KR20220065475A

KR20220065475A - 펜벤다졸 가용화 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20220065475A
Application number: KR1020200152044A
Authority: KR
Inventors: 신대환; 진익섭
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2020-11-13
Filing date: 2020-11-13
Publication date: 2022-05-20
Also published as: KR102455423B1

Abstract

본 발명은 펜벤다졸(Fenbendazole) 가용화 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 수난용성 약물인 펜벤다졸을 특정 고분자 중합체에 봉입하여 마이셀을 형성함으로써 물에 대한 용해도를 개선시킨 가용화 조성물 및 상기 펜벤다졸 가용화 조성물의 의약품 소재로의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 펜벤다졸(Fenbendazole) 화합물의 가용화 조성물은 폴리비닐 카프로락탐-폴리비닐 아세테이트-폴리에틸렌 글리콜 그래프트 공중합체(PCL-PVAc-PEG)의 회합으로 이루어진 고분자 마이셀을 사용함으로써 펜벤다졸 화합물을 효과적으로 가용화시킬 수 있다. 펜벤다졸 화합물은 난용성 물질로써 수층에는 거의 존재하지 않고 마이셀 내에 봉입됨으로써 가용화되게 된다. 이러한 방식으로 난용성 물질인 펜벤다졸 화합물은 수층에 녹아들 수 있게 하여 물을 이용한 정맥 주사제로 개발될 수 있다. 정맥 주사는 경구 투여 제형에 비하여 간 초회통과효과를 회피할 수 있어 불필요한 약물의 손실을 줄일 수 있으며, 경구 투여 제형에 비하여 생체이용률 또한 높일 수 있어 동일한 양의 약물로 높은 효과를 기대할 수 있는 효과적인 투여 방법이므로 이러한 제형의 개발은 펜벤다졸 화합물의 효과적인 투여를 가능하게 한다.

Description

펜벤다졸 가용화 조성물 및 이의 용도{A Composition for Solubilizing Fenbendazole and Uses Thereof}

본 발명은 펜벤다졸(Fenbendazole) 가용화 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 수난용성 약물인 펜벤다졸을 특정 고분자 중합체에 봉입하여 마이셀을 형성함으로써 물에 대한 용해도를 개선시킨 가용화 조성물 및 상기 펜벤다졸 가용화 조성물의 의약품 소재로의 용도에 관한 것이다.

펜벤다졸(Fenbendazole)은 벤즈이미다졸 (Benzimidazole) 구조를 가지는 구충제이다. 오랫동안 구충제로 사용되며 낮은 독성을 가진다는 것이 입증되었다. 그러나 최근에는 여러 가지 기전으로 항암 활성을 갖는다는 것이 보고되고 있다. 대표적으로, 팍클리탁셀과 같은 항암제처럼 튜블린 (tubulin)을 억제하며 소포체의 스트레스를 유발하고 활성산소종 의존성 세포사멸을 증가시키는 것으로 나타났다. 그러나 펜벤다졸은 물에 대한 용해도가 낮고 구강 투여시 생체이용률이 낮아서 위에 언급된 다양한 약리학적 유용성에도 불구하고 적합한 제형 연구 부족과 같은 일부 제한 때문에 전임상 및 임상에서의 사용은 제한되어 있다.

난용성 약물은 화합물의 구조상 소수성 부위를 포함하고 있어 물에 잘 녹지 않는 약물을 의미하며, 난용성으로 인해 그 실용성이 제한되는 경우가 많다. 예를 들어, 신약으로 개발되는 약물 중 약 41% 이상이 난용성으로 인하여 중도에 포기되고 있으며, 미국 약전(US Pharmacopeia)에 등재된 약물의 약 ⅓이상이 난용성 약물로 분류되고 있다.

이러한 난용성 약물을 사용하기 위해서는 난용성을 해결하기 위한 부가적인 물질이 첨가되어야 하나, 부가되는 물질의 독성으로 인하여 사용이 제한되는 사례가 다수 보고되고 있다. 예컨대, 일반적으로 난용성 물질을 수용화하기 위해서는 유화제를 이용한 유화, 리포좀을 이용한 포집 등이 널리 이용되고 있는데, 인체에서 유래되지 않은 이물질의 혼입과 물리적 불안정성 등으로 인해 사용이 제한되고 있는 실정이다.

따라서 난용성 소재인 펜벤다졸의 의약품 같은 산업 분야에 응용에 있어 기온, 보관 장소 및 기간에 따른 변질을 막고, 장기간 안정성을 확보하여, 균질화된 수용액 상태를 유지하기 위한 노력은 필수적이며, 이는 지나치게 많은 유화제, 안정제 및 부형제 포함하지 않고 수행되어질 필요성이 있다.

그러나 현재까지 난용성 소재인 펜벤다졸을 의약품으로 응용하기 위하여 수용화하거나 생체 내 흡수율을 높이기 위한 연구는 전무한 실정이다.

이러한 배경 하에, 본 발명자는 펜벤다졸의 물에 대한 용해성을 개선시킬 수 있는 조성물을 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하였으며, 솔루플러스(soluplus^®) 마이셀을 사용하여 펜벤다졸을 효과적으로 가용화시킬 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

특히, 본 발명에서는 난용성 약물의 담체로 사용될 수 있는 다양한 중합체(mPEO-b-PCL, mPEG-b-PLA, Pluronic F127^®, Soluplus^®)에 펜벤다졸을 적용한 결과, mPEG-b-PLA 및 Pluronic F127^®을 사용하여 제조된 마이셀의 경우 입자 크기가 300nm 내지 1000nm 이상으로 나타나 종양 조직에 침투하기 어려우며, mPEO-b-PCL를 사용하여 제조된 마이셀은 캡슐화 효율 및 약물 로딩 효율이 매우 저조하여, 펜벤다졸에 적용하는데 적합하지 않은 것으로 나타났다. 반면에, 솔루플러스(soluplus^®)를 사용하여 제조된 마이셀의 경우 60nm 내지 70nm의 균일한 나노 입자크기를 갖는바 종양 조직에 침투하기 용이하며, 캡슐화 효율 및 약물 로딩 효율이 상대적으로 우수한바, 펜벤다졸의 용해도 및 전달을 위한 최적화할 수 있는 담체임을 최초로 규명하였다.

