CN1274364C - 抗FcεRIα单克隆抗体Fab片段与雷公藤红素的交联体 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域。本发明公开了一种抗FcεRIα单克隆抗体Fab片段与雷公藤红素的交联体。该交联体能用于制备治疗肥大细胞和嗜碱性粒细胞介导疾病的生物制剂。本发明提供了制备方法。
Description
技术领域:
本发明属于生物技术领域。具体涉及肥大细胞和嗜碱性粒细胞介导疾病的治疗性生物制剂,抗FcεRIα单克隆抗体Fab片段与雷公藤红素的交联体及制备方法。
背景技术:
肥大细胞和嗜碱性粒细胞是I型变态反应性疾病和一些肥大细胞相关性疾病如变应性皮炎、皮肌炎、银屑病等的主要效应细胞。过敏原与其特异性IgE结合形成的复合物与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面IgE受体结合后使IgE受体发生微聚集,触发信号传导,包括蛋白激酶激活、磷脂酰肌醇水解和Ca2+流动等,引起细胞介质合成、释放,细胞因子分泌,黏附分子表达增加和细胞伸展、膜皱折形成最终导致细胞脱颗粒,释放血管活性物质及某些酶类引起平滑肌收缩、黏液分泌、血压降低和组织损伤。IgE受体有高低亲和力两种,低亲和力受体FcεRII(CD23)分布于肥大细胞,嗜碱、嗜酸性粒细胞,B细胞和树突状细胞。高亲和力受体FcεRI主要分布于肥大细胞和嗜碱粒细胞,嗜酸性粒细胞表面也有少量表达。生理条件FcεRII表达量高于FcεRI,病理情况二者表达均增加,但FcεRI表达量显著高于FcεRII,α亚单位是FcεRI与IgE的结合部位。因此,IgE或其受体阻断是阻止变态反应发生的最佳手段。
根据上述原理目前变态反应性疾病的生物治疗集中于抗IgE和抗FcεRIα单克隆抗体两类。前者目的在于通过外源性抗体与IgE结合而中和IgE或与IgE形成大的复合物使IgE丧失与其受体结合的能力,后者则是通过与IgE竞争受体结合部位而阻止IgE与受体的结合,二者都是通过抑制细胞活化来达到缓解或治疗变态反应性疾病的目的。前者最成功的是在2001年进入临床I期试验的药物Omalizumab。该药是基因重组人源化抗人IgE单克隆抗体,抗体名rhuMAB-E25。据报道其皮下注射后哮喘和过敏性鼻炎缓解率明显高于安慰剂的疗效,它能够使血清游离IgE浓度和IgE高亲和力受体表达量明显降低,报道认为治疗剂量的Omalizumab浓度的很低,不可能引起停药后IgE反弹。抗IgE单克隆抗体Omalizumab的作用机理是进入体内与IgE结合形成免疫复合物,这种大的免疫复合物使IgE失去了与IgE受体的结合能力,使肥大细胞不被触发活化。
人源化抗FcεRIα单克隆抗体Fab片段的研究报道出自2001年日本的实验室,迄今未见进一步详尽的报道。
但抗体是生物制剂,进入体内因被降解而存在着生物半衰期,因此需反复给药;另外,IgE合成和FcεRI表达是一动态变化过程,这些均直接影响给药效果和间期甚至效果;停药后IgE浓度和FcεRI表达的反弹也是需要考虑的问题。
发明内容:
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之外,设计一种靶向生物导弹,用于治疗肥大细胞和嗜碱性粒细胞相关性疾病。
本发明人在研究中考虑到肥大细胞和嗜碱性粒细胞是变态反应病的主要效应细胞,而FcεRI是仅表达于这两种细胞的IgE受体,在介导过敏原引起的变态反应性疾病中起着关键作用,α亚单位是IgE结合部位。因此,利用抗FcεRIα单克隆抗体与肥大细胞和嗜碱性粒细胞结合能够有效阻止IgE对肥大细胞和嗜碱性粒细胞的活化。肥大细胞和嗜碱性粒细胞大多存在于组织或黏膜,全抗体分子量过大,进入体内难以渗透入组织,因而难以奏效;更重要的是全抗体与FcεRI结合后同样能够触发肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒,而利用抗体的Fab片段,一方面分子量大大降低,解决了全抗体难于渗透组织的问题,另一方面,Fab片段具有与全抗体等同的肥大细胞和嗜碱性粒细胞结合活性,但失去了触发肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒的能力。
另外,凋亡(apoptosis)是细胞的一种死亡方式,凋亡形成的凋亡小体最终被邻近细胞吞噬,不引发周围组织的炎症反应。因而,诱导肥大细胞的凋亡是一条治疗I型变态反应病的理想途径。导向于肥大细胞的凋亡诱导剂,将直接和最大程度地发挥药物的作用,并能有效地限制毒性。
