CN1802899A - 一种超氧化物歧化酶葡萄及其生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种超氧化物歧化酶冬葡萄及其生产方法。该葡萄是在常规栽培管理条件下，从萌芽期开始，在葡萄结果树的树冠喷施和根部浇灌浓度为2.5×10⁷－4.5×10⁷cfu/mL芽孢杆菌(Bacillus spp.)CGMCC 0175的菌液后得到的果实。本发明的SOD葡萄具有以下优点：1)除保持了原有葡萄的优良性状外，SOD含量明显提高，可达500－800IU/g，且产生的SOD酶具有较强的耐热能力，在70℃条件下处理1小时，酶活为原酶活的47％；100℃条件下处理30分钟，酶活为原酶活的37％；2)对臭氧、高酸也具有较强的耐性；3)具有增强人体免疫力和延缓衰老的功效，食用安全性高；4)生产方法简单，成本低廉。基于上述优点，本发明具有显著的社会效益以及广阔的市场前景。

Description

一种超氧化物歧化酶葡萄及其生产方法

技术领域

本发明属于一种果树及生产方法，特别是涉及一种具有较高酶活性含量的超氧化物歧化酶葡萄及其生产方法。

背景技术

葡萄属落叶藤本植物为葡萄科Vita-ceae植物葡萄ViniferaLINN.的果实，是地球上最古老的植物之一，也是人类最早栽培的果树之一。葡萄是当今世界上人们喜食的第二大果品，在全世界的果品生产中，葡萄的产量以及栽培面积一直居于首位。其果实除作为鲜食用外，主要用于酿酒，还可以制成葡萄汁、葡萄干和罐头等食品。葡萄不仅味美可口，而且营养价值很高。成熟的浆果中含有15％-25％的葡萄糖以及许多种对人体有意的矿物质和维生素。葡萄还可作为酿造原料，葡萄酒是最受人们喜好的果酒。葡萄对水土的适应性很强。盐碱地、沙荒地或山薄地经过适当改良后，都能成功的进行葡萄栽培。葡萄枝蔓软，便于防寒，在寒地也能发展。此外，葡萄进入结果期早，寿命长，产量高。一般在定植后的第二年即可开始结果，第3、4年即可获得可观的产量。各地如能因地制宜的发展葡萄生产，对改变农村经济面貌和支援国家建设将起到积极的作用。

芽孢杆菌(Bacillus spp.)CGMCC 0175是一种对植物有益的内生共生菌。SOD酶是生物的重要保护酶之一，能增强机体的抗逆能力，并且具有防衰老的功效。益微SOD是中国农业大学的专利产品(专利号为：93103774.3)，是由植物体内有益内生共生芽孢杆菌(Bacillusspp.)制备而成，已有制剂、制品、粗酶、精酶、结晶五个层次的产品。益微SOD用于植物，具有增产、改善品质、提高SOD酶含量的作用。益微SOD酶的独特优点是耐热性好，在深加工和贮藏过程中不易失活。

发明内容

本发明为解决公知技术中存在的技术问题而提供一种具有较高SOD酶活性含量的超氧化物歧化酶葡萄及其生产方法。

本发明的SOD葡萄是将益微SOD高科技研究成果应用在葡萄的生产过程中，结合葡萄的栽培管理，在特定时期进行处理，获得SOD酶的葡萄即SOD葡萄。SOD葡萄除了保持原有葡萄的优良性状，其SOD含量明显提高，具有增强人体免疫力和延缓衰老的功效。因此SOD葡萄市场前景看好，符合绿色食品和功能食品的发展方向。

益微SOD制剂用到葡萄上，通过植物有益内生芽孢杆菌在葡萄树体内繁殖、转移，提高葡萄体内的SOD活性和含量。使用葡萄专用SOD制剂后，产生的SOD酶有较强的耐温抗热性和抗逆能力，在70℃条件下处理1小时，酶活为原酶活的47％；100℃条件下处理30分钟，酶活为原酶活的37％；对臭氧、高温高酸的耐性强；益微SOD制剂是由植物体内有益内生共生芽孢杆菌中制备而成，具有高度的安全性。因此，利用葡萄专用SOD制剂开发的葡萄保持了较高的SOD酶活，而且在深加工过程中仍可保持较高的SOD酶活。