한국등록특허 제10-1905010호

따라서 본 발명의 목적은, 난용성 소재인 펜벤다졸(Fenbendazole) 화합물의 물에 대한 용해도가 효과적으로 개선된, 펜벤다졸(Fenbendazole) 화합물의 가용화 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 난용성 소재인 펜벤다졸(Fenbendazole) 화합물의 물에 대한 용해도가 효과적으로 개선된, 펜벤다졸(Fenbendazole) 화합물의 가용화 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 난용성 소재인 펜벤다졸(Fenbendazole) 화합물의 물에 대한 용해도가 효과적으로 개선됨으로써 정맥 주사용 제제로 사용할 수 있는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,

본 발명은 펜벤다졸(Fenbendazole) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 봉입된 폴리비닐 카프로락탐-폴리비닐 아세테이트-폴리에틸렌 글리콜 그래프트 공중합체(PCL-PVAc-PEG) 마이셀을 유효성분으로 포함하는, 펜벤다졸 화합물의 가용화 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 수난용성 약물인 펜벤다졸(Fenbendazole) 화합물이 폴리비닐 카프로락탐-폴리비닐 아세테이트-폴리에틸렌 글리콜 그래프트 공중합체(PCL-PVAc-PEG)에 봉입됨으로써 물에 대한 용해도가 개선될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 마이셀은 60nm 내지 70nm의 입자크기를 가질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 4℃ 내지 37℃ 온도 조건에서 장기간 변질 없이 안정적일 수 있다.

또한, 본 발명은 a) 펜벤다졸(Fenbendazole) 및 폴리비닐 카프로락탐-폴리비닐 아세테이트-폴리에틸렌 글리콜 그래프트 공중합체(PCL-PVAc-PEG)를 t-부탄올에 용해시킨 후 증류수를 첨가하고 혼합하는 단계; b) 혼합물을 동결건조하는 단계; c) 동결건조된 혼합물에 증류수를 첨가하여 혼합물을 수화(hydration)시키는 단계; 및 d) 수화(hydration)된 용액을 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계를 포함하는, 펜벤다졸 화합물의 가용화 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 a) 단계에서 펜벤다졸(Fenbendazole) 및 폴리비닐 카프로락탐-폴리비닐 아세테이트-폴리에틸렌 글리콜 그래프트 공중합체(PCL-PVAc-PEG)는 1:50 내지 1:100 중량비로 혼합될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 펜벤다졸 화합물의 가용화 조성물을 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 정맥 주사용 제제일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 아미노산, 당, 지질, 비타민, 전해질, pH 조정제, 안정화제, 삼투압 조정제 및 용해보조제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 성분을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 유방암, 대장암, 자궁암, 나팔관암, 난소암, 위암, 뇌암, 두경부암, 직장암, 소장암, 식도암, 임파선암, 담낭암, 폐암, 비소세포폐암, 교모세포종, 피부암, 신장암, 방광암, 혈액암, 췌장암, 전립선암, 갑상선암, 내분비선암, 구강암, 간암 및 혈액암으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 펜벤다졸(Fenbendazole) 화합물의 가용화 조성물은 폴리비닐 카프로락탐-폴리비닐 아세테이트-폴리에틸렌 글리콜 그래프트 공중합체(PCL-PVAc-PEG)의 회합으로 이루어진 고분자 마이셀을 사용함으로써 펜벤다졸 화합물을 효과적으로 가용화시킬 수 있다. 펜벤다졸 화합물은 난용성 물질로써 수층에는 거의 존재하지 않고 마이셀 내에 봉입됨으로써 가용화되게 된다. 이러한 방식으로 난용성 물질인 펜벤다졸 화합물은 수층에 녹아들 수 있게 하여 물을 이용한 정맥 주사제로 개발될 수 있다. 정맥 주사는 경구 투여 제형에 비하여 간 초회통과효과를 회피할 수 있어 불필요한 약물의 손실을 줄일 수 있으며, 경구 투여 제형에 비하여 생체이용률 또한 높일 수 있어 동일한 양의 약물로 높은 효과를 기대할 수 있는 효과적인 투여 방법이므로 이러한 제형의 개발은 펜벤다졸 화합물의 효과적인 투여를 가능하게 한다.

특히, 본 발명에서는 다양한 고분자 중합체 중 PCL-PVAc-PEG를 사용하여 제조된 마이셀의 경우에서만 종양 침투능력이 우수한 60 내지 70nm 크기의 균일한 입자크기를 가지면서, 온도에 따른 저장 안정성이 우수한바, 펜벤다졸의 용해도 및 전달을 위한 최적화할 수 있는 담체임을 최초로 규명하였다.

도 1은 펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀 제제의 제조 방법과 제조 후의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2a는 펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀의 투과전자현미경(TEM) 이미지를 나타낸 것이다.
도 2b는 펜벤다졸에 다양한 중합체(mPEO-b-PCL, mPEG-b-PLA, Pluronic F127^®, Soluplus^®)를 적용하여 제조된 마이셀의 입자 분포를 나타낸 것이다.
도 3은 펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀 및 펜벤다졸 용액(25% Cremophor EL^®/EtOH에 펜벤다졸(0.8mg/mL)이 용해된 용액)의 실험관 내(In vitro) 약물 방출 프로파일을 나타낸 것이다.
도 4a는 유리 펜벤다졸 약물(펜벤다졸을 DMSO에 용해시킨 후 RPMI로 1000배 희석시킨 약물)의 인체 폐암세포(A549)에 처리에 따른 MTT assay 결과를 나타낸 것이다.
도 4b는 펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀의 인체 폐암세포(A549)에 처리에 따른 MTT assay 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 긴 기간 (14일) 동안 인체 폐암세포(A549)에 펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀 및 유리 펜벤다졸 약물(펜벤다졸을 DMSO에 용해시킨 후 RPMI로 1000배 희석시킨 약물)을 농도별 처치 후 암세포의 활성도를 측정한 것이다.
도 6은 펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀의 온도(4℃, 25℃, 37℃)에 따른 저장 안정성을 평가한 결과이다(6a: 다분산 지수, 6b: 입자 크기).
도 7은 펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀 및 펜벤다졸 용액(25% Cremophor EL^®/EtOH에 펜벤다졸(0.8mg/mL)이 용해된 용액)을 랫트에 정맥 내 투여한 후 펜벤다졸의 혈장 농도 시간 프로파일을 나타낸 것이다.
도 8은 펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀 및 펜벤다졸 용액(25% Cremophor EL^®/EtOH에 펜벤다졸(0.8mg/mL)이 용해된 용액)을 랫트에 정맥 내 투여한 후 8시간 이내에 각 조직(간, 폐, 신장, 심장, 비장)에서 펜벤다졸의 총 양을 나타낸 것이다.
도 9는 DPBS 대조군, 1펜벤다졸을 포함하는 25% Cremophor EL^®/EtOH 용액, 펜벤다졸을 포함하는 25% 폴리소르베이트 80(Tween 80^®) 용액, 펜벤다졸을 포함하는 25% 디메일아세트아미이드 용액 및 펜벤다졸-로딩된 soluplus^® 마이셀 각각의 시료를 랫트에 0일, 4일 및 8일차에 정맥 주사한 후 그룹별 랫트의 체중 변화 및 생존율을 측정한 것이다(9a: 체중, 9b: 생존율). 붉은 화살표는 시료의 정맥 주사 시점을 가리킨다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 펜벤다졸(Fenbendazole) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 봉입된 폴리비닐 카프로락탐-폴리비닐 아세테이트-폴리에틸렌 글리콜 그래프트 공중합체(PCL-PVAc-PEG) 마이셀을 유효성분으로 포함하는, 펜벤다졸 화합물의 가용화 조성물에 관한 것이다.

