CN1850118A - 治疗咳喘病的地龙酸性部位药及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从地龙干燥体中提取的抗咳喘病有效部位即地龙酸性部位药及其制备方法。地龙酸性部位药中含有脂肪酸、氨基酸、嘌呤类化合物，其中氨基酸与嘌呤质量分数之和为50％～ 80％。地龙酸性部位药的制备方法涉及地龙水提液用强碱性阴离子交换树脂吸附后，再用稀盐酸或者含醇稀盐酸洗脱。该地龙酸性部位可用于治疗哮喘、慢性支气管炎等咳喘病。与现有应用地龙粉或地龙水煎液相比，本发明地龙酸性部位药化学组成清楚，药理活性增强，减小了药物剂量，更方便病人用药，增加病人用药的依从性，同时，有利于药品质量标准的建立与质量控制，使应用地龙制备成各种抗咳喘病制剂成为可能。

Description

治疗咳喘病的地龙酸性部位药及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种医药工程技术领域的药物及其制备方法，具体的说，涉及的是一种治疗咳喘病的地龙酸性部位药及其制备方法。

背景技术

哮喘是一种由多种因素引起的以可逆性气道阻塞、气道高反应性和气道炎症为特征的免疫变态反应性疾病。慢性支气管炎(简称慢支)是气管、支气管黏膜及周围组织的慢性非特异性炎症。慢性支气管炎、阻塞性肺部疾病等临床表现主症为“咳、痰、喘”，医生习惯简称为慢性咳喘病。咳喘病是严重危害人民群众身体建康的常见病，多发病。咳喘病目前尚无特效的治疗方法，在我国，多年的临床经验表明，中医药治疗该病有较高的疗效，且毒副作用小。研究疗效确切、安全可靠的抗咳喘病的中药有效物质，进一步开发新药，将造福患者，产生显著的社会效益与经济效益。

《中国药典》2005年版收载的地龙为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretimaaspergillum(E.Perrier)、通俗环毛蚓Pheretima vulagris Chen、威廉环毛蚓Pheretima guillelm(Michaelsen)或栉盲环毛蚓Pheretima pectiniferaMichaelsen的干燥体，具有清热定惊、通络、平喘、利尿之功效，是一种常用动物药材，药理活性显著，资源丰富。文献报道地龙的组分可阻滞组胺受体，对抗组胺使气管痉挛及增加毛细血管通透性。地龙90％醇提取液可明显增加大鼠和家兔气管肺灌流量，并能对抗组胺和毛果芸香碱引起的支气管收缩。鲜地龙体液对肺部感染的常见病菌高度敏感。地龙可明显地促进免疫细胞——小鼠腹腔巨噬细胞活化，具有免疫调节作用。

已有文献和具体实践中尚未见关于治疗哮喘、慢性支气管炎等咳喘病的地龙酸性部位及其制备方法的报道。地龙一般情况下以药粉形式直接作为处方原料，或者粉碎后与其他药味入水共同煎煮取汁，或者简单地进行水提醇沉。例如2005版中国药典一部收录的成方制剂“清肺消炎丸”，即是地龙与麻黄、苦杏仁(炒)、牛蒡子、石膏、葶苈子粉碎成细粉，再与羚羊角极细粉与人工牛黄粉末配研，制成水蜜丸。例如李爱实在《银龙定喘汤治疗儿童哮喘72例》(陕西中医2002年第23卷第6期)报道的银龙定喘汤为地龙与银杏、炙麻黄、制杏仁、地骨皮、炙桑白皮、紫苏子、防己、当归、赤芍共10味药材混合水煎取汁。再例如收载于一九八七年版《广东省药品标准》上册的地龙注射液为地龙水提醇沉过滤后的灭菌水溶液。在地龙应用形式中，地龙粉或地龙提取液没有经过分离除杂，地龙平喘的有效部位和无效部位混合运用，有效成份化学物质基础不清楚，难以建立药物的质量标准，难以有效控制药物质量。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种用于治疗咳喘病的地龙酸性部位药及其制备方法。使其有利于药品质量标准的建立与质量控制。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明公开的治疗咳喘病的地龙酸性部位药是从地龙中提取的含有脂肪酸、氨基酸、嘌呤三类化合物的有效部位，其中氨基酸与嘌呤质量分数之和为50％～80％并由下述工序制得的物质：取干地龙，粉碎成粗粉，第一次加入地龙2～8倍量水室温浸泡2～5h，过滤；第二次加入地龙2～6倍量水40℃～50℃温浸1～3h，过滤，重复此操作一次，过滤，合并三次滤液，低速离心3～15min，取离心上清液，减压浓缩至地龙用量的2～6倍体积，再加入95％乙醇使含醇量达到70％，静置8～24h，离心，取上清液，将上清液减压浓缩至地龙用量的2～5倍体积，再将其通过强碱性阴离子交换树脂，径高比1∶10，树脂用量为地龙的2～5倍；先用3～15倍柱体积的去离子水洗脱至洗脱液为中性无色，再用含0.1N盐酸的0％～35％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，40℃～50℃减压干燥即得到用于治疗咳喘病的地龙酸性效部位药。

