CN113527275A - 一种sklb1039化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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CN113527275A CN202110820011.4A CN202110820011A CN113527275A CN 113527275 A CN113527275 A CN 113527275A CN 202110820011 A CN202110820011 A CN 202110820011A CN 113527275 A CN113527275 A CN 113527275A
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奉强
余洛汀
张小玲
张力丹
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Chengdu Normal University
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Abstract

本发明属于新化合物制备技术领域，具体来说是一种SKLB1039化合物及其制备方法和应用。本发明以2‑甲基‑3‑硝基苯甲酸为初始原料，经溴代、酯化、还原、两次还原胺化和水解合成5‑溴‑2‑甲基‑3‑(N‑乙基,N‑(四氢吡喃‑4‑基))氨基苯甲酸；以环己酮为原料，经羰基α乙酰化、乙酰环己酮及氰基吡啶酮催化氢化还原合成4‑氨甲基‑1‑甲基‑5,6,7,8‑四氢异喹啉‑3(2H)‑酮；将二者偶联为酰胺，再与芳基片呐醇硼酸酯催化偶联得到SKLB1039化合物。本发明提供了SKLB1039规模化制备的工艺，易操作，后处理纯化过程简单，路线总收率提高，原料易采购且价格低廉，生产成本大大降低。

Description

一种SKLB1039化合物及其制备方法和应用
技术领域
属于新化合物制备技术领域，具体来说是一种SKLB1039化合物及其制备方法和应用。
背景技术
癌症是世界上主要的公共卫生问题，而靶向表观遗传调控因子为我们提供了一种新的癌症治疗策略；Zeste Homolog 2(EZH2)的增强剂是组蛋白赖氨酸甲基转移酶家族的成员，也是多梳抑制复合物2(PRC2)的催化组分，PRC2催化组蛋白3赖氨酸27(H3K27)的甲基化，导致H3K27(H3K27me3)发生三甲基化，它是转录抑制的胚芽遗传标记物，并能够沉默靶基因。
在许多血液和实体瘤中均观察到EZH2的过度表达，例如霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、前列腺癌、乳腺癌、肾癌、黑素瘤和舌癌，EZH2广泛涉及癌症的进展，转移和不良预后；EZH2的酪氨酸Y641、丙氨酸A677和A687的体细胞突变据报道与生发中心B细胞有关，如弥漫性大B细胞淋巴瘤(GCB-DLBCL)和滤泡性淋巴瘤(FL)，因此抑制EZH2被认为是治疗癌症的有吸引力的治疗靶标。
近年来，包括葛兰素史克、Epizyme、诺华、UNC Eshelman和Constellation 在内的多个小组报告了EZH2小分子抑制剂的各种结构；据报道，目前最有效的化合物EPZ6438抑制EZH2的IC50为2.5nM，并且在几种人DLBCL和恶性横纹肌异种移植模型中均表现出显着的肿瘤生长抑制作用，于是于2013年开始进行 EPZ6438的I/II期研究，用于治疗晚期实体瘤和B细胞淋巴瘤，然而WSU-DLCL2 异种移植模型具有较差的理化特性，如溶解度，因此迫切需要一种具有能够改善理化性质的高效EZH2抑制剂。
现有技术中公开了“Design,synthesis and biological evaluation of novel1-methyl-3-oxo-2,3,5,6,7,8-hexahydroisoquinolins as potential EZH2inhibitors”的文献，并具体公开了SKLB1049化合物及其制备方法，在进一步研究中，发现制得的化合物SKLB1039化合物相比于SKLB1049化合物具有更加优异的抗肿瘤活性；而且公开的SKLB1049化合物的合成方法具有成本高昂、原料试剂使用量大、中间产物纯化困难、路线总收率低的缺点。
发明内容
为了解决上述现有技术的问题，本发明提供了一种SKLB1039化合物及其制备方法和应用，本发明在小试制备工艺基础上研究了中试放大制备工艺，克服了原合成方法的技术缺点，优化出公斤级SKLB1039规模化制备的工艺，优化后路线较原合成路线工艺更易操作，后处理纯化过程更简单，路线总收率提高，原料更易采购且价格低廉，生产成本大大降低。
为了实现上述目的，本申请采用的技术方案为：
一种SKLB1039化合物，结构式如式(Ⅰ)所示：
Figure BDA0003171525240000021
本发明还保护了SKLB1039化合物的制备方法，包括如下步骤：
S1、将2-甲基-3-硝基苯甲酸与1,3-二溴-5,5-二甲基-2,4-咪唑烷二酮反应制得化合物2；
S2、将S1制得的化合物2与碘甲烷反应制得化合物3；
S3、将S2制得的化合物3与氯化铵在催化作用下反应，制得化合物4；
S4、将S3制得的化合物4与四氢吡喃酮、三乙酰氧基硼氢化钠反应，制得化合物5；
S5、将S4制得的化合物5与无水乙醛和三乙酰氧基硼氢化钠反应，制得化合物6；
S6、将S5制得的化合物6于氢氧化钠水溶液中进行皂化反应，制得化合物 7；
S7、将环己酮和吗啡啉在催化作用下反应，制得化合物9；
S8、将S7制得的化合物9与氰基乙酰胺和三乙烯二胺反应，制得化合物10；
S9、将S8制得的化合物10于混有氨气的乙醇溶液中，于氢气气氛下催化反应，制得化合物11；
S10、将S6制得的化合物7与1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺、N-羟基-7- 偶氮苯并三氮唑反应后，继续与S9制得的化合物11反应，制得化合物12；
S11、将S10制得的化合物12和2-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-5-硼酸频那醇酯反应，制得SKLB1039化合物；
