CN101862340A - 乳糖衍生物Gu-4作为治疗内毒素休克药物的应用 - Google Patents
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Abstract
乳糖衍生物Gu-4作为整合素CD11b的抑制剂，可以有效地治疗内毒素休克。通过实验发现乳糖衍生物Gu-4可有效地延长内毒素休克小鼠的生存时间、显著提高其生存率。
Description
技术领域
本发明涉及一种对内毒素休克具有治疗作用的药物--乳糖衍生物Gu-4。
背景技术
内毒素休克(Endotoxic Shock，ES)是由革兰阴性菌产生的内毒素引起的一种以组织低灌流、低血压及器官功能障碍为主要特征的全身危重综合征。全身血管低反应性、广泛的内皮细胞激活或损伤、弥散性血管内凝血甚至多器官功能障碍是ES的典型病理生理改变。由于ES的高发病率和高死亡率，引起了人们的广泛关注。
内毒素由脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)与蛋白质复合而成。脂多糖为革兰阴性细菌细胞膜表面的主要组成成分，在细菌和外界环境的相互作用中扮演着重要角色。临床上，ES主要由革兰阴性菌感染或肠道细菌移位引起，细菌在大量繁殖代谢的过程中持续裂解，形成大量的细胞外膜碎片，即LPS；LPS向周围组织器官或经血液及淋巴移位，进入脉管系统中的大部分LPS与血浆中脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)结合，形成LPS-LBP复合物。LPS-LBP又与CD14分子结合，形成LPS-LBP-CD14复合物，并通过糖基磷脂酰肌醇(glucosyl phosphatidylinositol，GPI)锚定于细胞膜上。CD14没有胞浆区内段，所以CD14不能直接向细胞内传递细胞信号。研究发现，LPS细胞膜受体主要是Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)，LPS通过与TLR4结合将LPS的刺激信号向细胞内传导，即激活细胞内各种蛋白质的基因表达系统(MAPK、NF-κB等)(Palsson-McDermott EM，O NeillLA.Signal transduction by the lipopolysaccharide receptor，Toll-like receptor-4.Immunology，2004，113(2)：153～162)。继而激活了细胞粘附分子、TNF-α、IL-6等炎症因子的转录表达(Andreakos E，Sacre SM，Smith C，et al.Distinct pathways of LPS-induced NF-kappaB activation and cytokine production in human myeloid and nonmyeloid cells defined by selective utilization ofMyD88 andMal/TIRAP.Blood，2004，103(6)：2229～2237)。同时，LPS和TNF-α等细胞因子引起了白细胞，淋巴细胞和内皮细胞的全面活化，导致黏附分子的上调，促使中性粒细胞和单核细胞的黏附和侵润，加重炎症反应(Karima，R.，Matsumoto，S.，Higashi，H.，Matsushima，K.：The molecular pathoenesis of endotoxic shock and organ failure.Mol.Med.Today，1999，(5)：123-132)。这种由血管内外吞噬细胞引起的损伤，与其他途径引起的损伤一起，最终将导致多器官功能衰竭。
前人的研究已经证实白细胞与内皮细胞间的相互作用在休克的发病机制中占有重要的地位(Spronk，P.E.，Zandstra，D.F，Ince，C.：Bench-to-bedside review：sepsis is a disease of the microcirculation.Crit.Care，2004，(8)：462-468)。在休克的发病过程中，有效循环血量减少而致的微循环障碍是多数休克发生的共同基础。休克持续一段时间，血液流速明显降低，特别是在血流缓慢的微静脉；加上组胺的作用使血管通透性增加，血浆外渗，血液黏度增高；灌流压下降，可导致白细胞滚动、贴壁、粘附于内皮细胞，嵌塞毛细血管或在微静脉附壁黏着，使血流受阻，毛细血管后阻力增加。这种粘附是透过粘附分子介导的。粘附并激活的白细胞通过释放氧自由基和溶酶体导致血管内皮细胞和其他组织细胞损伤，进一步引起微循环障碍及组织损伤(王万铁，病理生理学，2006)。
