CN1861591A - 橙皮素衍生物及其制备方法 - Google Patents

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CN1861591A CN 200610088015 CN200610088015A CN1861591A CN 1861591 A CN1861591 A CN 1861591A CN 200610088015 CN200610088015 CN 200610088015 CN 200610088015 A CN200610088015 A CN 200610088015A CN 1861591 A CN1861591 A CN 1861591A
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Abstract

一种橙皮素衍生物是(1)式所代表的化合物，式中：R1为OH、OR′1或OOCR′2；R2为H、卤素或OR′1；R3为H、NO2或NR′3R′4；5，7，3′－三位上的R1可以相同，也可以不同；6，8，2′－三位上的R2可以相同，也可以不同；其中：R′1为C1－C10的直链或支链烷基；R′2为C1－C6的直链或支链烷基；R′3、R′4为H或C1－C6的饱和烷基(它们可以相同，也可以不同)或R′3、R′4与同他们相连的氮原子一起组成3－7员饱和未取代或取代的N－杂单环。本发明的橙皮素衍生物体外抑制佐剂性关节炎大鼠(AA大鼠)腹腔巨噬细胞(PMφ)合成PGE2和LTB4的活性实验表明，其抗炎活性明显高于其母体橙皮素。

Description

橙皮素衍生物及其制备方法
技术领域：
本发明属于黄酮类化合物，具体涉及一类橙皮素的衍生物及其制备方法。
背景技术：
橙皮素是橙皮苷经水解脱去糖苷基后的非糖类化合物，属黄酮类化合物，其化学结构如式(3)所示：
橙皮素具有广泛的生物活性，如抗氧化(Park，B-S.等人J.Agric.Food Chem.51，7203，2003.)、抗肿瘤(Dauzonne，D.等人，J.Med.Chem.46，3900-3913，2003；Brueggemeier，R.W.等人，J.Med.Chem.47，4032-4040，2004)、抗炎(Kang，Y.-H.等人，J.Agric.Food Chem.53，5150-5157，2005)、预防和治疗由胆固醇升高引起的疾病(中国专利：CN 1278170，2000.12.27；CN 97198803.X，1999.10.27)、预防和治疗由血脂或血糖水平升高引起的疾病(中国专利：CN1317938A，2001.10.17)以及与5-羟色氨有关的疾病(中国专利：CN02153313.X，2003.5.14)。
但橙皮素的上述生物活性只有在大剂量(≥100mg/kg体重/天)才起显效，而橙皮素较难被吸收至体内，因此还很少直接被用作治疗药，可见，开发药效比橙皮素本身更强、生物利用度更高的新衍生物很有必要。
发明内容：
本发明的目的是提供一类结构新颖的橙皮素衍生物及其制备方法。
本发明的橙皮素衍生物，其特征在于：将橙皮素5-位、7-位和3’-位的三个羟基烷基化或酰基化和/或6-位、8-位及2’-位引入1-3个卤原子取代，5’-位引入硝基或氨基取代。用化学结构通式表示如下：
Figure A20061008801500042
式中：R1为OH、OR’1或OOCR’2；
R2为H、卤素或OR’1；
R3为H、NO2或NR’3R’4；
5，7，3’-三位上的R1可以相同，也可以不同；
6，8，2’-三位上的R2可以相同，也可以不同；
其中：R’1为C1-C10的直链或支链烷基；
R’2为C1-C6的直链或支链烷基；
R’3、R’4为H或C1-C6的饱和烷基，它们可以相同，也可以不同；或R’3、R’4与同它们相连的氮原子一起组成3-7员饱和未取代或取代的N-杂单环。
优选式中：
R1为OH、OCH3或OOCCH3；
R2为H、F、Cl、Br或OCH3；
R3为H、NO2或NH2；