<화학식 1>

상기 펜벤다졸 화합물은 벤즈이미다졸 (Benzimidazole) 구조를 가지는 구충제로서, 오랫동안 개를 비롯한 동물용 구충제로 사용되어져 왔으며 낮은 독성을 가진다. 최근에는 여러 가지 기전으로 항암 활성을 갖는다는 것이 보고된바 있다. 항암 활성 기전으로는, 팍클리탁셀과 같은 항암제처럼 튜블린 (tubulin)을 억제하며 소포체의 스트레스를 유발하고 활성산소종 의존성 세포사멸을 증가시키는 것으로 알려져 있다.

상기 화학식으로 표시되는 펜벤다졸 화합물은 시중에서 판매되는 것을 사용할 수 있으며, 또는, 종래 알려진 합성방법을 통해 직접 합성하여 사용할 수도 있다.

상기 화학식으로 표시되는 펜벤다졸 화합물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다.

약학적으로 허용가능한 염은 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가 염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산 (lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

본 발명의 상기의 화학식의 구조를 갖는 펜벤다졸 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 화학식의 구조를 갖는 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.

본 발명에서 상기 폴리비닐 카프로락탐-폴리비닐 아세테이트-폴리에틸렌 글리콜 그래프트 공중합체(PCL-PVAc-PEG) 마이셀은 친수성 물질인 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)과 소수성 성분인 폴리비닐 캐프로락탐-폴리비닐 아세테이트(PCL-PVAc)의 중합 고분자인 Soluplus^®의 회합으로 이루어지며, 약물을 담지할 수 있는 담체 또는 약물을 전달할 수 있는 운반체(carrier)로서 역할을 한다.

상기, Soluplus^®는 단일 분자이지만 이 물질이 물에 용해되어 특정 농도 (critical micelle concentration, CMC)를 넘어서게 되면 구형의 마이셀을 형성한다. 마이셀이 형성되면, 친수성 부분인 껍질(shall)과 소수성 부분인 핵(core)이 형성된다. 친수성 부분인 껍질은 고분자의 친수성 부분인 PEG로 이루어져 있으며 소수성 부분인 핵은 고분자의 소수성 부분인 PCL-PVAc로 구성된다.

본 발명의 약물 전달용 조성물은 난용성 물질인 펜벤다졸 화합물이 마이셀의 수층이나 친수성 부분에 거의 존재하지 않고, 소수성 부분인 핵에 분포함으로써 마이셀 내에 봉입되게 되는 방식으로 가용화가 이루어지게 된다.

본 발명은 마이셀의 제조 방법으로 freeze-drying method를 사용하였다. 간략하게는, 1 mg의 펜벤다졸을 100 mg의 솔루플러스(Soluplus) 고분자와 함께 터셜리 부탄올 (tert-butanol)에 녹였다. 이를 영하 70도에서 1시간동안 급속 냉동을 시킨 후, 동결 건조기에 넣고 24시간동안 동결건조 시켰다. 이후에 증류수 1 mL를 사용하여 1분 동안 수화(hydration)시켜 마이셀 용액을 만들었다. 이 용액을 16,600 x g에서 5분간 원심분리한 후 상층액만을 취하여 200 nm의 포어 사이즈를 가지는 cellulose filter에 여과하여 무균화함과 동시에 침전되는 물질을 제거하여 수화되지 않은 불순물을 제거하였다.

상기와 같은 방법으로 제조된 본 발명의 마이셀은 평균 입자 직경이 60nm 내지 70nm일 수 있다. 참고로, 마이셀의 입자 크기가 100nm 미만인 경우 망상내피계(reticuloendothelial system, RES)에 의한 식균 작용 및 흡수를 피할 수 있기 때문에, 이에 따라 체순환이 연장될 수 있다. 따라서 본 발명의 마이셀은 입자크기가 충분히 작아 망상내피계에 의한 식균 작용 및 흡수를 피할 수 있는바, 체내에 오래 머무를 수 있어, 전달하고자 하는 약물(펜벤다졸)의 생체이용률을 높일 수 있다.

본 발명에서 용어 “가용화”라 함은, 계면활성제와 같은 물질의 존재에 의해 물에 잘 녹지 않는 물질의 용해도가 증가하는 현상을 의미한다.

본 발명의 펜벤다졸 화합물의 가용화 조성물은 수난용성 약물인 펜벤다졸 화합물이 폴리비닐 카프로락탐-폴리비닐 아세테이트-폴리에틸렌 글리콜 그래프트 공중합체(PCL-PVAc-PEG)에 봉입됨으로써 물에 대한 용해도가 개선되는 특징을 갖는다.

본 발명의 펜벤다졸 화합물의 가용화 조성물은 4℃ 내지 37℃ 온도 조건에서 장기간 변질 없이 안정적인 특성을 갖는다.

또한, 본 발명은 a) 펜벤다졸(Fenbendazole) 및 폴리비닐 카프로락탐-폴리비닐 아세테이트-폴리에틸렌 글리콜 그래프트 공중합체(PCL-PVAc-PEG)를 t-부탄올에 용해시킨 후 증류수를 첨가하고 혼합하는 단계; b) 혼합물을 동결건조하는 단계; c) 동결건조된 혼합물에 증류수를 첨가하여 혼합물을 수화(hydration)시키는 단계; 및 d) 수화(hydration)된 용액을 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계를 포함하는, 펜벤다졸 화합물의 가용화 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 상기 a) 단계에서 펜벤다졸(Fenbendazole) 및 폴리비닐 카프로락탐-폴리비닐 아세테이트-폴리에틸렌 글리콜 그래프트 공중합체(PCL-PVAc-PEG)는 1:50 내지 1:100 중량비로 혼합될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 펜벤다졸 화합물의 가용화 조성물을 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세 결정성셀룰로스, 폴리비닐피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있으며, 바람직하게는 정맥 주사용 액제가 좋다.

