CN1844148A - 抗人gl50单克隆抗体的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及鼠抗人GL50单克隆抗体11C4，其制备方法及所说的单克隆抗体在抑制活化B细胞的抗体分泌、抑制活化T细胞增殖和细胞因子分泌，以及在检测GL50分子的组织细胞分布中的应用。

Description

抗人GL50单克隆抗体的制备及其应用

发明的领域

本发明涉及鼠抗人GL50单克隆抗体11C4，其制备方法及所说的单克隆抗体在抑制活化B细胞的抗体分泌、抑制活化T细胞增殖和细胞因子分泌，以及在检测GL50分子的组织细胞分布中的应用。

发明的背景

已知有许多受体-配体相互作用都参与诱导、建立和调节抗原特异性免疫反应。为了有效激活T细胞反应，通常至少需要两个信号。除了T细胞抗原受体(TCR)识别抗原提呈细胞(APC)上的MHC-抗原复合物提供第一信号，即抗原特异性信号外，还必须获得T细胞与APC表达的共刺激分子相互作用后产生的非抗原特异性、非MHC限制性的第二信号。第二信号为共刺激信号或协同刺激信号。如果仅有抗原特异性信号而缺失共刺激信号，T细胞将表现为无反应或免疫耐受状态，甚至导致凋亡。可见，共刺激信号是T细胞克隆扩增、分化和发挥生物效应所必不可少的。因此可以认为，第一信号决定了T细胞活化的特异性，而第二信号则决定T细胞介导的免疫应答能否有效进行(Noelle RJ，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89：6550，1992；Allen RC et al.，Science.259：990，1993)。

近年来，分子生物学技术广泛应用于免疫学研究，共刺激分子被不断发现。根据其结构，这些共刺激分子可分为两类：一类是肿瘤坏死因子/肿瘤坏死因子受体(TNF/TNFR)超家族，包括CD40/CD154(CD40L)、CD27/CD27L、CD30/CD30L、4-1BB/4-1BBL、OX40/OX40L、RANK/RANKL和Fas/FasL等。另一类是免疫球蛋白超家族，如B7-CD28/CTLA4、LAF1-ICAM-1/ICAM-2/ICAM-3、ICOS-GL50、CD2/LFA-3等(Korthauer U et al.，Nature，361：539，1993)。这些共刺激分子以受体和配体相互作用的方式传导信号。受体和配体一般表达在不同的细胞表面，通常一个为持续性表达，一个是诱导性表达。在免疫应答的不同阶段，这些分子以各自独特而又相关联的方式参与信号传导，共同调控机体的免疫应答。

GL50是B7家族的新成员，可持续表达于B淋巴细胞表面。GL50分子参与调节体液免疫应答过程中抗体的分泌和类型转换以及生发中心的形成。GL50分子与其特异性受体ICOS相互作用介导的信号可促进活化T细胞的增殖和分泌IL-10，促使机体免疫向Th2型偏移。许多实验提示，ICOS/GL50信号途径在机体炎症反应、过敏反应、自身免疫性疾病以及移植排斥等免疫应答过程中发挥了重要的作用。因此，有必要在制备抗GL50抗体或其他GL50结合剂基础上，进一步研究它们对ICOS/GL50信号途径的影响，并为抗GL50抗体在疾病诊断和治疗中的潜在应用提供依据。

发明目的

本发明的一个目的是提供能够稳定分泌特异性鼠抗人GL50单克隆抗体的，保藏编号为CGMCC No.1158的杂交瘤细胞株。

本发明的另一个目的是提供由如上限定的杂交瘤细胞分泌的特异性鼠抗人GL50单克隆抗体11C4。

根据本发明的优选实施方案，如上限定的抗人GL50单克隆抗体11C4的重链和轻链分别具有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

