CN1789240A - 2－取代酰氨基二羧酸类化合物、其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供具有如右通式(I)结构的2－取代酰氨基二羧酸类化合物或其药学上可接受的盐，该类化合物与PPAR蛋白配体结构域具有很高结合活性(K_D＝0.20μM)，能够降低PPAR和RXR的相互作用，并且在酵母双杂交系统中能够有效的抑制罗格列酮的活性(IC₅₀＝8.67μM)，哺乳动物反式激活试验中对罗格列酮的抑制活性IC₅₀＝31.9μM。因此该类化合物显示出极高的成药价值。本发明还提供了该类化合物的制备方法和药物组合物。

Description

2-取代酰氨基二羧酸类化合物、其制备方法及用途

技术领域

本发明涉及药物化学和药物治疗学领域，具体涉及2-取代酰氨基二羧酸类化合物、其制备方法及用途。

背景技术

过多的从饮食中摄入脂肪会很大的影响人体健康。许多证据表明，现代社会中许多疾病与摄取高脂肪含量饮食有关，比如：糖尿病，肥胖和心血管疾病等，这些疾病还会引起许多并发症，严重危害了身体健康并可能导致死亡。实验表明对啮齿类和灵长类动物供给低脂肪的食物可以延长其寿命和降低代谢和心血管紊乱的作用。然而随着社会发展和我们饮食结构的变化，高热量和高脂肪含量的食物比重越来越大，寻找治疗上述疾病和控制人体脂肪摄入的药物也成为了当务之急。与人体代谢疾病相关流行病学和动物饲养研究发现，热量的摄取对调控脂质代谢，胰岛素敏感性，葡萄糖代谢平衡以及动脉粥样硬化等有非常重要的作用。由此可以推测，动物必定有一套激素系统用于调控饮食中脂肪酸的吸收。Issemann于1990年首先发现的，PPAR对于调节饮食中脂肪在体内的代谢与沉积具有重要作用，由于它们能被一类脂肪酸样化合物(过氧化物酶体增殖剂PP(Peroxisome Proliferator))所激活而得名。进一步的研究发现，PPAR与糖尿病、肥胖症、坏脂血症、炎症、高血压和癌症等疾病都有关系。除此之外，PPAR的发现也使人们对脂肪酸作为一种激素的重要性有了更进一步的了解。因此，它引起了人们的极大关注。

PPAR共有三种亚型，即PPARα(NR1C1)，PPARγ(NR1C3)，PPARδ(NR1C2)。PPARδ在以前也有人称之为PPARβ，现已经统一称作PPARδ。hPPAR主要分为DBD(DNA结合结构域)和LBD(配体结合结构域)两大部分。LBD位于基因的C端，它与DBD之间为一段Hinge区连接。PPAR三种亚型之间的DBD和LBD的序列具有非常高的保守性，分别为85％和70％左右。同时PPAR作为核受体基因家族的成员与其他成员在结构域上也具有非常高的相似性。然而，PPAR三个成员之间的LBD口袋区域的氨基酸残基却有明显的序列差异性，这种差异性导致它们在药理学上呈现出一定的差异。三个成员除了LBD口袋区域有差异外，它们的N末端区域表现出非常低的同源性。近来的研究发现，N末端区域与各自的生物功能的差异性有关，并且有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)催化磷酸化PPAR的N末端区域会影响到受体转录活性和配体结合活性。

三种亚型中以PPARγ作用最显著，对其的研究也最多。PPARγ又可细分为三种成员，分别为PPARγ1，PPARγ2和PPARγ3。PPARγ1和PPARγ3编码同一种蛋白，而PPARγ2比PPARγ1在N末端多编码28个氨基酸。人源PPARγ基因有9个外显子分布在人染色体3p25区，其长度达100kb。PPARγ主要在脂肪细胞内表达，它是调节脂肪分化的重要转录因子。近年来的分子生物学实验已经确定PPARγ是胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类药物(Thiazolidinediones，TZDs)作用的靶分子。这类药物与PPARγ结合以后可以激活该受体。从而调控一系列重要的生理过程。一方面激活的PPARγ可以促进脂肪组织中某些与葡萄糖转运和利用相关基因的表达，如胰岛素受体和葡萄糖转运子4等；另一方面可以抑制体内肿瘤坏死因子和肥胖蛋白的分泌，减轻这两种蛋白产生的胰岛素抵抗，从而起到降低血糖的效果。可见PPARγ的活性与葡萄糖的吸收和利用之间有着非常密切的联系，因此，PPARγ配体将有希望成为一类全新的二型糖尿病治疗药物。合适的PPARγ配体可以提高胰岛素对其靶组织的敏感性，从而有效降低血糖，达到治疗效果。另外，PPARγ在调节细胞生长周期和单核/巨噬细胞生物学功能方面也起着重要作用，这提示了一个令人鼓舞的前景，即最初用于治疗糖尿病的药物有可能用于治疗其它疾病如肿瘤等。现在我们已经知道PPAR组成一个核受体家族，在脂生成和癌发生过程中具有广泛的生物作用，目前已知，PPARγ核受体是调节很多与癌症发生有关基因表达的转录因子，是发展治疗和预防癌症的重要靶点，PPARγ的表达异常是癌发生的危险因素。这就需要筛选更多的配体，包括它的激动剂和拮抗剂来探索PPAR类，尤其是研究PPARγ的各种功能。