본 발명의 약제학적 조성물의 유효성분인 펜벤다졸 화합물의 가용화 조성물은 난용성 물질인 펜벤다졸 화합물은 수층에 녹아들 수 있게 하여 물을 이용한 정맥 주사제로 개발될 수 있다. 특히, 4℃ 내지 37℃ 온도 조건에서 장기간 변질 없이 안정적인 특성을 갖는바, 본 발명의 약제학적 조성물은 정맥 주사용 제제로 유용하게 사용될 수 있다. 정맥 주사는 경구 투여 제형에 비하여 간 초회통과효과를 회피할 수 있어 불필요한 약물의 손실을 줄일 수 있으며, 경구 투여 제형에 비하여 생체이용률 또한 높일 수 있어 동일한 양의 약물로 높은 효과를 기대할 수 있는 효과적인 투여 방법이므로 이러한 제형의 개발은 펜벤다졸 화합물의 효과적인 투여를 가능하게 한다.

본 발명의 약제학적 조성물이 정맥 주사용 제제인 경우 일반적으로 정맥주사 제제 조성물에 포함되는 약제학적 성분들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 정맥주사 제제 조성물은 아미노산, 당, 지질, 비타민, 전해질, pH 조정제, 안정화제, 삼투압 조정제 및 용해보조제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 아미노산 주사용 수액제, 당 주사용 수액제, 또는 지질 주사용 수액제의 구체적인 조성은 당업계에 잘 알려져 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 약제학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 치료효과를 나타낼 수 있는 암의 종류로는, 유방암, 대장암, 자궁암, 나팔관암, 난소암, 위암, 뇌암, 두경부암, 직장암, 소장암, 식도암, 임파선암, 담낭암, 폐암, 비소세포폐암, 교모세포종, 피부암, 신장암, 방광암, 혈액암, 췌장암, 전립선암, 갑상선암, 내분비선암, 구강암, 간암 및 혈액암 등을 예시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류에 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

1. 재료 및 방법

재료 및 시약

Soluplus^® (폴리비닐 카프로락탐-폴리비닐 아세테이트-폴리에틸렌글리콜 그래프트 공중 합체 (PCL-PVAc-PEG))는 BASF (Ludwigshafen, Rhineland-Palatinate, Germany)로부터 수득하였다. 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(d, 1-락타이드) (mPEG [4000]-b-PLA [2200])는 Advanced Polymer Materials, Inc. (Montreal, QC, Canada)에서 구입하였다. 폴리(에틸렌 옥사이드-b-ε-카프로 락톤) (PEO [5000] -b-PCL [10000])은 Polymer Source, Inc. (Montreal, QC, Canada)에서 구입하였다. Pluronic^® F127은 Sigma-Aldrich Corp. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Dulbecco의 DPBS (phosphate-buffered saline)와 트립신은 Corning Inc. (Corning, NY, USA)에서 구입하였다. 에탄올(EtOH) 및 아세토니트릴(ACN)은 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)에서 구입하였다. 증류수는 Tedia (Fairfield, OH, USA)에서 구입하였다. 펜벤다졸(bendazole, 이하 ‘FEN’이라 약칭함), MTT(Thiazolyl blue tetrazolium bromide), DMSO(Dimethyl sulfoxide), Polysorbate 80(Tween 80^®), DMA(dimethylacetamide) 및 Cremophor EL^®은 Sigma-Aldrich Corp.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 다른 모든 시약은 최소한 분석 또는 HPCL 등급을 사용하였다.

펜벤다졸-로딩된 마이셀 제조

펜벤다졸이 로딩된 고분자마이셀은 동결 건조법에 의해 4 가지 고분자(mPEO-b-PCL, mPEG-b-PLA, Pluronic F127^®, Soluplus^®)로부터 제조되었다.

간략하게는, 1mg의 펜벤다졸과 100mg의 폴리머를 1mL의 tert-부탄올에 용해시키고 60℃의 예열된 물에서 1분 동안 교반하였다. 이후 1mL의 증류수를 첨가하고 혼합물을 1분 동안 볼텍싱하였다. 혼합물을 -70℃에서 1시간 동안 빠르게 동결시키고, 동결건조기(Advantage Pro; SP Scientific, Warminster, PA, USA)에 넣고 24 시간 동안 동결 건조시켰다. 그런 다음 60℃에서 1 mL의 증류수를 첨가하여 혼합물을 수화시켰다. 용액을 4℃(한일 사이언스(주), 김포)에서 16,600 x g에서 5분 동안 원심분리하여 상층액만을 수득하였다. 0.2 μm 기공 크기의 비발열성 멸균 주사기 필터(Corning, NY, USA)를 사용하여 상층액에 남아있는 잔해물을 추가로 제거하고 멸균 상태를 유지하였다.

본 발명의 동결 건조법을 이용한 펜벤다졸-로딩된 마이셀 제조과정은 도 1에서 자세히 나타내었다.

고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 분석

펜벤다졸의 농도 분석을 위해 HPLC 시스템을 사용하였다. 인 비트로(in vitro) 및 인 비보(in vivo) 분석으로부터 수득된 샘플에서의 펜벤다졸의 농도는 Waters 2695 분리 모듈 및 Waters 2996 포토 다이오드 어레이가 장착된 Waters 고성능액체크로마토그래피 (HPLC) 시스템 (Waters, Milford, MA, USA)을 사용하여 측정하였다. The Fortis C18 크로마토그래피 컬럼 (5um, 4.6 × 250 mm)을 사용하였으며, 분석 동안 30℃에서 유지하였다. 펜벤다졸 및 제니스테인(내부 표준)은 아세토니크릴/물(70:30, v/v)로 구성된 이동상을 갖는 등용매 모드를 사용하여 용출하였다. 샘플 주입 볼륨은 10uL이었으며, 유동 속도는 이동상에서 1.0mL/min이었다. 제니스테인과 펜벤다졸의 체류 시간은 각각 3.4 분과 5.4 분이었으며, 피크 면적을 표준 곡선과 비교하여 농도를 계산하였다

마이셀의 물리화학적 특징

펜벤다졸이 로딩된 마이셀의 입자 크기는 동적광산란광도계(Dynamic light scattering, DLS)(Otsuka Electronics, Osaka, Japan)를 사용하여 측정하였다. 제조된 마이셀 용액을 측정 전에 10배 희석하였다. 측정 각도는 자동으로 선택되어 측면 산란 (90°)과 후면 산란 (175°) 사이에서 사용된다. 펜벤다졸이 로딩된 마이셀의 약물 로딩(DL, %) 및 캡슐화 효율(EE, %)은 HPLC 분석을 통해 측정하였으며, 다음 방정식을 이용하여 계산하였다.

DL% = (마이셀 단위의 약물 중량/공급 중합체 및 약물의 중량)×100

EE% = (마이셀 내 약물의 무게/공급 약물의 무게)×100

각 샘플 분석의 결과는 3 개의 개별 실험의 평균±표준편차(SD)로서 나타내었다.