因此，白细胞与内皮细胞粘附可作为治疗休克的重要靶点。
许多黏附分子的单克隆抗体在一些疾病模型中已被证实有些效果还是不错的，比如可溶性配基P-选择素糖蛋白配基-1(PSGL-1)，一种选择素共有的配基，已在创伤性休克和炎症模型中证实有效(Hicks，A.E.，Nolan，S.L.，Ridger，V.C.，Hellewell，P.G.，Norman，K.E.：Recombinant P-selectin glycoprotein ligand-1directly inhibits leukocyte rolling by all 3 selectins in vivo：complete inhibition of rolling is not required for anti-inflammatory effect.Blood，2003，(101)：3249-3256.)。但是在临床的应用上总是受限于一些负面影响，如治疗性抗体可能会因为其自身为大分子，而被作为抗原引起机体产生严重的免疫反应(Hale，G.：Therapeutic antibodies-delivering the promise？Adv.Drug Deliv.Rev.2006，(58)：633-639.)。
因此粘附分子的小分子抑制剂如寡糖应运而生。黏附分子的糖成分或其配体在白细胞和内皮细胞的表面直接参与到黏附分子的相互作用。唾液酸化路易斯糖(sLeX)，一种四糖，可结合到所有选择素上。这就引起了在sLeX的基础上对选择素抑制剂的研究。已经有很多选择素抑制剂被发现，如包含sLeX的寡糖和其他合成成分(Kaila，N.，Thomas，B.E.：Design and synthesis of sialyl Lewis(x)mimics as E-and P-selectin inhibitors.Med.Res.Rev.2002，(22)：566-601.)以前出现在抗肿瘤转移研究的乳糖及其衍生物也被用到了抗黏附实验中(Chervin，S.M.，Lowe，J.B.，Koreeda，M.：Synthesis and biological evaluation of a new sialyl Lewis X mimetic derived from lactose.J.Org.Chem.2002，(67)；5654-5662.)。
Gu-4是以丝氨醇为结构单元，以谷氨酸为连接臂的四价乳糖糖簇，结构式如下：
而我们前期通过在动物模型上的筛选发现，乳糖衍生物Gu-4可作用于整合素CD11b，抑制白细胞-内皮细胞粘附，对重度烧伤休克大鼠有较好的治疗作用(论文已在Glycoconjugate Journal发表(Zhihui Zhao，Qing Li，Jiale Hu，Zhongjun Li et al.：Lactosyl derivatives function in a rat model of severe burn shock by acting as antagonists against CD 11b of integrin on leukocytes.Glycoconj J 26：173-188))。此乳糖衍生物可显著延长重度烧伤休克大鼠的生存时间，稳定其血压，并且可减轻重要器官的损伤，从而提高重度烧伤休克大鼠的生存率。
发明内容
本发明的目的是提供一种乳糖衍生物Gu-4在制备治疗内毒素内毒素休克药物中的应用。
本发明将乳糖衍生物Gu-4作为治疗药物施用于内毒素休克小鼠。乳糖衍生物Gu-4能够有效延长内毒素休克小鼠的生存时间，显著提高其生存率。
在休克的发病过程中，有效循环血量减少而致的微循环障碍是多数休克发生的共同基础。造成微循环障碍的主要原因是白细胞和内皮细胞间的粘附增强。这种粘附是透过粘附分子介导的。粘附并激活的白细胞通过释放氧自由基和溶酶体导致血管内皮细胞和其他组织细胞损伤，进一步引起微循环障碍及组织损伤。
体外实验中，本发明使用乳糖衍生物Gu-4观察其对白细胞和内皮细胞间的粘附的影响。发现它可有效抑制白细胞和内皮细胞间的粘附。这就在细胞水平解释了乳糖衍生物Gu-4为什么会有抗内毒素休克活性。