由于PPAR发现之初并没有发现与其相互作用的配体因子，所以它们被称为核受体基因家族中的孤儿受体。进一步的研究中，与之相互作用的配体已经陆续发现了很多，这些配体被分为三大类：激动剂，半激动剂(半拮抗剂)和拮抗剂。

由于筛选方法都很多且较成熟，PPAR的激动剂已经发现了很多，它们大部分为TZD和不饱和脂肪酸衍生物。其中三个PPARγ的TZD类激动剂：罗格列酮rosiglitazone(Rezulin)，皮格列酮piogitazone(ACTOS)，和曲格列酮Troglitazone(Avandia)已被FDA认证通过，作为治疗2型糖尿病的药物已经在市场上销售。这些药物不论是作为单一的治疗用药还是与现存的治疗方式相结合，在治疗2型糖尿病上都前进了一步。但是进一步研究发现曲格列酮在能够激活PPARγ的剂量下也能激活另一核受体PXR(Pregnane X Receptor，孕烷X受体)表现出肝毒性，因此它已经在美国停止作为药物销售。虽然PPARγ的激动剂在治疗心血管疾病上有很大作用，不过在很多方面也表现出很多副作用，其中主要的就是导致服用者体重的增加。而PPAR拮抗剂在糖尿病的治疗中表现出更小的副作用，因此PPAR的拮抗剂具有更好的成药价值。

近年来，“计算机辅助药物设计”(Computer-Aided Drug Design，CADD)已成为现代药物研究与开发的一个重要方法和工具，将计算机辅助药物设计特别是计算机辅助组合化学库设计加入新药研究的循环，能缩短新药研究的周期，节省研究与开发费用，提高新药筛选的命中率。计算机辅助药物设计与其他现代药物研究方法结合，将推动药学和生命科学相关学科的迅速发展。CADD方法已广泛地应用于先导化合物的发现与优化，国际上一些大的制药公司充分重视这一技术在新药研究中的应用。经过多年努力，已有相当数量的通过计算机辅助药物设计的药物陆续上市，如Merck Sharp & Dohme(Harlow，UK)公司的碳酸酐酶抑制剂Dorzolamid，Roche(Welwyn，UK)公司的HIV蛋白酶抑制剂Saquinavir，Biota(Melbourne，Australia)公司的神经氨酸酐酶抑制剂Relenza和Roche(Basel，Switzerland)公司的凝血酶抑制剂Ro466240等；Searle公司开发的高选择性的COX-2抑制剂Celecoxib也是根据三维定量构效关系(3D-QSAR)研究结果设计的。“组合化学”(Combinatorial Chemistry)是近年来药物化学和合成化学中出现的一项新技术，能够迅速产生大量分子结构以进行高通量筛选(HighThroughput Screening)。组合化学方法一经出现，就引起了人们的广泛关注。先导化合物的发现和优化一直是药物化学研究的难点和重点。特别是近一、二十年来生物学和其他相关高新技术取得了长足进步，产生了基于细胞和分子水平的高通量筛选技术，更使得合成大量新结构类型的化合物成了药物研究的瓶颈。组合化学的出现对于解决这一问题提供了巨大的可能性。因此，“组合化学和高通量筛选”已成为继CADD又一药物研究的核心技术。“结构生物学”也从原来的基础研究进入应用研究阶段，其中的一个主要应用领域是在分子和原子结构水平上研究药物与靶蛋白的相互作用，测定药物—蛋白质复合物的晶体结构，为新化合物的设计和先导化合物的结构改造提供有益的结构信息。近年来，这方面的研究进展非常迅速，结构生物学技术和方法在抗艾滋病药物、抗感冒病毒药物和抗癌药物等研究中均得到了成功的应用。目前人类基因组测序已经完成，与生物信息学相结合，结构生物学将会在药物作用新靶标的发现中起重要作用。

本发明者根据PPAR的晶体结构，综合运用计算机辅助药物分子设计、组合化学、分子生物学和结构生物学方法，寻找具有PPAR抑制剂作用的先导化合物，并针对其生物学活性进行结构优化，本发明者发现了具有全新结构的2-取代酰氨基二羧酸类化合物与PPAR蛋白配体结构域具有很高结合活性(K_D＝0.20μM)，能够降低PPAR和RXR的相互作用，并且在酵母双杂交系统中能够有效的抑制罗格列酮的活性(IC₅₀＝8.67μM)，而在哺乳动物细胞水平对罗格列酮的抑制活性IC₅₀＝31.9μM。从而完成了本发明。