根据本发明的优选实施方案，如上限定的抗人GL50单克隆抗体11C4是可溶性抗人GL50的单克隆抗体。

本发明的再一个目的是提供制备如上限定的抗人GL50单克隆抗体的方法，该方法包括：

(1)用高表达人GL50分子的人B淋巴瘤来源的Daudi细胞作为免疫原免疫动物；

(2)分离被免疫动物的脾淋巴细胞，并在适于产生杂交瘤细胞的条件下与适当的小鼠骨髓瘤细胞融合；

(3)以L929/GL50转基因细胞作为筛选细胞筛选并培养如上得到的杂交瘤细胞；

(4)从细胞培养液或接种杂交瘤细胞的动物的腹水液中分离并纯化所需的单克隆抗体。

本发明的再一个目的是提供如上限定的抗人GL50单克隆抗体11C4在阻断T细胞依赖性B细胞的抗体分泌中的应用。

本发明的再一个目的是提供如上限定的抗人GL50单克隆抗体11C4在体外阻断活化T细胞增殖中的应用。

本发明的再一个目的是提供如上限定的抗人GL50单克隆抗体11C4在体外阻断活化T细胞分泌IL-10中的应用。

本发明的再一个目的是提供如上限定的抗人GL50单克隆抗体11C4在组织细胞GL50分子表达的免疫组织化学分析中的应用。

附图简要说明

图1显示抗体亚类快速定性试纸测定抗人GL50单克隆抗体11C4的(亚)类型。

图2显示分泌抗人GL50单克隆抗体11C4的杂交瘤细胞株染色体核型分析(×1000倍)。

图3显示抗人GL50单克隆抗体11C4与商品化PE标记的特异性鼠抗人GL50单克隆抗体GL50-PE对抗原位点的竞争性抑制实验的结果。反应细胞为B淋巴瘤Daudi细胞。其中峰1为阴性对照组，其中一抗为鼠抗人IgG，二抗为荧光素PE标记的羊抗鼠IgG；峰2为单抗11C4与商品化单抗的竞争组，其中一抗为抗人GL50单克隆抗体11C4，二抗为商品化PE标记的特异性鼠抗人GL50单克隆抗体GL50-PE，三抗为荧光素PE标记的羊抗鼠IgG；峰3为阳性对照组，其中一抗为商品化PE标记的特异性鼠抗人GL50单克隆抗体GL50-PE，二抗为荧光素PE标记的羊抗鼠IgG；峰4为Daudi细胞与抗人GL50单克隆抗体11C4反应组，其中一抗为抗人GL50单克隆抗体11C4，二抗为荧光素PE标记的羊抗鼠IgG。

图4显示抗人GL50单克隆抗体11C4的Western blot免疫印迹分析。其中第一泳道为B淋巴瘤Daudi细胞的膜蛋白；第二泳道为L929/GL50转基因细胞的膜蛋白；第三泳道为L929/mock转染空质粒转基因细胞的膜蛋白。

图5显示为抗人GL50单克隆抗体11C4应用于免疫组织化学分析GL50分子在不同组织细胞中的表达。其中1为乳腺癌组织；2为B淋巴瘤组织；3为炎性扁桃体组织；4为甲状腺组织(甲状腺功能亢进)。标记一抗为抗人GL50单克隆抗体11C4。

图6显示分析抗人GL50单克隆抗体11C4(mAb11C4)在体外抑制L929/GL50转基因细胞介导的促进抗CD3单克隆抗体活化的T细胞增殖的³H-TdR掺入实验。纵坐标为cpm值，横坐标为不同的实验分组，其中A：T细胞+激发性CD3mAb+L929/GL50+conIgG；B-F分别为T细胞+激发性CD3mAb+L929/GL50+不同剂量的mAb11C4(1.0μg/ml、2.5μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml、20.0μg/ml)。

图7显示抗人GL50单克隆抗体11C4体外抑制L929/GL50介导的活化T细胞的细胞因子IL-10分泌。纵坐标为细胞因子的水平；横坐标为实验分组：A：T细胞+激发性CD3mAb+conIgG；B：T细胞+激发性CD3mAb+L929/GL50；C：T细胞+激发性CD3mAb+L929/GL50+mAb 11C4。

