CN1834104A

CN1834104A - 一类抗粘附活性的乳糖簇及其荧光标记物

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Publication number: CN1834104A
Application number: CN 200610078665
Authority: CN
Inventors: 李中军; 李庆; 赵致辉; 孟祥豹
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2006-04-30
Filing date: 2006-04-30
Publication date: 2006-09-20
Anticipated expiration: 2026-04-30
Also published as: CN100497363C

Abstract

本发明涉及一类新的乳糖簇和其荧光标记物，及其制备方法和在制备抗粘附、抗休克药物及作为分子探针在生物学研究中的用途。该类化合物能够有效地抑制内皮细胞和白细胞的粘附，减轻休克的程度，延长存活时间，可作为抗炎、抗休克药物用于重症休克病人的抢救和治疗。部分糖簇的荧光标记物，可作为分子探针用于粘附位点的研究。

Description

一类抗粘附活性的乳糖簇及其荧光标记物

技术领域：

本发明涉及一类新的乳糖簇和其荧光标记物，及其制备方法和在制备抗粘附、抗休克药物及作为分子探针在生物学研究中的用途。该类化合物能够有效地抑制内皮细胞和白细胞的粘附，减轻休克的程度，延长存活时间，可作为抗炎、抗休克药物用于重症休克病人的抢救和治疗。其荧光标记物，可作为分子探针用于粘附位点的研究。

背景技术：

白细胞-内皮细胞的相互作用在许多生理和病理过程中起重要作用，例如，炎症反应、血栓、动脉粥样斑块形成等。而白细胞-内皮细胞的粘附在失血性休克中同样起着重要作用^[1-9]。创伤、烧伤引起的重症休克是平时和战常见的病理过程，是造成病人死亡和部队战时减员的主要原因之一。目前对休克发生机理的研究已由细胞、亚细胞水平进入分子水平；研究证实，白细胞粘附于微血管不仅会减少组织的器官和血流量而且会游出造成进一步的损伤，是造成休克不可逆的主要原因之一。因此，减少休克时粘附于微血管的白细胞数量，就有可能使休克减轻，为综合救治创造机会^[10-12]。已经有报道表明，乳糖具有抗粘附活性，一些乳糖的衍生物也已被证实有抑制白细胞-内皮细胞黏附的功能。为了进一步研究糖簇效应和连接臂的长短对抗粘附效应的影响，一些多价的乳糖已经合成，另外，荧光标记的多价乳糖衍生物，也已经合成出来并作为荧光性探针用于粘附机理的研究。

发明内容：

本发明制备了以不同连接臂缀合的乳糖簇用于抗粘附、抗休克活性研究，这些连接臂包括聚乙二醇、2-氨基-1，3-丙二醇及多元羧酸。在相应的糖簇化合物预留出氨基，缀以荧光素，将其作为小分子探针用于白细胞-内皮细胞粘附位点等作用机制的研究。

合成的化合物可以用下列通式表示：

R₁选自聚乙二醇、2-氨基-1，3-丙二醇及多元羧酸中的一种或几种。

其中m为2、4、6。

其中m为2、4、6。

溴代-2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖与聚乙二醇(PEG，n＝4，5，6)在无水CH₂Cl₂中，Ag₂CO₃为催化剂，室温下反应即得到相应的二价乳糖1，2，3，收率60-70％。

由2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖与2-叠氮甘油在无水CH₂Cl₂中，BF3·OEt₂为催化剂，室温下反应制得二价乳糖4，收率86％。然后在EtOAc-EtOH(1∶1)中用Pd(OH)₂/C催化氢化得到化合物5，5作为糖单元用于糖簇的合成。

5与连接臂反应，例如丁二酸，辛二酸，均苯三酸在无水四氢呋喃中，在HOBt和DCC存在下偶联得到四，六价乳糖6，7，8。收率70-88％。

四价乳糖9由5与Cbz保护的谷氨酸反应制得，化合物9在CH₃OH中用Pd/C催化氢化以94％的收率得到10。5或10与FITC(荧光素-5-异硫氰酸)在无水CH₂Cl₂和DMF中，40℃反应6～8小时，便成功地在糖簇中引入了荧光功能基团，收率95～96％。

将糖簇1，2，3，5，6，7，8，9，10，11和12用CH₃ONa/CH₃OH处理得到目标化合物13，14，15，16，17，18，19，20，21和22，收率94-98％.