发明内容

本发明的一个目的是提供一类2-取代酰氨基二羧酸类化合物。

本发明的另一个目的是提供以3-取代吲哚烷基氨基酸为原料合成2-取代酰氨基二羧酸类化合物的方法。

本发明的再一个目的是提供含2-取代酰氨基二羧酸类化合物的医学用途。

本发明的又一个目的是提供运用生物传感器，利用表面离子共振原理，简单、快捷、低耗地筛选出分子水平上对PPAR有结合活性和抑制活性的化合物；接着用酵母双杂交系统，通过检测分泌型的产物α-半乳糖苷酶的活性来检测化合物的酵母细胞水平活性；用哺乳动物反式激活试验，通过检测荧光素酶活性来测定化合物的哺乳动物细胞水平活性。

本发明通过如下步骤实施

本发明提供具有如下通式(I)结构的2-取代酰氨基二羧酸类化合物或其药学上可接受的盐：

其中：

X，Y各自独立地选自O，S，NH

R₁选自氢，苄基，乙酰基，叔丁氧酰基；

当X＝O时，R₂＝R₃，可选自氢，C₁-C₃直链或支链烃基，苄基，环己基，芳香基Ar，5-7元芳香杂环(含有1-3个选自氧、硫、氮的杂原子)。

当X＝NH时，R₃＝H，R₂可选自氢，C₁-C₃直链或支链烃基，苄基，环己基，芳香基Ar，5-7元芳香杂环(含有1-3个选自氧、硫、氮的杂原子)。

当X，Y为O时，

Ar为

R₄，R₅各自独立选自氢，卤素，C₁-C₆直链或支链烃基，氰基，硝基，氨基，羟基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，C₁-C₄烷氧基，巯基，C₁-C₄酰基；

m是0-3的整数，n是0-3的整数

当X为NH，Y为O时

Ar为

R₄，R₅各自独立自氢，卤素，C₁-C₆直链或支链烃基，氰基，硝基，氨基，羟基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，C₁-C₄烷氧基，巯基，C₁-C₄酰基；

m是0-3的整数，n是0-3的整数

2位和3’位手性碳原子的绝对构型各自独立的选R型或S型。

本说明书中所述的“药学上可接受的盐”具体地可列举与丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、等有机酸和天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸形成酯后再与无机碱形成的盐，如钠、钾、钙、铝盐和铵盐，或与有机碱形成的盐，如甲胺盐、乙胺盐、乙醇胺盐等，或与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸等碱性氨基酸形成酯后的盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸的盐，或与甲酸、乙酸，苦味酸、甲磺酸、乙磺酸等有机酸的盐。

本发明式(I)化合物的一个优选实施方案是如下2-取代酰氨基二羧酸类化合物或其药学上可接受的盐：

其中，X，Y是O

R₁，R₂，R₃，m和n的定义同前所述1一致；

2位和3’位手性碳原子的绝对构型均为R型

Ar选自以下基团：

R₄，R₅各自独立自氢，卤素，C₁-C₆直链或支链烃基，氰基，硝基，氨基，羟基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，C₁-C₄烷氧基，巯基，C₁-C₄酰基；

本发明式(I)化合物的另一个优选实施方案是如下2-取代酰氨基二羧酸类化合物或其药学上可接受的盐：

其中，X是NH；Y是O；

R₁，R₂，R₃，m和n的定义同前所述1一致；

2位和3’位手性碳原子的绝对构型均为R型；

Ar选自以下基团：

R₄，R₅各自独立自氢，卤素，C₁-C₆直链或支链烃基，氰基，硝基，氨基，羟基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，C₁-C₄烷氧基，巯基，C₁-C₄酰基；

本发明式(I)化合物的又一个优选实施方案是如下2-取代酰氨基二羧酸类化合物或其药学上可接受的盐：

其中，X，Y是O；

R₁，R₂，R₃，m和n的定义同前所述1一致；

2位和3’位手性碳原子的绝对构型均为R型；

Ar选自以下基团：

R₄，R₅各自独立自氢，卤素，C₁-C₆直链或支链烃基，氰基，硝基，氨基，羟基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，C₁-C₄烷氧基，巯基，C₁-C₄酰基；

本发明式(I)化合物的又一个优选实施方案是如下2-取代酰氨基二羧酸类化合物或其药学上可接受的盐：

其中，X是NH，Y是O；

R₁，R₂，R₃，m和n的定义同前所述1一致；

2位和3’位手性碳原子的绝对构型均为R型；

Ar选自以下基团：

R₄，R₅各自独立自氢，卤素，C₁-C₆直链或支链烃基，氰基，硝基，氨基，羟基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，C₁-C₄烷氧基，巯基，C₁-C₄酰基；

本发明式(I)化合物的又一个优选实施方案是如下2-取代酰氨基二羧酸类化合物或其药学上可接受的盐：

其中，X，Y是O

R₁，R₂，R₃，m和n的定义同前所述1一致，2位和3’位手性碳原子的绝对构型均为S型；

Ar选自以下基团：

R₄，R₅各自独立自氢，卤素，C₁-C₆直链或支链烃基，氰基，硝基，氨基，羟基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，C₁-C₄烷氧基，巯基，C₁-C₄酰基；