图8显示抗人GL50单克隆抗体11C4抑制T细胞依赖性B细胞分泌IgG。纵坐标为人IgG含量，横坐标为不同实验组：A：B细胞；B：B细胞+PWM；C：细胞+PWM+L929/ICOS+conIgG；D-H：B细胞+PWM+L929/ICOS+不同剂量的mAb 11C4(1.0μg/ml、2.5μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml、20.0μg/ml)。

发明的具体内容

本发明涉及免疫球蛋白超家族成员的结合蛋白质或多肽，更具体地说，本发明涉及抗人GL50单克隆抗体11C4，其制备方法以及所说的单克隆抗体在体外抑制活化T细胞增殖、抑制T细胞依赖性B细胞分化及抗体分泌，以及GL50分子表达的免疫组织化学分析中的应用。

因此，本发明首先提供了能够与人免疫细胞表面共刺激分子GL50特异结合的单克隆抗体11C4。本发明进一步提供制备所说的单克隆抗体的方法，特别是所说的单克隆抗体作为共刺激分子相互作用途径的特异性阻断或结合剂，在刺激或抑制人体内免疫放应中的应用。

可以按照下述方法制备本发明的单克隆抗体。所说的方法包括以下步骤：

(1)用高表达人GL50分子的人B淋巴瘤来源的Daudi细胞作为免疫原免疫动物；

(2)分离被免疫动物的脾淋巴细胞，并在适于产生杂交瘤细胞的条件下与适当的小鼠骨髓瘤细胞融合；

(3)以L929/GL50转基因细胞作为筛选细胞筛选并培养如上得到的杂交瘤细胞；

(4)从细胞培养液或接种杂交瘤细胞的动物的腹水液中分离并纯化所需的单克隆抗体。

为了制备本发明的抗人GL50单克隆抗体，我们优先使用高表达GL50分子的B淋巴瘤细胞Daudi作为免疫原免疫动物。Daudi具有较强的致瘤性和免疫原性，能够激发小鼠产生较强烈、有效的免疫反应。然而，由于Daudi细胞表面分子较多，抗原性复杂，因此非特异性抗体也较多。为了简化杂交瘤筛选步骤，我们同时使用L929/GL50和L929/mock转基因细胞分别作为阳性和阴性筛选细胞。

为了构建用作筛选的转基因细胞L929/GL50，可以按照本领域技术人员熟知的DNA操作技术(例如参见Sambrook et a1.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbour，1989)完成基因的分离、核苷酸片段的切割与连接、克隆和表达载体的构建及扩增、核苷酸序列的分析与鉴定、细胞的转化和培养等操作。例如，可以首先借助RT-PCR技术从活化的扁桃体B细胞中扩增出人GL50基因。因逆转录表达载体转化效率高，故选择逆转录载体pEGZ-Term作为表达载体，将GL50基因装入该载体，获得重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/GL50。然后，借助脂质体法用重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/GL50与两辅助病毒pHIT456和pHIT60共转染293T细胞。48小时后，收集含病毒颗粒的293T培养上清并用于感染L929细胞，连续感染3天后，用含Zeocin的选择培养基筛选阳性细胞。然后培养细胞，待抗性单克隆生长至足够大时，挑取单克隆集落并进行扩大培养。如此获得的转基因细胞GL50表达率高达90％以上。

然后，可以按照本领域已知的常规方法(Kohler and Milstein，Nature265：495-497，1975)制备杂交瘤。简单地说，首先用Daudi细胞免疫Balb/c小鼠，然后处死动物并分离脾细胞。在聚合剂例如聚乙二醇存在下，将脾细胞的单细胞悬液与骨髓瘤细胞按适当的比例接触并融合。用常规HAT培养基筛选已融合的杂交瘤细胞。然后，用流式细胞术、Western印迹法、免疫沉淀法等方法鉴定所需的特异性阳性抗性细胞株。利用腹水体内诱生法，生产单克隆抗体，并以亲和层析法纯化所需的抗体。