5，7，3’-三位上的R1可以相同，也可以不同；
6，8，2’-三位上的R2可以相同，也可以不同。
最优选式中：
R1为OH、OCH3或OOCCH3；
R2为H或Br
R3为H、NO2或NH2；
5，7，3’-三位上的R1可以相同，也可以不同；
6，8，2’-三位上的R2可以相同，也可以不同。
优选以下化合物：
5，7，3′-三乙酰橙皮素(4)或5′-硝基-5，7，3′-三乙酰橙皮素(5)或5′-硝基橙皮素(6)或5′-氨基-5，7，3′-三乙酰橙皮素(7)或7，3′-二甲氧基橙皮素(8)或6，8，2′-三溴橙皮素(9)或8-溴-7，3′-二甲氧基橙皮素(10)。
本发明的橙皮素衍生物是用橙皮素为原料，通过下列步骤制得的：
a橙皮苷(2)经酸性水解得橙皮素(3)；
b橙皮素(3)用醋酐/吡啶进行酰基化得5，7，3′-三乙酰橙皮素(4)；
橙皮素与过量的醋酐及吡啶进行反应，醋酐(兼作溶剂)的用量为10-30当量，优选15-20当量；吡啶的用量为1.2-3当量，优选1.5-2当量；反应温度为15-35℃，优选20-25℃，在上述条件下搅拌4-7h，反应即达终点。反应混合物经分离并柱层析纯化，得5，7，3′-三乙酰橙皮素纯产品，产率87-95％。
c5，7，3′-三乙酰橙皮素(4)用(CF3CO)2O/NH4NO3进行硝化得5′-硝基-5，7，3′-三乙酰橙皮素(5)；
用5，7，3′-三乙酰橙皮素为原料，用(CF3CO)2O/NH4NO3为硝化试剂，室温下与溶于CHCl3中的5，7，3′-三乙酰橙皮素一起搅拌3h，产率75-78％。
d5′-硝基-5，7，3′-三乙酰橙皮素(5)经碱性水解得5′-硝基橙皮素(6)；
5’-硝基-5，7，3′-三乙酰橙皮素碱性条件下水解，所述的碱为各种无机碱，如NaOH、KOH、K2CO3、Na2CO3等，优选的是用K2CO3在甲醇与水的混合溶剂(CH3OH∶H2O＝4-5∶1)中反应1-3h，产物用无水乙醇重结晶，得纯5’-硝基橙皮素黄色固体，产率70-82％。
e5′-硝基-5，7，3′-三乙酰橙皮素(5)经钯/碳催化加氢得5′-氨基-5，7，3′-三乙酰橙皮素(7)；
将5’-硝基-5，7，3′-三乙酰橙皮素溶于乙酸乙酯，于常温常压下用10％Pd/C催化加氢反应到达终点后滤去催化剂，即可高产率(90-95％)获得目标产物5’-氨基橙皮素。
f橙皮素(3)碱性条件下用硫酸二甲酯进行甲基化得7，3′-二甲氧基橙皮素(8)；
橙皮素溶于丙酮与NaH及(CH3)2SO4于60-75℃下反应5-7h。反应到达终点后，用适量氨水除去过量的硫酸二甲酯，产物经脱溶、分离后，直接用柱层析纯化，产率50-55％。
g橙皮素(3)常温下溴代得6，8，2′-三溴橙皮素(9)；
橙皮素溶于乙酸乙酯，于常温下滴加Br2/AcOEt，搅拌4-6h，产物经柱层析纯化，6，8，2′-三溴橙皮素的产率90-92％。
h7，3′-二甲氧基橙皮素(8)在低温下8-位上选择性溴代得8-溴-7，3′-二甲氧基橙皮素(10)。
将7，3′-二甲氧基橙皮素溶于THF，于-5-10℃条件下滴加Br2/THF溶液，搅拌反应6-9h，产物经柱层析纯化，8-溴-7，3′-二甲氧基橙皮素的产率50-52％。
上述制备步骤可用反应简图表示如下：
a浓H2SO4/CH3OH，回流       b.(CH3CO)2O/吡啶        c.(CF3CO)2O/NH4NO3
d H2O，CH3OH/K2CO3         e H2，Pd/C              f NaH/(CH3)2SO4，CH3COCH3
g Br2/AcOEt，rt                h Br2/THF，＜10℃
