CN112672825B - 提供分离的单细胞的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于提供分离的单细胞的方法和设备。在公开的一种设置中，在基底表面上形成液体测试体。液体测试体与基底表面之间的接触角小于平衡接触角。分析液体测试体的光学图像以确定液体测试体中是否只存在唯一一个细胞。

Description

提供分离的单细胞的方法和装置
技术领域
本发明涉及用于提供分离的单细胞的方法和设备，例如用于单克隆细胞培养的方法和设备。
背景技术
涉及单克隆细胞培养的广泛应用要求以高可靠性从单个细胞产生细胞集落。这些应用包括，例如，治疗性单克隆抗体的生产、干细胞治疗和基因编辑。在孔板上，这是具有挑战性和耗时的，并且由于所谓的“边缘效应”而常常是不可能的，在所谓的“边缘效应”中传统微量滴定板的固体壁会干扰用于检测细胞的存在的光学测量。微量板(或微量滴定板/微量孔板)在液体处理过程中被广泛使用；每个板本质上是微型试管的阵列。板具有可接受的标准尺寸(127.76×85.48×14.22mm)；具有96、384和1536孔/板的那些可商购获得，每孔的工作体积分别为～100-500微升、～15-150微升和～3-10微升。
除边缘效应外，传统的孔板通常需要旋转以便用荧光标志物对细胞进行成像和/或标记，然后才能对其进行检测。这些额外的处理步骤增加了复杂性和/或延长了处理时间。
一种替代方法是将包含细胞的小液滴沉积到孔板孔中的局部区域，液滴足够小以至于它们不接触孔的边界壁。因此避免了上述边缘效应。可以从上方或下方对单个液滴成像，以确定是否存在细胞。通常，使光穿过液滴，然后成像。每个液滴的上界面的曲率会降低液滴边缘周围的图像质量。还需要时间使细胞落入液滴的底部以进行可靠的光学检测。
发明内容
本发明的一个目的是提供用于提供分离的单细胞的改进的方法和设备。
根据本发明的一个方面，提供了一种提供分离的单细胞的方法，包括：在基底表面上形成液体测试体，其中所述液体测试体与所述基底表面之间的接触角小于平衡接触角；分析所述液体测试体的光学图像，以确定在所述液体测试体中是否只存在唯一一个细胞。
因此，提供了一种方法，其中将细胞(例如在少量液体中)引入液体测试体中，所述液体测试体相对于平衡液滴的形状是扁平的。较低的曲率使得能够以提高的置信度光学识别位于液体测试体边缘附近的细胞。液体测试体(相对于平衡液滴)的较低高度减少了细胞沉淀到基底表面所需的时间，从而可以快速获得高质量的细胞光学图像。该方法使得可以快速且可靠地确定液体主体是否只存在唯一一个细胞。
在一个实施方案中，形成所述液体测试体包括：在所述基底表面上沉积液体前体；以及在所述液体前体与所述基底表面接触的同时，除去所述液体前体的一部分。已经发现，该方法允许快速且容易地生产测试体，并且提供对每个测试体的最终形状的高水平控制以及高再现性。
在一个实施方案中，在液体前体中提供唯一一个细胞(即源自液体前体)(即，在前体被展平之前存在所述细胞)。这种方法可以最大程度地减少所需的处理步骤。
在一个实施方案中，该方法还包括将另一体积的液体添加到液体中间体中，所述液体中间体是通过所述的除去所述液体前体的一部分形成的。在一个实施方案中，在另一体积的液体中提供唯一一个细胞。通过避免在除去液体以形成(平的)测试体的过程中细胞被除去的风险，该方法提供了在液体测试体中存在细胞的高可能性。流体动力学效应还意味着，当添加另一体积的液体时，存在于该另一体积的液体中的细胞比存在于液体测试体中的细胞更可能沉降到朝向液体测试体中心的位置，因为该细胞已经提供在液体的前体中。
在一个实施方案中，用覆盖液体覆盖所述液体测试体，所述测试体的光学图像经分析包括这样的光学图像：所述测试体具有所述覆盖液体覆盖所述液体测试体，所述覆盖液体与所述液体测试体不混溶。所述覆盖液体减小了液体测试体的弯曲边界处折射率变化的大小，从而即使在靠近液体测试体边缘的区域中也有助于对液体测试体进行精确成像。
根据本发明的一个方面，提供了一种提供分离的单细胞的方法，包括：在基底表面上提供液体测试体，所述液体测试体包含单细胞；用与所述液体测试体不混溶的覆盖液体覆盖所述液体测试体；以及分析用所述覆盖液体覆盖的所述液体测试体的光学图像，以确定所述液体测试体是否仅包含唯一一个细胞。
根据本发明的另一方面，提供了一种提供分离的单细胞的方法，包括：在基底表面上形成液体测试体，其中所述液体测试体与所述基底表面之间的接触角小于25度；以及分析所述液体测试体的光学图像，以确定在所述液体测试体中是否只存在唯一一个细胞。
根据本发明的一个方面，提供了一种用于提供分离的单细胞的设备，该设备包括：分配单元，被配置为以如下方式在基底表面上形成液体测试体：所述液体测试体与所述基底表面之间的接触角小于平衡接触角；光学系统，被配置为形成所述液体测试体的光学图像；以及分析单元，被配置为分析所捕获的图像以确定在所述液体测试体中是否只存在唯一一个细胞。
根据本发明的一个方面，提供了一种用于提供分离的单细胞的装置，该装置包括：分配单元，被配置为在基底表面上提供液体测试体，并且用与所述液体测试体不混溶的覆盖液体覆盖所述液体测试体；光学系统，被配置为形成被所述覆盖液体覆盖的所述液体测试体的光学图像；以及分析单元，被配置为分析所捕获的图像以确定在所述液体测试体中是否只存在唯一一个细胞。