本发明的抗人GL50的杂交瘤细胞株被命名为11C4(Hybridoma SIGL50.1(11C4))，并已按照布达佩斯条约和中国专利法实施细则第25条的规定，于2004年6月2日将该细胞株样品保藏在中国北京中国微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，其保藏登记号为CGMCC No.1158。

序列分析结果显示，本发明的纯化的抗人GL50单克隆抗体多肽的重链和轻链分别具有如序列表中SEQ ID NO：1和2所示的推测的氨基酸序列。其中所有氨基酸序列都是以氨基酸的标准单字母缩写符表示的。

流式细胞仪分析结果显示，本发明的抗人GL50单克隆抗体11C4能特异性识别Daudi细胞和L929/GL50转基因细胞表面上表达的GL50分子。竞争性抑制试验结果表明，本发明的抗人GL50单克隆抗体11C4的抗原结合位点不同与商品化抗人GL50单克隆抗体PE-GL50的抗原结合位点。

为了进一步鉴定本发明的抗人GL50单克隆抗体11C4的生物学特征，我们使用Western-Blotting技术检测了单克隆抗体11C4对Daudi细胞、L929/GL50细胞和L929/mock细胞膜蛋白的特异性识别能力。结果可见，本发明的单克隆抗体11C4能够识别Daudi细胞和L929/GL50细胞表面的分子量约50～60KD的膜蛋白。由此可见，本发明的抗人GL50单克隆抗体11C4不仅可用于免疫印迹法分析GL50蛋白质在不同细胞和组织中的表达及其水平，同时也为检测GL50分子的表达提供了新的特异性手段。

使用本发明的抗人GL50单克隆抗体11C4完成的免疫组织化学分析结果显示：B淋巴瘤细胞表面有较高浓度的GL50分子表达，而T淋巴瘤细胞则基本上没有GL50分子的表达。抗人GL50单克隆抗体11C4在B、T淋巴瘤组织细胞上不同的染色结果提示，单抗11C4在B淋巴瘤的诊断中可能具有潜在的临床应用价值。由于B淋巴瘤细胞表面表达高水平GL50分子，所以GL50分子可能是B淋巴瘤发生、发展过程中的重要调节因子，并且可能是B淋巴瘤治疗过程中重要的靶分子。

进一步的生物学功能研究表明，本发明的单克隆抗体11C4能够有效地阻断L929/GL50转基因细胞介导的T细胞增殖和细胞因子(IL-10)分泌。在体液免疫应答反应中，T细胞辅助的B淋巴细胞反应发挥着举足轻重的作用。而B细胞的增殖、活化和分化、浆细胞的增生以及抗体的分泌及类型转化直接决定体液免疫应答的免疫学效应。在T细胞依赖的美洲商陆(PWM)激发的B细胞培养体系中，本发明的抗人GL50单抗11C4能够阻断L929/ICOS转基因细胞介导的促抗体分泌作用。因此可以认为，单克隆抗体11C4也能够有效地抑制T细胞的活化、阻止T细胞免疫应答向Th2型免疫应答偏移并抑制T细胞依赖性的B细胞分泌IgG抗体。业已证明，自身免疫性疾病是机体针对自身抗原产生的一种过强的、有害的免疫反应，主要表现为自身免疫性T细胞过度活化。如果能够有效抑制T细胞的活化以及效应性细胞因子的分泌，就可以缓解、治疗自身免疫性疾病。因此，可以利用阻断型抗人GL50单克隆抗体11C4阻断ICOS/GL50途径，抑制T细胞的活化增殖，进而抑制T细胞免疫应答，以预防和治疗自身免疫性疾病。

宿主针对移植物以及移植物针对宿主的免疫应答反应是移植过程中的重要问题，主要表现为过强的免疫应答反应。目前防止免疫排斥反应的唯一有效手段是使用非特异性免疫抑制剂。然而，非特异性免疫抑制剂的使用也造成许多毒副作用。如果能够特异性阻断移植后的免疫应答反应，抑制T细胞的增殖和活化，就能够有效地预防免疫排斥，同时也必将大大减少非特异性免疫抑制剂的使用。鉴于本发明的抗人GL50单克隆抗体11C4可有效地阻断T细胞应答反应，因此其有可能作为一种免疫抑制剂，用于预防或缓解移植排斥反应。