本发明的橙皮素衍生物体外抑制佐剂性关节炎大鼠(AA大鼠)腹腔巨噬细胞(PMφ)合成PGE2和LTB4的活性实验表明，其抗炎活性明显高于其母体橙皮素。例如，本发明提供的橙皮素衍生物8和10在10-4mol.L-1、10-5mol.L-1、10-6mol.L-1和10-7mol.L-1四种浓度下都显著降低AA大鼠PMφ分泌PGE2的量，其抑制PGE2生成的活性明显高于橙皮素本身(见表1第8、10栏vs第11栏的数据)；而本发明提供的橙皮素衍生物体外抑制AA大鼠PMφ合成LTB4的半数抑制浓度IC50均比橙皮素低(IC50越低，表明化合物抑制LTB4合成的能力越强)。其中化合物(8)、(4)和(9)的IC50分别为5.56×10-8、1.41×10-7和2.06×10-7mol·L-1，都远远低于橙皮素本身的IC50(1.41×10-4)，化合物(7)和(5)的IC50(2.41×10-6和8.03×10-6)也明显低于橙皮素。
此外，根据已知的黄酮类化合物都不同程度具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌和抗病毒以及预防和治疗心血管疾病等多种生物活性，本发明的橙皮素衍生物还可以开发他们在上述各生物活性领域的应用，是有重要用途的新化合物。
已报道过的橙皮苷或橙皮素衍生物从未见在7-位和3’-位上选择性烷基化的产物，也从未见在6、8、2’-位同时溴代，或8-位单独选择性溴代，或在5’-位选择硝化、氨基取代，亦或先在5、7、3’-位烷基化或酰基化，然后在上述指定位置上溴代、硝化或氨基取代，因此本发明提供的橙皮素衍生物在结构、成份上与已知的橙皮素衍生物不同，他们是全新的化合物。
由于本发明的橙皮素衍生物是未见报道的新化合物，其制备方法也是未见报道的，虽然类似的反应步骤是已知的，但本发明在实施这些步骤时做了重要改进，如：芳香环上的硝化反应传统方法是用浓硫酸和浓硝酸组成的混酸为硝化试剂，或用CH3COO- +NO2为硝化试剂，但在本发明的实施例4的硝化反应中，若用混酸，则导致反应液变黑，几乎得不到产物；即使用CH3COO- +NO2为硝化试剂，产率也很低。而用本发明提供的(CF3CO)2O/NH4NO3为硝化试剂，则反应进行平稳，产率达75％以上。又如，在橙皮素6-位、8-位和2’-位同时引入三个溴原子的溴代反应，按通常采用的Br2/CCl4或Br2/THF为溴代试剂，得不到目标化合物或产率很低(＜50％)，而按本发明采用的乙酸乙酯为溶剂，可以高产率(90％)地获得目标化合物。
具体实施方式：
下面通过实施例进一步说明本发明，但它不限制本发明。
实施例1：橙皮素(3)的制备
将2g橙皮苷80mL甲醇依次加入150mL三口瓶中，搅拌下缓慢滴加2mL浓硫酸，然后加热回流7.5h，溶液由混浊变澄清，将反应液倒入300mL乙酸乙酯中，静置片刻，产生沉淀，过滤，固体用少量冷乙酸乙酯洗涤，合并滤液，用饱和食盐水洗，无水Na2SO4干燥。减压蒸去溶剂，所得黄色固体粗产物用乙醇/水混合溶剂(7∶3)重结晶，得纯橙皮素(3)产物0.75g，产率75.7％，m.p.227.5-228.5℃。
1H NMR(DMSO-d6)，δ(ppm)：2.67-3.25(m，2H)；3.77(s，3H)；5.43(dd，1H，J＝3.0Hz，12.4Hz)；5.89(s，2H)；6.86(m，3H)。
IR(KBr)cm-1：3304(VO-H)；1637(VC＝O)；1587，1514，1465(苯环)
实施例2：5，7，3′-三乙酰橙皮素(4)的制备
在50mL三口瓶中依次加入橙皮素3.13g(10.4mmol)、醋酐15mL(16.2g，158.6mmol)和吡啶3.2mL(3.03g，31.2mmol)，室温下搅拌3h，反应液由黄色变成浅黄。减压蒸去过量的醋酐和吡啶，残留物用CH2Cl2溶解，然后依次用饱和NaHCO3、稀HCL和饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥。蒸去溶剂得浅黄色固体，经柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯∶石油醚＝1∶3或者丙酮∶正己烷＝1∶4)，得纯5，7，3′-三乙酰橙皮素(4)白色固体4.16g，产率90％，m.p.140.5-142℃。