附图说明
现在将仅通过举例的方式，参考附图描述本发明的实施例，在附图中，相应的附图标记指示相应的部分，其中：
图1是靠近孔板的固体壁的细胞的光学图像。
图2是靠近容纳空间的液体壁的细胞的光学图像，该容纳空间通过液体壁与相邻容纳空间隔开。
图3是靠近容纳空间的液体壁的细胞粘连(doublet)的光学图像，该容纳空间与相邻的容纳空间通过液体壁隔开。
图4是侧视截面图，其描绘了孔板的一部分，以及使用分配单元将液体主体沉积到孔中的基底表面上以及使用光学系统形成液体主体的图像。
图5是图4所示类型的液体主体的光学图像。
图6是侧视截面图，其描绘了孔板的一部分，以及使用分配单元以用覆盖液体来覆盖液体测试体，以及使用光学系统以形成覆盖的液体测试体的图像。
图7是图6所示类型的覆盖的液体测试体的光学图像。
图8是侧视截面图，其描绘了孔板的一部分，以及使用液体除去单元以从液体前体中除去液体以提供液体测试体。
图9是图8所示类型的液体测试体的光学图像，所述液体测试体通过从图5中成像的液体中除去80％的液体而形成。
图10是侧视截面图，其描绘了孔板的一部分，以及使用分配单元以使用覆盖液体覆盖图8所示类型的液体测试体，以及使用光学系统形成覆盖的液体测试体的图像。
图11是图10中所示类型的覆盖的液体测试体的光学图像，所述液体测试体通过覆盖图9中成像的液体测试体而形成。
图12是侧视截面图，其描绘了孔板的一部分，以及向液体中间体添加另一体积的液体以将细胞引入液体中间体并形成液体测试体。
图13是描绘孔板的一部分的侧视截面图，显示孔板的孔至少部分地填充了细胞培养液。
图14是又一实施例的侧视截面图，其中容纳空间通过液体壁而不是固体壁彼此分开。
图15至图17描绘了使用润湿体(例如，浸渍的多孔材料)形成测试体的一系列操作。
图18描绘了通过从移动的喷射头喷射液体来形成测试体。
图19描绘了：(a)座滴命名法(Sessile drop nomenclature)。(b)穿过聚苯乙烯基底上的座滴的光路的图示，与液滴表面不同的角度α会导致不同的出射角μ。(c)当μ<μm时折射光进入物镜，当μ>μm时图像上出现暗区。
图20描绘了：在IX53倒置显微镜上，用带有NA 0.25(Olympus A10 PL)的10倍物镜拍摄的图像(a)和(d-h)以及用带有NA 0.75(Nikon Plan Apo)的20倍物镜拍摄的图像(i)。(b)用FTA仪器一起拍摄的图像。所有液滴图像的底部直径为1.68mm，并标明了每个液滴的体积。(a)：在倒置显微镜上的座滴，(b)：(a)中液滴的侧视图，(c)：沿(a)中虚线所示的光强度图。(d-i)：具有不同体积的液滴图像。较小的体积会导致曲率减小，从而减小最大μ并除去可见定位线附近的暗区。
图21描绘了：鉴定孔板中的细胞。所有液滴具有相同的足迹面积但具有如图所示的不同体积，使用带有NA 0.25(Olympus A10 PL)的10倍物镜拍摄图像。a(i)-d(i)示出了每列中的实验设置。a(ii)-d(ii)：用DMEM+10％FBS制成的液滴的图像，c(ii)和d(ii)示出了浸没在FC40中的液滴的图像。a(iii)–d(iii)：与上一行相同的液滴形状，形成液滴之前，培养基中有HEK细胞。a(iv)-d(iv)示出了a(iii)-d(iii)的一部分的放大图。
具体实施方式
如说明书的背景技术部分所述，边缘效应会干扰孔板的孔中是否存在单细胞的可靠确定。在图1的光学图像中说明了该问题，其中壁的存在使与壁相邻的细胞在光学上不清楚。在该示例中，只能通过使用昂贵的光学器件和荧光或其他细胞标记来识别细胞。即使使用昂贵的光学器件和标记，壁的存在也会使细胞识别的可靠性降低，并可能耗费更多时间。可以通过将图1的图像与图2和图3的图像进行比较来了解边缘效应的大小，图2和图3分别显示了当将固体壁替换为液体壁时如何更容易地识别单细胞和粘连细胞。
本公开的实施方案提供允许将单细胞(即，唯一一个细胞)可验证地引入到用于单克隆细胞培养的容器中的方法和设备，或单细胞分离所需要的其他方法，其具有改进的可靠性、速度和/或不需要过于昂贵的设备。
根据一类实施方案，以下参考图4开始对其实施例进行详细描述。一种提供分离的单细胞的方法，包括在基底表面4上形成液体测试体12，其中液体测试体12与基底表面4之间的接触角小于平衡接触角，可选地低于平衡接触角的80％、可选地低于60％、可选地低于40％、可选地低于20％。在一个实施方案中，液体测试体12与基底表面4之间的接触角相比于平衡接触角更接近于零，可选地更接近后退接触角。该方法还包括分析液体测试体12的光学图像，以确定在液体测试体12中是否只存在唯一一个细胞。该方法可以包括捕获液体测试体12的光学图像并分析捕获的图像以确定在液体测试体12中是否只存在唯一一个细胞。
接触角的概念在本领域中是众所周知的。接触角是液体界面遇到固体表面时量化固体表面对所讨论液体的润湿性的角度。对于给定的固体、液体和蒸气/液体系统，有一个独特的平衡接触角。在实践中观察到接触角滞后，这意味着在某些情况下可以观察到最大(前进)接触角和最小(后退)接触角之间的接触角。可以使用多种方法来测量接触角，例如静态座滴法、动态座滴法、单纤维弯月面法和Washburn方程毛细管上升法。