附图说明

图1化合物16和20对烧伤休克大鼠白细胞与内皮细胞粘附的影响

图2化合物16和20对烧伤休克大鼠存活时间的影响

图3化合物21的粘附结果

图4化合物22的粘附结果

具体实施方式

实施例1.3，6，9-三氧杂-1，11-二O-二-[2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基]十二烷-1

1-溴代-2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖(0.2g，0.29mmol)和PEG(n＝4，0.02g，0.10mmol)溶于无水CH₂Cl₂(10mL)中，加入Ag₂CO₃(0.08g)和4分子筛(0.1g)，室温搅拌20小时。过滤混合物，用CH₂Cl₂稀释，水洗，无水Na₂SO₄干燥，蒸除溶剂。粗产品用柱层析纯化，石油醚(60-90℃)∶乙酸乙酯＝1∶3。得无色糖浆。收率70％。[α]_D＝+30.3°(c＝0.66，CH₃Cl)；¹HNMR(CD₃Cl)δ：5.35(d，1H，H-4′)，5.16(t，1H，H-3)，5.09(dd，1H，H-2′)，4.97(dd，1H，H-3′)，4.86(t，1H，H-2)，4.56(d，1H，J_1，2＝7.80Hz，H-1)，4.49(d，1H，J_1′，2′＝9.00Hz，H-1′)，4.51，4.22～4.08(m，4H，H-6a，b，H-6a′，b′)，3.90～3.61(m，11H，H-4，5，H-5′，-CH₂O-)，2.15～1.97(7s，21H，7CH₃CO-)；¹³CNMR(CD₃Cl)δ：170.4～169.0(7C，CH₃C＝O)，101.0(C-1′)，100.5(C-1)，76.2(C-4)，72.7(C-3)，72.5(C-5)，71.5(C-2)，71.0(C-5′)，70.6(C-3′)，70.5(-CH₂O-)，70.1(-CH₂O-)，69.9(-CH₂O-)69.0(-CH₂O-)，68.7(C-2′)，66.5(C-4′)，63.5(C-6′)，60.7(C-6)，20.9～20.4(7C，7CH₃CO-).

实施例2.3，6，9，12-四氧杂-1，14-二-O-二-[2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基]十六烷-2化合物2的制备同1，以PEG(n＝5)为连接臂，粗产品用柱层析纯化，石油醚(60-90℃)∶乙酸乙酯＝2∶7。得无色糖浆。收率63％。

实施例3.3，6，9，12，15-五氧杂-1，17-二-O-二-[2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基]二十烷-3化合物3的制备同1，以PEG(n＝6)为连接臂，粗产品用柱层析纯化，石油醚(60-90℃)∶乙酸乙酯＝1∶4。得无色糖浆。收率60％。

实施例4.2-叠氮基-1，3-二-O-二-[2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三--O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基]丙烷4-2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-1，2，3，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖(5.1g，7.52mmol)及2-叠氮-1，3-丙二醇(0.4g，3.42mmol)溶于无水CH₂Cl₂(10mL)中，加入BF₃·OEt₂(0.2mL)，室温搅拌24小时。混合物用CH₂Cl₂(20mL)稀释后，依次用饱和碳酸氢钠水溶液和水洗涤，无水Na₂SO₄干燥，蒸除溶剂。粗产品用柱层析纯化，石油醚(60-90℃)∶丙酮3∶2，得无色糖浆。收率86％。

实施例5.2-氨基-1，3-二-O-二-[2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三--O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基]丙烷5——化合物4(1g，0.74mmol)溶于乙酸乙酯-乙醇(1∶1，20mL)，加入Pd(OH)₂(100mg)，室温下催化氢化(0.4MPa)6小时，滤除催化剂，蒸除溶剂。粗产品用柱层析纯化，石油醚(60-90℃)∶丙酮2∶3，。得无色糖浆。收率92％。[α]²⁵ _D-18.65°(c 1.93，CHCl₃).¹HNMR(CD₃Cl)δ：5.35(d，1H，H-4′)，5.18(t，1H，H-3)，5.10(dd，1H，H-2′)，4.96(dd，1H，H-3′)，4.89(t，1H，H-2)，4.49(d，2H，J_1，2＝8.10Hz，H-1)，4.44(d，1H，J_1′，2′＝8.40Hz，H-1′)，4.46，4.12～4.08(m，4H，H-6a，b，H-6a′，b′)，3.91～3.43(m，6H，H-4，5，H-5′，-CH₂O-，-CHNH₂-)，2.17～1.92(7s，21H，7CH₃CO-)；¹³CNMR(CD₃Cl)δ：170.2～168.9(7C，CH₃C＝O)，100.9(C-1′)，100.7(C-1)，76.0(C-4)，72.6(C-3)，72.1(C-5)，71.5(C-2)，70.8(C-5′)，70.5(C-3′)，69.0(-CH₂O-)，68.7(C-2′)，66.5(C-4′)，61.7(C-6′)，60.7(C-6)，50.5(-CHNH₂-)，20.7～20.4(7C，7CH₃CO-).