所述的脂肪酸包括：草酸，琥珀酸，苹果酸，己二酸，戊二酸，3-羟基己酸，棕榈酸、月桂酸，一烯十六烷酸，十三烷酸，肉豆蔻酸，十五烷酸、十六烷酸，十七烷酸，亚油酸，油酸，硬脂酸，花生酸，花生三烯酸，花生四烯酸，五烯二十烷酸，三烯二十烷酸，六烯二十二烷酸，12-甲基烷酸、12-甲基十四烷酸、14-甲基十五烷酸、14-甲基十六烷酸、十九烷烯酸等。

所述的氨基酸包括：天冬氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、γ-氨基丁酸、甘氨酸、鸟氨酸、丙氨酸、赖氨酸、胱氨酸、组氨酸、缬氨酸、色氨酸、蛋氨酸、精氨酸等。

所述的嘌呤包括黄嘌呤、次黄嘌呤等。

本发明上述用于治疗咳喘病的地龙酸性部位药的制备方法如下：取干地龙，粉碎成粗粉，第一次加入地龙2～8倍量水室温浸泡2～5h，过滤；第二次加入地龙2～6倍量水40℃～50℃温浸1～3h，过滤，重复此操作一次，过滤，合并三次滤液，低速离心3～15min，取离心上清液，减压浓缩至地龙用量的2～6倍体积，再加入95％乙醇使含醇量达到70％，静置8～24h，离心，取上清液，将上清液减压浓缩至地龙用量的2～5倍体积，再将其通过强碱性阴离子交换树脂，树脂柱径高比1∶10，树脂用量为地龙的2～5倍；先用3～15倍柱体积的去离子水洗脱至洗脱液为中性无色，再用含0.1N盐酸的0％～35％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，40℃～50℃减压干燥即得到用于治疗咳喘病的地龙酸性效部位药。

所述的强碱性阴离子交换树脂，可以是HZ-201或其他不同型号的强碱性阴离子交换树脂。

茚三酮比色法测定酸性部位中总氨基酸的含量，HPLC法测定酸性部位中嘌呤的含量。

本发明地龙酸性部位药与地龙生药材相比，具有下述优点：1.经过提取分离除杂，去除了对于咳喘病无效物质，使平喘活性成分含量大大提高。2.地龙酸性部位没有地龙的固有腥味，应用其制成的制剂更有利于病人接受。

总之，与现有应用地龙粉或地龙水煎液相比，本发明地龙酸性部位药化学组成清楚，药理活性增强，减小了药物剂量，更方便病人用药，增加病人用药的依从性，同时，有利于药品质量标准的建立与质量控制，使应用地龙制备成各种抗咳喘病制剂成为可能。

