CN1843368A - 一种灯盏花素长循环纳米脂质体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含灯盏花素的长循环纳米脂质体药物，其成分包括灯盏花素、磷脂、聚乙二醇衍生化的磷脂(PEG₂₀₀₀－DSPE)和胆固醇；其粒径范围为150～500nm，为一种长循环的纳米脂质体；其药物剂型包括注射液，冻干粉针剂和喷雾剂。在所述灯盏花素长循环纳米脂质体的成分中，磷脂∶胆固醇∶聚乙二醇衍生化的磷脂∶灯盏花素的摩尔比为55∶25～55∶3～7∶2.2～18.3。所述磷脂为大豆磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化大豆磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油。本发明含灯盏花素的长循环纳米脂质体优选采用薄膜挤压法制备而成。质检结果表明，本发明的灯盏花素长循环脂质体粒径均一，形态圆整，包封率高，泄漏低，符合药典要求。

Description

一种灯盏花素长循环纳米脂质体及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种药物，特别是关于一种灯盏花素长循环纳米脂质体及其制备方法。

背景技术

人类老龄化带来的重大课题就是老年病的预防和治疗，随着心脑血管患病比例的上升，人们对药物质量的要求日益提高。目前应用于心脑血管疾病的中药不但品种少，且多为传统剂型，药效不理想。灯盏花素(breviscapine)是从菊花短亭飞蓬属植物灯盏花中提取的有效成分，是灯盏甲素和灯盏乙素的混合物。药理研究表明，灯盏花素可以扩张脑血管，降低脑血管阻力，增加脑血流量，改善微循环，并有对抗血小板聚集的作用。临床多用于心脑血管疾病的治疗。

由于灯盏花素的溶解度低，因此临床使用的注射液一般在碱性条件下配制，并用吐温80等表面活性剂增溶，存在不安全的因素。并且灯盏花素在体内消除速度很快，不利于治疗。

脂质体(liposomes)作为新一代的药物载体系统，在第三代控释制剂和第四代靶向制剂领域有广阔的发展前景。传统脂质体在血液中蛋白、调理素等的作用下，易发生破裂渗漏，被网状内皮(RES)系统的巨噬细胞所吞噬，将其在血液循环中清除，从而减少了脂质体到达非RES系统病灶组织部位的药量。

在传统脂质体的基础上，在磷脂膜中掺入聚乙二醇修饰的磷脂构成的脂质体成为长循环脂质体(stealth liposomes)。长循环脂质体表面暴露的亲水性基团所产生的空间位阻，可以减少与血浆中调理成分的结合，增加在血液中的稳定性。因此长循环脂质体有更充足的时间到达靶向部位。掺入聚乙二醇修饰的膜材料的磷脂，本身无毒，对心脑血管疾病有预防和辅助治疗的作用。

因此，将长循环脂质体作为药物载体，结合灯盏花素研制一种含有灯盏花素的长循环纳米脂质体药物，具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种灯盏花素长循环纳米脂质体药物及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种灯盏花素长循环纳米脂质体，其成分包括灯盏花素、磷脂、聚乙二醇衍生化的磷脂(PEG₂₀₀₀-DSPE)和胆固醇。

在所述灯盏花素长循环纳米脂质体的成分中，磷脂∶胆固醇∶聚乙二醇衍生化的磷脂(PEG₂₀₀₀-DSPE)：灯盏花素的摩尔比为55∶25～55∶3～7∶2.2～18.3。

所述磷脂为大豆磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化大豆磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱或二棕榈酰磷脂酰甘油。

所述灯盏花素长循环纳米脂质体的粒径为150～500nm，为一种长循环的纳米脂质体。

所述灯盏花素长循环纳米脂质体的药物剂型包括注射液，冻干粉针剂，喷雾剂。

一种制备灯盏花素长循环纳米脂质体的方法，其包括以下步骤：1)将磷脂、胆固醇、聚乙二醇衍生化的磷脂(PEG₂₀₀₀-DSPE)、灯盏花素加入到乙醇中进行超声溶解，然后将溶解液置于圆底烧瓶中；2)将圆底烧瓶在38℃恒温水浴中进行减压蒸发，去除溶解液中的有机溶剂，使磷脂等成膜材料在瓶壁上形成均匀薄膜，并在氮气保护下继续空转1h；3)向圆底烧瓶中加入0.9％的NaCl溶液，进行水合，旋转至瓶壁上形成的薄膜全部被洗下，加入添加剂；4)将瓶中的混合物通过挤压器连续两次挤压过0.45μm的微孔滤膜，得到灯盏花素长循环纳米脂质体。