其中，所述化合物2为5-溴-2-甲基-3-硝基苯甲酸；所述化合物3为5-溴-2- 甲基-3-硝基苯甲酸甲酯；所述化合物4为5-溴-2-甲基-3-氨基苯甲酸甲酯；所述化合物5为5-溴-2-甲基-3-N-(四氢吡喃-4-基)氨基苯甲酸甲酯；所述化合物6为 5-溴-2-甲基-3-(N-乙基,N-(四氢吡喃-4-基))氨基苯甲酸甲酯；所述化合物7为5- 溴-2-甲基-3-(N-乙基,N-(四氢吡喃-4-基))氨基苯甲酸；所述化合物9为2-乙酰环己酮；所述化合物10为1-甲基-3-氧代-2,3,5,6,7,8-六氢异喹啉-4-腈；所述化合物11 为4-氨甲基-1-甲基-5,6,7,8-四氢异喹啉-3(2H)-酮；所述化合物12为5-溴-3-(N-乙基,N-(四氢吡喃-4-基))氨基-2-甲基苯甲酰-(1-甲基-5,6,7,8-四氢异喹啉-3(2H)- 酮)-4-甲基)氨；所述SKLB1039化合物为3-(乙基(四氢吡喃-4-基)氨基)-2-甲基 -N-((1-甲基-5,6,7,8-四氢异喹啉-3(2H)-酮)-4-甲基)-5-(6-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-3- 基)苯甲酰胺。
本发明还保护了SKLB1039化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
与现有技术相比，本申请的有益效果在于：
1、本发明以2-甲基-3-硝基苯甲酸为初始原料，经溴代、酯化、还原、两次还原胺化和水解六步反应合成重要中间体5-溴-2-甲基-3-(N-乙基,N-(四氢吡喃-4- 基))氨基苯甲酸，六步总收率达到80.3％；以环己酮为原料，经羰基α乙酰化、乙酰环己酮与氰基乙酰胺环化以及氰基吡啶酮催化氢化还原等三步反应合成重要中间体4-氨甲基-1-甲基-5,6,7,8-四氢异喹啉-3(2H)-酮，三步总收率达到44.3％； 5-溴-2-甲基-3-(N-乙基,N-(四氢吡喃-4-基))氨基苯甲酸、4-氨甲基-1-甲基-5,6,7,8- 四氢异喹啉-3(2H)-酮在1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺、N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑试剂缩合下偶联为酰胺，后者在1,1'-双二苯基膦二茂铁二氯化钯催化下与芳基片呐醇硼酸酯偶联得到SKLB1039，汇聚路线两步反应收率分别达到90.5％、 96％。终产品经精制后纯度达到99.5％以上。
2、现有技术的合成路线不具备放量生产，试剂耗费巨大，每一步后处理需采用柱层析纯化，加之中间步骤生成难以除去的异构体，导致终产品纯度不高，无法提供充足高品质SKLB1039。本发明制备工艺，研究优化中试放大制备工艺，克服了原合成路线成本高昂、原料试剂使用量大、中间产物纯化困难、路线总收率低的缺点，生产出公斤级SKLB1039规模化制备工艺。具体包括：1)、通过优化羧酸酯化反应，成功解决了以往碘甲烷用量大大过量问题。碘甲烷几乎定量反应，避免了原料的消耗浪费和过量碘甲烷污染环境问题，降低合成成本；2)、通过探究反应影响因素，解决了两步还原胺化问题。通过对第一步还原胺化反应的分析，解决了该步副产物的生成问题，控制了产品质量指标。优化乙醛还原胺化，通过改变乙醛加入方式，减少了乙醛消耗量，并且所得产品纯度更高，更易于纯化；3)、为了解决市售乙酰环己酮价格昂贵且需要定制的限制，开发了乙酰环己酮的合成工艺。在开发的工艺中，乙酰环己酮不需纯化，直接用于下步关环反应。这就减少了生产中劳动量和溶剂用量，降低了路线成本；4)、找到了乙酰环己酮环化产物中异构体副产物的纯化方法。通过乙醇的回流热滤，能高效得到高纯度目标氰基吡啶酮，为最终高纯度的SKLB1039获得打下基础；5)、四氢异喹啉酮甲腈溶解性差，加氢还原时有大量白色固体副产物生成，通过加大溶剂甲醇的使用量能大大减少副产物的生成。通过溶剂和催化剂的循环使用，最大程度降低生产成本；6)、通过缩合试剂、溶剂和反应温度等条件的筛选和优化，大大提高了反应收率和产品纯度，使酰胺化反应能放量化生产；7)、优化路线提高了Suzuki 偶联反应收率，通过水和二氯甲烷溶剂混合使用，简化了纯化操作，使路线更能工业化。总之，工艺研究达到预期目标，工艺稳定，达到药物生产工艺要求。
3、本发明制得的SKLB1039化合物是一个含六氢异喹啉骨架结构的新型 EZH2抑制剂，通过生物活性评估及构效关系研究，发现(1)其具有低纳摩尔抑制活性的EZH2抑制剂。对其进行溶解度测试发现，SKLB1039在水中及有机溶剂中的溶解性均显著优于EPZ6438，例如在水中的溶解度较EPZ6438有大约60 倍的提升(185.3μg/mL vs<3.0μg/mL)。(2)体外蛋白亲和力研究中化合物 SKLB1039对EZH2野生型和突变型均显示出很高的亲和力，而对其他甲基转移酶包括DOT1L、SETD7、G9a、MLL1和SUV39H1则无明显的抑制活性，同时，我们也发现化合物它还是一种SAM竞争性甲基转移酶抑制剂。
4、在细胞实验中，化合物SKLB1039以浓度和时间依赖性的方式显著的降低了SU-DHL-6和Pfeiffer细胞中的H3K27me3和H3K27me2的水平。在细胞增殖抑制实验中，SKLB1039作用6天可显著抑制SU-DHL-6和Pfeiffer细胞的生长，IC50值分别为6.17μM和1.19μM。而该化合物对三个正常细胞株HEK 293, VERO and L02均没有明显的影响，说明了化合物具有良好的体外安全性。同时我们还进行了小鼠急性毒性实验，同样未表现出明显影响，进一步说明了化合物的安全性。
5、进一步的作用机制研究显示，10μM浓度下SKLB1039可以使SU-DHL-6 细胞的G0/G1期细胞比例从44.89％增加到66.09％，而相应的S期细胞比例从 34.43％减少到12.68％，但该化合物对G2/M细胞的比例则没有明显影响。这些结果提示化合物10r可以以浓度依赖性的方式使细胞阻滞在G0/G1期，从而阻止细胞的增殖。药代动力学研究表明，化合物SKLB1039的口服吸收良好、体内暴露量较高、药物半衰期较长明显优于EPZ6438。其最大血浆浓度相比于EPZ6438，提高了5倍。药时曲线下面积AUC大约为EPZ6438的8倍，而药物的血浆清除率则比EPZ6438降低了近10倍。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的SKLB1039化合物的合成步骤示意图；