투과전자현미경(Transmission Electron Microscopy, TEM) 연구

마이셀의 이미지는 투과전자현미경(TEM)(JEM-2100 Plus, JEOL, Tokyo, Japan)을 사용하여 얻었다. 희석된 마이셀 현탁액을 200 메쉬 포름바르 코팅된 구리 그리드(200-mesh formvar-coated copper grids)에 떨어뜨렸다. 적재 후, 건조 오븐에서 60℃에서 12 시간 동안 건조시켰다. 마지막으로 펜벤다졸이 로딩된 Soluplus^® 마이셀을 200kV에서 작동하는 TEM을 사용하여 측정하였다.

인 비트로( In Vitro ) 약물 방출 에세이

마이셀에서 펜벤다졸의 시험관내(In Vitro) 방출 거동을 336시간에 걸쳐 평가하였다. 이때, 방출 매질(release medium)로서 포스페이트 완충식염수(PBS, pH 7.4)를 이용한 투석법을 사용하여 평가하였다.

간략하게는, 펜벤다졸-로딩된 mPEG-b-PLA 마이셀 및 대조군인 펜벤다졸 용액(25% Cremophor EL^®/EtOH에 펜벤다졸(0.8mg/mL)이 용해된 용액) 샘플을, pre-wetted dialysis membrane bag (MWCO 20 kD)에 삽입하였다. 상기 pre-wetted dialysis membrane bag은 묶은 후, 37℃의 핫 플레이트 교반기 상에서 2.0L 방출 미디엄에 넣었다. 방출 미디엄을 8, 48, 120, 168, 216 및 288 시간 후에 새로운 배지로 교체하였다. 미리 결정된 시간 간격(0, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72, 168, 240 및 336 h)에서, 20L의 샘플을 수집하고, 아세토니크릴로 10배 희석한 다음, HPLC 분석을 통해 펜벤다졸의 농도를 측정하였다. 모든 실험은 세 번 반복하여 수행하였다.

인 비트로( In Vitro ) 세포독성 평가

A549 인간 비소세포폐암 세포주는 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. 세포 성장을 위한 배지는 다음과 같다. 암세포의 배양을 위해 90%의 RPMI-1640 배지(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 10% fetal bovine serum(FBS, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)에 1%의 페니실린 및 스트렙토마이신 (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)이 포함된 성장배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. A549 세포를 웰 당 5000개 세포의 밀도로 96-웰 플레이트에 분주하였다. 24 시간 후, 세포를 유리 펜벤다졸 약물(DMSO에 용해시킨 후 RPMI로 1000배 희석시킨 약물) 또는 펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀로 처리하였다. 처리된 마이셀의 초기 농도는 205.5 μM이었으며, 유리 펜벤다졸의 초기 농도는 33.4 μM이었다. 처리는 초기 농도 (n = 6)에서 10 배 희석하여 수행되었다. 48 시간의 인큐베이션 후, MTT 분석에 의해 세포 생존력을 평가하였다. 마이크로 플레이트 판독기(Spectra Max ID3, Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 사용하여 MTT 처리 4시간 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 데이터는 GraphPad Prism v. 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)로 처리되었다.

집락형성 분석법(clonogenic assay)

A549 세포를 웰 당 300개 세포의 밀도로 6-웰 플레이트에 접종하였다. 24 시간 후, 세포를 유리 펜벤다졸 약물(DMSO에 용해시킨 후 RPMI로 1000배 희석시킨 약물) 또는 펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀로 처리하였다. 약물 처리 14일(336 시간) 뒤 약물을 제거하고, 크리스탈 바이올렛 (0.5%)이 들어간 에탄올 수용액을 처리하여 30분간 방치한 다음, 깨끗한 물로 씻어내고 염색된 콜로니의 수를 카운팅하였다.

펜벤다졸-로딩된 Soluplus®의 마이셀 안정성 테스트

본 발명의 펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀의 온도에 따른 저장 안정성을 측정하기 위하여 냉장 보관 온도인 4℃, 실내 보관 온도인 25℃, 체온인 37℃ 환경에서 본 발명의 Soluplus^®로 제형화된 마이셀을 14일 동안 보관하여 마이셀 제제의 크기(Size)와 다분산 지수(PDI)를 측정하였다. 실험은 세 번 반복 수행하였다.

약물동태 연구

모든 동물 실험은 충북대학교 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았다(No. CBNUR-1407-20; 2020 년 7 월 23 일). 수컷 Sprague-Dawley 랫트(7 주령)는 Orient Bio Inc.(Seongnam, Korea)에서 구입하여 모든 동물 실험에 사용하였다. 랫트는 물과 음식에 자유롭게 접근할 수 있는 통풍 케이지에 보관하였다. 각 그룹별 랫트는 펜벤다졸 용액(25% Cremophor EL^®/EtOH에 펜벤다졸(0.8mg/mL)이 용해된 용액) 또는 펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀을 캐뉼러로 주입하고 정맥 주사하였다. 독성에도 불구하고 Cremophor EL^®/EtOH는 펜벤다졸 용액의 가용화제로 사용되었다. 약물 투여 후 2, 5, 15, 30, 60, 120, 240 및 480 분에 혈액을 채취하고 샘플을 3000rpm에서 5분 동안 원심 분리하여 혈장을 수득하였다. 항응고제로 헤파린을 사용하였고 대퇴 동맥을 통해 400 ~ 450 μL의 혈액을 채취하였다. 샘플은 즉시 동결시키고 분석할 때까지 -70℃에 보관하였다. 약동학적 분석을 위해 비구획적 모델을 사용하여 Soluplus^®로 제형화된 마이셀에서 펜벤다졸의 혈중농도-시간곡선하면적(concentration-time curve, AUC), 총 청소율(total clearance, CL_t), 겉보기 분포 용적(apparent volume of distribution, V_d), 초기 혈액 농도(initial blood concentration, C₀)와 같은 상대적인 파라미터를 계산하였다. 약동학적 매개 변수 계산을 위한 곡선 피팅(curve fitting)은 Sigma Plot V 10.0(Systat Software, San Jose, CA, USA)을 사용하여 수행되었다.

HPLC 분석을 위한 생물 시료 전처리

동결된 생물학적 샘플을 실온에서 해동시켰다. 혈장 샘플의 200㎕ 분취량을 아세토니트릴로 추출하고 20 μL의 제니스테인(내부표준)과 혼합하였다. 혼합물을 16,600 x g에서 4℃에서 5분 동안 원심분리하고 10 μL의 상청액을 HPLC 시스템에 주입하였다. 조직 샘플에서 펜벤다졸의 양은 균질화 방법을 사용하여 측정하였다. 간략하게는, 조직을 테프론 패슬(Teflon pestle)을 갖는 glass Potter-Elvehjem-type homogenizer로 균질화하였다. 상청액 중의 펜벤다졸의 농도를 상기에서 언급한 HPLC 분석 방법으로 측정하였다.