因此，乳糖衍生物Gu-4有可能成为新型的治疗内毒素休克的药物。
附图说明
图1是乳糖衍生物Gu-4对内毒素休克小鼠存活率的影响其中：Saline是模型组生理盐水治疗组，L-Gu-4是低剂量Gu-4治疗组，M-Gu-4是中剂量Gu-4治疗组，H-Gu-4是高剂量Gu-4治疗组，L-Lac是低剂量乳糖治疗组，M-Lac是中剂量乳糖治疗组，H-Lac是高剂量乳糖治疗组，Dex是地塞米松治疗组。
图2是粘附实验其中：LPS-是LPS未刺激THP-1细胞，LPS+是LPS刺激THP-1细胞；Control是对照组，Gu-4是Gu-4处理组，An-2是An-2处理组(An-2是结构与Gu-4相似的乳糖衍生物)，CD11b antibody是anti-human CD11b(Biolegend 301312)处理组。
本发明的优点：1、作用机理明确。我们的前期研究工作已经查明乳糖衍生物Gu-4以白细胞表面整合素CD11b为靶点发挥其生物学效应；2、疗效确实。除了我们前期发现乳糖衍生物Gu-4对重度烧伤休克大鼠有较好的治疗作用外，本实验确定Gu-4具有抗内毒素休克活性；3、具有发展前景。对乳糖衍生物Gu-4的研究有可能带动相关药物临床治疗策略的改变和相关药物治疗，具有重要的理论意义和应用价值。
具体实施方式
实施例1：一、内毒素休克模型动物模型：用18-22g健康雄性ICR小鼠(购自中国科学院上海实验动物中心)，按照体重0.005ml/g腹腔注射LPS(Escherichia coli O111：B4，Sigma)(37.5mg/kg)，复制内毒素休克模型。
实验使用的治疗药物为：Gu-4(北京大学药学院提供)；乳糖(β-Lactose，Sigma，L3750)；地赛米松(金陵药业股份有限公司，国药准字：H32021839；生产日期：2009-10-16；产品批号：091003；有效期至2011年09月)；氯化钠(国药集团有限公司10019318)。
存活率实验：小鼠腹腔注射LPS 30分钟后，按照表1的分组尾静脉注射治疗药物：生理盐水治理组、高、中、低剂量Gu-4治疗组、高、中、低剂量乳糖治疗组、地塞米松治疗组，每组小鼠数量为10只，共80只。造模后开始观察小鼠存活情况，每半小时观察一次，连续观察72小时，纪录小鼠的死亡情况并统计小鼠的生存时间和存活率。表1.乳糖衍生物Gu-4对内毒素休克小鼠的治疗效应
| 分组 | 给药浓度 | 母液浓度 | 给液量 | 给药方式 |
| 生理盐水组 | 0.9％ | 0.9％ | 0.005ml/g | i.v. |
| 高量Gu-4组 | 800nmol/kg | 160nmol/ml | 0.005ml/g | i.v. |
| 中量Gu-4组 | 400nmol/kg | 80nmol/ml | 0.005ml/g | i.v. |
| 低量Gu-4组 | 200nmol/kg | 40nmol/ml | 0.005ml/g | i.v. |
| 高量乳糖组 | 800nmol/kg | 160nmol/ml | 0.005ml/g | i.v. |
| 中量乳糖组 | 400nmol/kg | 80nmol/ml | 0.005ml/g | i.v. |
| 低量乳糖组 | 200nmol/kg | 40nmol/ml | 0.005ml/g | i.v. |
| 地塞米松组 | 1.3mg/kg | 0.26mg/ml | 0.005ml/g | i.v. |
注释：i.v.代表静脉注射。
由图1可知，乳糖衍生物Gu-4有较好的抗内毒素活性。乳糖衍生物Gu-4有效延长内毒素休克小鼠的生存时间，显著提高其生存率。
造模后连续观察内毒素休克小鼠72小时后统计发现：中、高剂量Gu-4治疗组内毒素休克小鼠的存活率提高至40％、50％。而内毒素休克模型生理盐水组在20小时以内，小鼠全部死亡，存活率为0％。低剂量Gu-4治疗组的治疗效果不甚满意，存活率为0％。对照组低、中剂量乳糖治疗组的存活率仅为10％，高剂量乳糖治疗组的存活率为20％。而阳性对照地塞米松治疗组的存活率也仅为10％。
这说明乳糖衍生物Gu-4对内毒素休克具有良好的治疗效应。