1H NMR(CDCl3)，δ(ppm)：2.30(s，3H)；2.33(s，3H)；2.38(s，3H)；2.76(dd，1H，J＝2.61Hz，16.68Hz)；3.02(dd，1H，J＝13.5Hz，16.65Hz)；3.85(s，3H)；5.42(dd，1H，J＝2.45Hz，13.44Hz)；6.53(d，1H，J＝2.01Hz)；6.76(d，1H，J＝2.01Hz)；7.01(d，1H，J＝8.46Hz)；7.16(d，1H，J＝1.74Hz)；7.26(t，1H，J＝7.8Hz)。
IR(KBr)cm-1：1773(VC＝O，酯)；1691(VC＝O，酮)；1618，1516，1434(苯环)。
实施例3：
在50mL三口瓶中依次加入橙皮素3.13g(10.4mmol)、醋酐5mL(5.4g，5.27mmol)和氯仿10mL、吡啶1.6mL(1.52g，15.6mmol)，室温下搅拌6h，反应液由黄色变成浅黄。减压蒸去过量的醋酐和吡啶，残留物用CH2Cl2溶解，然后依次用饱和NaHCO3、稀HCL和饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥。蒸去溶剂得浅黄色固体，经柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯∶石油醚＝1∶3)，得纯5，7，3′-三乙酰橙皮素(4)白色固体4.07g，产率88％。
实施例4：5′-硝基-5，7，3′-三乙酰橙皮素(5)的制备
在100mL圆底瓶中加入5，7，3′-三乙酰橙皮素4.8g(11.2mmol)、NH4NO30.9g(11.2mmol)、(CF3CO)2O 6mL和CHCl320mL，室温下搅拌至NH4NO3完全溶解(约2h)，将反应混合物倒入40mL水中，用CHCl3(3×40mL)萃取，合并萃取液，干燥，蒸去大部分溶剂，剩余物经柱层析分离(洗脱剂：乙酸乙酯∶石油醚＝1∶3)，得纯产物(5)白色固体3.7g，产率75-78％，m.p.58-58.5℃。
1H NMR(CDCl3)，δ(ppm)：2.31(s，3H)；2.38(s，3H)；2.40(s，3H)；2.79-3.03(m，2H)；3.96(s，3H)；5.50(dd，1H，J＝3.1Hz，13.3Hz)；6.60(d，1H，J＝2.2Hz)；6.82(d，1H，J＝2.2Hz)；7.43(d，1H，J＝2.2Hz)；7.83(d，1H，J＝2.2Hz)。
IR(KBr)cm-1：1776(VC＝O，酯)；1693(VC＝O，酮)；1618，1540，1435(苯环)。
MS：m/z＝473(M+)。
实施例5：
上述硝化反应若用通常采用的混酸作硝化试剂，室温下将混酸滴加到5，7，3′-三乙酰橙皮素在CH2Cl2溶液中，反应液逐渐变黑，并有胶状物生成，最后从这一反应混合物中分离不出所要的产物。
实施例6：
上述反应改用温和的硝化试剂CH3COONO2在CHCl3溶液中与5，7，3′-三乙酰橙皮素反应，室温下搅拌24h，TLC表明，反应物完全没有变化；改用硝基苯为溶剂，回流下反应24h，反应物已作用完全，但产物比较复杂，直接用柱层析分离，可得目标产物5’-硝基-5，7，3′-三乙酰橙皮素，但产率仅35-47％。
实施例7：5′-硝基橙皮素(6)的制备
在50mL圆底瓶中加入5′-硝基-5，7，3′-三乙酰橙皮素2g(4.23mmol)、甲醇20mL、水5mL和K2CO3620mg(4.5mmol)，室温下搅拌约1h，蒸去溶剂，残留物用无水乙醇提取并进行重结晶，得纯产物黄色固体1.08g，收率75％，m.p.225-226℃。
1H NMR(CD3COCD3)，δ(ppm)：2.82-3.20(m，2H)；3.95(s，3H)；5.55(dd，1H，J＝3.1Hz，12.6Hz)；6.00(dd，2H，J＝2.1Hz，13.7Hz)；7.45(dd，2H，J＝2.0Hz，16.7Hz)。
IR(KBr)cm-1：3394(VO-H)；1648(VC＝O)；1618，1524，1357(苯环)。
MS：m/z＝347(M+)。