마이셀의 생체 내 분포

생체 분포 연구는 펜벤다졸 용액(25% Cremophor EL^®/EtOH에 펜벤다졸(0.8mg/mL)이 용해된 용액) 또는 펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀을 랫트에 정맥 주사한 후 수행되었다. 실험은 시간적 변화를 관찰하기 위해 두 번 수행되었다(n = 3). 랫트는 첫 번째 주사 후 1 시간과 8 시간 후에 이산화탄소(CO₂)를 사용하여 안락사시키고, 신장, 간, 심장, 비장 및 폐를 절제하였다. 조직 샘플을 DPBS(식염수)로 세척하고, 종이 타월로 닦아 과량의 유체를 제거하고, 무게를 측정한 다음, 분석할 때까지 약 -70℃에서 보관하였다.

인 비보( In Vivo ) 독성 에세이

5개의 마우스 그룹 (그룹당 n = 6)을 사용하여 생체 내 독성을 평가하였다. 각 그룹의 래트는 Dulbecco’s phosphate-buered saline(DPBS, 대조군), 2 mg/kg 펜벤다졸을 포함하는 25% Cremophor EL^®/EtOH 용액, 2 mg/kg 펜벤다졸을 포함하는 25% 폴리소르베이트 80(Tween 80^®) 용액, 2 mg/kg 펜벤다졸을 포함하는 25% 디메일아세트아미이드 용액, 2 mg/kg 펜벤다졸을 포함하는 펜벤다졸-로딩된 soluplus^® 마이셀을 정맥 주사하였다. 모든 그룹의 체중 변화는 2일에 1회 총 14일 동안 모니터링하였다. 정맥 주사는 0일, 4일 및 8일에 수행되었다. 제형의 독성은 체중 감소(10 % 초과), 비정상적인 행동, 불편의 징후 또는 사망으로 정의되었다. 체중 변화를 정규화하여 백분율로 표시하였다. 독성 시험에서 병이 많은 것으로 판단 된 쥐를 안락사시켰다.

통계분석

모든 데이터는 평균±표준편차(SD)로 나타내었다. 분산 파라미터는 평균±표준오차(SE)로 표현하였다. 스튜던트 t- 검정을 사용하여 통계 분석을 수행하였고, p <0.05 또는 <0.01 (각각 95 % 및 99 % 신뢰 수준)에서 통계학적 유의성이 있는 것으로 평가되었다.

2. 결과

펜벤다졸-로딩된 마이셀의 물리화학적 특성

다양한 중합체(mPEO-b-PCL, mPEG-b-PLA, Pluronic F127^®, Soluplus^®)를 사용하여 제조된 펜벤다졸-로딩된 마이셀 각각의 EE(%), DL(%) 및 입자 직경을 측정하였으며, 이를 하기 표 1에서 자세히 나타내었다. 마이셀 제제의 입자 크기는 동적광산란광도계(Dynamic light scattering, DLS)로 측정하였다.

펜벤다졸-로딩된 마이셀의 특성(n=3, 평균±표준편차(SD)

중합체 양 (mg)	펜벤다졸 양 (mg)	입자 크기 (nm)	다분산지수 (PDI)	제타 전위(mV)	캡슐화 효율 (EE%)	약물 로딩 (DL %)
mPEO-b-PCL 100 mg	1.0	96.8±3.8	0.14±0.01	-0.4±0.1	24.7±2.0	0.2±0.02
mPEG-b-PLA 100 mg	1.0	347.7±40.4	0.26±0.04	-9.5±2.1	56.8±2.8	0.6±0.03
Pluronic F127^® 100 mg	1.0	1566.5±157.8	0.23±0.09	-4.6±0.1	N.D.^a	N.D.^a
Soluplus^® 100 mg	1.0	68.3±0.6	0.01±0.02	-2.3±0.2	85.3±2.9	0.8±0.03

^aN.D., not detectable.

그 결과 표 1 및 도 2에서 나타낸 바와 같이, 펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀의 평균 입자 크기는 68.3 nm인 것으로 나타났다. 반면에, mPEG-b-PLA, Pluronic^® F127 및 mPEO-b-PCL로 제조된 다른 중합체 마이셀은 평균 입자 크기가 훨씬 더 큰 것으로 나타났다. 특히, Pluronic^® F127 및 mPEG-b-PLA는 마이셀의 입자 크기가 300nm를 초과하는 것으로 나타나, 나노 입자 속성을 갖지 않으므로, 약물 전달을 위한 제형으로 적합하지 않은 것을 확인할 수 있었다. 또한 TEM을 사용하여 Soluplus^® 마이셀 형성을 확인했다. ImageJ 소프트웨어로 측정한 TEM 이미지의 평균 입자 크기는 65.6±26.2 nm인 것으로 나타났다.

한편, 펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀은 상대적으로 높은 캡슐화 효율(EE, 85.3±2.9.0 %) 및 약물 로딩(DL, 0.8±0.03 %) 값을 보였으며, 반면에, 펜벤다졸-로딩된 mPEO-b-PCL 마이셀 및 펜벤다졸-로딩된 Pluronic F127^® 마이셀은 캡슐화 효율(EE%)과 약물 로딩(DL%) 값이 매우 낮거나, 검출되지 않는 것으로 나타났다.

참고로, 종양에서 마이셀과 같은 나노 약물 전달 시스템은 주로 향상된 투과성 및 보유 효과를 통해 종양에 축적된다. 입자 크기가 50-60 nm인 마이셀은 일반적으로 종양 조직에 침투하는 능력이 뛰어나며 또한, 마이셀의 입자 크기가 100nm 미만인 경우 망상내피계(reticuloendothelial system, RES)에 의한 식균 작용 및 흡수를 피할 수 있기 때문에, 이에 따라 체순환이 연장될 수 있다. 따라서 마이셀의 입자 크기가 충분히 작아 망상내피계에 의한 식균 작용 및 흡수를 피할 수 있는 경우, 체내에 오래 머무를 수 있어, 전달하고자 하는 약물의 생체이용률을 높일 수 있다.

결과적으로, 마이셀의 상대적으로 높은 캡슐화 효율(EE%) 및 약물 로딩(DL%) 값과 더불어, 마이셀의 입자 직경과 항암 효과 사이의 상기와 같은 관계를 고려하였을 때, 펜벤다졸이 로딩된 Soluplus® 마이셀이 최종 제형 후보로 고려되었다.

인 비트로( In Vitro ) 약물 방출 프로파일

펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀 및 펜벤다졸 용액(25% Cremophor EL^®/EtOH에 펜벤다졸(0.8mg/mL)이 용해된 용액)의 약물 용출 정도를 시험관 수준에서 측정하였다. pH 7.4의 PBS를 이용한 용출 시험을 체온과 같은 섭씨 37℃에서 336시간까지 시행하였다.