实施例6.N-{2-[1，3-二-O-二-[2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三--O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-丁二酰胺6-丁二酸(0.02g，0.17mmol)溶于无水THF(3mL)，冷却至0℃，然后加入HOBt(0.07g，0.51mmol)和DCC(0.11g，0.51mmol)。0℃下搅拌0.5小时，化合物5(0.4g，0.34mmol)的THF溶液(5mL)用N-甲基吗啡啉将溶液调至pH＝8～9后加入反应瓶中，混合物在0℃下搅拌2小时后于室温下搅拌36小时，蒸除溶剂，加入CH₂Cl₂(10mL)，滤去不溶物，溶液依次用10％的柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤，无水Na₂SO₄干燥，蒸除溶剂。粗产品用柱层析纯化，石油醚(60-90℃)∶丙酮2∶3。得无色糖浆(0.35g)，收率85％。[α]²⁵ _D-19.75°(c1.62，CHCl₃)；¹HNMR(CD₃Cl)δ：6.14(d，1H，-NHCO)，5.36(d，1H，H-4′)，5.20(t，1H，H-3)，5.13(dd，1H，H-2′)，4.93(dd，1H，H-3′)，4.87(t，1H，H-2)，4.49(d，2H，J_1.2＝7.80Hz，H-1)，4.45(d，1H，J_1′，2′＝7.80Hz，H-1′)，4.53，4.13～4.05(m，4H，H-6a，b，H-6a′，b′)，3.89～3.49(m，6H，H-4，5，H-5′，-CH₂O-，-CHNH₂-)，2.16～2.14(s，1H，COCH₂-)，2.14～1.97(7s，21H，7CH₃CO-)，1.84(t，1H，-CH₂-)；¹³CNMR(CD₃Cl)δ：171.4～169.0(8C，CH₃C＝O，-CONH)，101.0(C-1′)，100.8(C-1)，76.1(C-4)，72.7(C-3)，72.4(C-5)，71.7(C-2)，71.5(C-5′)，70.9(C-3′)，70.6(-CH₂O-)，69.0(C-2′)，66.6(C-4′)，61.8(C-6′)，60.7(C-6)，48.3(-CHNHCO-)，30.8(-CH₂CO)，20.9～20.5(7C，7CH₃CO-，).

实施例7.N-{2-[1，3-二-O-二-[2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三--O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-辛二酰胺7-化合物7的制备同化合物6，用辛二酸作连接臂，粗产品用柱层析纯化，石油醚(60-90℃)∶丙酮2∶3，得无色糖浆。收率83％。

实施例8.N-{2-[1，3-二-O-二-[2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三--O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-1，3，5均苯三酰胺8-化合物8的制备同化合物6，用1，3，5-均苯三酸作连接臂，粗产品用柱层析纯化，石油醚(60-90℃)∶丙酮2∶3。得无色糖浆。收率70％。

实施例9.N-{2-[1，3-二-O-二-[2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三--O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-2-苄氧羰酰氨基戊二酰胺9-化合物9的制备同化合物6，用苄氧羰基-L-谷氨酸作连接臂。粗产品用柱层析纯化，石油醚(60-90℃)∶丙酮＝2∶3，得无色糖浆，收率88％.