本发明式(I)化合物的又一个优选实施方案是如下2-取代酰氨基二羧酸类化合物或其药学上可接受的盐：

其中，X是NH；Y是O

R₁，R₂，R₃，m和n的定义同前所述1一致，2位和3’位手性碳原子的绝对构型均为S型；

Ar选自以下基团：

R₄，R₅各自独立自氢，卤素，C₁-C₆直链或支链烃基，氰基，硝基，氨基，羟基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，C₁-C₄烷氧基，巯基，C₁-C₄酰基；

本发明提供式化合物I包含的(I_A)、(I_B)和(I_C)类化合物的制备方法。其中R₂，R₃，R₄，R₅，m，n的定义如上所述，2位和3’位手性碳原子的绝对构型各自独立的选R型或S型。

I_A类化合物的合成是以3-取代吲哚烷基氨基酸为原料，分别经叔丁氧酰基(BOC)保护，酯活化，酯化，N-酰化，脱保护制得。合成方法具体见Scheme 1中。

Scheme 1^a

^a(a)(i)BOC酸酐，dioxane/H₂O/DMF(4∶4∶1，v/v/v)，无机碱(如NaHCO₃)，0-20℃(ii)无机酸(如HCl)；(b)NMM，氯甲酸异丁酯，EtOAc(或CH₂Cl₂或CHCl₃)，＜10℃；(c)MeOH，SOCl2(或HCl)，20-40℃；(d)EtOAc(或CH₂Cl₂或CHCl₃)，＜10℃；(e)EtOAc(或CH₂Cl₂或CHCl₃)，＜0℃，CF₃COOH

I_B类化合物的合成是以取代苯烷基氨基酸为原料，分别经叔丁氧酰基(BOC)保护，酯活化，酯化，N-酰化，脱保护制得。合成方法具体见Schem 2中。

Scheme 2^a

^a(a)(i)BO℃酸酐，dioxane/H₂O/DMF(4∶4∶1，v/v/v)，无机碱(如NaHCO₃)，0-20℃(ii)无机酸(如HCl)；(b)NMM，氯甲酸异丁酯，EtOAc(或CH₂Cl₂或CHCl₃)，＜10℃；(c)MeOH，SOCl2(或HCl)，20-40℃；(d)EtOAc(或CH₂Cl₂或CHCl₃)，＜10℃；(e)EtOAc(或CH₂Cl₂或CHCl₃)，＜0℃，CF₃COOH

I_C类化合物的合成是以2-取代萘烷基氨基酸为原料，分别经叔丁氧酰基(BOC)保护，酯活化，酯化，N-酰化，皂化，脱保护制得。合成方法具体见Scheme 3中。

Scheme 3^a

^a(a)(i)BOC酸酐，dioxane/H₂O/DMF(4∶4∶1，v/v/v)，无机碱(如NaHCO₃)，0-20℃(ii)无机酸(如HCl)；(b)NMM，氯甲酸异丁酯，EtOAc(或CH₂Cl₂或CHCl₃)，＜10℃；(c)MeOH，SOCl2(或HCl)，20-40℃；(d)EtOAc(或CH₂Cl₂或CHCl₃)，＜10℃；(e)(i)MeOH(或THF，或两者混合液)，无机碱(如LiOH)(ii)无机酸(如HCl)；(f)EtOAc(或CH₂Cl₂或CHCl₃)，＜0℃，CF₃COOH

本发明利用的生物传感技术和酵母双杂交系统以及哺乳动物反式激活试验来验证PPAR拮抗剂活性的方法由下列步骤组成：

1、用生物传感器测定2-取代酰氨基二羧酸类化合物与PPARγLBD的结合活性(1)、6His标记PPARγLBD融合蛋白克隆：本步骤是借助基因工程上游方法，选用pET15b载体构建PPARγLBD融合蛋白的质粒(pET15b-PPARγLBD)。

a.用PCR技术从pcDNA3.1-PPARγ中获得PPARγLBD(206-475aa)的DNA片段(基因序列依据NM_138712(GENEBANK))。

引物：FW：5’AAC ATATGT CCG CTG ACC TCC GGG CCC T3’

RV：5’AAG GAT CCC TAG TAC AAG TCC TTG TAG ATC3’

95℃变性5min，开始循环95℃1min，58℃1min，72℃1min30s，重复29循环，72℃10min。采用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，回收DNA。

b.将PPARγLBD的PCR产物克隆到pET15b载体上：PPARγLBD的PCR产物和pET15b分别用Nde I和BamH I酶切；用试剂盒回收酶切产物，其中PPARγLBD回收的PCR酶切产物近800bp，pET15b酶切产物近5.7kb。用T4DNA连接酶连接；连接产物转化入感受态细胞DH5α；通过酶切鉴定和测序得到正确的克隆。