그 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이, 펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀 및 펜벤다졸 용액의 약물 방출은 6시간이 경과했을 때 각각 12.9%, 46.3%에 도달하였다. 72 시간 이하에서 펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀의 경우 50.4 %, 펜벤다졸 용액의 경우 75.1%였다. 처음 168 시간 동안 펜벤다졸 용액은 펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀 대비 두드러지게 빠르게 약물을 방출한 것으로 나타났다.

이러한 결과는 본 발명의 Soluplus® 마이셀 담체가 난용성 약물인 펜벤다졸을 가용화시킬 뿐만 아니라 약물의 빠른 방출을 제한하는 것을 보여주는 것이다.

인 비트로( In Vitro ) 상에서 펜벤다졸-로딩된 Soluplus® 마이셀의 암세포 처치 후 효능평가

인 비트로(in vitro) 상에서의 암세포 사멸 효과를 입증하기 위하여 MTT assay를 시행하였다.

그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이, 유리 펜벤다졸 약물(펜벤다졸을 DMSO에 용해시킨 후 RPMI로 1000배 희석시킨 약물)을 처리한 경우 IC₅₀값이 2707nM로 측정되었으며(도 4a 참조), 펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀을 처리한 경우 IC₅₀ 값이 3070nM인 것으로 나타났다(도 4b 참조). IC₅₀ 값은 약물 반응을 수치화하는 방법 중 하나로, 약물을 투여하였을 때 세포의 활성도가 절반으로 떨어지는 순간의 최대 농도를 가리킨다.

참고로, 커큐민은 IC₅₀ 범위가 5.43-108.69 μM이며, 17-AAG의 IC₅₀ 범위는 0.1-2.37 μM인 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명의 마이셀의 경우 IC₅₀ = 3070nM (3.07 μM)에 해당하는바, 충분한 항암 효능을 가지고 있다고 판단된다.

한편, DMSO(Dimethyl sulfoxide)는 세포 실험에 있어서 난용성 물질을 녹이는데 많이 사용되는 유기용매로서, 독성이 강하여 실질적으로 인체 적용되는 약물에 적용하기에는 어려운 문제점이 있다. 이와는 대조적으로 본 발명의 마이셀은 수난용성 약물인 펜벤다졸을 soluplus^® 소재에 봉입하여 물에 잘 녹을 수 있도록 함으로써, 인체 안전한 특성을 갖는다.

집락형성 분석법(clonogenic assay)

또한, 인 비트로(in vitro) 상에서의 암세포에 대한 치료의 장기 억제 효과를 결정하기 위해 집락형성 분석을 수행하였다.

그 결과 도 5에서 나타낸 바와 같이, 약물을 1740μM 농도로 처리하였을 때, 콜로니가 형성되지 않는 것을 확인하였다. 한편, 174μM 농도의 마이셀 처리 군에서 콜로니 형성이 약간 억제되는 것으로 나타났으나, 17.4 μM 농도에서는 콜로니 형성을 거의 억제시키지 못하는 것으로 나타났다.

펜벤다졸-로딩된 Soluplus® 마이셀의 안정성 테스트

실제로 제품이 제작되었을 때 유통과정이나 보관환경에서의 물리화학적 안전성을 실험하기 위하여 2주 동안 3가지 온도(섭씨 4℃, 25℃, 37℃)에서 나노입자의 크기와 분포(PDI)를 확인하였다.

그 결과, 도 6에서 나타낸 바와 같이, 펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀은 4℃, 25℃ 및 37℃에서 2주 동안 안정적인 것으로 나타났다. 모든 경우에 마이셀 제제의 크기(Size)는 ≤100nm이고 다분산 지수(PDI)는 ≤0.3이었다.

이와 같은 결과를 통해, 펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀이 냉장고 또는 실온에서 적어도 14일 동안은 저장될 수 있음을 시사한다. 또한, 37℃에서 14일 동안 안정한 것으로 나타나, 생체 내에서의 안정성 관점에서 주사 후 신체에서 마이셀이 안정할 수 있음을 확인하였다.

랫트에서 펜벤다졸이 로딩된 Soluplus® 마이셀의 약물동태학

펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀 또는 펜벤다졸 용액(25% Cremophor EL®/EtOH에 펜벤다졸(0.8mg/mL)이 용해된 용액)의 랫트에 정맥 주사한 후, 시간 경과에 따른 혈중 내 약물의 농도 변화를 분석하였다.

그 결과 도 7에서 나타낸 바와 같이, 펜벤다졸 용액과 펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀을 랫트에 정맥 주사한 후 혈장에서 펜벤다졸 농도가 급격히 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀은 주사 2 시간 후 검출된 반면, 펜벤다졸 용액은 1 시간 이내에서만 검출되었다. 펜벤다졸 용액 주사 후 2 시간이 경과한 시점에 펜벤다졸 혈장 농도는 검출한계(limitation of detection, LOD)보다 낮은 것으로 나타나, 펜벤다졸 용액이 검출되지 않았다.

상기와 같은 결과를 통해, 본 발명 펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀의 긴 순환 시간 및 펜벤다졸의 지속적인 방출이 혈액에서 상기 약물의 장시간 보유에 기여하는 것을 알 수 있었다.

비구획 모델을 사용하여 약동학적 파라미터를 계산하였다.

그 결과 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 마이셀 제형의 경우 펜벤다졸 용액보다 혈중농도-시간곡선하면적(concentration-time curve, AUC) 및 초기 혈액 농도(initial blood concentration, C₀)는 값이 약 1.5 배 및 2 배 이상 높은 것을 확인할 수 있었다. 또한 펜벤다졸의 총 청소율(total clearance, CL_t) 및 겉보기 분포 용적(apparent volume of distribution, V_d) 값은 펜벤다졸 용액에 비해 마이셀 제형에서 각각 1.4 배, 2 배 이상 낮은 것으로 나타났다.

이러한 결과는, 본 발명의 펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀이 혈액 순환 시간을 유의적으로 증가시키고, 펜벤다졸의 혈장 청소율을 감소시키는 것을 나타내는 것이다.

펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀 및 펜벤다졸 용액의 정맥 주사 후 펜벤다졸의 약물동태학적 파라미터

Parameters	FEN Solution	FEN-Loaded Soluplus^® Micelle
AUC^a(min·μg·mL^-1)	156±2.6	234±56.9
C_O ^b(μg·mL^-1)	2.2±0.3	5.1±0.2
CL_t ^c(mL·kg^-1·min)	12.8±0.2	9.0±1.9
V_d ^d(mL·kg^-1)	906±112	393±12.9

^aAUC, area under the curve; ^bC0, plasma concentration at time 0; ^cCLt, total clearance; ^dVd, volume of distribution.