本发明为解决公知技术中存在的技术问题所采取的技术方案是：

一种超氧化物歧化酶葡萄，是在常规栽培管理条件下，从萌芽期开始，在葡萄结果树的树冠喷施和树根浇灌浓度为2.5×10⁷-4.5×10⁷cfu/mL芽孢杆菌(Bacillus spp.)CGMCC 0175的菌液后得到的果实。

本发明的第二个目的是提供一种具有较高SOD酶活性含量的超氧化物歧化酶(SOD)葡萄的生产方法。

超氧化物歧化酶葡萄的生产方法，是在常规栽培管理条件下，从萌芽期开始，在葡萄结果树的树冠喷施和树根浇灌浓度为2.5×10⁷-4.5×10⁷cfu/mL芽孢杆菌(Bacillus spp.)CGMCC 0175的菌液，每隔15-20天喷施一次，共喷5-6次，得到葡萄。

所述喷施的芽孢杆菌(Bacillus spp.)CGMCC 0175的菌液为益微SOD制剂的800-1200倍稀释液。

所述向葡萄树冠叶面、果实喷施益微SOD制剂的800-1200倍稀释液的方法是，喷施要均匀周到，喷施至滴水为标准。

对于葡萄存在根部病虫害的情况下，从葡萄树萌芽期开始，同时需采用葡萄结果树灌根法，即使用益微SOD制剂的300-500倍液浇灌葡萄树根部，可根据葡萄树树体大小，决定浇灌量，以浇透为基准。

本发明提供了一种具有较高超氧化物歧化酶含量的葡萄及其生产方法。该葡萄是在葡萄树常规的栽培管理条件下，在特定时期用有益内生菌芽孢杆菌(Bacillus spp.)CGMCC 0175(优选为益微SOD菌剂)进行处理，芽孢杆菌(Bacillus spp.)CGMCC 0175在葡萄树体内繁殖、转移，从而提高葡萄体内的超氧化物歧化酶(SOD)活性和含量，最终得到富含SOD酶的葡萄，即SOD葡萄。本发明的SOD葡萄具有以下优点：1)除保持了原有葡萄的优良性能和形状外，其SOD含量明显提高，可达500-800IU/g，且产生的SOD酶具有较强的耐热能力，在70℃条件下处理1小时，酶活为原酶活的47％；100℃条件下处理30分钟，酶活为原酶活的37％；2)对臭氧、高酸也具有较强的耐性；3)具有增强人体免疫力和延缓衰老的功效，食用安全性高；4)生产方法简单，成本低廉。基于上述优点，本发明具有广阔的市场前景。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

所述百分含量均为质量百分含量。

实施例1、

葡萄专用益微SOD制剂的制备

一、菌株的发酵生产

1、芽孢杆菌(Bacillus spp.)CGMCC 0175的发酵

灭菌条件：温度121-125℃，压力0.11-0.14MPa，时间30min。

培养条件：温度28-34℃，压力0.05mpa，通气值1∶1，pH值7-7.5。

放罐指标：含菌量≥70亿/mL，芽孢形成≥70％，杂菌率≤0.3％。

2、菌种的获得

从芽孢杆菌(Bacillus spp.)CGMCC 0175原菌种斜面上挑取少许在备用斜面试管内划线，置于28℃温箱中培养24h，取出检查，确认无杂菌污染，菌体生长整齐时，再继续培养36h，然后涂片、染色，并在油镜下观察，无杂菌污染，孢子整齐时，作为发酵生产的菌种。