在一个实施方案中，如图4所示，分配单元2用于将液体沉积到基底表面4上，以便提供液体测试体12。在一个实施方案中，如下所述，分配单元2首先沉积液体前体11，在随后的步骤中处理该液体前体11以提供液体测试体12。在一个实施方案中，液体测试体12和/或液体前体11在基底表面4上形成圆形液滴。在一个实施方案中，基底表面4形成用于细胞培养的容纳空间6的边界。在该示例中，基底表面4是孔板8的孔的底表面，孔板8的每个孔提供不同的容纳空间6。孔板8可以采用孔板领域中已知的任何形式，例如包括市售孔板。可以使用的孔板的非限制性示例包括具有96、384或1536个孔/板的孔板，孔板的每孔工作体积分别为
Figure BDA0002940801580000051
微升，
Figure BDA0002940801580000052
微升和
Figure BDA0002940801580000053
微升。在图4的示例中，仅示出了孔板8的一小部分。为了清楚起见，仅描述了对于一个孔的分配单元2的使用，但是应当理解，对于多个孔，该过程可以重复或并行进行。
分配单元2的性质没有特别限制。可以使用能够以所需的空间和体积精度沉积液体的任何分配单元2。因此，分配单元2可以包括为此目的的液体处理设备的任何合适的组合，包括例如适当配置的桶架系统和控制器，所述桶架系统用于在孔板8的表面上方移动注射头以将注射头定位在每个孔上方(例如，压电式、喷墨打印机、泵和油管)，所述控制器用于将受控量的液体引导注入每个孔内的局部区域。分配单元2可以包括多个不同的设备和/或被配置为执行多种不同的技术。分配单元2可以例如另外被配置为除去液体，由此用作液体除去单元18(如下所述)。分配单元2可以被配置为添加覆盖液体13(如下所述)。分配单元2可以被配置成添加另一体积的包含细胞的液体20(如下所述)。分配单元2可以被配置为添加培养基以填充容器，例如用于细胞培养的培养基(如下所述)。
在一个实施方案中，提供光学系统14(例如，包括一个或多个透镜、光学检测器和/或光源)，用于捕获液体主体(例如测试体12或前体11)的光学图像。光学图像的捕获可以包括由人观看光学图像和/或，当捕获至少部分地由机器执行时，存储代表光学图像的数据，至少直到分析捕获的图像为止(参见下文)。光学系统14可以被配置为使得光学图像的焦平面与基底表面4的平面重合或靠近。因此，光学系统14可以优先对基底表面4上与该基底表面4直接相邻的液体主体的一部分进行成像，从而允许以高灵敏度检测已经沉积在基底表面4上的细胞。在一个实施方案中，光学系统14被配置为从上方提供照明和从下方提供图像。在一个实施方案中，提供了分析单元16，其被配置为分析所捕获的图像以确定在被成像的液体内是否只存在单细胞(即，唯一一个细胞)。可选地或附加地，例如，当操作员正在使用光学系统14查看光学图像时，或者当操作员正在查看显示在显示器上的一个版本的捕获图像时，可以由操作员分析(评估)捕获的图像，以确定正在被成像(或已被成像)的液体主体中是否只存在单细胞(即唯一一个细胞)。
分析单元16可以是计算机实现的。该计算机可以包括计算机硬件的各种组合，包括例如CPU、RAM、SSD、主板、网络连接、固件、软件和/或本领域已知的其他允许计算机硬件执行所需计算操作的元件。所需的计算操作可以由一个或多个计算机程序定义。所述一个或多个计算机程序可由用于存储计算机可读指令的介质，可选地非暂时性介质的形式来提供。当计算机读取计算机可读指令时，计算机将执行所需的方法步骤。所述计算机可以由独立单元组成，例如通用台式计算机、笔记本电脑、平板电脑、移动电话、智能设备(例如，智能TV)等。或者，计算机可以由具有多个独立计算机的分布式计算系统组成，所述计算机系统具有通过网络(例如Internet或Intranet)彼此连接的不同计算机。
在一个实施方案中，分析单元16使用模式识别算法来识别由光学系统14捕获的图像内的细胞。当模式识别算法识别出捕获的图像中的唯一一个细胞时，分析单元16确定液体主体包含唯一一个细胞。
在一些实施方案中，光学系统14从下方对液体主体成像。这确保了最靠近光学系统14的液体主体的界面是平的(如果基底表面4是平的)，这有助于产生清晰的图像。在其他实施方案中，光学系统14从上方对液体主体成像。
图5描绘了图4所示类型的液体主体的图像，该液体主体由处于平衡状态(在液体与基底表面之间具有平衡接触角)的1μl液滴组成。尽管最靠近光学系统14的液体主体的界面是平的，但液滴与空气之间的上部界面的曲率会降低朝向主体边缘的图像(圆形液滴周围的较暗区域)的质量，并使得在该区域可靠地检测细胞变得更加困难。
在一个实施方案中，如图6所示，分配单元2用覆盖液体13来覆盖液体测试体12。在这种情况下，可以通过对最初具有平衡接触角(或更大接触角)的液体进行覆盖来形成液体测试体12，例如对图4中所示的液体主体进行覆盖来形成。可替代地，如下所述，测试体12可以包含扁平的液体主体，该扁平的液体主体相对于基底表面4的接触角小于平衡接触角。覆盖液体13与液体测试体12不混溶。在一个实施方案中，液体测试体12是水性的，并且覆盖液体13与水不混溶。在一个实施方案中，覆盖液体13包括油。在一个实施方案中，覆盖液体13包括碳氟化合物，例如FC40，其是密度为1.8555g/ml的透明的完全氟化的液体，其广泛用于基于液滴的微流体中。