以下借助非限制性实施例举例详细描述本发明。本领域技术人员可以在不背离本发明的基本精神和原则前提下，改变或改动本说明书中描述的某些技术内容或技术环节，但人们可以理解到，这些平行的改变或改动均将包括在本发明的待批权利要求范围之内。

实施例

实施例1：抗人GL50单克隆抗体的制备

本实施例旨在举例说明制备本发明的抗人GL50单克隆抗体11C4的方法。

(1)转基因细胞L929/GL50和L929/mock的建立

(a)人GL50基因的克隆：用TRIZOL(Gibco，BRL)抽提植物血凝素(PHA)活化的扁桃体B细胞的总RNA。使用MBI逆转录试剂盒将所得到的mRNA逆转录成cDNA。取5μl cDNA作为模板，使用上游引物：5’-GTTGGA TCCAT GAAGTCA GGCCTCTGGT-3’(SEQ ID NO：3)，和下游引物：5’-GAGAATTCTTATAGGGTCACATCTG-3’(SEQ ID NO：4)进行PCR扩增(PCR条件为94℃预变性5min，94℃变性40s，62℃退火40s，72℃延伸40s，36个循环；然后72℃延伸10分钟)。纯化后在T₄DNA连接酶作用下将PCR产物与pMD18-T载体连接过夜。然后用连接产物转化感受态大肠杆菌TOP10细胞。培养细胞后筛选阳性克隆，并进行PCR分析、酶切鉴定和DNA测序。结果显示，如此获得的cDNA序列与GenBank中注册的人GL50cDNA序列完全一致。

(b)重组逆转录病毒载体的构建：分别用EcoRI和BamHI双酶消化测序正确的pMD18-T/GL50质粒和逆转录病毒载体pEGZ-Term(37℃，4h)。回收酶切后的目的片段，然后连接并将连接混合物用于转化感受态细菌细胞。培养被转化的细菌细胞以扩增所需的重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/GL50。

(c)稳定表达人GL50的L929转基因细胞的构建：按照试剂盒操作手册所述的方法重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/GL50与两辅助病毒pHIT456和pHIT60(2∶1∶1)共转染6孔板中60-70％汇片的293T细胞。48小时后，收集含病毒颗粒的293T培养物上清，并以其感染L929细胞。同时加入polybrene(终浓度8ng/m1)，37℃感染6小时后，添加含10％FCS的1640培养基(2ml/孔)，隔日换液一次。重复感染3次后，收集细胞并按1∶6稀释。然后将细胞置于含Zeocin(Invitrogen，500μg/ml)的选择培养基中，筛选培养2周。待抗性单克隆生长至足够大时，挑取单克隆集落，进行扩大培养。同时制备作为阴性对照的转基因细胞L929/mock。流式细胞术检测显示，L929/GL50细胞膜上人GL50蛋白的表达率约95％。

(2)抗人GL50单克隆抗体的制备

按Kohler和Milstein建立的方法(Nature 1975，256：495-496)制备抗人GL50单克隆抗体。

用高表达GL50分子的B淋巴瘤Daudi细胞为免疫原，免疫Balb/c小鼠(10⁷/500μl PBS/只)。每次接种间隔3周，共免疫三次。末次免疫后第四天取小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤按常规方法进行融合。以高表达GL50分子的L929/GL50为阳性对照，并以不表达GL50分子的L929/mock为阴性对照，用间接免疫荧光法对杂交瘤培养上清进行初步筛选。筛选的阳性克隆以有限稀释法单克隆化，经过4次有限稀释后，使克隆的阳性率达95％以上。经复筛及亚克隆后获得稳定地分泌特异性小鼠抗人GL50的杂交瘤细胞株，并将其命名为11C4。体外持续传代(40代)后，该细胞株仍能稳定地分泌特异性抗体。规模化细胞培养或生产腹水、分离纯化和单抗的特性鉴定并获得抗人GL50单抗纯品。