附图说明

图1 地龙三部位的提取分离流程图

图2 地龙三部位对10μM卡巴胆碱引起的豚鼠离体气管平滑肌收缩的舒张作用

图3 地龙三部位对10μM组氨引起的豚鼠离体气管平滑肌收缩的舒张作用

图4 地龙三部位对10μM卡巴胆碱引起大鼠气管黏膜短路电流上升的抑制作用

图5 地龙酸性部位GC-MS总离子流图谱

图6 地龙酸性部位的HPLC图谱

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本发明进行详细说明。

实施例1  筛选地龙平喘有效部位

分别制备地龙的3个部位，包括地龙酸性部位、地龙碱性部位、地龙水提醇沉部位(制备过程见图1)。随后观察三个提取部位对卡巴胆碱(CCh)和组胺(His)引起的豚鼠气管平滑肌张力增加的松弛作用，以及对CCh引起的大鼠气管上皮短路电流增加的抑制作用(抑制痰液分泌作用)。3个地龙提取部位对气管平滑肌的舒张作用见图2和图3，结果表明3种地龙提取部位对于10μM卡巴胆碱引起的豚鼠离体气管平滑肌收缩的舒张作用均较弱，地龙酸性部位具有最大舒张率，为35.53％；地龙酸性部位对于10μM组氨引起的豚鼠离体气管平滑肌收缩的舒张作用均显著性地优于地龙碱性部位和水提醇沉部位，其最大舒张率达到77.99％，说明地龙中对气管平滑肌起舒张作用的有效部位为酸性部位，其作用主要是抗组氨引起的收缩。

3种地龙部位对10μM卡巴胆碱引起短路电流上升的下降作用，见图4，结果表明地龙酸性部位对10μM卡巴胆碱引起的短路电流上升的下降作用优于地龙碱性部位和水提醇沉部位，说明地龙抑制气管黏膜离子分泌的有效部位为酸性部位。

综上所述，地龙的三个提取分离部位中，地龙酸性部位具有对于组氨引起的豚鼠离体气管平滑肌收缩的舒张作用。同时，地龙酸性部位还有抑制离体大鼠气管黏膜离子分泌的作用，因而可以抑制过量的痰液分泌。总之，用于咳喘病治疗的地龙有效部位为地龙酸性部位。

实施例2  制备地龙酸性部位

制备方法：

取干地龙1000g，粉碎成粗粉，第一次加入地龙5倍量水室温浸泡3h，过滤；第二次加入地龙4倍量水45℃温浸2h，过滤，重复此操作一次，过滤，合并三次滤液，低速离心9min，取离心上清液，减压浓缩至地龙用量的4倍体积，再加入95％乙醇使含醇量达到70％，静置16h，离心，取上清液，将上清液减压浓缩至地龙用量的3倍体积。再将其通过强碱性阴离子交换树脂(树脂柱径高比1∶10，树脂用量为地龙的3倍)。先用9倍柱体积的去离子水洗脱至洗脱液为中性无色，再用含0.1N盐酸的20％乙醇溶液洗脱，收集黄色洗脱液部分，45℃减压干燥即得到治疗咳喘病的地龙酸性部位药。

实施效果：

氨基酸含量占整个酸性部位的重量百分比为64.68％，嘌呤含量占0.68％。

实施例3  制备地龙酸性部位

制备方法：

取干地龙1000g，粉碎成粗粉，第一次加入地龙2倍量水室温浸泡2h，过滤；第二次加入地龙2倍量水40℃温浸1h，过滤，重复此操作一次，过滤，合并三次滤液，低速离心3min，取离心上清液，减压浓缩至地龙用量的2倍体积，再加入95％乙醇使含醇量达到70％，静置8h，离心，取上清液，将上清液减压浓缩至地龙用量的2倍体积。再将其通过强碱性阴离子交换树脂(树脂柱径高比1∶10，树脂用量为地龙的2倍)。先用3倍柱体积的去离子水洗脱至洗脱液为中性无色，再用0.1N盐酸溶液洗脱，收集黄色洗脱液部分，50℃减压干燥即得到治疗咳喘病的地龙酸性部位药。