在一个实施方案中，覆盖液体13的折射率相比于空气的折射率，更相似于液体测试体12的折射率(例如，更类似于水的折射率)。这减小了在液体测试体12的弯曲上边界处的折射率差的大小，如图7所示，从而减轻了朝向测试体12的图像边缘的图像质量的降低，并且有助于检测该区域中的细胞。通过将图5与图7进行比较，可以了解这种改进。
在一个实施方案中，如图8所示，形成所述液体测试体12包括沉积液体前体11(例如，接触角等于或大于平衡接触角的液体主体，例如图4所示的液体主体)，使用液体除去单元18在液体前体11与基底表面4接触的同时，除去液体前体11的一部分。在一个实施方案中，去除至少50％，任选地至少60％，任选地至少70％，任选地至少80％，任选地至少90％，任选地至少95％，任选地至少99％的液体前体11。进行该除去操作，使得所得液体主体与基底表面4之间的接触角小于液体前体11与基底表面4之间的接触角。因此，例如，液体前体11可以以使得液体前体11与基底表面4之间的接触角处于或接近平衡接触角的方式沉积在基底表面4上。然后可以通过将液体从前体11中吸出来实现液体的除去，从而使液体主体变得更平。因此，接触角减小，例如接触角减小到平衡接触角与后退接触角之间或近似等于后退接触角。通过除去液体形成的液体主体可以用作液体测试体12，能够马上用于成像以确定是否只存在唯一一个细胞(如图8所示)，或者可以如下面进一步详细描述的那样，用作液体中间体121，在后续阶段向中间体121中添加另一体积的液体以提供细胞。因此，测试体12可以是比前体11的主体更平坦但不比中间体121更平坦的主体。测试体12(以及，如果有的话，中间体121)的液体组成通常与前体11的液体的组成基本相同(例如，在两种情况下或全部情况下为水性)。
液体除去单元18的性质没有特别限制。可以使用能够以适当的精度除去液体的任何液体除去单元18。因此，液体除去单元18可以包括用于该目的的液体处理设备的任意合适的组合，包括例如适当配置的桶架系统和控制器，所述桶架系统用于在孔板8的表面上方移动注射头以将注射头定位在每个孔上方，所述控制器用于从每个孔内的局部区域引导抽吸受控量的液体。为了清楚起见，仅示出了对于其中一个孔的液体除去单元18的使用，但是将理解的是，对于多个孔，该过程可以重复或并行进行。
在这种类型的实施方式中，光学系统14捕获相对平的液体测试体12的图像，而不是接近平衡形状(例如，如图6所示)的测试体12的图像，但是可以如上所述的那样配置。例如通过分析单元16分析捕获的液体测试体12的图像，以确定在液体测试体12中是否只存在唯一一个细胞。除了图像来自平的测试体12的事实之外，分析单元16还可以如上所述进行配置。
图9示出了图8所示类型的液体测试体12的光学图像，该测试体通过从图5中成像的液体主体中除去0.8nl的液体而形成。通过除去液体形成的液体测试体12导致变平，这减小了上界面的曲率，并且减轻了朝向液体主体图像边缘的图像质量的降低，有助于检测该区域中的细胞。通过比较图5和图9，可以了解这种改进。
在一个实施方案中，如图10中示意性所示，分配单元2用覆盖液体13覆盖扁平的液体测试体12。覆盖液体13可以参考图6和图7采用以上描述的任何形式。覆盖液体13减小了在液体测试体12的弯曲上边界处的折射率差的大小，如图11所示，从而减轻了朝向测试体12的图像边缘的图像质量的降低，并且有助于检测该区域中的细胞。通过将图5或9与图11进行比较，可以了解这种改进。实际上，在图11中，测试体12的外边缘几乎是看不见的。
在一个实施方案中，在液体前体11中提供存在的唯一一个细胞(即源自液体前体11)(当使用液体前体11时)。如下所述，液体前体11最初具有多个细胞，但是可以在测试体12的形成过程中除去一些细胞。在唯一一个细胞起源于前体11的实施方案中，不需要额外的添加细胞的步骤。例如，可以在用于沉积多个液体前体11的液体中提供细胞，其中细胞的浓度应使得适当量的液体前体11平均包含唯一一个细胞和/或适当量的液体测试体12包含唯一一个细胞(即使从前体11中除去液体以形成测试体12之后)。因此，在一些实施方案中，特别是在除去大部分液体前体11以提供液体测试体12的情况下，液体前体11可能最初包含许多细胞，但是前体11中的细胞浓度使得当形成测试体12时，测试体12包含唯一一个细胞的可能性相对较高。
可选地或附加地，如图12所示，分配单元2可以被配置为向液体中间体121添加另一体积的液体20，所述液体中间体121是通过除去一部分液体前体11而形成的液体主体(例如，如以上参照图8所述)。通过向液体中间体121中添加另一体积的液体20而得到的液体主体用作液体测试体12，可以马上用于成像并确定测试体12中是否只存在唯一一个细胞。如果存在的话，则该唯一一个细胞是在该另一体积的液体20中提供的。例如，可以使用单细胞打印机技术添加该另一体积的液体20。在一个实施方案中，对喷射头中的细胞进行成像以鉴定待喷射的一定体积的液体中(尖端附近)是否存在单个分离的细胞，当通过成像鉴定出存在单个细胞时，所要喷射的体积的液体被射出以作为该另一体积的液体20。由此，可以在通过从液体前体11除去液体而形成液体中间体121之后添加细胞。由于流体动力学效应，该方法可促进细胞向容纳空间中心的定位，这将有利于该另一体积20与中间体121的结合，使得该另一体积20中的任何细胞趋向于朝向所形成的测试体12的中心定位，而不是朝向所形成的测试体12的边缘定位。通常将该另一体积20中的液体添加到靠近中心的中间体121，这使得中间体121中已经存在的液体向外移动，而新添加的液体保持在中心附近。