图2为本发明实施例1制得的SKLB1039化合物的氢谱图；
图3为本发明实施例1制得的SKLB1039化合物的碳谱图；
图4为本发明SKLB1039化合物选择性抑制EZH2的酶活性对照图，其中， A为SKLB1039对WT EZH2、Y641F EZH2及A677G EZH2的抑制活性对照图； B为SKLB1039对野生型EZH1和EZH2的抑制活性对照图；C为SKLB1039对其他组蛋白甲基转移酶的抑制活性对照图，包括EZH1、SETD7、SUV39H1、G9a、 DOT1L、SUV39H2、SMYD2、PRDM9、SETD8、NSD3和mLL1，数据以平均值±SD(n＝3)表示；
图5为本发明SKLB1039化合物与SAM竞争性结合EZH2的SAM结合口袋图；A和B分别为SAM与SKLB1039竞争性的抑制EZH2活性对照图，SAM 浓度分别为平衡条件下浓度、5×SAM和10×SAM浓度；C为在不同浓度H3多肽底物条件下，SKLB1039对EZH2的抑制活性图；D为不同浓度的SKLB1039、不同浓度的SAH对EZH2的反应速率曲线图，数据以平均值±SD(n＝3)表示；
图6为Si-RNA沉默EZH2表达后抑制乳腺癌细胞的增殖图；A为细胞转染 EZH2siRNA后，通过免疫印迹检测EZH2和H3K27me3的表达水平图；B为 MCF-7和MDA-MB-231细胞转染EZH2 siRNA 0、1、2、3、4天后，通过MTT 法检测细胞活力图；数据以平均值±SD(n＝3)表示；
图7为本发明SKLB1039化合物在体外对乳腺癌细胞增殖活性的抑制图；A 为采用MTT法检测SKLB1039对乳腺癌细胞增殖活性抑制作用图；SKLB1039 药物浓度分别为0μM,0.3125μM,0.625μM,1.25μM,2.5μM,5μM,10μM，药物处理时间分别为4天；B为SKLB1039对乳腺癌细胞的克隆形成实验图，SKLB1039 的作用浓度分别为0μM,0.625μM,1.25μM,2.5μM,5μM,10μM，作用时间为14天，数据表示为三次实验的平均值±SD表示；
图8为在SKLB1039治疗周期内，荷瘤小鼠体重变化图(Mean±SD；n＝5)。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种SKLB1039化合物的制备方法，包括如下步骤：
S1、5-溴-2-甲基-3-硝基苯甲酸(化合物2)的合成：
氮气保护下，在20L反应釜中加入6.5L质量分数为98％的浓硫酸，搅拌下加入1.63kg的2-甲基-3-硝基苯甲酸(化合物1)，继续搅拌并降温至3℃，待反应釜内固体全部溶解，此时溶液呈黑褐色；分批次缓慢加入1.425kg的1,3-二溴 -5,5-二甲基-2,4-咪唑烷二酮，期间热效应明显，温度由6℃升温至19℃，加毕后，反应釜内溶液变成浅褐色并逐渐有固状物析出，使得体系变得浑浊；保持低温浴并冷至10℃后，再撤去低温浴，自然升温至15-25℃下搅拌30min后，反应釜内溶液逐渐变为黄色并伴有大量固体物析出，此时反应体系粘稠；继续于15-25℃下反应10h后取样，经HPLC检测显示反应进行了70％，继续搅拌反应22h后，经HPLC检测显示反应完全，得粘稠混合物；
将粘稠混合物加入至搅拌着的80L碎冰中，析出大量白色固体，在冰水混合物中搅拌1h后抽滤，滤饼转移至50L容器中并用30L冷水搅拌洗涤1h抽滤，再次洗涤直至滤液pH＝5；将滤饼水分抽干，于60℃真空条件下加入P2O5干燥，得到目标化合物5-溴-2-甲基-3-硝基苯甲酸(化合物2)2.36kg，产率97.2％，HPLC 检测含量约为100％，水分含量测试<0.2％，熔点：177-179℃；
S2、5-溴-2-甲基-3-硝基苯甲酸甲酯(化合物3)的合成：
氮气保护下，在30L反应釜中加入14L的溶剂N,N-二甲基甲酰胺，1.87kg 无水碳酸钠，搅拌下缓慢加入2.29kg的5-溴-2-甲基-3-硝基苯甲酸(化合物2)，加毕继续搅拌30min后，将反应釜内溶液冷至0℃后，并于之后1h内分批次缓慢滴加1.63kg的碘甲烷，反应釜内溶液逐渐变为淡黄色，碘甲烷加毕后撤去冷浴并让其自然升至室温，继续搅拌反应18h后，TLC和HPLC监测显示反应完成，得反应混合物；
抽滤反应混合物，滤液经减压蒸馏后除去溶剂DMF，得红色油状物；滤饼每次用7L的乙酸乙酯充分搅拌洗涤、抽滤，当TLC检测乙酸乙酯洗液中再无 5-溴-2-甲基-3-硝基苯甲酸甲酯时，合并乙酸乙酯洗液，并用乙酸乙酯洗液将蒸出DMF的残余红色油状物溶解，此时有白色固体物出现，抽滤除去不溶物后，乙酸乙酯有机液用10L水洗涤、分液、重复洗涤两次；再合并洗涤水层并用6L乙酸乙酯萃取，分出有机液；合并所有有机液，小心用6L饱和碳酸氢钠溶液洗涤，搅拌30min，静置，分液；有机相再用6L水搅拌洗涤，重复洗涤操作两次；有机相减压蒸至无乙酸乙酯蒸出，得深红色油状液体；
将该深红色油状液体转移至20L反应釜中，加入10L正己烷并升温至60℃，以500r/min速率搅拌10min后使体系自然降温，3h后析出大量白色小颗粒固体物，待体系冷至室温，用冷浴将体系冷至0℃，继续搅拌3h，将白色小颗粒固液混合物抽滤，用1L冷正己烷洗涤滤饼；真空干燥滤饼，得2.41kg得白色固体 5-溴-2-甲基-3-硝基苯甲酸甲酯(化合物3)，收率96.5％；HPLC:纯度>95％；熔点：40-43℃；
减压蒸馏回收正己烷后得到300g红色高沸点油状物，-30℃冷却固化成黄红色蜡状固体，HPLC显示含有48％产品；用乙酸乙酯：石油醚＝1:4混合溶剂重结晶，回收得118g纯度为92％的浅粉色固体3；
S3、5-溴-2-甲基-3-氨基苯甲酸甲酯(化合物4)的合成：
氮气保护下，在50L反应釜中加入12L溶剂甲醇，搅拌下加入2.4kg的5- 溴-2-甲基-3-硝基苯甲酸甲酯(化合物3)，5-溴-2-甲基-3-硝基苯甲酸甲酯在甲醇中溶解不完全，并分散成乳白色悬浊液；继续加入1.44kg的氯化铵固体物和7L 水溶剂，反应釜内混合液逐渐变为墨绿色，析出大量有机物并结块；将混合液加热至回流，机械搅拌速度调至300r/min，搅拌回流30min后，体系内固体物变得分散；然后每次小心迅速加入200g还原铁粉，当铁粉加入后反应剧烈，此时甲醇快速回流(还原铁粉加入量再大时有冲出反应液或更严重的危险)；约20min 后待反应平缓下来，溶液逐渐变为锈红色，反应釜壁上出现红色固体物，重复还原铁粉加料工作，直至加入还原铁粉总量为2.4kg；加毕后保温回流搅拌反应3h，TLC和HPLC监测显示反应完成，得到混合物；