实施效果：氨基酸占整个酸性部位的重量百分比为50.36％，瞟呤含量占0.44％。

实施例4  制备地龙酸性部位

制备方法：

取干地龙1000g，粉碎成粗粉，第一次加入地龙8倍量水室温浸泡5h，过滤；第二次加入地龙6倍量水50℃温浸3h，过滤，重复此操作一次，过滤，合并三次滤液，低速离心15min，取离心上清液，减压浓缩至地龙用量的6倍体积，再加入95％乙醇使含醇量达到70％，静置24h，离心，取上清液，将上清液减压浓缩至地龙用量的5倍体积。再将其通过强碱性阴离子交换树脂(树脂柱径高比1∶10，树脂用量为地龙的5倍)。先用15倍柱体积的去离子水洗脱至洗脱液为中性无色，再用含0.1N盐酸的35％乙醇溶液洗脱，收集黄色洗脱液部分，40℃减压干燥即得到治疗咳喘病的地龙酸性部位药。

实施效果：氨基酸占整个酸性部位的重量百分比为78.45％，嘌呤含量占1.25％。

实施例5  对地龙酸性部位的各个成分加以确认

将实施例2所得地龙酸性部位用氯甲酸乙酯乙酯化，利用气相色谱/质谱/计算机联用技术研究其组成，各组分通过计算机谱库进行检索，并参考文献对化合物加以确认，结果见图5。

其中各峰分别表示：出峰时间6.21min为延胡索酸，6.31min为琥珀酸，7.68min为苹果酸，7.71min为丙氨酸，7.91min为甘氨酸，9.25min为己二酸，9.4min为缬氨酸，10.65min为亮氨酸，10.70min为戊二酸，10.89min为异亮氨酸，11.25min为天冬氨酸，12.66min为3-羟基己酸，14.20min为谷氨酸，17.34min为肉豆蔻酸，18.73min为苯丙氨酸，18.85min为脯氨酸，21.40min为一烯十六烷酸，21.76为赖氨酸，21.92min为十六烷酸，23.90min为十七烷酸，24.75min为亚油酸，24.81min为油酸，25.08min为硬脂酸，26.17min为花生四烯酸，26.22min为五烯二十烷酸，，26.32min为三烯二十烷酸，26.7min为酪氨酸，27.40min为六烯二十二烷酸，27.49min为色氨酸，27.69min为半胱氨酸。

对实施例2所得地龙酸性部位进行HPLC分析，通过与对照品比对，结果：5.316min为次黄嘌呤，5.71min为黄嘌呤，9.898min为酪氨酸(见图6)。

实施例6  药理毒理研究

1.平喘作用

实施例2所得地龙酸性部位0.3～0.6mg/ml对10uM组氨引起离体豚鼠气管环收缩有明显的舒张作用。按360mg，720mg，1080mg/kg对豚鼠灌胃给药，对卵蛋白引起的过敏性哮喘潜伏期明显延长，对吸入组胺引起的哮喘潜伏期也明显延长。

2.对小鼠气管酚红排泌量的影响

实施例2所得地龙酸性部位按180mg，360mg，540mg/kg对小鼠灌胃给药，可延长浓氨水和二氧化硫诱发的小鼠咳嗽潜伏期，减少咳嗽次数，使小鼠气管酚红排泌量明显增加。

3.抗炎作用

实施例2所得地龙酸性部位可抑制金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、甲型链球菌的生长及对抗炎性鼠耳的肿胀。与对照组庆大霉素比较有显著差异；可减少患者痰液中皮脱落细胞与炎症细胞的数量，提示有抗炎作用。

4.增强免疫作用

选用巨噬细胞的活化率来评价免疫作用，结果表明，实施例2所得地龙酸性部位具有明显地促进免疫细胞——巨噬细胞活化的作用，浓度在0.45％～0.9％时作用较为显著。过高或过低作用较弱或无作用。