雷公藤(Tripterygium wilfor-dii Hook.f.)属木质藤本植物它具有抗炎、抗肿瘤、抗生育等多种活性,其化学成分主要是二萜、三萜、倍半萜、生物碱等。祖国医学用其治疗类风性关节炎、系统性红斑狼疮等疾病有不可替代的药理作用。雷公藤红素(tripterine)是雷公藤的单体之一,属五环三萜类色素,分子式C29H38O4,分子量450。研究证实雷公藤红素能够诱导肥大细胞凋亡,细胞凋亡不引发周围组织的炎症反应,另一方面,肥大细胞凋亡也不会引起如其它细胞凋亡后可能带来的与功能损伤或紊乱相关的副作用和并发症。就其药理机制来讲,雷公藤红素应为治疗I型变态反应病的理想药物。然而,由于其作用靶的广泛性,体内应用有明显的毒副反应,特别是免疫和生殖抑制等,从而大大限制了它的临床应用范围。
从前面所述抗FcεRIαFab本身具有竞争性抑制IgE与肥大细胞和嗜碱性粒细胞结合并抑制二者脱颗粒的生物学效应,也是生物治疗的方向。
基于上述的作用机理,本发明人设计了一种靶向生物导弹,其中导弹为雷公藤红素,靶为肥大细胞和嗜碱性粒细胞,靶导向物为抗FcεRIα单克隆抗体Fab片段。
本发明将雷公藤红素与FcεRIαFab片段交联,使之成为具有靶向特异性的药物,极小量与抗FcεRIαFab片段结合的雷公藤红素进入体内,定向与肥大细胞结合,既达到了雷公藤红素诱导肥大细胞凋亡的目的又限制了其毒性。
本发明提供了一种抗FcεRIα单克隆抗体Fab片段与雷公藤红素的交联体及制备方法,该方法是以FcεRI高表达的大鼠嗜碱性粒细胞白血病细胞系RBL-2H3免疫小鼠,取血清抗体浓度高的小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合,制备抗鼠FcεRIα单克隆抗体,从腹水和细胞培养上清中获得的抗体的Fab片段并与雷公藤红素交联,获得交联体。
本发明的FcεRIα单克隆抗体Fab片段与雷公藤红素的交联体进行了下列体外实验与动物实验:
①验证实验设计的正确性和可行性:通过体外实验比较单纯FcεRIα单克隆抗体Fab片段与交联体在与肥大细胞结合(免疫荧光法和ELISA)、致肥大细胞脱颗粒效应(ELISA法测组胺释放)细胞因子释放(ELISA检测IL-4)和诱导肥大细胞凋亡(DNA电泳、DNA含量、TNUNEL标记检测DNA断裂点和Annexin V检测区分细胞调之和坏死)方面的区别;
②体内应用的有效性:通过动物实验明确交联体对哮喘的疗效(有效、无效),进一步确定给药方式、时间(发作前或后、给药间隔和疗程),给药途径(吸入、皮下)和给药浓度;
③作用机制和途径:检测血清和肺泡灌洗液组胺IL-4浓度分别确定肥大细胞脱颗粒和细胞因子的影响、酶免疫荧光测定治疗前后血清总IgE浓度明确作用途径,肺组织和支气管切片检测肥大细胞和嗜碱性粒细胞数量、凋亡(TUNEL、HE染色、电镜)明确效果;
④动物生存期观察和毒副作用观察。
上述实验结果表明:
大鼠嗜硷性粒细胞细胞系RBL-2H3免疫的BALB/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,ELISA筛选鼠血清和融合细胞产生的抗体,有限稀释克隆化培养。SDS-PAGE胶电泳、免疫扩散鉴定抗体性质,IgE竞争结合、组胺释放检测抗体生物活性,125I-细胞膜抗体复合物免疫沉淀放射自显影鉴定抗体识别抗原成分。获得2株抗FcεRIαmAb生产细胞株ER-E5.3,ER-C7.4,均为IgG1。培养上清和小鼠腹水获得的抗体效价均大于105。流式细胞仪(flow cytometry,FCM)分析抗体与RBL-2H3结合率均大于95%,与大鼠胸腺细胞和外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL)无交叉反应,并能竞争性抑制IgE与肥大细胞结合。抗体触发RBL-2H3脱颗粒,组胺释放效应与抗原特异性IgE对肥大细胞的激活效应相同。木瓜酶切的Fab片段能与RBL-2H3结合,也能竞争抑制IgE与肥大细胞的结合,但不致RBL-2H3脱颗粒。抗体结合的细胞膜成分为α亚单位。