将混合物趁热在硅藻土上过滤，滤液为浅绿色，黑色滤饼分别用10L、8L、 7L甲醇搅拌热煮，过滤三次，TLC监测滤饼中无5-溴-2-甲基-3-氨基苯甲酸甲酯 (化合物4)；
合并所有滤液，减压蒸馏去除甲醇后析出大量白色固体，过滤出固体，滤液用3L二氯甲烷萃取，分出二氯甲烷层、旋干、得白色固体物；水相在减压下蒸除水分，残余物以固体废弃物处置；将所得白色固体物转移至50L大桶中，加入15L水充分搅拌洗涤，抽滤出白色固体物并再次用10L水洗涤一次，抽滤出产品，真空干燥箱中45℃干燥6h，得2.04kg的5-溴-2-甲基-3-氨基苯甲酸甲酯，收率，95.5％；熔点：88-91℃，5-溴-2-甲基-3-氨基苯甲酸甲酯送HPLC检测：97％；
S4、5-溴-2-甲基-3-N-(四氢吡喃-4-基)氨基苯甲酸甲酯(化合物5)的合成：
氮气保护下，在50L反应釜中加入20L氯仿，搅拌下一次性加入1.88kg的 5-溴-2-甲基-3-氨基苯甲酸甲酯(化合物4)和1.16kg的四氢吡喃酮后，慢慢滴加600g冰醋酸/1L氯仿的混合溶液，滴毕于室温搅拌30min后，冷却反应液至 0℃，分批加入总量为4.9kg还原试剂三乙酰氧基硼氢化钠，控制加料速度，使反应液温度<5℃，加毕，于0-5℃保温反应1h；反应液颜色由乳白色变为深红色，后又转变为橘红色；撤去冷浴，让体系搅拌自然升温至室温反应，10h后TLC显示反应完成，HPLC确认反应体系无原料5-溴-2-甲基-3-氨基苯甲酸甲酯(化合物 4)剩余以及杂质极少，得混合液；
将体系再次冷至0℃，加入10L冰水稀释混合液，搅拌下慢慢加入4kg碳酸氢钠/5L水悬浊液进行中和，控制加料速度防止体系生成气体太快而冲料；加毕搅拌2h、静置、分液；水层用2L二氯甲烷萃取两次，合并有机层并用6L水洗涤两次后，减压浓缩至恒重，得粉色固体物；
将粉色固体物与6L正己烷混合，加热至50℃搅拌3h，冷却至0℃并保持1h，过滤、滤饼用300mL冷正己烷洗涤、抽干；滤液减压蒸馏回收正己烷后得约100g 混合物，核磁分析含有杂质及少许产品(暂时放置不用)；将所得产品与5.5L 甲醇混合，升温回流搅拌50min，降温至0℃并保温2h，析出大量白色固体，过滤出固体物并用500mL冷甲醇洗涤，抽干；再重复操作一次后，将滤饼于50℃真空干燥，得2.37kg的5-溴-2-甲基-3-N-(四氢吡喃-4-基)氨基苯甲酸甲酯，收率： 94％；HPLC纯度：98％；熔点：134-136℃；
S5、5-溴-2-甲基-3-(N-乙基,N-(四氢吡喃-4-基))氨基苯甲酸甲酯(化合物6) 的合成：
氮气保护下，在50L反应釜中加入20L的1,2-二氯乙烷，搅拌下一次性加入 2.14kg的5-溴-2-甲基-3-N-(四氢吡喃-4-基)氨基苯甲酸甲酯，将反应混合物冷至 0℃，慢慢搅拌下小心注入690g的反应原料无水乙醛于溶液液面下，再于30min 内加入2.2kg的冰醋酸(起酸的作用)，溶液反应呈橘黄色；加毕后自然升至室温并搅拌1h后，再将混合物冷至0℃，分批缓慢加入4.96kg还原剂三乙酰氧基硼氢化钠；控制加料速度使反应体系温度<5℃，加料大约需要2h；加毕后反应体系于0-5℃保温反应1h，撤去冷浴，让体系自然升至室温并搅拌反应12h；次日，TLC显示反应完成，HPLC确认反应体系很干净；
将体系冷至0℃，加入10L冰水，搅拌下缓慢加入5kg碳酸氢钠/5L水混合悬浊液，控制加料速度防止体系生成气体太快而将反应液冲出；加毕，搅拌2h、静置、分液；水层中有少许絮状物，抽滤分出，并用3L二氯甲烷洗涤絮状物后，再用于萃取水层两次，合并有机层并用6L水洗涤两次后，分液；有机相分出并减压浓缩至恒重，得黄色至浅红色油状液体；
将所得油状液体与7.5L甲醇混合，加热至40℃搅拌30min，体系全部溶清；将热浴换为冷浴，慢慢冷却混合液，当体系温度降至9℃时开始析出晶体；待析出大量晶体后继续降温至-5℃，并于该温度保持2h；过滤，滤饼用冰冷2L冷甲醇多次润洗，抽干，于真空干燥箱中干燥，得2.06kg浅黄色晶体；
合并滤液及洗液，减压蒸馏至剩余大约500mL体积，将所得混合物升温回流搅拌30min，慢慢降温至-5℃并保温1h，析出浅黄色晶体，过滤出固体物并用50mL 冷甲醇洗涤，抽干，真空干燥，得0.18kg；TLC和HPLC显示两批产品为同一化合物，合并得2.24kg的5-溴-2-甲基-3-(N-乙基,N-(四氢吡喃-4-基))氨基苯甲酸甲酯产品；收率96.6％，熔点：55-57℃，HPLC纯度：97％；
S6、5-溴-2-甲基-3-(N-乙基,N-(四氢吡喃-4-基))氨基苯甲酸(化合物7)的合成：
氮气保护下，在20L反应釜中加入5L甲醇，一次性加入2.23kg的5-溴-2- 甲基-3-(N-乙基，N-(四氢吡喃-4-基))氨基苯甲酸甲酯，升温至60℃后，保温下缓慢滴加376g氢氧化钠/880mL水的混合溶液，反应液颜色由浅绿色清液逐渐变为乳浊液，最后变为浅绿色清液；保温反应1h后，TLC监测反应完成，得反应液；
将反应液减压蒸馏除去大部分甲醇，往剩余物中加入10L水，搅拌10min，固体物完全溶解；升温至65℃，慢慢滴加6mol/L的盐酸溶液1.6L，其间析出大量白色固体，直至pH试纸检测体系pH＝2-3时停止滴加盐酸；停止热浴，搅拌下自然降温至室温后，打开冷却浴，将反应体系冷却至0-5℃，并保温搅拌2h；抽滤，滤饼用8L冰水充分洗涤，pH试纸检测洗液和滤液pH＝5-6，TLC检测无产品，合并弃于废水处理池中；滤饼抽干后于真空干燥箱中以P2O5为干燥剂， 60℃干燥10h，得2.12kg白色固体化合物7，收率：99.2％，HPLC纯度:99％.熔点：130-132℃；
S7、2-乙酰环己酮(化合物9)的合成：
向20L反应釜中充N210min，并在N2保护下加入2.95kg的环己酮(化合物8)、 3.14kg吗啡啉、催化剂对甲苯磺酸30g和12L甲苯，搅拌均匀后油浴加热至130℃，反应体系开始回流并不断有水分析出；回流24h后，分出水总计590mL，取样送 GC监测反应完成，得混合物；
将混合物水浴温度为55℃下蒸出溶剂甲苯，得浅红色粘稠液体，此时有少许晶体附着在瓶壁上，小心转出液态物质，称量，得3.80kg油状物；