实施例8：5′-氨基-5，7，3′-三乙酰橙皮素(7)的制备
将5′-硝基-5，7，3′-三乙酰橙皮素4g(8.5mmol)溶于60mL乙酸乙酯，加入10％Pd/C催化剂0.6g，常温下搅拌通入H2，反应约20h，滤去Pd/C，滤液减压蒸去溶剂，剩余物用柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯∶石油醚＝1∶3)，得亮黄色固体3.8g，产率95％，m.p.77-78℃。
1H NMR(CDCl3)，δ(ppm)：2.14(s，2H)；2.30(s，3H)；2.34(s，3H)；2.38(s，3H)；2.72-3.03(m，2H)；3.78(s，3H)；5.34(dd，1H，J＝2.7Hz，13.4Hz)；6.53(d，1H，J＝2.2Hz)；6.62(d，1H，J＝1.54Hz)；6.80(d，1H，J＝1.4Hz)；6.78(d，1H，J＝2.2Hz).
IR(KBr)cm-1：3377(VN-H)；1771(VC＝O，酯)；1692(VC＝O，酮)；1618，1434(苯环)。
MS：m/z＝443(M+)。
实施例9：7，3′-二甲氧基橙皮素(8)的制备
将1.2g橙皮素溶于20mL丙酮中，加入650mg NaH，立即产生大量气体，同时生成黄色固体。搅拌至无气体产生，加入20mL水使固体溶解。然后加入3mL硫酸二甲酯，加完后室温下搅拌8h，反应物大部分没有变化；升温至60℃，反应约3h，TLC表明，反应物已完全转化。向反应混合物中滴加少量氨水以除去多余的硫酸二甲酯。将反应液减压蒸去溶剂，剩余物用乙酸乙酯(3x20mL)萃取，合并萃取液，干燥(Na2SO4)减压蒸去溶剂，残留物用柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯∶石油醚＝1∶5)，得白色固体产物0.7g，产率53％，m.p.138-139℃。
1H NMR(CDCl3)，δ(ppm)：2.80(dd，1H，J＝3.03Hz，17.16Hz)；3.11(dd，1H，J＝12.99Hz，17.16Hz)；3.81(s，3H)；3.90(s，3H)；3..92(s，3H)；5.40(dd，1H，J＝3.1Hz，12.3Hz)；6.06(dd，2H，J＝2.31Hz，5.22Hz)；6.90(d，1H，J＝8.76Hz)；6.98(dd，2H，J＝1.95Hz，5.58Hz)；12.03(s，1H)。
IR(KBr)cm-1：3434(VO-H)；1637(VC＝O)；1573，1517，1427(苯环)；1303，1156(VC-O)。
实施例10：
上述甲基化反应若在更高的温度(＞75℃)下进行，搅拌3h后，主要生成完全甲基化的产物5，7，3’-三甲氧基橙皮素。
实施例11：6，8，2′-三溴橙皮素(9)的制备
将4.4g橙皮素溶于300mL乙酸乙酯中，向这一溶液缓慢滴加5mL溴在30mL乙酸乙酯中的溶液，TLC跟踪直至原料完全反应，将反应液蒸除部分溶剂后直接用柱层析分离(洗脱剂：乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1)，得浅黄色粉状固体5.5g，产率90％，m.p.204.5-205.5℃。
1H NMR(CD3COCD3)，δ(ppm)：2.93-3.30(m，2H)；3..91(s，3H)；5.64(dd，1H，J＝3.2Hz，12.0Hz)；7.00(d，1H，J＝3.3Hz)；7.09(s，1H)。
IR(KBr)cm-1：3517，3386(VO-H)；1636(VC＝O)；1561，1440(苯环)；1356，1106(VC-O)。
实施例12：
上述溴代反应，若用CCl4为溶剂，Br2/CCl4为溴代试剂，反应基本上不发生。
实施例13：
上述溴代反应，若用THF为溶剂，Br2/THF为溴代试剂，室温下搅拌4h，TLC表明反应物已作用完全，但生成的产物复杂，经柱层析分离，产率仅23％。
实施例14：8-溴-7，3′-二甲氧基橙皮素(10)的制备