在一个实施方案中，该另一体积20足够小，使得即使通过将该另一体积20添加到中间体121而形成测试体12，液体测试体12仍保持相对扁平，从而确保测试体12的上部界面的弯曲保持相对较低，以允许通过光学系统14可靠地检测测试体12中的单个细胞。在一个实施方案中，在添加另一体积的液体20之后，液体测试体12的体积小于液体前体11的体积。在上述示例中，其中提供了体积约为1μl的前体11(图4)，并除去了800nl以形成中间体121，因此，另一体积20将小于800nl。在一个实施方案中，使用单细胞打印机方法，例如产生液滴的喷嘴，施加该另一体积20。
在上述实施方案中，描述了方法，其中通过从前体11除去液体来形成比平衡液体主体更扁平的主体(例如，测试体12或中间体121)。在其他实施方案中，比平衡液体主体更扁平的主体(适于用作测试体12或中间体121)是通过将液体主体直接以扁平形式沉积而形成的。在一类实施方案中，如图15-17所示，这是通过以下方式实现的：使润湿体26(例如，浸有液体的多孔材料，如湿海绵，或在其上形成有水体的固体元件)在基底表面4上的接触区域(可以称为润湿区域)上连续地与基底表面4接触，然后除去润湿体26。这种方法可以直接提供液体主体，使所述液体主体以比平衡接触角更小的接触角铺在接触区域。在另一类实施方案中，如图18所示，可以执行正向打印过程，在该过程中，在喷射头28相对于基底表面4移动期间，液体从喷射头28喷射到基底表面4上，从而形成接触角小于平衡接触角的液体主体。这可以通过适当地控制从喷射头28流出的液体的流速和喷射头28相对于基底表面4的移动速度来实现(例如，因此流速不要太高，并且移动速度不要太低)。在又一类实施方案中，形成测试体12，其具有非常小的平衡接触角，可选地小于25度(在空气中和/或当覆盖有诸如FC40的覆盖液体13时)，可选地小于15度，可选地小于10度，可选地小于5度，可选地小于1度。由此，可以实现与上述具有相对平的测试体12有关的好处，而不必使用获得比平衡接触角更小的接触角的那些步骤(尽管可以采用这样的步骤来进一步减小接触角)。已知多种用于实现低平衡接触角的技术，包括向液体中添加表面活性剂。在示例性实施方案中，形成包含泊洛沙姆例如
Figure BDA0002940801580000101
的测试体12，已知
Figure BDA0002940801580000102
与细胞特别相容。泊洛沙姆是非离子型三嵌段共聚物，其由聚氧丙烯的中心疏水链与两个聚氧乙烯的亲水链侧接而成。在另一个示例性实施方案中，形成包含聚山梨酸酯20的测试体12，聚山梨酸酯20是在加入月桂酸之前通过对山梨糖醇进行乙氧基化形成的聚山梨酸酯型非离子表面活性剂。只要保持足够低的浓度/暴露时间，就可以使用许多其他非离子型表面活性剂，对细胞的损害风险很小。
在一个实施方案中，如图13所示，在已经确定液体测试体12具有唯一一个细胞之后，每个容纳空间6至少部分地用细胞培养液填充。至少部分填充可以使得每个容纳空间6的所有底部都完全被液体覆盖。在一个实施方案中，每个容纳空间6被填充至容纳空间6的高度的至少25％(可选地至少50％，可选地至少75％)。然后在已确定最初存在唯一一个细胞的每个容纳空间6中进行细胞的单克隆集落的培养过程。培养过程可以包括确保细胞能够获得可能需要的任何营养、生长因子、激素和/或气体，以及控制理化环境以维持合适的条件。可以从图6、图8和图10所示的任何配置开始，用细胞培养液至少部分填充每个容纳空间6。在提供覆盖液体13的情况下，在用细胞培养液填充之前，可以除去或部分除去覆盖液体13，或可在后续的阶段留下或除去覆盖液体13(或完全不除去)。
对于多个容纳空间6(例如，由孔板中的各个孔限定的所有容纳空间6)，重复上述过程(例如，形成液体测试体12，可选地除去液体以提供测试体12，可选的覆盖、成像和分析步骤)，在确定最初存在唯一一个细胞的每个容纳空间6中培养细胞的单克隆集落。
在一个实施方案中，多个容纳空间6通过固体壁22彼此分开(如图13所示)。在一个实施方案中，每个液体测试体12被提供在各自的容纳空间6的中心区域中，以便不与将容纳空间6与其他容纳空间6分开的任何固体壁22接触。
在替代实施方案中，多个容纳空间6通过液体壁24彼此分开(如图14所示)。在这种情况下，可以通过在已经进行单细胞检测之后将细胞培养液添加到液体测试体12中来形成储集体积6。所添加的液体可以使得每个容纳空间6在基底表面4上的印迹与相应的液体测试体12的印迹相同(通过确保每个容纳空间6与基底表面4的接触角不超过前进接触角)。用覆盖液体13覆盖多个容纳空间6。覆盖液体可以采用上述任何形式(例如，FC40)。因此，液体壁24由容纳空间6之间的覆盖液体13形成。
背景理论和进一步的实验验证