将所得油状物转移至30L反应釜中并加入12L二氯甲烷，待冷至5℃时，加入3.64kg的三乙胺(碱的作用)，再冷至0℃，再慢慢滴加2.59kg的酰化试剂乙酰氯，此时有大量白烟生成并伴随着大量热量放出，控制滴加速度，使体系内温度低于5℃；滴毕于3℃保温30min后，撤去冷浴，让体系自然升温至室温并搅拌过夜；次日，TLC监测反应中间体烯胺转化完全，将体系冷至0℃，滴加入4.7L 浓盐酸(12mol/L，起强酸分解中间产物的作用)/4.7L水的混酸；滴毕，慢慢升温至回流并保持回流状态3h，反应液呈深红色；停止加热，反应液静置并冷至室温，分出下部有机层；上部水层加入3L二氯甲烷并搅拌30min，静置、分出下层有机液并与先前有机液合并；上层水相pH≈1，TLC监测不含产品2-乙酰环己酮(化合物9)，将该水相弃于废水处理池；将合并的有机相分别用6L水洗涤两次，分出二氯甲烷层，弃去水相洗液；有机液在减压条件下旋出二氯甲烷后，得粗品 2-乙酰环己酮(化合物9)，深红色油状液体3.68kg；
GC监测上述深红色液体中2-乙酰环己酮的含量为87％，曾尝试减压蒸馏纯化；蒸馏前期，2-乙酰环己酮很容易蒸出，随着蒸馏的进行，蒸馏瓶中快速发生复杂聚合反应，生成大量胶状物，后期2-乙酰环己酮极难蒸出而使得收率低至 40％左右；由于2-乙酰环己酮用于后期关环反应时，杂质对反应没有影响，故不再对粗品2-乙酰环己酮进行蒸馏纯化；
S8、1-甲基-3-氧代-2,3,5,6,7,8-六氢异喹啉-4-腈(化合物10)的合成：
氮气保护下，在30L反应釜中，依次一次性加入18L无水乙醇、3.68kg 2-乙酰环己酮(化合物9)粗品、2.4kg氰基乙酰胺和4.6kg三乙烯二胺，搅拌加热至 40℃，固体完全溶解，保温反应大约1h后逐渐有固体出现，继续于40℃搅拌反应72h；待TLC和HPLC监测无原料2-乙酰环己酮(化合物9)，停止搅拌后趁热过滤，得浅褐色固体；
滤液为草绿色粘稠液，检测无1-甲基-3-氧代-2,3,5,6,7,8-六氢异喹啉-4-腈(化合物10)，旋出溶剂乙醇回收，弃去高沸点副产物；
浅褐色滤饼用1.5L乙醇多次润洗，洗液呈褐色，得白色固体物，经检测为1- 甲基-3-氧代-2,3,5,6,7,8-六氢异喹啉-4-腈(化合物10)与4-甲基-3-氰基-5,6,7,8- 四氢喹啉酮的混合物，在核磁上显示二者比例为12:1；
将上述固体物与5L无水乙醇混合回流打浆3h，趁热过滤，滤液中1-甲基-3- 氧代-2,3,5,6,7,8-六氢异喹啉-4-腈(化合物10)含量为89％，固体中1-甲基-3-氧代-2,3,5,6,7,8-六氢异喹啉-4-腈(化合物10)含量为97％；分别再用5L无水乙醇重复操作两次，过滤，得纯度>99％白色固体1-甲基-3-氧代-2,3,5,6,7,8-六氢异喹啉-4-腈(化合物10)，熔点>258℃分解；将所有滤液和洗液合并，减压下浓缩至约1L后，加热回流1h，趁热滤去不溶物后，滤液冷却，析出类白色固体，得 1-甲基-3-氧代-2,3,5,6,7,8-六氢异喹啉-4-腈，纯度>99％，熔点>251℃分解；
S9、4-氨甲基-1-甲基-5,6,7,8-四氢异喹啉-3(2H)-酮(化合物11)的合成：
在100L高压釜中，分别加入1.75kg的1-甲基-3-氧代-2,3,5,6,7,8-六氢异喹啉-4-腈(化合物10)、175g催化剂雷尼镍、46L甲醇、500mL的氨气乙醇溶液，加毕后氮气置换三次后再用氢气置换两次；将体系密封后，加氢气，保持氢气压力在1.5-2.0MPa，缓慢升温至60℃，搅拌反应；反应前10h，吸氢较快，随着反应时间的增加，吸氢速度快速减慢；反应三天，体系不再吸氢，取样HPLC 检测反应完成；
将反应体系冷至室温，小心过滤出雷尼镍，并用500mL冷甲醇洗涤，小心抽滤，雷尼镍回收循环使用；减压下将滤液旋干，剩下浅绿色油状物，将油状物分散于5L甲醇中，加热至回流状态使之成均一状态后慢慢冷至-20℃，其间剧烈搅拌，待体系渐渐析出大量白色固体后，继续保持该温度2h，抽滤，滤饼用500 mL冰冷甲醇洗涤，减压下抽干；将产品转移至真空干燥箱，减压下于45℃干燥 6h，得4-氨甲基-1-甲基-5,6,7,8-四氢异喹啉-3(2H)-酮1.45kg，收率83％；熔点： 192-194℃；
S10、5-溴-3-(N-乙基,N-(四氢吡喃-4-基))氨基-2-甲基苯甲酰-(1-甲基-5，6，7，8-四氢异喹啉-3(2H)-酮)-4-甲基)氨(化合物12)的合成：
氮气保护下，在50L反应釜中加入20L二氯甲烷，冷却至10℃，搅拌下一次性加入2.12kg的化合物7后，慢慢加入3.14kg的N-甲基吗啉(有机碱的作用)；此时有明显热效应，控制滴加速度，使温度不高于20℃；加毕，再分别加入2.14kg 的缩合试剂1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺和1.52kg的N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑；保持该温度搅拌1h，将反应混合物冷至5℃，分批加入1.43kg的4-氨甲基 -1-甲基-5,6,7,8-四氢异喹啉-3(2H)-酮，控制加料速度，使体系温度不超过10℃；加毕，将体系温度保持在<15℃反应，TLC和HPLC监测，4h后反应完成；
将反应体系冷至0℃，加入10L水，搅拌1h后静置分液，水层用3L二氯甲烷萃取，并将萃取有机液合并于上步有机液中并用10L水搅洗；混合液搅拌30min 后，静置分液，分出水层再用1.5L二氯甲烷萃取一次；合并有机相并重复操作一次；水相检测无产品，弃于废水处理池中；有机相在旋转蒸发仪中减压下蒸去二氯甲烷至恒重，转入30L反应釜中，加入7L甲醇，搅拌下加热至回流，待产品完全溶解体系呈均一溶液后，停止加热自然冷至室温；待有大量固体析出至固体不再增多后，慢慢冷却体系至-5℃并保温2h；抽滤，滤饼用2L冰冷甲醇洗涤多次，抽干后将其转移至真空干燥箱中50℃真空干燥6h，得2.76kg白色目标化合物；合并滤液和洗液，减压下浓缩除去甲醇，待剩余约1.5L后，加热混合物至溶清，放置过夜，析出白色固体；抽滤，并用0.2L冰冷甲醇润洗多次，抽干后减压干燥，得0.14kg白色固体；TLC显示两批白色固体物纯度高且为同一物质；合并白色物，得2.90kg产品，收率：90.5％；熔点：213-215℃.
