CN100415081C - 一种生产sod冬枣的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产SOD冬枣的方法。本发明的SOD冬枣是在常规栽培管理条件下，从花期开始，在冬枣结果树的树冠喷施浓度为1.0×107-5.0×107cfu/mL芽孢杆菌CGMCC 0175的菌液，每隔15-25天喷施一次，共喷3-8次，得到SOD冬枣果实。本发明的SOD冬枣具有以下优点：1)除保持了原有冬枣的优良性状外，SOD含量明显提高，可达500-800IU/g，且产生的SOD酶具有较强的耐热能力，在70℃条件下处理1小时，酶活为原酶活的47%；100℃条件下处理30分钟，酶活为原酶活的37%；2)对臭氧、高酸也具有较强的耐性；3)具有增强人体免疫力和延缓衰老的功效，食用安全性高，具有广阔的市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及SOD冬枣及其生产方法，特别是涉及一种具有较高SOD酶活性的冬枣及其生产方法。
背景技术
冬枣又名苹果枣、冻枣等，属鼠李目，鼠李科，枣属，因在寒露后成熟而得名。冬枣的树干灰色，树皮裂纹均匀，叶面卵形或披针形，叶片互生，叶片向正面卷曲，革质，无毛；果实扁圆或短圆锥形，褐红色，果肉乳白，肉质细嫩、脆，汁液多，甜味浓，清香，每百克果肉含维生素C 650mg；栽后3-4年即可结果。
芽孢杆菌(Bacillus spp.)CGMCC 0175是一种对植物有益的内生共生菌。SOD酶是生物的重要保护酶之一，能增强机体的抗逆能力，并且具有防衰老的功效。益微SOD是中国农业大学的专利产品(专利号为：93103774.3)，是由芽孢杆菌(Bacillusspp.)制备而成，已有制剂、制品、粗酶、精酶、结晶五个层次的产品。益微SOD用于植物，具有增产、改善品质、提高SOD酶含量的作用。益微SOD酶的独特优点是耐热性好，在深加工和贮藏过程中不易失活。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有较高SOD酶活性的冬枣。
本发明所提供的冬枣，是在常规栽培管理条件下，从花期开始，在冬枣结果树的树冠喷施浓度为1.0×107-5.0×107cfu/mL芽孢杆菌(Bacillus spp.)CGMCC 0175的菌液后得到的果实。
为获得具有更高SOD酶活性的冬枣，喷施的芽孢杆菌(Bacillus spp.)CGMCC 0175的菌液为益微SOD制剂的稀释液。
本发明的第二个目的是提供一种上述冬枣的生产方法。
本发明所提供的生产方法，是在常规栽培管理条件下，从花期开始，在冬枣结果树的树冠喷施浓度为1.0×107-5.0×107cfu/mL芽孢杆菌(Bacillus spp.)CGMCC 0175的菌液，每隔15-25天喷施一次，共喷3-8次，得到具有较高SOD酶活性的冬枣。
所述芽孢杆菌(Bacillus spp.)CGMCC 0175的菌液浓度优选为2.5×107-4.5×107cfu/mL；菌液喷施的间隔时间优选为20天，喷施次数优选为5次。
所述喷施的芽孢杆菌(Bacillus spp.)CGMCC 0175的菌液优选为益微SOD制剂的800-1200倍稀释液，更优选为1000倍稀释液。
本发明提供了一种具有较高SOD酶活性的冬枣。该冬枣是在冬枣常规的栽培管理条件下，在特定时期用有益内生菌芽孢杆菌(Bacillus spp.)CGMCC 0175(优选为益微SOD菌剂)进行处理，芽孢杆菌(Bacillus spp.)CGMCC 0175在冬枣树体内繁殖、转移，从而提高冬枣体内的SOD活性和含量，最终得到富含SOD酶的冬枣，即SOD冬枣。本发明的SOD冬枣具有以下优点：1)除保持了原有冬枣的优良性状外，SOD含量明显提高，可达500-800IU/g，且产生的SOD酶具有较强的耐热能力，在70℃条件下处理1小时，酶活为原酶活的47％；100℃条件下处理30分钟，酶活为原酶活的37％；2)对臭氧、高酸也具有较强的耐性；3)具有增强人体免疫力和延缓衰老的功效，食用安全性高；4)生产方法简单，成本低廉。基于上述优点，本发明具有广阔的市场前景。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所述百分含量均为质量百分含量。
实施例1、冬枣的获得及其SOD酶活性的测定
一、SOD冬枣的获得
在冬枣常规的栽培管理条件下，从花期开始，在冬枣结果树的树冠喷施浓度为1.0×107-5.0×107cfu/mL芽孢杆菌(Bacillus spp.)CGMCC 0175的菌液，以清水作为对照(其余栽培管理条件均相同)，每隔25天喷施一次，共喷6次，最终得到SOD冬枣。
二、SOD活性的测定
采用NBT光化学法测定步骤一获得的冬枣的SOD活性，具体方法如下：
主要设备：752型分光光度计、台式离心机、光照培养箱。
试剂：氯化硝基氮蓝四唑(NBT)，上海前进制剂厂生产；L-甲硫氨酸(L-Met)，上海康达氨基酸厂生产；乙二胺四乙酸(EDTA)，北京化工厂生产；核黄素(VB2)，北京西中化工厂生产。
NBT反应液：配制pH7.8，50mmol/L的磷酸缓冲液1000mL，加入1.933mg的L-Met，待完全溶解后，加入45.8mg NBT，0.47mg核黄素(使用时，先配成0.47mg/mL溶液，吸取1mL即可)和29.0mgEDTA，得到NBT反应液，各成分的终浓度：Met为13mmol/L，NBT为6.3×10-3mmol/L，核黄素为1.3×10-3mmol/L，EDTA为0.1mmol/L。置于棕色试剂瓶中，用黑布罩遮光，于4℃冰箱中可保存1个月。