在一种制备灯盏花素长循环纳米脂质体的方法中，所述磷脂∶胆固醇∶聚乙二醇衍生化的磷脂(PEG₂₀₀₀-DSPE)：灯盏花素的摩尔比为55∶25～55∶3～7∶2.2～18.3。

所述添加剂包括甘露醇、蔗糖、葡萄糖、乳糖、磷脂酸、十八胺、维生素E中的一种或多种。

所述制备灯盏花素长循环纳米脂质体的方法包括薄膜挤压法、逆相蒸发法、注入法和冷冻干燥法；优选采用薄膜挤压法。

根据中华人民共和国药典2000年版二部，对本发明灯盏花素长循环纳米脂质体及其制剂的质量进行检查，结果表明，灯盏花素长循环纳米脂质体形态粒度分布均一，包封率高(大于90％)，泄漏率低，符合药典对脂质体制剂的各项要求。

本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：1、本发明由于采用长循环脂质体作为药物载体，结合灯盏花素制备而成，因而能够明显提高药物的体内外稳定性，延长药物作用时间，提高靶向性。2、经本发明灯盏花素长循环脂质体注射给药，在灯盏花素药物成分在血液中的驻留时间明显延长，有利于心脑血管病灶部位的吸收。3、本发明灯盏花素长循环脂质体药物，能降低药物毒性，增强药理作用。4、本发明灯盏花素长循环脂质体的粒径范围选择为150～500nm，成为一种长循环的纳米脂质体，其粒径的大小可以影响其在体内的分布与稳定性。5、本发明灯盏花素长循环脂质体成分中的添加剂可以选择性改善脂质体的特性，例如甘露醇作为冻干保护剂，在制备长循环脂质体的冻干粉时，可以提高贮存稳定性。6、本发明灯盏花素长循环纳米脂质体制备工艺简单。

附图说明

图1是灯盏花素长循环脂质体的透射电镜照片

图2是灯盏花素长循环脂质体经Zetasizer激光粒度分析所得的粒度分布曲线

图3是灯盏花素长循环脂质体在磷酸盐缓冲液中的累计释放曲线(n＝3)

图4是灯盏花素长循环脂质体在家兔体内的经时曲线(n＝3)

具体实施方式

现通过下列实施例详细说明本发明的具体实施方式。

实施例1、一种灯盏花素长循环纳米脂质体的制备

(1)将蛋黄卵磷脂1.50g，胆固醇0.56g，聚乙二醇衍生化的磷脂(PEG₂₀₀₀-DSPE)0.51g，灯盏花素0.15g，加入到200ml乙醇中进行超声溶解，然后将溶解液置于2500ml圆底烧瓶中。(2)将圆底烧瓶在38℃恒温水浴中进行减压蒸发，去除溶解液中的有机溶剂，使磷脂等成膜材料在瓶壁上形成均匀薄膜，并在氮气保护下继续空转1h。(3)向圆底烧瓶中加入100ml 0.9％的NaCl溶液，进行水合，旋转至瓶壁上形成的薄膜全部被洗下，加入1.0g甘露醇。(4)将瓶中的混合物通过挤压器连续两次挤压过0.45μm的微孔滤膜，得到灯盏花素长循环纳米脂质体。

对本实施例制备的灯盏花素长循环纳米脂质体进行质量检测如下：

(1)包封率的测定

取以上制备的灯盏花素长循环脂质体溶液，在4℃、75krpm的转速条件下离心2h，然后取其上清液，以0.9％的NaCl溶液为参比，测定紫外吸光度值A。结合标准曲线，求得游离药物的浓度CF。以10％的Triton-X100溶液破乳，以0.9％的NaCl溶液定容，由标准曲线求得脂质体溶液中灯盏花素的总浓度CT。