杂交瘤细胞株11C4(CGMCC No.1158)的亲本细胞为小鼠SP2/0骨髓瘤细胞株和Daudi细胞免疫后的小鼠脾脏细胞，其细胞染色体数目为102(参见图2所示)。

(3)抗人GL50单抗的生产与特性鉴定

(a)采用本室建立的腹水体内诱生方法生产单克隆抗体。取6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，腹腔注入Pristane 0.5ml/只。一周后腹腔注射杂交瘤细胞1×10⁷/只，同时另一侧腹腔再次注入Pristane和福氏半佐的等体积混合物0.2ml/只。轻轻按摩小鼠腹部，使杂交瘤细胞分散于腹腔中。5-10天后收获腹水，离心取上清分装后于-80℃保存。

(b)腹水型单抗的纯化及定量。取腹水液离心去除凝块，每10ml腹水加入1ml(1mol/L)氯化钙、0.1ml 5％硫酸盐葡聚糖溶液，室温搅拌15分钟，4℃离心(12000rpm，20min)去除纤维蛋白。取上清液按50％饱和度加入等体积饱和硫酸胺溶液，混匀后4℃放置4-6小时，离心弃上清。取沉淀加磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)复溶。透析去除(NH₄)₂SO₄后按照Pharmacia公司提供的方案用蛋白G亲和层析柱纯化所需的抗体。样品对磷酸盐缓冲液(PBS)透析后用751紫外分光光度计测定抗体蛋白的含量。结果可见，腹水型单抗纯化后蛋白浓度为4.05mg/ml。间接免疫荧光法分析显示，纯化后单抗的效价为1∶2000以上。(c)Ig亚类鉴定。采用试纸快速测定(Argen公司)法，鉴定纯化产物的Ig亚类为小鼠IgG2a型(参见图1)。

(d)抗体识别抗原结合位点的竞争性抑制试验。将悬浮的Daudi细胞(5×10⁵/管)用PBS洗涤后加入单克隆抗体11C4(每管2μg)，4℃孵育45分钟。洗涤后加入商品化鼠抗人GL50单克隆抗体PE-GL50，再4℃孵育30分钟。洗涤后进行流式细胞分析，结果如图3所示。

由图3所示的结果可以看出，单抗11C4不能完全阻断商品化单抗PE-GL50对GL50的识别，表明抗人GL50单克隆抗体11C4的抗原结合位点不同于商品化抗人GL50单克隆抗体PE-GL50的抗原结合位点。这也提示了抗人GL50单克隆抗体11C4可能具有不同于商品化抗人GL50单克隆抗体PE-GL50的生物学特性和功能。

(e)单抗的Western blot鉴定。收集生长状态良好的Daudi、L929/GL50和L929/mock细胞(各5×10⁷个)，用预冷的PBS洗涤两遍后于冰上孵育，依次加入细胞膜裂解液(RIPA)0.5ml和蛋白酶抑制剂(PMSF)100μl，分别抽提3种细胞的膜蛋白。蛋白质样品中加入1×SDS凝胶加样缓冲液，加热煮沸3分钟使蛋白质变性。配制12％的积层胶和5％的分离胶，恒压100伏特下进行SDS-PAGE电泳(3小时)。电泳结束后，将蛋白质样品电转移到硝酸纤维膜上。用20％脱脂奶粉过夜封闭硝酸纤维膜，次日TBS洗涤后加入稀释的抗体11C4(1∶2000)。封闭2小时后用TBS充分洗涤，然后加入兔抗鼠IgG二抗。室温孵育2小时后，充分洗涤并加入显色液BCIP显色。

免疫印迹实验结果显示，抗体11C4印染的硝酸纤维膜在细胞Daudi(图1-4A，E)和L929/GL50的位置上出现了特异性的染色条带，大小为56KD左右。而在细胞L929-mock的位置上未出现特异性的染色条带。由此可见，抗体11C4皆可特异性地识别Daudi和L929/GL50细胞表面的GL50膜蛋白(参见图4)。由此可见，抗体11C4能够运用于免疫印迹实验分析GL50蛋白在不同组织细胞中的表达及其水平。