S11、3-(乙基(四氢吡喃-4-基)氨基)-2-甲基-N-((1-甲基-5,6,7,8-四氢异喹啉-3(2H)-酮)-4-甲基)-5-(6-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-3-基)苯甲酰胺(化合物14)的合成：
氮气保护下，在20L反应釜中加入8L的二氧六环，慢慢搅拌下一次性加入 1.55kg的5-溴-3-(N-乙基,N-(四氢吡喃-4-基))氨基-2-甲基苯甲酰-(1-甲基-5,6,7,8- 四氢异喹啉-3(2H)-酮)-4-甲基)氨(化合物12)，2-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-5-硼酸频那醇酯1.00kg，1.15kg无水碳酸钠(无机碱)，1.6L水，空气泵抽真空后氮气置换5次；一次性加入催化剂1,1'-双二苯基膦二茂铁二氯化钯30g后，空气泵抽真空后氮气置换5次；在氮气流保护下体系快速升温至回流，反应混合液颜色由黄色变为浅红色浊液，进而变为深红色浊液，再变为土灰色浊液；回流反应1.5h 后，体系变为灰白色粘稠状；TLC和HPLC监测反应，显示体系24h反应完成；
停止加热，用冷浴将反应混合液冷至0℃；将反应混合物转移至抽滤漏斗，抽滤，滤液为深黑色，滤饼为浅灰色；将滤饼转移至反应釜中，加入10L水搅洗 1h，抽滤，水洗中无产品，直接注入废水处理池中，再重复洗涤一次，抽干；将滤饼转移至30L反应釜中，加入15L二氯甲烷和7.5L水，搅拌加热回流3h，抽滤，水相为无色，二氯甲烷深黑色，滤饼变为灰白色；将滤饼抽干后转移至30L 反应釜中，加入15L二氯甲烷搅拌加热回流3h，抽滤，滤液颜色为浅黑色，滤饼抽干后接近类白色；用12L二氯甲烷再重复洗涤一次，抽滤，滤饼干燥后送HPLC检测，纯度>99％，收率96％；熔点：160-162℃。
3-(乙基(四氢吡喃-4-基)氨基)-2-甲基-N-((1-甲基-5，6，7，8-四氢异喹啉-3(2H)- 酮)-4-甲基)-5-(6-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-3-基)苯甲酰胺(化合物14)的：1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ12.48(s,1H),8.33(d,J＝2.4Hz,1H),7.60(dd,J＝8.8, 2.6Hz,1H),7.41(t,J＝5.8Hz,1H),7.25(d,J＝1.9Hz,1H),7.20(d,J＝1.8Hz,1H), 6.62(d,J＝8.8Hz,1H),4.57(d,J＝5.7Hz,2H),3.94(dt,J＝11.5,3.2Hz,2H),3.57 (t,J＝5.0Hz,4H),3.31(td,J＝11.2,3.1Hz,2H),3.08(q,J＝7.0Hz,2H),3.00(m, 1H),2.94(t,J＝6.1Hz,2H),2.52(t,J＝5.0Hz,4H),2.35(s,6H),2.05(s,3H),1.72 (p,J＝6.8,6.3Hz,10H),0.88(t,J＝6.9Hz,3H)；
13CNMR(101MHz,Chloroform-d)δ170.08,163.47,158.66,151.00,149.57,145.94,140.37,139.51,135.79,135.58,132.85,125.55,123.14,121.26,119.99,114.75,106.72,67.35,58.40,54.86,46.24,45.24,41.55,35.96,30.50,27.41, 24.89,22.31,22.23,16.67,14.72,12.76。
如图1所示，为SKLB1039化合物的氢谱图，在12.84处出峰，为环内酰胺 NH基团的出峰，在8.33、7.60、6.62处出峰，为吡啶环上CH基团的出峰，在 7.41处出峰，为酰胺NH基团的出峰，在7.25、7.20处出峰，为苯环CH基团的出峰，在4.57处出峰，为酰胺N-CH2基团的出峰，在3.94处出峰，为O-CH2基团的出峰，在3.57处出峰，为O-CH2和吡啶环N-CH2基团的出峰，在3.31处出峰，为吡啶环N-CH2基团的出峰，在3.08处出峰，为苯环N-CH2基团的出峰，在3.00处出峰，为苯环N-CH基团的出峰，在2.94处出峰，为吡啶环N-CH2基团的出峰，在2.52处出峰，为N-CH2基团的出峰，在2.35处出峰，为芳环-CH3基团的出峰，在2.05处出峰，为N-CH3基团的出峰，在1.72处出峰，为-CH2- 基团的出峰，在0.88处出峰，为乙基中-CH3基团的出峰。
如图2所示，为SKLB1039化合物的碳谱图，在170.08处出峰，为苯甲酰胺羰基碳原子的出峰，在163.47处出峰，为环内酰胺羰基碳原子的出峰，在158.66 处出峰，为吡啶环氮原子旁季碳原子的出峰，在151.00处出峰，为苯环氮原子所接季碳原子的出峰，在149.57处出峰，为环内酰胺羰基间位并六元环季碳原子的出峰，在145.94处出峰，为吡啶环氮原子旁CH碳原子的出峰，在140.37处出峰，为苯环上羰基所接碳原子的出峰，在139.51处出峰，为吡啶环上氮原子对位碳原子的出峰，在135.79处出峰，为苯环上接吡啶环碳原子的出峰，在135.58 处出峰，为环内酰胺接甲基碳原子的出峰，在132.85处出峰，为苯环羰基对位碳原子的出峰，在125.55处出峰，为吡啶环上接苯基碳原子的出峰，在123.14处出峰，为环内酰胺接氨甲基碳原子的出峰，在121.26处出峰，为苯环上接甲基碳原子的出峰，在119.99处出峰，为环内酰胺羰基对位碳原子的出峰，在114.75 处出峰，为苯环上酰胺基邻位CH碳原子的出峰，在106.72处出峰，为吡啶环间位CH碳原子的出峰，在67.35处出峰，为四氢吡喃环2-CH2碳原子的出峰，在 58.40处出峰，为四氢吡喃环4-CH碳原子的出峰，在54.86处出峰，为哌嗪环 CH2碳原子的出峰，在46.24处出峰，为哌嗪环CH2碳原子的出峰，在45.24处出峰，为哌嗪环上CH3碳原子的出峰，在41.55处出峰，为苯环氮上乙基CH2碳原子的出峰，在35.96处出峰，为酰胺氮上CH2碳原子的出峰，在30.50处出峰，为四氢吡喃环3-CH2碳原子的出峰，在27.41、24.89、22.31、22.23处出峰，分别为内酰胺并六元饱和环上5、8、7、6-CH2碳原子的出峰，在16.67处出峰，为内酰胺环上CH3碳原子的出峰，在14.72处出峰，为苯环上CH3碳原子的出峰，在12.76处出峰，为苯环氮上乙基CH3碳原子的出峰。
经过质谱图确定，SKLB1039化合物的HR-MS(ESI-TOF)m/z:Calcd for C36H49N6O3{[M+H]+}613.3866,found 613.3864。
需要说明的是，步骤1-14的温度、时间、比例参数在所取值的±15％范围内变化时，也是能制备出相应化合物的，且化合物的性质不变，本实施例仅为其中一个优选的方案。
本课题组开发靶向EZH2的新型抗肿瘤药物，基于文献报道的吡啶酮母核结构，设计并合成了一系列新型小分子化合物，经过EZH2酶活性筛选，得到化合物SKLB1039对EZH2酶具有良好的抑制活性。将这些化合物进行进一步的体外抗细胞增殖活力，本发明选择化合物SKLB10391039考察了其体外活性及成药性，并将其命名为SKLB1039。
表1新型EZH2抑制剂SKLB1039体外酶活性