实施例10.N-{2-[1，3-二-O-二-[2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三--O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-2-氨基戊二酰胺10-化合物9(0.2g，0.07mmol)溶于MeOH(10mL)，加入Pd/C，室温下催化氢化(0.4MPa)3小时，滤除催化剂，蒸除溶剂，粗产品用柱层析纯化，石油醚(60-90℃)∶丙酮2∶5，得无色糖浆(0.18g)，收率94％。[α]²⁵ _D-31.58°(c1.14，CHCl₃)；¹HNMR(CD₃Cl)δ：6，21(d，1H，-NHCO)，6.18(d，1H，-NHCO)，5.35(d，1H，H-4′)，5.20(t，1H，H-3)，5.12(dd，1H，H-2′)，4.96(dd，1H，H-3′)，4.86(dd，1H，H-2)，4.46(d，2H，J_1，2＝J_1′2′＝7.50Hz，H-1，H-1′)，4.48，4.13～4.08(m，4H，H-6a，b，H-6a′，b′)，3.90～3.53(m，7H，H-4，5，H-5′，-CH₂O-，-COCHNH-，-CHNH₂-，)，2.32～1.97(m，23H，7CH₃CO-，-COCH₂-，-CH₂CHNH₂)；¹³CNMR(CD₃Cl)δ：170.3～169.0(9C，CH₃C＝O，-CONH)，101.0(2C，C-1，C-1′)，76.1(C-4)，72.8(C-3)，72.6(C-5)，71.6(C-2)，71.5(C-5′)，70.9(C-3′)，70.6(-CH₂O-)，69.0(C-2′)，66.5(C-4′)，61.8(C-6′)，60.7(C-6)，48.6～48.3(2C，-CHNHCO-)，20.8～20.5(9C，7CH₃CO-，-CH₂CO，-CH₂CHNH₂).

实施例11.2-FITC-1，3-二-O-二-[-2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三--O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基]丙烷11-FITC(0.06g，0.15mmol)溶于无水DMF(0.2mL)，滴加化合物5(0.2g，0.15mmol)的CH₂Cl₂(10mL)溶液，40℃搅拌8小时。蒸除溶剂，粗产品用柱层析纯化，CHCl₃∶MeOH＝10∶1，得到黄色糖浆(0.25g)，收率96％.[α]²⁵ _D-28.95°(c 1.52，CHCl₃)；8.02，7.93，6.72，6.58(m，9H，PhH)，7.15(d，2H，-NHCSNH-)，5.35(d，1H，H-4′)，5.14(t，1H，H-3)，5.10(dd，1H，H-2′)，4.92(dd，1H，H-3′)，4.82(dd，1H，H-2)，4.55(d，2H，J_1，2＝J_1′，2′＝7.80Hz，H-1，H-1′)，4.53，4.13～4.09(m，4H，H-6a，b，H-6a′，b′)，3.93～3.68(m，6H，H-4，5，H-5′，-CH₂O-，-CHNHCS-，)，2.94(1H，PhCH-)，2.18～1.97(m，21H，7CH₃CO-)；¹³CNMR(CD₃Cl)δ：207.3，180.7，139.9，129.4，110.6(10C，Ph，PhCH-)，171.1～169.0(8C，CH₃C＝O，-PhCO)，162.7(C＝S)，102.7(C-1′)，100.8(C-1)，75.9(C-4)，72.9(C-3)，72.6(C-5)，71.5(C-2)，71.3(C-5′)，70.8(C-3′)，70.4(-CH₂O-)，68.9(C-2′)，66.5(C-4′)，61.7(C-6′)，60.6(C-6)，52.9(-CHNHCS-)，30.7()，20.9～20.3(7C，7CH₃CO-).

实施例12.N-{2-[1，3-二-O-二-[2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三--O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-2-FITC-戊二酰胺12-化合物12的制备同化合物11，粗产品用柱层析纯化，CHCl₃∶MeOH＝10∶1，得到黄色糖浆，收率95％。

实施例13.3，6，9-三氧杂-1，11-二-O-二-[β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]十二烷13-化合物1(0.1g)溶于甲醇(10mL)，加入催化量的钠，室温搅拌12小时，然后用阳离子交换树脂中和至中性。滤去树脂，蒸除溶剂，残渣溶于20mL水，冷冻干燥，得白色固体(0.06g，97％)。[α]_D＝+56.3°(c＝0.71，H₂O)；¹HNMR(D₂O)δ：4.33(d，1H，J_1′，2′＝8.40Hz，H-1′)，4.26(d，1H，J_1，2＝7.50Hz，H-1)，3.85～3.47(m，19H，H-3，4，5，6a，b，H-2′，3′，4′，5′，6a′，b′，-CH₂O-)，3.36(m，1H，H-2)；¹³CNMR(D₂O)δ：105.7(C-1′)，104.8(C-1)，81.0(C-4)，78.1，77.5，77.0，75.2，74.4，73.8，73.7，72.3，72.2，71.5，71.3，63.8，62.8(C-2，3，5，6，C-2′，3′，4′，5′，6′，-CH₂O-).