二、白细胞和内皮细胞间的粘附实验实验材料：Gu-4(from Peking University)Calcein-AM(Sigma C 1359)Recombinant Human CXCL8/IL-8(R&D Systems 208-IL)BSA(Roche 738328)ECGS(ScienCell 1052)LEAFTM Purified anti-human CD 11b(Biolegend 301312)Human TNF-α/TNFSF 1A Immunoassay(Bioworld BCT0352)细胞培养：人单核细胞白血病细胞THP-1(购买自中国科学院上海分院生物化学与细胞生物学研究所细胞库)在37℃，5％CO2条件下，用含15％胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS，PAA)和抗生素(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素，Hyclone)的RPMI 1640完全培养液(GIBCO)培养。
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(购自ScienCell)在37℃，5％CO2条件下，用含5％胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS，GIBCO)，1％ECGS(ScienCell)，抗生素(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)的ECM完全培养液(ScienCell，1001)培养。HUVEC经0.25％的胰酶-EDTA(Hyclone)消化一分钟后，用含有5％胎牛血清的ECM培养液终止消化，制成悬浮细胞，接种在培养瓶内，置入5％CO2培养箱中37℃培养，每两天换一次液，生长融合的细胞经0.25％的胰酶-EDTA消化传代。
粘附实验：1.将HUVEC分于96孔板中，使每孔数量达到3×104，2-3天后待其生长融合，并铺满单层。
2.用Calcein-AM将THP-1细胞染色40min(在无血清RPMI 164完全培养基中)，在染色25min时加入1μg/ml LPS(Sigma L4391)刺激15min，而后用HEPES CaMg buffer洗两遍，800rpm，4min。
3.将THP-1细胞分至1.5ml EP管中，使得每管3×105/300μl，分别用Gu-4处理组，An-2处理组，anti-human CD11b antibody(Biolegend 301312)处理组室温孵育10分钟。
4.将处理好的THP-1细胞分至含有HUVEC的96孔板中，每孔THP-1细胞量达到105/100μl，37℃，5％CO2避光孵育20分钟。
5.用HEPES CaMg buffer洗板。用酶标仪(Synergy 2BioTek)485nm/528nm检测96孔板荧光强度。表2.乳糖衍生物Gu-4对白细胞和内皮细胞间的粘附的影响
注释：LPS工作浓度为1μg/ml。
| 分组 | 工作浓度 | |
| LPS未刺激THP-1组 | Control | - |
| LPS未刺激THP-1组 | Gu-4处理组 | 40nmol/ml |
| LPS未刺激THP-1组 | An-2处理组 | 40nmol/ml |
| LPS未刺激THP-1组 | Anti CD11b处理组 | 40ng/ml |
| LPS刺激THP-1组 | Control | - |
| LPS刺激THP-1组 | Gu-4处理组 | 40nmol/ml |
| LPS刺激THP-1组 | An-2处理组 | 40nmol/ml |
| LPS刺激THP-1组 | Anti CD11b处理组 | 40ng/ml |
由图2知，LPS未刺激THP-1组中，对照组、乳糖衍生物处理组Gu-4组、An-2组的荧光强度相近。说明在静息状态下，乳糖衍生物对白细胞和内皮细胞间的粘附是没有影响的。
LPS刺激THP-1组中，与对照组相比较，Gu-4处理组的荧光强度下降了32％。An-2处理组的荧光强度仅下降了13％。CD11b抗体处理组在LPS处理前后对白细胞和内皮细胞间的粘附没有太大的影响。统计分析，Gu-4处理组与对照组间有显著性差异。本实验中荧光强度的强弱代表着白细胞和内皮细胞间的粘附强度。由此说明乳糖衍生物Gu-4可显著抑制白细胞和内皮细胞间的粘附。这就在细胞水平解释了乳糖衍生物Gu-4为什么会对内毒素休克小鼠有较好的治疗作用。
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