(2)、PPARγLBD表达纯化：本步骤运用了基因工程下游技术。

a.将构建好的pET15b-PPARγLBD转化入大肠杆菌BL21(DE3)中。挑取鉴定正确的克隆37摄氏度过夜培养于50ml LB培养基中(酵母提取物5g/L、胰蛋白胨10g/L和NaCl 10g/L)，并加入安苄青霉素至终浓度100mg/L。1∶1000转接到新鲜1升LB培养基中，当菌体长到OD600为0.6左右时，加入IPTG至终浓度0.2mM并将温度降至25摄氏度诱导蛋白表达5小时。5000g/分离心5分钟收集菌体，并分装到两个50ml离心管中放置于零下80摄氏度冰箱过夜。

b.超声破碎细菌，然后用NTA-Ni²⁺树脂纯化蛋白。

(3)、2-取代酰氨基二羧酸类化合物与PPARγLBD结合活性检测：本步骤运用了生物传感器Biacore3000及其相关技术。

a.将纯化后PPARγLBD蛋白透析到20mM磷酸缓冲液中(PH7.4)。然后将蛋白偶连到Biacore3000专用CM5芯片上。

b.将各个浓度的化合物2-取代酰氨基二羧酸类化合物配置到含0.1％DMSO的10mM HEPES-EP缓冲液中(HEPES 2.38g/L、NaCl 8.77g/L、0.5M EDTA 6ml和P200.5ml)。然后将各浓度梯度的2-取代酰氨基二羧酸类化合物流过芯片。通过Biacore3000自带软件拟合出2-取代酰氨基二羧酸类化合物与PPARγLBD的解离常数K_D。

2、用生物传感器测定2-取代酰氨基二羧酸类化合物抑制罗格列酮诱导增加的RXRαLBD与PPARγLBD结合活性：

(1)构建6His标记的RXRαLBD融合蛋白：本步骤是借助基因工程上游方法，选用pET22b载体构建RXRαLBD融合蛋白的质粒(pET22b-RXRαLBD)。

a.用PCR技术从pcDNA3.1-RXRα中获得RXRαLBD(223-462aa)的DNA片段(基因序列依据NM_002957(GENEBANK))。

引物：FW：5’AAT CAT ATG ACC AGC AGC GCC AAC3’

 RV：5’TAA CTC GAG CTA AGT CAT TTG GTG CGG3’

95℃变性5min，开始循环95℃1min，55℃1min，72℃1min30s，重复30循环，72℃10min。采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，回收DNA。

b.将RXRαLBD的PCR产物克隆到pET22b载体上：RXRαLBD的PCR产物和pET22b分别用NdeI和XhoI酶切；用试剂盒回收酶切产物，其中RXRα回收的PCR酶切产物近750bp，pET22b酶切产物近5.5kb。用T₄DNA连接酶连接；连接产物转化入感受态细胞DH5α；通过酶切和测序得到正确的克隆。

(2)RXRαLBD表达纯化：本步骤运用了基因工程下游技术。

a.将构建好的pET22b-RXRαLBD转化入大肠杆菌BL21(DE3)中。挑取鉴定正确的克隆37摄氏度过夜培养于50ml LB培养基中并加入安苄青霉素至终浓度100mg/L。1∶1000转接到新鲜1升LB培养基中，当菌体长到OD600为0.6左右时，加入IPTG至终浓度0.5mM并将温度降至25摄氏度诱导蛋白表达5小时。5000g/分离心5分钟收集菌体，并分装到两个50ml离心管中放置于零下80摄氏度冰箱过夜。

b.超声破碎细菌，然后用NTA-Ni²⁺树脂纯化蛋白。

(3)2-取代酰氨基二羧酸类化合物抑制RXRαLBD与PPARγLBD结合活性检测：本步骤运用了生物传感器Biacore3000及其相关技术：

a.将纯化后RXRαLBD蛋白透析到10mM HEPES-EP中。然后将蛋白偶连到Biacore3000专用CM5芯片上。

b.将PPARγLBD蛋白中加入10μM罗格列酮和各浓度梯度的2-取代酰氨基二羧酸类化合物。再将样品流经偶连有RXRαLBD芯片来检测2-取代酰氨基二羧酸类化合物对PPAR和RXR结合活性的影响。

3、酵母双杂交测定2-取代酰氨基二羧酸类化合物酵母细胞水平活性：

(1)、CBP和酵母GAL4AD融合蛋白(pGADT7-CBP)的质粒构建；

本步骤是借助基因工程方法，选用pGADT7载体构建CBP和酵母GAL4AD融合蛋白的质粒(pGADT7-CBP)。

a.用PCR技术从CMV-mCBP中获得CBP(1-464aa)的DNA片段(基因序列依据S66385(GENEBANK))：

引物：FW：5’AACATATGATGGCCGAGAACTTGCTGGACG 3’

      RV：5’AAGGATCCCTGTTGCCCTGCACCAACAG 3’

95℃变性8min，开始循环95℃1min，65℃1min，72℃2min30s，重复30循环，72℃10min。采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，回收DNA。

b.将CBP(1-464aa)的PCR产物克隆到pGADT7载体上：CBP(1-464aa)的PCR产物和pGADT7分别用Nde I和BamH I酶切；用试剂盒回收酶切产物，其中回收CBP(1-464aa)的PCR酶切产物近1400bp，pGADT7酶切产物近8.0kb。用T₄DNA连接酶连接；连接产物转化入感受态细胞DH5α；通过酶切鉴定挑选正确的克隆。