1、材料的预处理
将步骤-获得的冬枣果肉用研钵研碎，再按照果肉∶50mM磷酸缓冲液＝1∶2的体积比加入缓冲液，混匀后，10000rpm离心10分钟，取上清液进行SOD酶活测定。
2、SOD酶活测定
吸取30μl步骤1经预处理的样品，放入10mL透明玻璃小烧杯中，加入3mL NBT反应液，混匀，在28℃的SOD光化反应室中，用2×15W日光灯光照20分钟(光照为4000勒克司)，再在560nm处测定吸光度，以NBT反应液作空白对照，每组设3次重复，整个测定过程除光化反应外，均在避光条件下进行，同时以美国″Sigma″公司、上海宝安公司的标准SOD酶和贵州老来福药业公司生产的SOD口服液作为测试对照。
3、计算酶活
SOD酶活(IU/g)＝(0D对照-OD样品)/(1/20D对照)×稀释倍数
重复测定3次，结果步骤一获得的冬枣的SOD酶活为570.6IU/g，而对照冬枣的SOD酶活仅为300.5IU/g，且在a＝0.05水平差异显著，酶活提高达89.9％，表明用本发明的方法可获得具有较高SOD酶活的保健冬枣。
实施例2、冬枣的获得及其SOD酶活性的测定
一、益微SOD制剂的制备
1、芽孢杆菌(Bacillus spp.)CGMCC 0175的发酵
灭菌条件：温度121-125℃，压力0.11-0.14MPa，时间30min。
培养条件：温度28-34℃，压力0.05mpa，通气值1∶1，pH值7-7.5。
放罐指标：含菌量≥70亿/mL，芽孢形成≥70％，杂菌率≤0.3％。
1)菌种的获得
从芽孢杆菌(Bacillus spp.)CGMCC 0175原菌种斜面上挑取少许在备用斜面试管内划线，置于28℃温箱中培养24h，取出检查，确认无杂菌污染，菌体生长整齐时，再继续培养36h，然后涂片、染色，并在油镜下观察，无杂菌污染，孢子整齐时，作为发酵生产的菌种。
2)发酵
发酵生产分种子罐培养和发酵罐培养两部分进行，发酵液达到规定指标时及时放罐。
2、制备生物制剂
1)添加吸附剂
向步骤1中的发酵液中投入6倍菌体重量的细度为0.09mm的轻质碳酸钙(也可用草炭或腐植酸)，然后机械搅拌5小时，使菌体充分被载体轻质碳酸钙吸附。
2)压滤
采用明流式板扛压滤机滤去多余水份。
3)干燥
低温干燥(不超过70℃)，使含水率≤5％。
4)粉碎
用超细度粉碎机粉碎，细度要求为100％通过0.09mm孔径筛，得到益微SOD制剂。所得益微SOD制剂为白色或灰色粉末，芽孢杆菌含量为3.0×1010cfu/g，含水率≤5％，细度为100％通过0.09mm筛。
二、SOD冬枣的获得及其SOD酶活性的测定
在冬枣的常规栽培管理条件下，从花期开始，在冬枣结果树的树冠喷施益微SOD制剂的1000倍稀释液，以清水作为对照(其余栽培管理条件均相同)，每隔20天喷施一次，共喷5次，最终得到冬枣。用与实施例1相同的方法测定所获冬枣的SOD酶活性，重复测定3次，结果喷施益微SOD制剂的冬枣的SOD酶活为583.6IU/g，而对照冬枣的SOD酶活仅为303.3IU/g，且在a＝0.05水平差异显著，酶活提高达92.4％，表明用本发明的方法可获得具有较高SOD酶活的保健冬枣。
实施例3、冬枣中SOD的耐热性检测
对实施例2获得的具有较高SOD酶活性的冬枣及对照冬枣中的SOD进行耐热性检测。先按实施例1的SOD酶活测定方法中所述的对待测及对照冬枣样品进行预处理，再将待测和对照冬枣样品在100℃中保持20分钟，最后测定经热处理的待测和对照冬枣样品的SOD酶活，实验重复三次，酶活测定结果如表1所示，经过热处理后，SOD冬枣中仍保持较高的SOD酶活，但对照冬枣中的SOD酶活性急剧降低，表明用本发明方法获得的具有较高SOD酶活的冬枣适于在常温下保存和进行深加工，SOD活性稳定。
表1冬枣中SOD的抗热性实验结果
| 样品 | 重复次数 | 加热前SOD酶活(IU/g) | 加热后SOD酶活(IU/g) |
| SOD冬枣 | 3 | 583.6 | 232.5 |
| 对照冬枣 | 3 | 303.3 | 31.2 |
Claims (4)
1. 一种生产SOD冬枣的方法，是在常规栽培管理条件下，从花期开始，在冬枣结果树的树冠喷施浓度为1.0×107-5.0×107cfu/mL芽孢杆菌(Bacillus spp.)CGMCC0175的菌液，每隔15-25天喷施一次，共喷3-8次，得到SOD冬枣果实。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述芽孢杆菌(Bacillus spp.)CGMCC 0175的菌液浓度为2.5×107-4.5×107cfu/mL；喷施的间隔时间为20天，喷施次数为5次。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述喷施的芽孢杆菌(Bacillusspp.)CGMCC 0175的菌液为益微SOD制剂的800-1200倍稀释液。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述喷施的芽孢杆菌(Bacillusspp.)CGMCC 0175的菌液为益微SOD制剂的1000倍稀释液。
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