将3g 7，3′-二甲氧基橙皮素溶于100mL THF中，冰浴(0-5℃)冷却下，向这一溶液缓慢滴加1mL溴在10mL THF中的溶液，用TLC跟踪反应，直至原料作用完全。将反应液蒸除部分溶剂后直接用柱层析分离(洗脱剂：乙酸乙酯∶石油醚＝1∶4)，得白色固体2.01g，产率52％，m.p.201-202℃。
1H NMR(CDCl3)，δ(ppm)：2.82-3.21(m，2H)；3..91(s，3H)；3..92(s，3H)；3..93(s，3H)；5.39(dd，1H，J＝2.9Hz，13.1Hz)；6.18(s，1H)7.00(m，3H)。
IR(KBr)cm-1：3432(VO-H)；1633(VC＝O)；1554，1523(苯环)。
MS：m/z＝408(M+)。
本发明橙皮素衍生物的抗炎活性测定：
实验原理：
前列腺素PGE2和白三烯LTB4是炎症反应的两种重要的炎症介质。本发明采用体外给药方式，研究橙皮素及其衍生物抑制佐剂性关节炎大鼠腹腔巨噬细胞合成PGE2和LTB4的活性，筛选出抗炎活性高的橙皮素衍生物。
1、橙皮素新衍生物抑制佐剂关节炎(AA)大鼠巨噬细胞(PMφ)合成PGE2的实验
腹腔巨噬细胞制备：
断头处死佐剂关节炎大鼠(AA大鼠)，于腹腔内注入D-Hank’s液5mL，轻揉腹部，抽出灌洗液；重复两次，合并灌洗液，离心洗涤即得富含巨噬细胞(PMφ)的悬浮液。用10％小牛血清RPMI-1640悬浮细胞调整至所需细胞浓度(1×106/mL)。
将上述大鼠腹腔巨噬细胞悬浮液分成39组。除正常组、AA组和阳性药A7717263组外，其余8种待测橙皮素新衍生物和对照的橙皮素共9种化合物，每种分10-4mol.L-1、10-5mol.L-1、10-6mol.L-1和10-7mol.L-1四种浓度。每组设两管，每管加入0.5mL PMφ悬浮液和0.5mL不同浓度的药物(巨噬细胞终浓度为5×105/mL)，于37℃水浴中振荡20min.。除AA组外，其余各组均加入刺激剂A231871uL，振荡5min.，再加入1M HCl酸化至Ph＝3。取出400uL，分装于2管中，-20℃下保存待测。用放免法测定PGE2含量(n＝4)，所得结果见表1：
表1橙皮素及其衍生物抑制AA大鼠PMφ合成PGE2实验结果(x±s，n＝4)
组别   PGE2含量(pg.ml-1)
  10-4mol.L-1   10-5mol.L-1   10-6mol.L-1   10-7mol.L-1   -
  正常组AAAA+(3)AA+(4)AA+(5)AA+(6)AA+(7)AA+(8)AA+(9)AA+(10)橙皮素AA+A771726 8.94±0.7610.30±1.098.86±1.398.31±1.32*7.57±0.64**4.75±1.169.23±0.656.20±0.30**8.16±1.02*5.84±0.33ΔΔ** 9.14±0.649.06±1.099.34±0.869.27±1.518.92±0.926.54±1.3110.04±1.606.08±2.29**8.76±0.41 9.75±1.1411.20±3.9810.30±1.1310.77±1.839.55±0.987.86±0.49*10.40±0.678.50±1.469.23±0.63 9.49±2.09.11±0.7610.20±0.3210.91±1.5810.20±0.708.22±0.65*10.30±1.408.95±0.2710.10±0.83   4.35±0.7510.00±0.75
(3)-(10)为橙皮素新衍生物；ΔΔP＜0.01，对比正常组；*P＜0.05，**P＜0.01，对比模型组
从表1中的实验数据可以看出，本发明提供的橙皮素衍生物(8)和(10)在10-4mol.L-1、10-5mol.L-1、10-6mol.L-1和10-7mol.L-1四种浓度下都显著降低AA大鼠PMφ分泌PGE2的量，其抑制PGE2生成的活性明显高于橙皮素本身(第8、10栏vs第11栏的数据)。