(2)、PPARγLBD和酵母GAL4LBD融合蛋白(pGBKT7-PPARγLBD)的质粒构建；本步骤是借助基因工程方法，选用pGBKT7载体构建PPARγLBD和酵母GAL4DNA-BD融合蛋白的质粒(pGBKT7-PPARγLBD)。

a.利用PCR技术从pcDNA3.1-PPARγ中获得PPARγLBD(193aa-475aa)的DNA片段：

引物：FW：5’AACATATGGCGGAGATCTCCAGT 3’

RV：5’AAGTCGACCTAGTACAAGTCCTT3’

95℃变性8min，开始循环95℃1min，65℃1min，72℃1min30s，重复30循环，72℃10min。采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，回收DNA。

b.将PPARγLBD的PCR产物克隆到pGBKT7载体上：PPARγLBD的PCR产物和pGBKT7分别用Nde I和Sal I酶切；用试剂盒回收酶切产物，其中回收PPARγLBD的PCR酶切产物近850bp，pGBKT7酶切产物近7.3kb；用T4DNA连接酶连接；连接产物转化入感受态细胞DH5α；通过酶切鉴定挑选正确的克隆。

(3)、将pGADT7-CBP与pGBKT7-PPARγLBD共转化入酵母细胞AH109中：采用LiAc转化法。先将pGBKT7-PPARγLBD质粒转化入酵母细胞AH109中，用色氨酸缺陷(T-)的培养基筛选阳性克隆，然后将pGADT7-CBP质粒转化入含有pGBKT7-PPARγLBD质粒的酵母中，用色氨酸，亮氨酸双缺陷(T-L-)的培养基筛选阳性克隆，得到同时含有pGADT7-CBP质粒和pGBKT7-PPARγLBD质粒的酵母细胞。

(4)、通过测定α-半乳糖苷酶的活性检测化合物活性：

在得到的稳定表达pGADT7-CBP和pGBKT7-PPARγLBD的阳性酵母细胞中加入罗格列酮(阳性激动剂)、GW9662(阳性拮抗剂)及化合物2-取代酰氨基二羧酸类化合物，当酵母细胞生长至OD600到0.8至1.0时，通过测定410nm光吸收来检测α-半乳糖苷酶的活性，并计算其抑制率。抑制率的计算公式为：

抑制率＝[(2-取代酰氨基二羧酸类化合物+罗格列酮)的酶活力-罗格列酮酶活力]/(DMSO酶活力-罗格列酮酶活力)×100％

有益效果：本发现找到了一种高活性的PPAR拮抗剂2-取代酰氨基二羧酸类化合物。

4、哺乳动物反式激活试验测定2-取代酰氨基二羧酸类化合物细胞水平活性：

(1)、RXRα哺乳动物表达质粒pcDNA3.1-RXRα的构建；

本步骤是借助基因工程方法，将全长RXRα接入pcDNA3.1载体多克隆位点构建RXRα哺乳动物表达质粒pcDNA3.1-RXRα。

a.用PCR技术从pMT-RXRα中获得RXRα的DNA片段(基因序列依据NM_002957(GENEBANK)：

引物：FW：5’ATAAGCTTATGGACACCAAACATTTCCTGC 3’

      RV：5’ATGAATTCCTAAGTCATTTGGTGCGGCGC 3’

95℃变性5min，开始循环95℃1min，65℃1min，72℃1min30s，重复30循环，72℃10min。采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，回收DNA。

b.将RXRα的PCR产物克隆到pcDNA3.1载体上：RXRα的PCR产物和pcDNA3.1分别用HindIII和EcoRI酶切；用试剂盒回收酶切产物，其中回收RXRα的PCR酶切产物近1.5kb，pcDNA3.1酶切产物近5.5kb。用T₄DNA连接酶连接；连接产物转化入感受态细胞DH5α；通过酶切鉴定挑选正确的克隆。

(2)细胞培养和转染；

用含10％胎牛血清的DMEM细胞培养基37摄氏度5％二氧化碳孵箱中培养COS-7细胞。细胞在25平方厘米培养瓶中调养，每24小时更换培养基，并用PBS清洗细胞碎片一次。当细胞覆盖率达90％左右时，将细胞接种到24孔板中。孵育过夜后，细胞覆盖率达到70％左右。用脂质体PPAR、RXR和报告基因以及内参质粒pSV-beta-gal共转染入细胞。

(3)待测化合物加入和活性检测；

质粒转染后24小时，加入加入罗格列酮(阳性激动剂)、GW9662(阳性拮抗剂)及化合物2-取代酰氨基二羧酸类化合物，测定OD410nM时β半乳糖苷酶活性和萤火虫荧光素酶底物产生的荧光强度。当各孔OD410在同一水平时(说明转染效率相同)，抑制率的计算公式为：