(f)单抗的免疫组织化学鉴定。选择B淋巴瘤、T淋巴瘤、肺癌等组织标本，分别用10％中性福尔马林固定后，常规制备组织切片。脱蜡、修复抗原并洗涤后，加入0.3％过氧化氢甲醇以阻断内源过氧化物酶。再次用蒸馏水洗涤后，各切片分别加入10％正常羊血清降低本底。然后再依次加入工作浓度为1∶50的小鼠抗人GL50抗体11C4(作为一抗)、生物素标记的第二抗体、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，于每次加样后洗涤(PBS)反应混合物并于37℃孵育40-60分钟。末次洗涤后，再加入0.04％DAB+0.03％H₂O₂显色，于室温孵育15分钟。常规苏木素衬染、脱水、透明并封片后检测并记录荧光强度，借以分析GL50分子在不同组织中的表达水平。

本研究运用免疫组织化学技术共检测20例B淋巴瘤标本、18例T淋巴瘤标本和10例肺癌标本。免疫组化分析结果显示，肺癌和T淋巴瘤组织几乎未检测到染色反应，而B淋巴瘤组织则呈现强染色。表明肺癌和T淋巴瘤细胞没有GL50分子的表达；而B淋巴瘤细胞则高表达GL50分子。因此，本发明的抗体11C4可被用于B淋巴瘤的辅助诊断，在B淋巴瘤的初步筛选中具有潜在的临床应用价值(参见图5)。

实施例2：抗人GL50单克隆抗体抑制活化T细胞的体外增殖

本实施例描述采用³H-TdR掺入法检测抗人GL50单克隆抗体11C4阻断L929/GL50介导的活化T细胞增殖的效应。

(1)T细胞制备：以梯度离心法(Ficoll)和常规的绵羊红细胞结合法由正常志愿者外周血中分离获得纯度＞90％的T细胞。

(2)抗人GL50单克隆抗体11C4阻断L929/GL50介导的活化T细胞增殖实验：用含1μg/ml CD3mAb的PBS100μl包被96孔板。次日用PBS洗涤以除去未结合的抗CD3单抗。然后加入新鲜分离的T细胞(2×10⁵细胞/孔100μl)，并根据实验要求加入经丝裂霉素C(1×10⁶细胞/100μg)处理的转基因细胞L929/GL50、L929/mock(1×10⁴细胞/孔)以及不同浓度的抗人GL50单克隆抗体11C4。于培养的第5天添加3.7×10⁴Bq³H-TdR/孔，继续培养18h后收获细胞于49^#玻璃纤维纸上。烘干后测定放射性核素的每分钟闪烁计数值(cpm)。结果提示，本发明的抗人GL50单克隆抗体11C4能够阻断L929/GL50转基因细胞介导的活化T细胞的体外增殖(参见图6)。

实施例3：抗人GL50单克隆抗体对活化T细胞的细胞因子分泌的影响

本实施例描述以酶联免疫法检测抗人GL50单克隆抗体11C4对L929/GL50介导的活化T细胞的细胞因子(IL-10)分泌的影响。

(1)T细胞制备：：以梯度离心法(Ficoll)和常规的绵羊红细胞结合法由正常志愿者外周血中分离获得纯度＞90％的T细胞。

(2)L929/GL50介导的T细胞的细胞因子IL-10分泌实验：用含1μg/mlCD3mAb的PBS100μl包被96孔板。次日用PBS洗涤以除去未结合的抗CD3单抗。然后加入新鲜分离的T细胞(2×10⁵细胞/孔100μl)，并根据实验要求加入经丝裂霉素C(1×10⁶细胞/100μg)处理的转基因细胞L929/GL50、L929/mock(1×10⁴细胞/孔)以及不同浓度的抗人GL50单克隆抗体11C4。于培养的第3天收集实验组的培养上清，以ELISA法检测培养物上清中IL-10的分泌水平。实验结果提示，本发明的抗人GL50单克隆抗体11C4能够逆转L929/GL50转基因细胞介导的活化T细胞的细胞因子IL-10的分泌(参见图7)。