以醛基为交联剂连接雷公藤红素与抗FcεRIα单克隆抗体Fab片断,获得的混合物,经柱层析去除未结合的雷公藤红素,获得交联体与未结合雷公藤红素的混合成分。经体外与肥大细胞作用,TUNEL标记,HE染色,DNA电泳和DNA含量分析均证实了肥大细胞凋亡。表明交联成功,由于雷公藤红素分子量仅450所以无法将交联了和未交联雷公藤红素的抗FcεRIα单克隆抗体Fab片段分离,也无法确定交联率。但是,只要有交联并能够诱导肥大细胞凋亡就能达到目的,因为,仅抗FcεRIα单克隆抗体Fab片段也有其治疗效果。
通过实验,本发明解决了以下问题
1)、制备小鼠抗大鼠FcεRIα单克隆抗体,并鉴定其生物活性和免疫活性
2)、得到小鼠抗大鼠FcεRIα单克隆抗体Fab片段,鉴定生物活性
3)、FcεRIα单克隆抗体Fab片段与雷公藤红素交联,鉴定交联体体外诱导肥大细胞凋亡特性
4)、建立大鼠哮喘模型,确立交联体体内应用的方式、时间、给药间期、疗效
5)、证实与雷公藤红素结合与单纯抗体应用不同的效果、剂量,以及交联雷公藤红素后的致凋亡效应
6)、确定交联体体内应用无毒副作用
本发明的特点如下:
1)、本发明利用了免疫学原理将抗体与传统的中药结合,抗体的主要作用是导向;2)、本发明一方面能够阻止IgE与肥大细胞和嗜碱性粒细胞的结合,另外还能诱导肥大细胞凋亡;3)、不仅对IgE介导的I型变态反应性疾病,而且对肥大细胞和嗜碱性粒细胞介导的疾病如变应性皮炎、银屑病、皮肌炎甚至肥大细胞介导的组织纤维化也有疗效;4)、由于疗效是通过细胞凋亡实现的,所以有希望根除肥大细胞介导的疾病,而不仅仅是缓解症状;5)生物半衰期、停药后血清IgE浓度甚至FcεRI表达反弹的可能性很小。
具体实施方式:
实例一,本发明抗FcεRIα单克隆抗体Fab与雷公藤红素交联剂对大鼠作用,以卵清蛋白免疫SD大鼠诱发哮喘,建立哮喘模型,哮喘诱发率80%分别于再次诱发前后给予雷公藤红素与抗FcεRIα单克隆抗体Fab交联体喷雾。结果再次诱发前给药一次,能够明显减轻哮喘发作程度,再次给药2-4次,哮喘不再发作。再次诱发后平均给药7次对过敏原不再应答。血清和肺泡灌洗液IL-4、总IgE、组胺浓度与未治疗组比较显著降低,二者差异非常显著(p<0.0010)。不同剂量组比较10-20μg/ml/日即达治疗效果,连续用药一月心、肝、肾、肺等器官无病理改变。
实例二,本发明抗FcεRIα单克隆抗体Fab与雷公藤红素交联剂的细胞凋亡作用。将FcεRIα单克隆抗体经木瓜蛋白酶切后得到小分子的Fab片段,将其与雷公藤红素以醛基偶联剂偶联得到抗FcεRIα单克隆抗体Fab与雷公藤红素交联体,此交联体进入体内与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面FcεRI结合一方面,阻止了IgE与肥大细胞和嗜碱性粒细胞的结合,从而使IgE不能触发肥大细胞和嗜碱性粒细胞活化;另一方面,雷公藤红素定向于肥大细胞,或通过其表面的受体进入细胞,由于雷公藤红素是分子量极小的五环萜类色素能够自由进入细胞,一旦进入细胞即启动细胞凋亡信号,使细胞凋亡。
实例三,本发明将抗FcεRIα单克隆抗体Fab与雷公藤红素交联体与单纯雷公藤红素和单纯FcεRIα单克隆抗体Fab比较,在诱导肥达细胞凋亡方面:交联体与雷公藤红素在剂量(摩尔浓度)和时间上没有统计学差异,而单纯FcεRIα单克隆抗体Fab没有任何诱导肥大细胞凋亡作用,说明FcRIα单克隆抗体Fab与雷公藤红素交联是成功的;在靶的特异性方面:雷公藤红素能诱导T细胞系6T-CEM凋亡,交联体和单纯FcεRIα单克隆抗体Fab体6T-CEM细胞没有致凋亡作用,说明交联体是定向于肥大细胞的。
Claims (3)
1、一种抗FcεRIα单克隆抗体Fab片段与雷公藤红素的交联体,其特征在于该交联体为靶向特异性生物制剂,其中导弹为雷公藤红素、靶为肥大细胞和嗜碱性粒细胞、靶导药物为抗FcεRIα单克隆抗体Fab片段。
2、一种抗FcεRIα单克隆抗体Fab片段与雷公藤红素的交联体的制备方法,其特征在于该方法是以FcεRI高表达的大鼠嗜碱性粒细胞白血病细胞系RBL-2H3免疫小鼠,取血清抗体浓度高的小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合,制备抗鼠FcεRIα单克隆抗体,从腹水和细胞培养上清中获得的Fab片段并与雷公藤红素交联,获得交联体。
3、一种抗FcεRIα单克隆抗体Fab片段与雷公藤红素的交联体在制备治疗肥大细胞和嗜碱性粒细胞介导疾病的生物制剂中的应用。
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