3、发酵

发酵生产分种子罐培养和发酵罐培养两部分进行，发酵液达到规定指标时及时放罐。

二、制备生物制剂

1、添加吸附剂

向步骤1中的发酵液中投入6倍菌体重量的细度为0.09mm的轻质碳酸钙(也可用草炭或腐植酸)，然后机械搅拌3-6小时，使芽孢杆菌充分被载体载体吸附。

2、压滤

采用明流式或暗流式板扛压滤机滤去多余水份。

3、干燥

低温干燥(不超过70℃)，使含水率≤5％。

4、粉碎

用超细度粉碎机粉碎，细度要求为100％通过0.09mm孔径筛，得到益微SOD制剂。控制细度的目的是为防止使用时堵塞喷雾器的喷头。

所得益微SOD制剂为白色或灰色粉末，芽孢杆菌含量为3.0×10¹⁰cfu/g，含水率≤5％，细度为100％通过0.09mm筛。

5、包装。

              表1SOD葡萄的SOD酶活标准

项目名称	计量单位	指标
			SOD	IU/g	180-300

实施例2、

超氧化物歧化酶的葡萄及其生产方法

在葡萄树常规的栽培管理条件下，从萌芽期开始，在葡萄结果树的树冠喷施浓度为2.5×10⁷-4.5×10⁷cfu/mL芽孢杆菌(Bacillus spp.)CGMCC 0175的菌液，以清水作为对照(其余栽培管理条件均相同)，每隔20天喷施一次，共喷5次，所述喷施的芽孢杆菌(Bacillusspp.)CGMCC 0175的菌液为益微SOD制剂的800-1200倍稀释液，其喷施方法是，每次用1小袋(20g)兑水15kg，装满背负式喷雾器。喷雾要均匀周到，喷施至滴水为标准。

喷施时间以及次数：

从葡萄树以早春萌动期第一次开始喷施；花前期进行第二次喷施；在其花期为防止葡萄树授粉不良不宜喷施，落花座果后实施第三次喷施；幼果膨大期实施第四次喷施；当果实进入着色期实施第五次喷施，在葡萄树整个生育期至少喷施5次。

对于葡萄根部有病虫害的情况下，在葡萄树常规的栽培管理条件下，从葡萄树萌动期开始，同时要采用灌根法，即使用益微SOD制剂的300-500倍液浇灌葡萄树根部，可根据葡萄树树体大小，决定浇灌量，以浇透根部为准。

配液时应注意：本SOD制剂为可湿性粉剂，使用前应用少量水将粉剂制成糊状后再逐渐加足稀释的水量，不要把粉剂直接撒到水中，以免影响喷施。

葡萄专用SOD制剂的兼容性：本SOD制剂还可与多种杀虫剂、杀菌剂混合使用，但不能与杀细菌剂(如农用链霉素、土霉素、青霉素和四环素等)混合使用，也可与植物生长调节剂和叶面肥等混合使用。还可减少化学药剂的用量。该SOD制剂可与各种肥料配合施用，减少肥料用量。

萝卜专用SOD制剂的安全性：SOD制剂具有高度的安全性，对作物、人、蓄无毒，不会引起不良反应。

在SOD萝卜生产过程中，除去SOD制剂的处理外，其他栽培管理仍可按照当地常年积累总结的操作规程进行。

实施例3、

本发明超氧化物歧化酶葡萄的SOD活性的测定

采用NBT光化学法测定步骤一获得的葡萄的SOD活性，具体方法如下：

1、主要设备：752型分光光度计、台式离心机、光照培养箱；冰箱；10ml小烧杯等。

2、试剂：氯化硝基氮蓝四唑(NBT)————上海前进制剂厂生产；

         L-甲硫氨酸(L-Met)————上海康达氨基酸厂生产；

         乙二胺四乙酸(EDTA)————北京化工厂生产；

         核黄素(VB2)————————北京西中化工厂生产。

3、NBT反应液的制备：配制pH7.8，50mmol/L的磷酸缓冲液1000mL，加入1.933mg的L-Met，待完全溶解后，加入45.8mg NBT，0.47mg核黄素(使用时，先配成0.47mg/mL溶液，吸取1mL加入)和29.0mgEDTA，溶液的终浓度：Met为13mmol/L；NBT为6.3×10³mmol/L，核黄素为1.3×10^-3mmol/L，EDTA为0.1mmol/L。置于棕色试剂瓶中，用黑布罩遮光，于4℃冰箱中可保存1个月。