实施例4：抗人GL50单克隆抗体11C4对T细胞依赖性抗体分泌的影响

本实施例描述采用酶联免疫法检测单抗11C4对B细胞的IgG抗体分泌水平的影响。

(1)扁桃体淋巴细胞的制取：将手术切除的扁桃体除去包膜(标本获自苏州大学附属第一人民医院五官科)，压碎并筛网过滤单细胞。所得的单细胞悬液经淋巴细胞分离液(Ficoll)分离得到纯度约为50％的扁桃体B淋巴细胞。

(2)酶联免疫法检测人IgG水平：以5×10⁵/孔的浓度将扁桃体悬液加入24孔板中，同时加入PWM(4μg/ml)，并根据实验要求分别加入丝裂霉素C(100μg/10⁶细胞)处理的转基因细胞L929/ICOS(1×10⁵细胞/孔)和特异性抗人GL50单克隆抗体11C4(调整浓度分别达到1.0、2.5、5.0、10.0、20.0μg/ml)。于培养的第10天，以ELISA法测定细胞培养上清中的IgG水平。具体方法如下所述：用羊抗人IgG抗体(2.0μg/ml)包被96孔板，4℃过夜后用含20％牛血清的PBS缓冲液37℃封闭2小时。PBS(含0.5％Tween)充分洗涤后，加入待测样品和梯度稀释的人标准IgG蛋白，37℃反应1.5小时。洗涤后再加入HRP标记的羊抗人IgG(1∶2000)，37℃孵育2小时。最后加入底物OPD缓冲液，以分光光度法测定OD值(405nm)。结果如图8所示。

由图8所示的结果可以看出，本发明的抗人GL50单克隆抗体11C4能够阻断L929/ICOS转基因细胞介导的B细胞的抗体分泌。这些结果提示，该抗体在调节机体免疫状态、治疗自身免疫性疾病中具有潜在的临床应用价值。

                        序列表

<110>苏州大学生物技术研究所

<120>抗人GL50单克隆抗体的制备及其应用

<140>

<141>

<160>4

<210>1

<211>149

<212>氨基酸

<213>人工序列

<220>

<223>根据合成的单克隆抗体11C4的重链核甘酸编码序列推测的氨基酸序列。

<400>1

VQLQESGGGL VQPGGSRKLS CAASGFTFSS FGMHWVRQAP EKGLEWVAYI SGGSTTLYYA

DTVKGRFTIS RDNPKNTLFL QMTSLRSEDT AMYYCTRWRG YSAMDYWGQG TSVTVSSAKT

TPPSVYPLAP VCGDTTGSSV TLGCLVKGY

<210>2

<211>120

<212>氨基酸

<213>人工序列

<220>

<223>根据合成的单克隆抗体11C4的重链核甘酸编码序列推测的氨基酸序列。

<400>2

DIVMTQSPSS LAVSAGEKVT MSCKSSQSVL HGSDQKNYLA WYQQKPGQSP KLLIYWASTR

ESGVPDRFTG SGSGTDFFLT ISSVQAEDLA LYYCHQYLSS YTFGGGTKLE IKSADAAPTV

<210>3

<211>28

<212>氨基酸

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>3

GTTGGATCCA TGAAGTCAGG CCTCTGGT

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>4

GAGAATTCTT ATAGGGTCAC ATCTG

Claims (4)

1、稳定地分泌特异性小鼠抗人GL50单克隆抗体的编号为CGMCC No.1158的杂交瘤细胞株。

2、权利要求1的杂交瘤细胞分泌的分别具有如SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示的推测的重链和轻链氨基酸序列的特异性小鼠抗人GL50单克隆抗体11C4。

3、权利要求1的抗人GL50单克隆抗体11C4在阻断T细胞依赖性B细胞的抗体分泌中的应用。

4、权利要求1的抗人GL50单克隆抗体11C4在组织细胞的免疫组织化学分析中的应用。

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