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本研究通过AlphaScreen的方法测试化合物对组蛋白修饰酶的抑制作用。在酶活性测试中，首先测试了化合物SKLB1039对野生型及突变型的EZH2的抑制活性。如图4-A显示，SKLB1039能够显著的抑制野生型EZH2及A677G和 Y641F突变型EZH2酶的活性，IC50值分别为5.6nM、4.0nM和15nM。验证化合物的选择性，我们选择了与EZH2的结合口袋同源性达到90％以上的EZH1 蛋白，发现SKLB1039对EZH1的抑制IC50值(81nM)为野生型EZH2的16 倍左右，显示出其对EZH2具有一定的选择性(图4-B)。在对其他组蛋白修饰酶的抑制活性测试中(SETD7，SUV39H1，G9a，DOT1L，SUV39H2，SMYD2， PRDM9，SETD8，NSD3和mLL1)发现，在100μM的浓度下SKLB10391039对这些酶基本无抑制作用(图4-C)。以上数据表明SKLB1039对EZH2酶具有良好的抑制活性及高度的选择性。
1、SKLB1039与EZH2酶作用方式分析
EZH2蛋白通过其SET结构域与SAM结合后，将SAM甲基转移到H3K27 位点上，因此当小分子化合物占据EZH2的SET结构域时就可能达到抑制EZH2 的酶活性的作用。研究采用化合物与SAM或者H3多肽竞争性结合EZH2实验来验证SKLB1039是否结合于EZH2蛋白的SAM结合口袋。如图5显示，当加入不同浓度的SAM和H3多肽浓度后，SKLB1039对EZH2的抑制IC50值随着 SAM浓度的增加逐渐增大，而增大H3多肽浓度并不影响SKLB1039对EZH2的抑制作用，这些结果证明SKLB1039可能结合于EZH2的SAM结合口袋而非H3 结合口袋。SAH为EZH2催化SAM甲基转移后的反应产物，并且目前已经通过晶体结构验证SAH能够结合于多种甲基转移酶的SAM结合口袋，并且能够与 SAM竞争性的结合组蛋白甲基转移酶。如果SKLB1039能够结合于EZH2的SAM 结合口袋，那么SKLB1039将会与SAH发生相互排斥作用。因此我们通过测定在不同SKLB1039浓度下SAH与EZH2的反应速率来验证SKLB1039与SAH 相互排斥作用。如图5-D显示，增加SKLB1039浓度能使SAH的反应速率明显降低。另外如图显示不同SKLB1039浓度下的反应速率曲线为一系列平行线，这也与Yonetani和Theorell理论中两种相互排斥的抑制剂作用方式相符合，即两种相互排斥的抑制剂不同比例混合反应速率曲线平行。
以上实验结果表明SKLB1039结合于EZH2 SET结构域的SAM结合口袋，并与SAM竞争性抑制EZH2的活性。但是最直接而明确的说明此问题仍需要采用晶体结构方式来验证。目前EZH2的晶体结构已经被报道，因此未来可通过 SKLB1039与EZH2蛋白形成共晶的方式来确认SKLB1039与EZH2的结合位点。
综合以上数据表明SKLB1039是一个对EZH2具有高活性和高选择性的SAM 竞争性EZH2抑制剂。
EZH2蛋白不仅有可能作为乳腺癌恶性增殖的标记物，其本身也能够作为类似癌基因一样导致乳腺癌的恶性增殖和转移。为了确定EZH2与乳腺癌细胞的关系，我们采用siRNA的方法沉默EZH2后，检测乳腺癌细胞株的增殖活性。如图 6-A所示，设计的三条siRNA均能降低EZH2的表达，其中命名为siEZH2#2和 siEZH2#3的siRNA能明显降低乳腺癌细胞株内EZH2的表达，并且H3K27me3 也随之明显降低。随后采用MTT法检测沉默EZH2后乳腺癌细胞株的增殖情况。如图6-B所示，随着时间的延长，EZH2沉默后明显降低细胞株的增殖。以上结果可初步说明降低EZH2的表达能影响乳腺癌细胞株的增殖活性，因此推断采用小分子抑制剂SKLB1039抑制EZH2酶活性也可能达到同样的抑制乳腺癌细胞增殖活性。
ER+细胞株MCF-7进行进一步的SKLB1039抗肿瘤作用和机制研究。目前广泛用于抗肿瘤治疗作用的激酶抑制剂或者细胞毒类化合物体外抑制细胞增殖活性发挥最大药效的时间较快，一般1～2天，而组蛋白甲基转移酶抑制剂起效时间相对长。集落形成抑制实验见图7-B不同浓度的SKLB1039处理细胞14天后， MCF-7和MDA-MB-231细胞集落形成率明显下降，且数目和大小都随药物浓度的升高而减少，呈现出明显的浓度依赖性。对于MCF-7细胞，在1.25μM的 SKLB1039作用下，其集落形成有显著下降，在2.5μM的药物浓度下无明显的集落形成。
2、SKLB1039小鼠体内抗肿瘤活性
对于MCF-7的皮下移植瘤模型：待肿瘤生长到约100mm3时，将小鼠随机分成四组，分别为SKLB1039的200mg/kg QD，200mg/kg TID，100mg/kg TID 和溶媒对照组，并开始给药，每三天测量一次肿瘤体积。实验结果显示，三种给药剂量方案均能抑制肿瘤组织的生长。其中200mg/kg TID抑制效果最好，抑瘤率为67.5％。而100mg/kg TID给药方案的抑瘤效果要优于200mg/kg QD。可能与SKLB1039的药代动力学性质有关。经SD大鼠体内药代动力学检测发现，该类抑制剂半衰期较短，体内代谢快，因此每天三次给药剂量能维持血液达到有效药物浓度的时间长，而每天单次给药即使剂量大，但是血药浓度维持时间短，导致效果不如每天三次的给药方案。此外，在给药的整个过程中，SKLB1039未对小鼠造成不可耐受的体重下降、活动能力减弱等明显毒副作用(图8)。对于 MDA-MB-231细胞的皮下移植肿瘤模型：待肿瘤生长到约100mm3时，将小鼠随机分成三组，分别为SKLB1039的200mg/kg，130mg/kg和溶媒对照组，每天口服给药一次，每三天测量一次肿瘤体积。实验结果显示，随着SKLB1039浓度的递增，其对MDA-MB-231模型皮下肿瘤的抑制率呈上升趋势。SKLB1039在剂量为130mg/kg时，能够有效抑制肿瘤组织的生长。与溶媒对照组相比，在连续给药28天后，SKLB1039在剂量为200mg/kg对肿瘤组织的生长抑制率能够达到86.1％。在整个实验过程中，SKLB1039未对小鼠造成不可耐受的体重下降、活动能力减弱等明显毒副作用(图8)。对于4T1细胞的皮下移植肿瘤模型：细胞接种后，4天即可形成肿瘤，待生长7天后将小鼠随机分成三组，每组5只小鼠，分别为SKLB1039的250mg/kg，125mg/kg和溶媒对照组，每天口服给药一次，每三天测量一次肿瘤体积。实验结果显示，随着SKLB1039给药剂量的提高，对4T1模型皮下移植瘤的抑制率呈上升趋势。连续治疗18天后，与溶媒对照组相比，SKLB1039在250mg/kg剂量下对移植瘤生长抑制率达到58.6％。并且SKLB1039治疗组的肿瘤的重量也有明显的降低(图8)。
显然，本领域的技术人员可以对发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种SKLB1039化合物，其特征在于，结构式如式(Ⅰ)所示：
Figure FDA0003171525230000011
2.一种权利要求1所述的SKLB1039化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将2-甲基-3-硝基苯甲酸与1,3-二溴-5,5-二甲基-2,4-咪唑烷二酮反应制得化合物2；
S2、将S1制得的化合物2与碘甲烷反应制得化合物3；
S3、将S2制得的化合物3与氯化铵在催化作用下反应，制得化合物4；
S4、将S3制得的化合物4与四氢吡喃酮、三乙酰氧基硼氢化钠反应，制得化合物5；
S5、将S4制得的化合物5与无水乙醛和三乙酰氧基硼氢化钠反应，制得化合物6；
S6、将S5制得的化合物6于氢氧化钠水溶液中进行皂化反应，制得化合物7；
S7、将环己酮和吗啡啉在催化作用下反应，制得化合物9；
S8、将S7制得的化合物9与氰基乙酰胺和三乙烯二胺反应，制得化合物10；
S9、将S8制得的化合物10于混有氨气的乙醇溶液中，于氢气气氛下催化反应，制得化合物11；
S10、将S6制得的化合物7与1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺、N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑反应后，继续与S9制得的化合物11反应，制得化合物12；