实施例14.3，6，9，12-四氧杂-1，14-二-O-二-[β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]十六烷14

-化合物14的制备同化合物13，收率97％。

实施例15.3，6，9，12，15-五氧杂-1，17-二-O-二-[β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]二十烷15

-化合物15的制备同化合物13，收率95％。

实施例16.2-氨基-1，3-二-O-二-[β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙烷16

-化合物16的制备同化合物13，收率98％。

实施例17.N-{2-[1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-丁二酰胺17

-化合物17的制备同化合物13，收率97％。[α]²⁵ _D-46.51°(c 1.29，H₂O)；¹HNMR(D₂O)δ：6.10(d，1H，-NHCO)，4.33(d，1H，J_1，2＝7.80Hz，H-1)，4.28(d，1H，J_1′，2′＝7.80Hz，H-1′)，3.83～3.18(m，13H，H-2，3，4，5，6a，b，H-2′，3′，4′，5′，6a′，b′，-CH₂O-，-CHNH₂)，2.40(s，1H，-CH₂CO)；¹³CNMR(D₂O)δ：175.4(-NHC＝O)，103.5(C-1′)，103.1(C-1)，78.9(C-4)，75.9，75.3，74.8，73.3，73.1，72.3，71.5，69.1，(C-2，3，5，C-2′，3′，4′，5′，-CH₂O-)，61.6，60.6(C-6，C-6′)，49.5(-CHNH₂)，31.5(COCH₂).

实施例18.N-{2-[1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-辛二酰胺18

-化合物18的制备同化合物13，收率95％。

实施例19.N-{2-[1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-1，3，5-均苯三酰胺19

-化合物19的制备同化合物13，收率94％。

实施例20.N-{2-[1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-2-氨基-戊二酰胺20

-化合物20的制备同化合物13，收率96％。

实施例21.2-FITC-1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙烷21

-化合物21的制备同化合物13，收率96％。[α]²⁵ _D-35.82°(c 1.34，H₂O)；¹HNMR(D₂O)δ：7.77，6.68，6.36(m，9H，C₆H₅)，7.10(d，2H，-NHCSNH-)，4.26(d，2H，J_1，2＝J_1′，2′＝7.50Hz，H-1，H-1′)，3.75～3.17(m，13H，H-2，3，4，5，6a，b，H-2′，3′，4′，5′，6a′，b′，-CH₂O-，-CHNH-)；¹³CNMR(D₂O)δ：165.5(C＝S)，155.4，152.7，141.0，131.3，119.9，117.4，113.2(10C，C₆H₅，C₆H₅CH)，103.6(C-1′)，103.3(C-1)，79.1(C-4)，78.8，75.9，75.4，74.8，73.4，73.1，71.5，69.1，68.7(C-2，3，5，C-2′，3′，4′，5′，-CH₂O-)，61.6，60.8(C-6，C-6′)，49.4(-CHNH).

实施例22.N-{2-[1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-2-FITC-戊二酰胺22

-化合物22的制备同化合物13，收率94％。

活性试验结果

将上述合成的化合物进行了抗粘附和抗休克活性的测定，均显出良好的抗粘附和休克保护作用。荧光标记的乳糖缀合物作为生物探针，在粘附靶细胞的研究中得到了明确的结果。具体活性试验操作及典型化合物的结果如下：

抗粘附活性试验：

(1)血液粒细胞的制备

动物麻醉后，分离颈部动脉插管，以肝素抗凝取血3-5ml，并加等量生理盐水稀释，混匀后轻轻加到底部装有5ml淋巴细胞分离液的试管中，2000rpm离心20min，取红细胞表层的白细胞，加到5ml红细胞裂解液中摇匀放置8min，再looorpm离心smin，弃上清液，(红细胞去除不完全可再重复裂解1次)，以DMEM培养基洗2次，计数后，配成1-2XIO⁶/ml浓度的粒细胞悬液备用。

(2)大鼠肺血管内皮细胞的培养

：动物放血处死，75％酒精浸泡消毒动物皮肤，无菌条件下开胸取其肺组织，洗去血液后再将肺周边组织剪下一圈，将其剪碎成1mm³大小的组织块，加含20％小牛血清DMEM培养液，放入细胞培养箱中37℃、5％CO₂中培养60～72小时，换液去掉组织块，再培养4～7天，培养瓶中长满鹅卵石样的肺血管内皮细胞。用0.25％胰蛋白酶消化细胞，将其传代至载玻片上继续培养，待其长满后用于粘附实验。