如上所述，在下面的讨论中，对“液滴”的引用应理解为包括在基底表面上形成的液体的主体(例如测试体)。
理论
可以通过了解数值孔径(NA)来计算在空气中显微镜物镜可接受的最大角度μm。
um＝sin-1NA
角度超过μm的光线将不会到达图像平面，因此可能会导致出现暗区。当光线穿过弯曲的液体表面，例如液滴(例如在基底表面上的液体测试体)时，折射率的变化会导致光线根据斯涅尔定律(Snell’s law)发生折射。为了说明这种效果，将折射率n＝1.33的水座滴置于空气(n＝1)包围的聚苯乙烯(n＝1.58)表面(普通孔板材料)上。如果液滴半径小于毛细管直径的长度
Figure BDA0002940801580000121
则重力的影响可忽略不计，液滴的形状为球形帽。对于图19(a)中所示的球形帽，最大高度h，曲率半径R，体积，Vcap，印迹半径a和接触角θ通过以下公式关联：
Figure BDA0002940801580000122
Figure BDA0002940801580000123
Figure BDA0002940801580000124
对于已知的体积和印迹半径，可以评估整个液滴的几何形状。然后，参考图19(a和b)，可以通过以下公式提供表面上任意点处的切线与水平线之间的角α：
Figure BDA0002940801580000125
使用该角，可以通过满足斯涅尔折射定律来确定通过座滴的光线轨迹。图19(c)图解了平行光通过聚苯乙烯基底上的座滴的路径，该座滴具有空气/水界面(实线光线路径)和FC40/水界面(虚线光线路径)。如果光线发生折射，使它们的出射角μ超过μm；那么图像将在如图19(c)所示的这些区域中显得暗淡，在这些暗淡区域中所示Ra与μ＝μm同时发生，白色区域μ<μm和暗区μ>μm。当液滴被碳氟化合物FC40(n＝1.29)等不混溶性流体覆盖时，由于该不混溶性流体具有较高折射率(如虚线光线路径所示)，μ低于空气。
实验装置
为了鉴定孔板中的单细胞，重要的是，细胞沉积在孔中的整个区域必须具有光学清晰度。通常，增强的光学清晰度降低了显微镜检查和人工/时间成本。用流体壁代替固体壁的原理-液滴的液/流体界面成为界面流体壁-并且控制其中的体积可以使得用低成本的显微镜物镜在整个液滴区域实现完全的清晰度。通过将等体积的8份1μl座滴细胞培养基(DMEM+10％胎牛血清(FBS))放在聚苯乙烯基底上来验证这种方法。从七种流体中抽出液体，留下的液滴体积在100-1000nl之间，且印迹面积恒定–FBS防止定位线后退，因为从液滴中除去了流体，这导致了较小的后退接触角。使用安装在IX53倒置显微镜上的尼康D610DSLR，所述倒置显微镜在明视场模式下操作并且装有10倍物镜-Olympus A10 PL，在液滴形成后不到十秒的时间内对液滴成像，以最大程度地减少蒸发效应；NA＝0.25。尽管在本文中仅使用了明视场，但该方法在明视场显微镜和相差显微镜中均有效。如理论部分所述，使用测得的印迹区域(使用显微镜校准尺从图像中得出)计算出接触角θ；使用First TenAngstroms(FTA)仪器和软件通过座滴法直接测量接触角θ。对于后一种方法，液滴是通过使用通过特氟隆管与注射泵(Harvard Ultra)连接的针头(33G钝NanoFilTM针，世界精密仪器公司)喷射1μl液滴而形成的。将液滴从聚苯乙烯制成的
Figure BDA0002940801580000131
悬浮培养皿底部轻轻地转移到切成正方形切块的表面，然后从侧面成像。使用分析法和座滴法测定的结果是，空气中的平衡接触角分别为
Figure BDA0002940801580000132
和
Figure BDA0002940801580000133
如前所述制备细胞。
结果
处理图20的液滴图像以测量半径Ra(从深色区域开始)，可以从该半径计算出α和光线路径；表1列出了具有恒定印迹直径的液滴体积的最终数据。考虑液滴A-F(在图20中标记为a-f)；在Ra处垂直进入液滴的光线的平均μ＝12.8°(SD为0.6°)。所用物镜的NA提供了μm＝14.5°。考虑到平行光进入液滴的简化假设，这种一致是令人满意的；此外，对于一定范围的液滴体积，μ的近似恒定值进一步说明了分析的有效性。所考虑的所有液滴的最大折射角以μ＝48°出现在同一液滴A和I(图20中的a和i)的边缘；这是α＝θ＝82的最大值。使用NA＝0.75的显微镜物镜(μm＝48.6°)观察该液滴的一部分，最终图像中的暗区最小化，如图20(i)所示。表1还显示，液滴G-H在任何地方都导致μ<10°，因此使用NA＝0.25的物镜消除了暗区，如图20(g&h)所示。可以通过用折射率比空气大的不溶混性流体，例如FC40(n＝1.29的碳氟化合物)覆盖液滴，进一步减小μ值。在表1中对于液滴几何形状A-F，μ从空气中的平均12.8°降低到1.3°。
表1
液滴 体积(μl) <![CDATA[R<sub>a</sub>(μm)]]> θ° h(μm) <![CDATA[α°@R<sub>a</sub>]]> μ°@α(空气) μ°@α(FC40)
A 1 466 82 726 33.6 12.0 1.5
B 0.8 485 73 618 33.8 12.1 1.1