包封率计算公式如下：包封率％＝(CT-CF)/CT×100％。

本实施例制备的灯盏花素长循环脂质体经检验测定计算，其包封率为95.5％。

(2)载药量的测定

按以下计算公式计算载药量：载药量％＝(WT-WF)/WP×100％。

其中，WT为脂质体溶液中灯盏花素的总含量，WF为游离灯盏花素的含量，WP为蛋黄卵磷脂的用量。

本实施例制备的灯盏花素长循环脂质体经检验测定计算，其载药量为9.6％。

(3)灯盏花素长循环脂质体的粒径分布及形态

将灯盏花素长循环脂质体在铜网上制样后，在TEM透射电镜下观察脂质体结构，结果显示所制得的灯盏花素长循环脂质体，外形圆整，分布均一(如图1所示)。其中，图中a为TEM电镜照片(×10K)，b为TEM电镜照片(×25K)，c为TEM电镜照片(×40K)。将灯盏花素长循环脂质体用二次水适当稀释后，用Zetasizer激光粒度分析仪测定粒径的分布，结果如图2所示。

经电镜和粒度分析结果显示，该批次制得的灯盏花素长循环脂质体粒径为400nm，且粒度均匀，分布单一。

(4)脂质体体外释放度检验

本检验考察灯盏花素长循环脂质体在37℃时72h内的体外释放度。具体检验方法如下：将灯盏花素长循环脂质体溶液加入到筒状透析袋中，同时加入释放介质磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)，在37℃水浴中搅拌。分别于搅拌后的不同时间段时取透析外液，同时补充等量新鲜的磷酸盐缓冲液。由紫外吸光度法结合标准曲线计算各时间段时脂质体的累计释放量MA。取等量的灯盏花素脂质体溶液，用10％的Triton-X100破乳，求得药物总量MT。以下式计算释放度：

释放度％＝(透析外液中药物的累积释放量MA/药物总量MT)×100％

体外释放实验结果表明灯盏花素长循环脂质体在37℃介质中的药物释放度缓慢，72h的累计释放量为总量的20.5％(如图3所示)。

实施例2、一种灯盏花素长循环纳米脂质体的制备

(1)将蛋黄卵磷脂1.50g，胆固醇0.35g，聚乙二醇衍生化的磷脂(PEG₂₀₀₀-DSPE)0.71g，灯盏花素0.20g，加入到200ml乙醇中进行超声溶解，然后将溶解液置于2500ml圆底烧瓶中。(2)将圆底烧瓶在38℃恒温水浴中进行减压蒸发，去除溶解液中的有机溶剂，使磷脂等成膜材料在瓶壁上形成均匀薄膜，并在氮气保护下继续空转1h。(3)向圆底烧瓶中加入100ml 0.9％的NaCl溶液，进行水合，旋转至瓶壁上形成的薄膜全部被洗下，加入3.0g蔗糖。(4)将瓶中的混合物通过挤压器连续挤压过0.45μm的微孔滤膜，得到灯盏花素长循环脂质体。

采用与实施例1相同的检测方法对本实施例制备的灯盏花素长循环纳米脂质体进行质量检测。

实施例3、一种灯盏花素长循环纳米脂质体的制备

(1)将蛋黄卵磷脂1.50g，胆固醇0.77g，聚乙二醇衍生化的磷脂(PEG₂₀₀₀-DSPE)0.30g，灯盏花素0.10g，加入到200ml乙醇中进行超声溶解，然后将溶解液置于2500ml圆底烧瓶中。(2)将圆底烧瓶在38℃恒温水浴中进行减压蒸发，去除溶解液中的有机溶剂，使磷脂等成膜材料在瓶壁上形成均匀薄膜，并在氮气保护下继续空转1h。(3)向圆底烧瓶中加入100ml 0.9％的NaCl溶液，进行水合，旋转至瓶壁上形成的薄膜全部被洗下，加入2.0g葡萄糖。(4)将瓶中的混合物通过挤压器连续挤压过0.45μm的微孔滤膜，得到灯盏花素长循环脂质体。