抑制率＝[(2-取代酰氨基二羧酸类化合物+罗格列酮)的酶活力-罗格列酮酶活力]/(DMSO酶活力-罗格列酮酶活力)×100％

有益效果：本发现在哺乳动物细胞水平证实了一种高活性的PPAR拮抗剂2-取代酰氨基二羧酸类化合物的活性。

该类拮抗剂可用于与PPAR相关疾病研究和治疗，包括II型糖尿病、肥胖症、动脉粥样硬化、坏脂血、以及血糖、血脂异常等代谢类疾病。

本发明的2-取代酰氨基二羧酸类化合物的制备方法具有反应条件温和、原料丰富易得、操作及后处理简单等优点。

本发明的2-取代酰氨基二羧酸类化合物在计算机虚拟筛选以及PPAR蛋白配体结合实验中，具有很高结合活性(K_D＝0.20μM)，能够降低PPAR和RXR的相互作用，在酵母双杂交系统中能够有效的抑制罗格列酮的活性(IC₅₀＝8.67μM)并且在哺乳动物反式激活试验中同样有效的抑制了罗格列酮的活性(IC₅₀＝31.9μM)从而完成了本发明。

本发明的化合物毒性很低。

附图说明

图1是SDS-PAGE电泳考马氏亮蓝染色检测纯化后PPARγLBD蛋白。左起第一泳道为蛋白分子量标准；后三泳道为纯化过程中收集的不同洗脱体积的样品。如图所示，蛋白纯度大于95％。

图2是不同浓度的2-取代酰氨基二羧酸类化合物与PPARγLBD蛋白结合的Biacore3000检测图，通过Biacore自带软件分析得到其K_D＝0.20μM。

图3是SDS-PAGE电泳考马氏亮蓝染色检测纯化后RXRαLBD蛋白。左起第一泳道为蛋白分子量标准；后两泳道为纯化过程中收集的不同洗脱体积的样品。如图所示，蛋白纯度大于95％。

图4是罗格列酮和GW9662对RXRαLBD与PPARγLBD结合活性影响的Biacore检测图，由图所示罗格列酮以浓度依赖方式促进RXRαLBD与PPARγLBD的结合，而GW9662可以有效地抑制罗格列酮的作用。

图5是2-取代酰氨基二羧酸类化合物对RXRαLBD与PPARγLBD结合活性影响的Biacore检测图，由图所示2-取代酰氨基二羧酸类化合物可以有效地抑制罗格列酮地作用。

图6是酵母双杂交检测不同浓度2-取代酰氨基二羧酸类化合物对20μM罗格列酮活性地抑制作用，IC50＝8.67μM。

图7是哺乳动物反式激活试验检测不同浓度2-取代酰氨基二羧酸类化合物对0.1μM罗格列酮活性地抑制作用，IC50＝31.9μM。

具体实施方式

下面进一步用实施例说明式(I)化合物的制备，但这些实施例绝不是对本发明的任何限制。

核磁共振谱在Bruker AM-400上测定，质谱在MAT-95型质谱仪上进行。元素分析由中科院上海药物研究所分析室完成。熔点在电热熔点管或b型熔点管上测定，温度计未经校正；簿层层析(TLC)采用硅胶GF₂₅₄(青岛海洋化工厂生产)与浓度为0.8％的羧甲基纤维素钠蒸馏水溶液充分搅匀后铺板，晾干，经100～110℃活化1～2小时后于干燥器内保存备用，紫外灯(λ：254nm)显色；柱层析采用100目～200目柱层析硅胶(青岛海洋化工厂生产)。

实施例1

N-叔丁氧羰基-L-色氨酸(II-1)

L-色氨酸(2.04g，10mmol)，BOC酸酐(6.54g，30mmol)，加入二氧六环、水、DMF的混合溶剂45ml中(4∶4∶1，v/v/v)，室温搅拌下，分批加入NaHCO₃(6.54g，30mmol)，继续室温搅拌10小时，减压蒸除溶剂，所得固体溶于适量水中，6N HCl调PH＝6-7，析出大量固体，抽滤水洗，干燥，所得固体用无水甲醇重结晶得产物。

实施例2

L-谷氨酸二甲酯盐酸盐(III-1)

L-谷氨酸(0.75g，5mmol)加入到甲醇10ml中，冰浴冷却搅拌下，滴加SOCl₂(1.1ml，15mmol)，完毕后转为室温搅拌24小时，减压蒸除溶剂得产品。

实施例3

N-(N-叔丁氧羰基-L-色氨酰基)-L-谷氨酸二甲酯(IV-1)

II-1(0.45g，1.5mmol)加入到乙酸乙酯20ml中，冰盐浴冷至-12℃，加入NMM(0.36ml，3.2mmol)，搅拌下滴加氯甲酸异丁酯(0.22g，1.6mmol)溶于乙酸乙酯(5ml)的溶液，加毕，在此温度下继续搅拌20分钟，分批加入III-1(0.32g，1.5mmol)，然后自然升至室温搅拌10小时，加入30ml水，分出有机层，依次用饱和NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液、水洗，干燥，减压蒸除溶剂，所得残余物硅胶柱层析分离的产品。