C 0.7 531 68 558 36.0 13.0 1.2
D 0.6 581 61 492 37.5 13.7 1.3
E 0.4 696 45 346 36.1 13.1 1.2
F 0.3* 835 35 263 35.0 12.6 1.2
G 0.2* 835 24 177 24.0 8.2 0.8
H 0.1* 835 13 91 12.5 4.2 0.4
I 1** 835 82 726 82 48 10.9
*所示数据仅出于完整性考虑，并且基于定位线处的α进行计算。
**计算在所有考虑的液滴的最大接触角处的最大折射。
表1：对图20所示的液滴图像所计算的几何参数(有些未显示)，假设液滴形状由球形帽表示。
为了评估使用此方法鉴定细胞的难易程度，将四滴液滴置于具有变化体积和恒定印迹的悬浮细胞培养基底上，如图21a(i)-d(i)所示。如前对液滴成像，通过比较a(ii)和d(ii)，FC40/水界面的影响是明显的，其中用FC40覆盖时，深色环形区域几乎消失了。这在b(ii)和c(ii)之间也很明显，其中当用FC40覆盖时液滴的轮廓几乎消失了，因此为鉴定这些区域中的细胞提供了完全的清晰度。用细胞悬浮液产生的液滴显示在a-d(iii)中，是在a-d(iv)的定位线附近的区域中数字放大的部分，以说明鉴定细胞的难易程度。
在a(iv)中在暗区中看不到细胞，但使用低成本显微镜在b-d(iv)中可以鉴定单细胞。注意，使用d(iv)方法，液滴仍然可以具有很高的高度，有关数值请参见表1，因此细胞可能在显微镜物镜焦深之外；图像中显示了两个轮廓可见的细胞，但它们不在焦点内。因此，在开始成像以确保单克隆性之前，这种方法要么需要对液滴进行垂直扫描，要么需要沉降期使细胞沉淀落入培养皿底部。如20(i)中使用的高NA物镜也会除去在a列中的液滴的深色区域，但是较高成本、如在d(iv)中的沉降时间问题，较高放大率(较高的NA透镜通常具有较高的放大倍率或需要专门的显微镜)将使其使用效果有限。
降低液滴高度的b(iv)和c(iv)的方法可以通过使液滴足够扁平来消除对通过液滴的多次成像和沉降时间的需要。这两种方法都是用于鉴定孔板形式内的细胞的有效方法，并且是确保单克隆性的良好方法。单细胞分离和确保单克隆方法的实际实施可以是；1)在孔板上形成培养基液滴以适应单个图像；2)从液滴中除去液体；3)使用已建立的小体积分配技术将纳米升的单细胞悬液分配到液滴中；3a)可选地，如果蒸发有问题则用FC40覆盖，4)记录图像并确认哪个孔包含单细胞，5)用培养基填充孔并正常处理孔板。
在以下编号的条款中定义了本公开的其他实施方案：
1.一种提供分离的单细胞的方法，包括：在基底表面上形成液体测试体，其中所述液体测试体与所述基底表面之间的接触角小于平衡接触角；分析所述液体测试体的光学图像，以确定在所述液体测试体中是否只存在唯一一个细胞。
2.根据第1款所述的方法，其中，所述液体测试体与所述基底表面之间的接触角相比于所述平衡接触角更接近于零。
3.根据第1或2款所述的方法，其中，形成所述液体测试体的步骤包括：在所述基底表面上沉积液体前体；以及在所述液体前体与所述基底表面接触的同时，除去所述液体前体的一部分。
4.根据第3款所述的方法，其中，所述唯一一个细胞，当存在时，来自所述液体前体。
5.根据第3款所述的方法，其中：所述方法还包括将另一体积的液体添加到液体中间体中，从而提供所述的液体测试体，所述液体中间体是通过所述的除去所述液体前体的一部分形成的，在捕获所述液体测试体的光学图像之前添加另一体积的液体；以及将所述唯一一个单细胞，当存在时，提供在所述另一体积的液体中。
6.根据第5款所述的方法，其中，在添加了所述另一体积的液体之后，所述液体测试体的体积小于所述液体前体的体积。
7.根据第3至6中任一款所述的方法，其中，所述除去所述液体前体的一部分包括除去所述液体前体的体积的至少50％。
8.根据前述任一款所述的方法，其中，所述形成所述液体测试体包括使润湿体与所述基底表面接触，随后除去所述润湿体与所述基底表面的接触。
9.根据前述任一款所述的方法，其中，所述形成所述测试液体包括在使喷射头相对于所述基底表面移动的同时，从所述喷射头喷射液体，从而形成液体主体，并且所述液体主体的接触角小于所述平衡接触角。
10.根据前述任一款所述的方法，还包括：用覆盖液体覆盖所述液体测试体，其中所述测试体的光学图像经分析包括这样的光学图像：所述测试体具有所述覆盖液体覆盖所述液体测试体，所述覆盖液体与所述液体测试体不混溶。
11.根据第10款所述的方法，其中，所述覆盖液体的折射率相比于空气的折射率，更相似于所述液体测试体的折射率。
12.根据前述任一款所述的方法，其中：所述基底表面形成用于细胞培养的容纳空间的边界的至少一部分；以及在确定所述液体测试体仅包含唯一一个细胞之后，将所述容纳空间至少部分地填充细胞培养液。
13.根据第12款所述的方法，还包括在所述容纳空间中培养细胞的单克隆集落。
14.根据第12或13款所述的方法，其中，针对多个容纳空间重复形成和分析步骤，在确定所述液体测试体包含唯一一个细胞的每个所述容纳空间中培养细胞的单克隆集落。
15.根据第14款所述的方法，其中，所述多个容纳空间通过固体壁彼此分开。