2、橙皮素新衍生物体外抑制AA大鼠PMφ合成LTB4实验
用实验1相同的方法制备AA大鼠巨噬细胞(PMφ)悬浮液，将PMφ悬浮液分成38组，除AA组和阳性药FC外，其余8种待测橙皮素新衍生物和对照的橙皮素共9种化合物，每种分10-4mol.L-1、10-5mol.L-1、10-6mol.L-1和10-7mol.L-1四种浓度。每个浓度设3个复管，每管加入0.9mL PMφ悬浮液，然后分别加入待测样品和溶剂(10uL，DMSO浓度＜0.5％)，置于37℃恒温振荡水浴中温孵10min.，然后依次加入花生四烯酸5uL(终浓度50umol/L)、钙离子载体A231875uL(终浓度3umol/L)、CaCl2和MgCl2混合液0.1mL(终浓度5mmol/L)，37℃下继续温孵5min.，每管加入2mL无水乙醇终止反应，再加10.5mL蒸馏水使乙醇浓度稀释为15％；4℃下离心(5000g，10min.)，取上清液并用1M HCl调至Ph＝3。通过反相预处理柱(SEP-PAK C18 Cartridge Waters Associates Milford MA)，并用15％乙醇20mL、蒸馏水20mL、石油醚20mL及乙酸乙酯10mL依次洗脱，收集乙酸乙酯洗脱液，减压下氮气吹干，残留物加200uL甲醇复溶，取100uL进样，反相HPLC检测LTB4(5-脂氧合酶产物)(Waters HPLC，6x150mm ODS C18柱)洗脱剂：甲醇∶水∶醋酸(70∶30∶0.01)，流速0.8mL/min.，检测波长280nm。测定结果见表2。
从表2可以看出，本发明提供的橙皮素新衍生物体外抑制AA大鼠PMφ合成LTB4，的半数抑制浓度IC50均比橙皮素低(IC50越低，表明化合物抑制LTB4合成的能力越强)。其中化合物(8)、(4)和(9)的IC50分别为5.56×10-8、1.41×10-7和2.06×10-7mol·L-1，都远远低于橙皮素本身的IC50(1.49×10-4)，化合物(7)和(5)的IC50(2.41×10-6和8.03×10-6)也明显低于橙皮素。
根据衍生化合物的物量性质，可利用现有的药物加工技术将本发明提供的橙皮素新衍生物加工成针剂或冻干剂或粉针剂或口服片剂，胶囊，冲剂，缓释制剂用于临床。
                                表2橙皮素新衍生物体外抑制AA大鼠PMφLTB4合成实验结果(X±s，n＝3)
组别   peak area(Inhibition of LTB4 biosynthesis％)   IC50/mol.L-1
  10-7mol.L-1   10-6mol.L-1   10-5mol.L-1   10-4mol.L-1   -
AAAA+(3)AA+(4)AA+(5)AA+(6)AA+(7)AA+(8)AA+(9)AA+(10)橙皮素AA+FC 354261±114207(17±27)184842±47808(57±11)265325±20856(38±5)277486±10828(35±3)273068±36052(36±8)136402±28478(68±7)232971±55992(45±13)244798±22385(43±5)403131±43714(6±10) 177268±11398(59±3)163561±80690(62±19)268641±27992(37±7)216546±34348(49±8)236542±20653(45±5)125172±10253(71±2)161899±57204(62±13)239352±2586(44±1)353449±33832(17±8) 105044±60950(75±16)31595±31665(93±7)239017±39530(44±9)218146±38327(49±9)213919±43981(50±10)19302±12165(95±3)115353±58203(73±14)215331±6080(50±1)305885±2162(28±5) 70451±34948(84±8)6203±713(99±0)145933±10640(66±2)209857±25776(51±6)112468±45720(74±11)5698±2305(99±1)54804±8010(87±2)199179±26754(53±6)241124±52933(44±12)145724±56075(66±13)   427155±44357(0)   -1.37×10-61.41×10-78.03×10-62.23×10-52.41×10-65.56×10-82.06×10-71.55×10-51.49×10-4