랫트에서 마이셀의 생체 내 분포

펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀 또는 펜벤다졸 용액(25% Cremophor EL^®/EtOH에 펜벤다졸(0.8mg/mL)이 용해된 용액)의 랫트에 정맥 주사한 후, 8시간이 경과하였을 때, 주요 기관에서 펜벤다졸의 약물 양을 측정하였다.

그 결과 도 8에서 나타낸 바와 같이, 펜벤다졸은 주로 간과 폐에 많이 분포한다는 것을 확인 할 수 있었으며, 이를 통해 본 제제가 간이나 폐를 주로 표적하는 약물로 개발될 경우 보다 효율적인 제제가 될 것으로 예상된다.

자세하게는, 약물 투여 후 1 시간이 경과한 시점에 약물의 장기 분포는 비장을 제외한 다른 모든 장기에서, 펜벤다졸 용액보다 펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀에서 더 낮게 측정되었다. 한편, 약물 투여 후 8 시간이 경과한 시점에, 펜벤다졸 용액과 펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀 모두 모든 기관에서 LOD 아래에 존재하였다. 특히, 펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀 투여한 경우 대비, 펜벤다졸 용액을 투여한 실험군에서, 1 시간 후 폐에서 훨씬 더 많은 양의 약물이 검출되었다. 또한 장기가 확보되었을 때 일부 용혈이 폐에서 관찰되었다(데이터는 표시되지 않음).

인 비보( in vivo ) 독성 에세이

본 실험에서는 생체 내에서 펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀의 독성을 평가하였다. DPBS(Dulbecco’s phosphate-buered saline)를 대조군으로 사용하였으며, 펜벤다졸을 포함하는 25% Cremophor EL^®/EtOH 용액, 펜벤다졸을 포함하는 25% 폴리소르베이트 80(Tween 80^®) 용액, 펜벤다졸을 포함하는 25% 디메일아세트아미이드 용액, 펜벤다졸-로딩된 soluplus^® 마이셀을 랫트에 여러 번 주사한 후 그룹별 랫트의 체중 변화를 측정하였다.

그 결과 도 9에서 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀 처리군에서 100 % 생존율을 보여주었으며, 더 높은 체중을 나타내었다. 한편, 펜벤다졸을 포함하는 25% 폴리소르베이트 80(Tween 80^®) 용액 및 펜벤다졸을 포함하는 25% Cremophor EL^®/EtOH 용액을 투여한 그룹에서 6일에 각각 1 마리의 쥐가 가용화제의 누적 독성으로 인해 사망하였다. 또한, 펜벤다졸을 포함하는 25% 디메일아세트아미이드 용액을 주사한 그룹에서 10일째에 3 마리의 랫트가 사망하였다. 2주 후, 펜벤다졸을 포함하는 25% 디메일아세트아미이드 용액을 주사한 그룹은 절반의 쥐가 살아남았으며, 펜벤다졸을 포함하는 25% Cremophor EL^®/EtOH 용액을 투여한 그룹에서는 4 마리의 쥐가 살아남았고, 펜벤다졸을 포함하는 25% 폴리소르베이트 80(Tween 80^®) 용액을 투여한 그룹에서는 한 마리가 쥐가 살아남은 것을 확인하였다. 반면에, 본 발명의 펜벤다졸-로딩된 Soluplus® 마이셀 투여한 그룹과 대조군에서는 모든 동물이 생존한 것으로 나타났다.

상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 펜벤다졸-로딩된 Soluplus^® 마이셀의 경우 생체 내 독성을 유발하지 않음에 따라, 종래 가용화제에 따른 독성 문제를 해결할 수 있음을 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

FEN: Fenbendazole
mPEG-b-PLA: methoxy poly(ethylene glycol)-b-poly(d,l-lactide)
PEO-b-PCL: Poly(ethylene oxide-b-ε-caprolactone)
DPBS: Dulbecco’s phosphate-buered saline
PCL-PVAc-PEG: Polyvinyl caprolactam-polyvinyl acetate-polyethylene glycol graft copolymer

Claims

펜벤다졸(Fenbendazole) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 봉입된 폴리비닐 카프로락탐-폴리비닐 아세테이트-폴리에틸렌 글리콜 그래프트 공중합체(PCL-PVAc-PEG) 마이셀을 유효성분으로 포함하는, 펜벤다졸 화합물의 가용화 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 수난용성 약물인 펜벤다졸(Fenbendazole) 화합물이 폴리비닐 카프로락탐-폴리비닐 아세테이트-폴리에틸렌 글리콜 그래프트 공중합체(PCL-PVAc-PEG)에 봉입됨으로써 물에 대한 용해도가 개선되는 것을 특징으로 하는, 펜벤다졸 화합물의 가용화 조성물.
제1항에 있어서,
상기 마이셀은 60nm 내지 70nm의 입자크기를 갖는 것을 특징으로 하는, 펜벤다졸 화합물의 가용화 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 4℃ 내지 37℃ 온도 조건에서 장기간 변질 없이 안정적인 것을 특징으로 하는, 펜벤다졸 화합물의 가용화 조성물.
a) 펜벤다졸(Fenbendazole) 및 폴리비닐 카프로락탐-폴리비닐 아세테이트-폴리에틸렌 글리콜 그래프트 공중합체(PCL-PVAc-PEG)를 t-부탄올에 용해시킨 후 증류수를 첨가하고 혼합하는 단계;
b) 혼합물을 동결건조하는 단계;
c) 동결건조된 혼합물에 증류수를 첨가하여 혼합물을 수화(hydration)시키는 단계; 및
d) 수화(hydration)된 용액을 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계를 포함하는, 펜벤다졸 화합물의 가용화 조성물의 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 펜벤다졸(Fenbendazole) 및 폴리비닐 카프로락탐-폴리비닐 아세테이트-폴리에틸렌 글리콜 그래프트 공중합체(PCL-PVAc-PEG)는 1:50 내지 1:100 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는, 펜벤다졸 화합물의 가용화 조성물의 제조방법.
제1항의 펜벤다졸 화합물의 가용화 조성물을 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제7항에 있어서,
상기 약제학적 조성물은 정맥 주사용 제제인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제8항에 있어서,
상기 약제학적 조성물은 아미노산, 당, 지질, 비타민, 전해질, pH 조정제, 안정화제, 삼투압 조정제 및 용해보조제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 성분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제7항에 있어서,
상기 암은 유방암, 대장암, 자궁암, 나팔관암, 난소암, 위암, 뇌암, 두경부암, 직장암, 소장암, 식도암, 임파선암, 담낭암, 폐암, 비소세포폐암, 교모세포종, 피부암, 신장암, 방광암, 혈액암, 췌장암, 전립선암, 갑상선암, 내분비선암, 구강암, 간암 및 혈액암으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.