(3)细胞液流室制作

液流室由两层透明有机玻璃制成中空液流通道，内径长6.1cm，宽1.5cm。液流室两端及两侧各有一通道，用于通入液体及测压力。其中一端连接蠕动泵用于形成不同流速不同切应力的液体灌流。

(4)粒细胞粘附特性的检测：

将已长满肺血管内皮细胞的载玻片放入液流室中，用橡胶垫圈上下密封玻片四周，盖好后用螺丝钉旋紧至无液体渗漏。连接好蠕动泵后放入Olympus倒置显微镜的观察室中，观察室保持37℃恒温。将视野放大400倍，用MTV彩色摄象机、National监视器和JVC录像机同步录像观察记录。先用Hanks液灌洗以清除液流室及其连接导管中的气泡(关键步骤)。然后再加入分离的白细胞到液流室中与内皮细胞温育20～30min。开动蠕动泵，以不同的切应力灌流2min，计数各种切应力灌流后视野中与内皮细胞粘附的白细胞数，计算其粘附率。

两个代表性化合物16和20的抗粘附活性(flow chamber)如图1所示：

结果表明：这两种寡糖具有明显抑制休克大鼠白细胞与内皮细胞粘附的活性。

烧伤休克保护活性试验：

动物模型：24只SD大鼠，体重180～220g，雌雄不限，随机分为3组。用133％乌拉坦+05％氯醛糖(06mL/100g体重，ip)麻醉。一侧颈总动脉插入PE-50导管，用于监测血压和采血。用80℃热水烫伤腰以下肢体30s(占体表面积35％～40％)造成深II度烧伤，复制大鼠重症烧伤休克模型。烫伤后20分钟左右给予寡糖或生理盐水，只给药一次。

动物试验的样品量：40nmol/100g体重。

两个代表性化合物16和20的抗烧伤休克保护活性(大鼠模型)，如图2所示：结果表明，两种寡糖均能延长烧伤休克大鼠的存活时间，具有明显的治疗作用。

荧光标记寡糖缀合物用于粘附靶点的确定

将寡糖配制成10pmol/ul的工作液，与分离得到的白细胞作用10分钟后洗去未结合寡糖，在荧光显微镜下观察。

化合物21、22粘附结果分别如图3、图4所示：

结果表明：化合物21、22都能与白细胞结合，特别是粒细胞。这可能是其抗粘附和抗休克的细胞学基础。

参考文献

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Claims

1、具有通式(I)的抗粘附活性的乳糖簇化合物，

R₁选自聚乙二醇、2-氨基-1，3-丙二醇及多元羧酸中的一种或几种，其中m为2、4、6。

2、权利要求1所述的化合物，其特征在于聚乙二醇的聚合度n为4-6的整数；多元羧酸选自丁二酸、辛二酸、均苯三酸中的一种或几种。

3、权利要求1所述的化合物，其特征在于该化合物为：

3，6，9-三氧杂-1，11-二-O-二-[β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]十二烷；

3，6，9，12-四氧杂-1，14-二-O-二-[β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]十六烷；

3，6，9，12，15-五氧杂-1，17-二-O-二-[β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]二十烷；

2-氨基-1，3-二-O-二-[β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙烷；

N-{2-[1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-丁二酰胺；

N-{2-[1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-辛二酰胺；

N-{2-[1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡哺葡萄糖基]丙基}-1，3，5-均苯三酰胺；

N-{2-[1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-2-氨基-戊二酰胺。

4、具有通式(II)的荧光标记化合物，

5、权利要求4所述的化合物，其特征在于聚乙二醇的聚合度n为4-6的整数；多元羧酸选自丁二酸、辛二酸、均苯三酸中的一种或几种。

6、权利要求4所述的化合物，其特征在于该化合物为：

2-FITC-1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙烷；

N-{2-[1，3-二-O-二-[O-β-D-吡哺半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-2-FITC-戊二酰胺。

7、权利要求1至3任意一项所述的化合物在制备抗粘附、抗休克活性药物中的应用。

8、权利要求4至6任意一项所述的荧光标记化合物作为分子探针的用途。