Claims (10)

1.一种橙皮素衍生物，其特征在于：由以下通式(1)表示的化合物：
Figure A2006100880150002C1
式中：R1为OH、OR’1或OOCR’2；
R2为H、卤素或OR’1；
R3为H、NO2或NR’3R’4；
5，7，3’-三位上的R1可以相同，也可以不同；
6，8，2’-三位上的R2可以相同，也可以不同；
其中：R’1为C1-C10的直链或支链烷基；
R’2为C1-C6的直链或支链烷基；
R’3、R’4为H或C1-C6的饱和烷基，它们可以相同，也可以不同；或R’3、R’4与同它们相连的氮原子一起组成3-7员饱和未取代或取代的N-杂单环。
2、根据权利要求1所述的橙皮素衍生物，特征在于：
式中：R1为OH、OCH3或OOCCH3；
R2为H、F、Cl、Br或OCH3；
R3为H、NO2或NH2；
5，7，3’-三位上的R1可以相同，也可以不同；
6，8，2’-三位上的R2可以相同，也可以不同。
3、根据权利要求1或2所述的橙皮素衍生物，特征在于：
式中：R1为OH、OCH3或OOCCH3；
R2为H或Br
R3为H、NO2或NH2；
5，7，3’-三位上的R1可以相同，也可以不同；
6，8，2’-三位上的R2可以相同，也可以不同。
4、根据权利要求3所述的橙皮素衍生物，特征在于它们是如下化合物：
5，7，3′-三乙酰橙皮素(4)或
5′-硝基-5，7，3′-三乙酰橙皮素(5)或
5′-硝基橙皮素(6)或
5′-氨基-5，7，3′-三乙酰橙皮素(7)或
7，3′-二甲氧基橙皮素(8)或
6，8，2′-三溴橙皮素(9)或
8-溴-7，3′-二甲氧基橙皮素(10)。
5、如权利要求4所述的橙皮素衍生物5，7，3′-三乙酰橙皮素(4)的制备方法，其特征在于：用橙皮素(3)为原料，与过量的醋酐及吡啶进行反应，醋酐的用量为10-30当量，吡啶的用量为1.2-3当量，反应温度为15-35℃，搅拌4-7h，反应即达终点，反应混合物经分离并用柱层析纯化，即可得5，7，3′-三乙酰橙皮素白色固体。
6、如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：醋酐的用量为15-20当量，吡啶的用量为1.5-2当量，反应温度为20-25℃。
7、如权利要求4所述的橙皮素衍生物5’-硝基-5，7，3′-三乙酰橙皮素(5)的制备方法，其特征在于：用5，7，3′-三乙酰橙皮素为原料，用(CF3CO)2O/NH4NO3为硝化试剂，室温下与溶于CHCl3中的5，7，3′-三乙酰橙皮素一起搅拌，反应3h。
8、如权利要求4所述的橙皮素衍生物7，3’-二甲氧基橙皮素(8)的制备方法，其特征在于：用橙皮素为原料，溶于丙酮再与NaH及(CH3)2SO4反应，反应温度控制在60-75℃，反应到达终点后，用适量氨水除去过量的硫酸二甲酯，产物经脱溶分离后，直接用柱层析纯化。
9、如权利要求4所述的橙皮素衍生物6，8，2’-三溴橙皮素(9)的制备方法，其特征在于：用橙皮素为原料，用乙酸乙酯为溶剂，常温下滴加Br2/AcOEt溴代试剂，搅拌反应4-6h。
10、如权利要求4所述的橙皮素衍生物8-溴-7，3’-二甲氧基橙皮素(10)的制备方法，其特征在于：用7，3’-二甲氧基橙皮素为原料，THF为溶剂，于-5-10℃条件下滴加Br2/THF，搅拌反应6-9h。
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