4、材料的预处理

将由实施例2获得的葡萄果肉用研钵研碎，再按照果肉∶50mM磷酸缓冲液＝1∶2的体积比加入缓冲液，混匀后，10000rpm离心10分钟，取上清液进行SOD酶活测定。

5、SOD酶活测定

吸取30μl样品，放入10mL透明玻璃小烧杯中，加入3mL NBT反应液，混匀，在28℃的SOD光化反应室中，用2×15W日光灯光照20分钟(光照为4000勒克司)，在560nm处测定吸光度，以NBT反应液作空白对照，每组设3次重复，整个测定过程除光化反应外，均在避光条件下进行，同时测试过程中以美国″Sigma″公司、上海宝安公司的标准SOD酶和贵州老来福药业公司生产的SOD口服液作为测试对照。

6、计算酶活

SOD酶活(IU/g)＝(OD_对照-OD_样品)/(1/2OD_对照)×稀释倍数

实施例4、

益微SOD对葡萄中SOD酶活的作用效果

严格按照SOD葡萄的栽培生产过程，以清水处理为对照，其他栽培管理措施均一致，根据实施例1的SOD测定方法，测定SOD葡萄和对照葡萄的SOD酶活，结果见表2。

由表2可知，SOD葡萄中SOD酶活显著高于普通葡萄，且在a＝0.05水平差异显著，酶活提高321.1％。说明通过该项技术可以生产出具有高SOD酶活的SOD保健葡萄。

            表2SOD葡萄的SOD活性测定

样品	重复次数	SOD酶活(IU/g)	酶活提高百分率(％)
				SOD葡萄	3	151.6A	321.1
对照	3	36.0B	——

实施例5、

SOD葡萄中SOD的耐热性测定

严格按照SOD葡萄的栽培生产过程，以清水处理为对照，其他栽培管理措施均一致。根据实施例4的SOD测定方法，测试前将所测试的样品在100℃中保持20分钟，测定SOD葡萄和对照葡萄的SOD酶活性，结果见表3。

由表3可知，经过热处理后，SOD葡萄中仍保持较高的SOD酶活，但对照含有的SOD酶活极低。说明通过该项技术生产的SOD葡萄，适于在常温下保存和进行深加工，仍能保持较高的SOD活性。

      表3SOD葡萄中SOD的抗热性测定

样品	重复次数	SOD酶活(IU/g)
			SOD葡萄	3	112.1A
对照	3	10.3B

Claims (5)

1、一种超氧化物歧化酶葡萄，是在常规栽培管理条件下，从萌芽期开始，在葡萄结果树的树冠喷施和树根浇灌浓度为2.5×10⁷-4.5×10⁷cfu/mL芽孢杆菌(Bacillus spp.)CGMCC0175的菌液后得到的果实。

2、一种超氧化物歧化酶葡萄的生产方法，是在常规栽培管理条件下，从萌芽期开始，在葡萄结果树的树冠喷施和树根浇灌浓度为2.5×10⁷-4.5×10⁷cfu/mL芽孢杆菌(Bacillusspp.)CGMCC 0175的菌液，每隔15-20天喷施一次，共喷5-6次，得到葡萄。

3、根据权利要求2所述的一种超氧化物歧化酶葡萄的生产方法，其特征在于：所述喷施的芽孢杆菌(Bacillus spp.)CGMCC 0175的菌液为益微SOD制剂的800-1200倍稀释液。

4、根据权利要求2所述的一种超氧化物歧化酶葡萄的生产方法，其特征在于：所述向葡萄树冠叶面、果实喷施益微SOD制剂的800-1200倍稀释液的方法是，喷施要均匀周到，喷施至滴水为标准。

5、根据权利要求2所述的一种超氧化物歧化酶葡萄的生产方法，其特征在于：在葡萄有根部病虫害的情况下，从葡萄树萌芽期开始，也可以采用灌根法，即使用益微SOD制剂的300-500倍液浇灌葡萄树根部，可根据葡萄树树体大小，决定浇灌量，以浇透为基准。