5.急性毒性试验

用Wistar健康小鼠，采用口服和尾静脉注射两种给药方式，测定实施例2所得地龙酸性部位的半数致死量(LD50)，口服为1753mg/Kg±104mg/Kg，腹腔注射为985mg/Kg±87mg/Kg。

上述试验证明本发明地龙酸性部位安全、毒性低，具有镇咳、祛痰、平喘、抗炎、增强哮喘、慢性支气管炎等咳喘病患者机体免疫力的作用。

Claims (6)

1、一种治疗咳喘病的地龙酸性部位药，其特征在于，含有氨基酸、脂肪酸、嘌呤，其中氨基酸与嘌呤质量分数之和为50％～80％并由下述工序制得的物质：取干地龙，粉碎成粗粉，第一次加入地龙2～8倍量水室温浸泡2～5h，过滤；第二次加入地龙2～6倍量水40℃～50℃温浸1～3h，过滤，重复此操作一次，过滤，合并三次滤液，低速离心3～15min，取离心上清液，减压浓缩至地龙用量的2～6倍体积，再加入95％乙醇使含醇量达到70％，静置8～24h，离心，取上清液，将上清液减压浓缩至地龙用量的2～5倍体积，再将其通过强碱性阴离子交换树脂，树脂柱径高比1∶10，树脂用量为地龙的2～5倍；先用3～15倍柱体积的去离子水洗脱至洗脱液为中性无色，再用含0.1N盐酸的0％～35％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，40℃～50℃减压干燥即得到用于治疗咳喘病的地龙酸性效部位药。

2、根据权利要求1所述的治疗咳喘病的地龙酸性部位药，其特征是，所述的脂肪酸包括：草酸，琥珀酸，苹果酸，己二酸，戊二酸，3-羟基己酸，棕榈酸、月桂酸，一烯十六烷酸，十三烷酸，肉豆蔻酸，十五烷酸、十六烷酸，十七烷酸，亚油酸，油酸，硬脂酸，花生酸，花生三烯酸，花生四烯酸，五烯二十烷酸，三烯二十烷酸，六烯二十二烷酸，12-甲基烷酸、12-甲基十四烷酸、14-甲基十五烷酸、14-甲基十六烷酸、十九烷烯酸。

3、根据权利要求1所述的治疗咳喘病的地龙酸性部位药，其特征是，所述的氨基酸包括：天冬氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、γ-氨基丁酸、甘氨酸、鸟氨酸、丙氨酸、赖氨酸、胱氨酸、组氨酸、缬氨酸、色氨酸、蛋氨酸、精氨酸。

4、根据权利要求1所述的治疗咳喘病的地龙酸性部位药，其特征是，所述的嘌呤包括黄嘌呤、次黄嘌呤。

5、一种治疗咳喘病的地龙酸性部位药的制备方法，其特征在于，取干地龙，粉碎成粗粉，第一次加入地龙2～8倍量水室温浸泡2～5h，过滤；第二次加入地龙2～6倍量水40℃～50℃温浸1～3h，过滤，重复此操作一次，过滤，合并三次滤液，低速离心3～15min，取离心上清液，减压浓缩至地龙用量的2～6倍体积，再加入95％乙醇使含醇量达到70％，静置8～24h，离心，取上清液，将上清液减压浓缩至地龙用量的2～5倍体积，再将其通过强碱性阴离子交换树脂，树脂柱径高比1∶10，树脂用量为地龙的2～5倍；先用3～15倍柱体积的去离子水洗脱至洗脱液为中性无色，再用含0.1N盐酸的0％～35％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，40℃～50℃减压干燥即得到用于治疗咳喘病的地龙酸性效部位药。

6、根据权利要求5所述的治疗咳喘病的地龙酸性部位药的制备方法，其特征是，所述的树脂是强碱性阴离子交换树脂。

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