S11、将S10制得的化合物12和2-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-5-硼酸频那醇酯反应，制得SKLB1039化合物；
其中，所述化合物2为5-溴-2-甲基-3-硝基苯甲酸；所述化合物3为5-溴-2-甲基-3-硝基苯甲酸甲酯；所述化合物4为5-溴-2-甲基-3-氨基苯甲酸甲酯；所述化合物5为5-溴-2-甲基-3-N-(四氢吡喃-4-基)氨基苯甲酸甲酯；所述化合物6为5-溴-2-甲基-3-(N-乙基,N-(四氢吡喃-4-基))氨基苯甲酸甲酯；所述化合物7为5-溴-2-甲基-3-(N-乙基,N-(四氢吡喃-4-基))氨基苯甲酸；所述化合物9为2-乙酰环己酮；所述化合物10为1-甲基-3-氧代-2,3,5,6,7,8-六氢异喹啉-4-腈；所述化合物11为4-氨甲基-1-甲基-5,6,7,8-四氢异喹啉-3(2H)-酮；所述化合物12为5-溴-3-(N-乙基,N-(四氢吡喃-4-基))氨基-2-甲基苯甲酰-(1-甲基-5,6,7,8-四氢异喹啉-3(2H)-酮)-4-甲基)氨；所述SKLB1039化合物为3-(乙基(四氢吡喃-4-基)氨基)-2-甲基-N-((1-甲基-5,6,7,8-四氢异喹啉-3(2H)-酮)-4-甲基)-5-(6-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-3-基)苯甲酰胺。
3.根据权利要求2所述的一种SKLB1039化合物的制备方法，其特征在于，所述化合物7按照如下步骤制备：
S1、化合物2的制备：
于氮气气氛中，将2-甲基-3-硝基苯甲酸加入至质量分数为98％的浓硫酸中，待固体全部溶解后于0～10℃下滴加1,3-二溴-5,5-二甲基-2,4-咪唑烷二酮，自然升温至15-25℃并反应32h，经提纯处理后，制得化合物2；
S2、化合物3的制备：
于氮气气氛中，将无水碳酸钠加入至N,N-二甲基甲酰胺中，然后滴加S1制得的化合物2，降温至0℃并滴加碘甲烷后，升温至室温并反应18h，经提纯处理后制得化合物3；
S3、化合物4的制备：
于氮气气氛中，将S2制得的化合物3溶解于甲醇中，再加入氯化铵和水并加热至回流30-50min后，每隔20-30min加入还原铁粉，加毕后继续回流搅拌反应3h，经提纯处理后得化合物4；
S4、化合物5的制备：
于氮气气氛中，将S3制得的化合物4和四氢吡喃酮溶解于氯仿中，滴加助剂冰醋酸的氯仿溶液，混合均匀后于0℃下加入还原剂三乙酰氧基硼氢化钠，于0-5℃下反应1h，再于室温继续反应10h，经提纯处理后，得化合物5；
S5、化合物6的制备：
于氮气气氛中，将S4制得的化合物5溶解于二氯甲烷，于0℃下注入无水乙醛，再加入助剂冰醋酸，然后于室温下搅拌1h后再冷却至0℃，加入还原剂三乙酰氧基硼氢化钠，于0-5℃下反应1h，再于室温下继续反应10h，经提纯处理后，得化合物6；
S6、化合物7的制备：
氮气保护下，将S5制得的化合物6溶解于甲醇中，升温至60℃滴加氢氧化钠水溶液，保温反应1h后，经提纯处理后，得化合物7。
4.根据权利要求3所述的一种SKLB1039化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，1,3-二溴-5,5-二甲基-2,4-咪唑烷二酮与2-甲基-3-硝基苯甲酸的质量比为1:1-2；1,3-二溴-5,5-二甲基-2,4-咪唑烷二酮及2-甲基-3-硝基苯甲酸的质量之和与浓硫酸的体积比为1g：2-5mL；
所述步骤S2中，化合物2、无水碳酸钠和碘甲烷的质量比为1-2:1-1.5:1；
所述步骤S3中，化合物3与氯化铵及还原铁粉的质量之比为2:1-2；还原铁粉每次的添加量为铁粉总量的1/10-1/20；
所述步骤S4中，化合物4、四氢吡喃酮、三乙酰氧基硼氢化钠的质量比为2-3：2：3-5；
所述步骤S5中，化合物5、无水乙醛、冰醋酸、三乙酰氧基硼氢化钠的质量比为2-3:1:2-3:5-7；
所述步骤S6中，化合物6和氢氧化钠的质量比为5-10：1，氢氧化钠的浓度为0.3～0.5g/mL。
5.根据权利要求2所述的一种SKLB1039化合物的制备方法，其特征在于，所述化合物11按照如下步骤制备：
S1、化合物9的制备：
氮气保护下，将环己酮、吗啡啉和催化剂对甲苯磺酸溶解于甲苯中，于130℃下回流24h后，冷却至室温并旋蒸，得油状物；
将油状物溶解于二氯甲烷中，并于0-5℃下加入缚酸剂三乙胺和酰化试剂乙酰氯，再于0-5℃保温反应30min后，于室温条件下搅拌10-14h，再冷却至0℃，滴加体积分数为50％的浓盐酸水溶液并回流3h，经提纯处理后，得化合物9；
S2、化合物10的制备：
氮气保护下，将氰基乙酰胺、三乙烯二胺和S1制得的化合物9溶解于无水乙醇中，搅拌加热至40℃反应72h，经提纯处理，得到化合物10；
S3、化合物11的制备：
将S2制得的化合物10和催化剂雷尼镍加入至甲醇中，再加入混有质量分数为4％氨气的乙醇溶液，去除空气并密封，加氢气并保持氢气压力1.5-2.0MPa，升温至60℃，搅拌反应80-85h后，经提纯处理，得化合物11。
6.根据权利要求5所述的一种SKLB1039化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，环己酮、吗啡啉和对甲苯磺酸的质量比为50-100:50-100:1；油状物、三乙胺、乙酰氯的质量比为1-3：1-3：1-2；
所述步骤S2中，化合物9、氰基乙酰胺和三乙烯二胺的质量之比为1-3：1-2：1-4；
所述步骤S3中，混有氨气的乙醇溶液、化合物10的质量、雷尼镍的质量之比为10:3-5:0.3-0.5。
7.根据权利要求2所述的一种SKLB1039化合物的制备方法，其特征在于，所述化合物12按照如下步骤制备：
于氮气气氛中，将化合物7溶解于二氯甲烷中，于10-20℃滴加碱N-甲基吗啉，再加入缩合试剂1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺、N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑；保持10-20℃反应1h，再冷却至5℃，加入化合物11，并于5-15℃反应4h；冷却至0℃，经提纯处理后得到化合物12；
其中，化合物7、N-甲基吗啉、1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺、N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑的物质的量之比为2:2-3:2:1。
8.根据权利要求2所述的一种SKLB1039化合物的制备方法，其特征在于，所述SKLB1039化合物按照如下步骤制备：
S1、于氮气气氛中，将化合物12、2-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-5-硼酸频那醇酯、无水碳酸钠和水溶解于二氧六环中，排除空气后加入催化剂1,1'-双二苯基膦二茂铁二氯化钯并回流1.5h，再反应24h；
其中，化合物12、2-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-5-硼酸频那醇酯和无水碳酸钠的物质的量之比为(1-2):1:(1-1.3)；水的体积用量是二氧六环的20％；
S2、于氮气气氛中，回流4-6后停止加热，冷浴冷却至0℃后抽滤，得滤饼，将滤饼经提纯处理后得到SKLB1039化合物。
9.根据权利要求2-8任一项所述的一种SKLB1039化合物的制备方法，其特征在于，反应进度的监测均采用TLC和HPLC。
10.一种权利要求1所述的SKLB1039化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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