面的基底,其中所述方法包括修饰基底表面以产生多个不同可湿性区域,并且其中检测样品中分析物的区域基本上是分析物结合抵抗的。
16.权利要求15的方法,其中所述修饰包括向基底表面应用一种或多种自组装单层。
17.权利要求16的方法,其中应用自组装单层包括使用选自UV光图案化、照相平板印刷图案化、微印、电子束图案化和反应离子蚀刻法中的一种或多种图案化技术将表面图案化。
18.检测样品中分析物的方法,其包括将样品与权利要求1的样品呈递装置接触和检测样品中的分析物。
19.检测多个样品中分析物的方法,其包括将多个样品与权利要求1的样品呈递装置接触和检测多个样品中的分析物。
20.权利要求18的方法,其中检测样品中分析物的方法包括选自质谱分析法、表面等离子体共振、荧光、原子力显微镜、光谱法、生物发光、化学发光、x射线光电子能谱、椭圆偏振技术、电化学检测、磷光、紫外光谱法、可见光谱法和红外光谱法中的一种方法。
21.权利要求20的方法,其中质谱分析法是激光解吸电离质谱分析法。
22.使用权利要求1的样品呈递装置浓缩包含分析物的样品的方法,其中所述方法包括在最高程度可湿性的区域内浓缩样品。
23.权利要求22的方法,其中最高程度可湿性区域的面积小于2mm2。
24.权利要求22的方法,其中最高程度可湿性区域的面积小于1mm2。
25.权利要求22的方法,其还包括将在最高程度可湿性区域内浓缩的样品转移至一个或多个附加样品呈递装置,其中每一装置包含对所浓缩样品而言可湿性不同的多个区域。
26.检测样品中分析物的方法,其包括从样品中捕获与权利要求10的样品呈递装置的一个或多个区域基本上结合的分析物。
27.检测样品中分析物的方法,其包括从样品中减少干扰后续样品处理过程的物质,其中所述物质与权利要求10的样品呈递装置的一个或多个区域基本上结合。
28.贮存来自样品的分析物的方法,其包括在样品呈递装置上贮存分析物,其中所述样品呈递装置包含具有表面的基底,其中表面由多个不同可湿性区域组成并且其中贮存来自样品的分析物的区域基本上是分析物结合抵抗的。
29.贮存来自样品的分析物的方法,其包括在样品呈递装置上贮存分析物,其中所述样品呈递装置包含具有表面的基底,其中表面由多个不同可湿性区域组成并且其中贮存来自样品的分析物的区域基本上结合分析物。
30.处理包含分析物的样品的方法,其包括将样品与由多个不同可湿性区域组成的样品呈递装置接触和在最高程度可湿性区域内浓缩样品,并且其中最高程度可湿性区域基本上是分析物结合抵抗的。
31.处理包含分析物的样品的方法,其包括将样品与由多个不同可湿性区域组成的样品呈递装置接触和在最高程度可湿性区域内浓缩样品,并且其中最高程度可湿性区域基本上结合分析物。
32.权利要求30的方法,其还包括检测在最高程度可湿性区域内浓缩的样品中的分析物。
33.权利要求32的方法,其中检测样品中分析物的方法包括选自质谱分析法、表面等离子体共振、荧光、原子力显微镜、光谱法、生物发光、化学发光、x射线光电子能谱、椭圆偏振技术、电化学检测、磷光、紫外光谱法、可见光谱法和红外光谱法中的一种方法。
34.权利要求33的方法,其中质谱分析法是激光解吸电离质谱分析法。
35.使用权利要求7的样品呈递装置修饰分析物的方法,其包括在液体滞留区或分析区或两者内修饰分析物。
36.权利要求35的方法,其中分析物的修饰是可逆的。
37.权利要求35的方法,其中分析物的修饰是不可逆的。
38.改变权利要求1的样品呈递装置中一个或多个区域的可湿性的方法,其包括通过物理刺激或化学刺激或两者修饰样品呈递装置表面,其中区域的相对可湿性被改变。
39.权利要求38的方法,其中样品呈递装置表面的修饰是可逆的。
40.权利要求38的方法,其中样品呈递装置表面的修饰是不可逆的。
41.使用权利要求1的样品呈递装置定位一种或多种样品的方法,其中一种或多种样品从最初接触点移动至相对于最初接触点可湿性更高的一个或多个区域。
42.使用权利要求10的样品呈递装置定位一种或多种样品的方法,其中一种或多种液体样品从最初接触点移动至相对于最初接触点可湿性更高的一个或多个区域。
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