采用与实施例1相同的检测方法对本实施例制备的灯盏花素长循环纳米脂质体进行质量检测。

实施例4、灯盏花素长循环纳米脂质体冻干粉针剂的制备

取实施例1制备的灯盏花素长循环纳米脂质体溶液，用微孔滤膜过滤除菌后置于安瓿瓶中，预冻48h后经冷冻干燥，充氮气封口后得到灯盏花素长循环脂质体的冻干粉针剂。

实施例5、灯盏花素长循环纳米脂质体注射液的制备

将实施例1制备的灯盏花素长循环纳米脂质体溶液经微孔滤膜过滤除菌后，充氮气灌封于安瓿中，即得灯盏花素长循环纳米脂质体的注射液。

实施例6、灯盏花素长循环纳米脂质体喷雾剂的制备

将实施例1制备的灯盏花素长循环纳米脂质体溶液经微孔滤膜过滤除菌后装入喷雾剂装置中，得到喷雾剂。长循环脂质体溶液在压力作用下呈雾状喷出。

实施例7、灯盏花素长循环纳米脂质体药物在家兔体内的经时曲线

取家兔3只，经耳缘静脉注射给药(给药剂量10mg/kg)，在72h内于不同时间点从另一侧耳缘静脉取血，血样处理后经HPLC检测得到如下经时曲线(如图4所示)。

实验结果表明灯盏花素长循环脂质体在48h时在血液中仍有较高残留，说明长循环脂质体作为灯盏花素的药物载体确实可以延长药物的半衰期，使药物有更多的机会到达靶向部位从而提高生物利用度。

Claims (9)

1、一种灯盏花素长循环纳米脂质体，其特征在于：所述灯盏花素长循环纳米脂质体的成分包括灯盏花素、磷脂、聚乙二醇衍生化的磷脂和胆固醇。

2、如权利要求1所述的一种灯盏花素长循环纳米脂质体，其特征在于：在所述灯盏花素长循环纳米脂质体的成分中，磷脂∶胆固醇∶聚乙二醇衍生化的磷脂∶灯盏花素的摩尔比为55∶25～55∶3～7∶2.2～18.3。

3、如权利要求1或2所述的一种灯盏花素长循环纳米脂质体，其特征在于：所述磷脂为大豆磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化大豆磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱或二棕榈酰磷脂酰甘油。

4、如权利要求1或2所述的一种灯盏花素长循环纳米脂质体，其特征在于：所述灯盏花素长循环纳米脂质体的粒径为150～500nm，为一种长循环的纳米脂质体。

5、如权利要求1或2所述的一种灯盏花素长循环纳米脂质体，其特征在于：所述灯盏花素长循环纳米脂质体的药物剂型包括注射液、冻干粉针剂和喷雾剂。

6、一种制备灯盏花素长循环纳米脂质体的方法，其包括以下步骤：1)将磷脂、胆固醇、聚乙二醇衍生化的磷脂、灯盏花素加入到乙醇中进行超声溶解，然后将溶解液置于圆底烧瓶中；2)将圆底烧瓶在38℃恒温水浴中进行减压蒸发，去除溶解液中的有机溶剂，使磷脂等成膜材料在瓶壁上形成均匀薄膜，并在氮气保护下继续空转1h；3)向圆底烧瓶中加入0.9％的NaCl溶液，进行水合，旋转至瓶壁上形成的薄膜全部被洗下，加入添加剂；4)将瓶中的混合物通过挤压器连续两次挤压过0.45μm的微孔滤膜，得到灯盏花素长循环纳米脂质体。

7、如权利要求7所述的一种制备灯盏花素长循环纳米脂质体的方法，其特征在于：所述磷脂∶胆固醇∶聚乙二醇衍生化的磷脂∶灯盏花素的摩尔比为55∶25～55∶3～7∶2.2～18.3。

8、如权利要求7所述的一种制备灯盏花素长循环纳米脂质体的方法，其特征在于：所述添加剂包括甘露醇、蔗糖、葡萄糖、乳糖、磷脂酸、十八胺、维生素E中的一种或多种。

9、制备灯盏花素长循环纳米脂质体的方法，包括薄膜挤压法、逆相蒸发法、注入法和冷冻干燥法；优选采用薄膜挤压法。

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