16.根据第15款所述的方法，其中，每个液体测试体与将所述容纳空间与其他容纳空间分开的所有固体壁分开。
17.根据第14款所述的方法，其中，所述多个容纳空间通过液体壁彼此分开。
18.一种提供分离的单细胞的方法，包括：在基底表面上提供液体测试体，所述液体测试体包含单细胞；用与所述液体测试体不混溶的覆盖液体覆盖所述液体测试体；以及分析用所述覆盖液体覆盖的所述液体测试体的光学图像，以确定所述液体测试体是否仅包含唯一一个细胞。
19.一种提供分离的单细胞的方法，包括：在基底表面上形成液体测试体，其中所述液体测试体与所述基底表面之间的接触角小于25度；以及分析所述液体测试体的光学图像，以确定在所述液体测试体中是否只存在唯一一个细胞。
20.一种用于提供分离的单细胞的设备，包括：分配单元，被配置为以如下方式在基底表面上形成液体测试体：所述液体测试体与所述基底表面之间的接触角小于平衡接触角；光学系统，被配置为形成所述液体测试体的光学图像；以及分析单元，被配置为分析所捕获的图像以确定在所述液体测试体中是否只存在唯一一个细胞。
21.一种用于提供分离的单细胞的设备，包括：分配单元，被配置为在基底表面上提供液体测试体，并且用与所述液体测试体不混溶的覆盖液体覆盖所述液体测试体；光学系统，被配置为形成被所述覆盖液体覆盖的所述液体测试体的光学图像；以及分析单元，被配置为分析所捕获的图像以确定在所述液体测试体中是否只存在唯一一个细胞。

Claims (18)

1.一种提供分离的单细胞的方法，包括：
在基底表面上形成液体测试体，其中所述液体测试体与所述基底表面之间的接触角小于平衡接触角；
分析所述液体测试体的光学图像，以确定在所述液体测试体中是否只存在唯一一个细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述液体测试体与所述基底表面之间的接触角相比于所述平衡接触角更接近于零。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，形成所述液体测试体的步骤包括：
在所述基底表面上沉积液体前体；以及
在所述液体前体与所述基底表面接触的同时，除去所述液体前体的一部分。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述唯一一个细胞，当存在时，来自所述液体前体。
5.根据权利要求3所述的方法，其中：
所述方法还包括将另一体积的液体添加到液体中间体中，从而提供所述的液体测试体，所述液体中间体是通过所述的除去所述液体前体的一部分形成的，以及
将所述唯一一个单细胞，当存在时，提供在所述另一体积的液体中。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，在添加了所述另一体积的液体之后，所述液体测试体的体积小于所述液体前体的体积。
7.根据权利要求3所述的方法，其中，所述除去所述液体前体的一部分包括除去所述液体前体的体积的至少50％。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述形成所述液体测试体包括使润湿体与所述基底表面接触，随后除去所述润湿体与所述基底表面的接触。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述形成所述液体测试体包括在使喷射头相对于所述基底表面移动的同时，从所述喷射头喷射液体，从而形成液体主体，并且所述液体主体的接触角小于所述平衡接触角。
10.根据权利要求1或2所述的方法，还包括：用覆盖液体覆盖所述液体测试体，其中所述测试体的光学图像经分析包括这样的光学图像：所述测试体具有所述覆盖液体覆盖所述液体测试体，所述覆盖液体与所述液体测试体不混溶。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述覆盖液体的折射率相比于空气的折射率，更相似于所述液体测试体的折射率。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其中：
所述基底表面形成用于细胞培养的容纳空间的边界的至少一部分；以及
在确定所述液体测试体仅包含唯一一个细胞之后，将所述容纳空间至少部分地填充细胞培养液。
13.根据权利要求12所述的方法，还包括在所述容纳空间中培养细胞的单克隆集落。
14.根据权利要求12所述的方法，其中，针对多个容纳空间重复形成和分析步骤，在确定所述液体测试体包含唯一一个细胞的每个所述容纳空间中培养细胞的单克隆集落。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述多个容纳空间通过固体壁彼此分开。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，每个液体测试体与将所述容纳空间与其他容纳空间分开的所有固体壁分开。
17.根据权利要求14所述的方法，其中，所述多个容纳空间通过液体壁彼此分开。
18.根据权利要求1或2所述的方法，还包括捕获所述液体测试体的光学图像。
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