实施例4

N-L-色氨酰基-L-谷氨酸二甲酯(I_A-1)

IV-1(0.46g，1mmol)加入到10mlDCM中，冰浴冷却下，滴加三氟乙酸(5ml)，然后自然升至室温搅拌10小时，减压蒸除溶剂，加适量的水，冻干得产品。

实施例5

N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸(V-1)

L-苯丙氨酸(1.65g，10mmol)，BOC酸酐(6.54g，30mmol)，加入二氧六环、水、DMF的混合溶剂45ml中(4∶4∶1，v/v/v)，室温搅拌下，分批加入NaHCO₃(6.54g，30mmol)，继续室温搅拌10小时，减压蒸除溶剂，所得固体溶于适量水中，6N HCl调PH＝6-7，析出大量固体，抽滤水洗，干燥，所得固体用无水甲醇重结晶得产物

实施例6

L-谷氨酰胺甲酯盐酸盐(VI-1)

L-谷氨酰胺(0.73g，5mmol)加入到甲醇30ml中，冰浴冷却搅拌下，滴加SOCl₂(0.55ml，7.5mmol)，完毕后转为室温搅拌24小时，减压蒸除溶剂得产品。

实施例7

N-(N-叔丁氧羰基-L-苯丙酰基)-L-谷氨酰胺甲酯(VII-1)

V-1(0.25g，1.5mmol)加入到乙酸乙酯20ml中，冰盐浴冷至-12℃，加入NMM(0.36ml，3.2mmol)，搅拌下滴加氯甲酸异丁酯(0.22g，1.6mmol)溶于乙酸乙酯(5ml)的溶液，加毕，在此温度下继续搅拌20分钟，分批加入VI-1(0.24g，1.5mmol)，然后自然升至室温搅拌10小时，加入30ml水，分出有机层，依次用饱和NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液、水洗，干燥，减压蒸除溶剂，所得残余物硅胶柱层析分离的产品。

实施例8

N-L-苯丙酰基-L-谷氨酰胺甲酯(I_B-1)

VII-1(0.41g，1mmol)加入到10mlDCM中，冰浴冷却下，滴加三氟乙酸(5ml)，然后自然升至室温搅拌10小时，减压蒸除溶剂，加适量的水，冻干得产品。

实施例9

N-叔丁氧羰基-L-3-(2-萘基)丙氨酸(VIII-1)

L-3-(2-萘基)丙氨酸(2.15g，10mmol)，BOC酸酐(6.54g，30mmol)，加入二氧六环、水、DMF的混合溶剂45ml中(4∶4∶1，v/v/v)，室温搅拌下，分批加入NaHCO₃(6.54g，30mmol)，继续室温搅拌10小时，减压蒸除溶剂，所得固体溶于适量水中，6N HCl调PH＝6-7，析出大量固体，抽滤水洗，干燥，所得固体用无水甲醇重结晶得产物

实施例10

N-(N-叔丁氧羰基-L-3-(2-萘基)丙氨酰基)-L-谷氨酸二甲酯(IX-1)

VIII-1(0.47g，1.5mmol)加入到乙酸乙酯20ml中，冰盐浴冷至-12℃，加入NMM(0.36ml，3.2mmol)，搅拌下滴加氯甲酸异丁酯(0.22g，1.6mmol)溶于乙酸乙酯(5ml)的溶液，加毕，在此温度下继续搅拌20分钟，分批加入III-1(0.32g，1.5mmol)，然后自然升至室温搅拌10小时，加入30ml水，分出有机层，依次用饱和NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液、水洗，干燥，减压蒸除溶剂，所得残余物硅胶柱层析分离的产品。

实施例11

N-(N-叔丁氧羰基-L-3-(2-萘基)丙氨酰基)-L-谷氨酸(X-1)

IV-1(0.47g，1mmol)加入到甲醇20ml中，冰浴冷却下加入LiOH.H₂O(0.13g，3mmol)，然后自然升至室温搅拌24小时，加入50ml水，1N HCl调PH＝2-3，乙酸乙酯提取，干燥，减压蒸除溶剂得产品。

实施例12

N-L-3-(2-萘基)丙氨酰基-L-谷氨酸(I_C-1)

X-1(0.45g，1mmol)加入到10mlDCM中，冰浴冷却下，滴加三氟乙酸(5ml)，然后自然升至室温搅拌10小时，减压蒸除溶剂，加适量的水，冻干得产品。

实施例13

N-L-色氨酰基-L-天冬氨酸二甲酯(I_A-2)

将L-谷氨酸(0.75g，5mmol)替换成L-天冬氨酸(0.66g，5mmol)，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-4制得目标物。

实施例14

2-L-色氨酰氨基-L-己二酸二甲酯(I_A-3)

将L-谷氨酸(0.75g，5mmol)替换成2-氨基-L-己二酸(0.81g，5mmol)，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-4制得目标物。

实施例15

N-L-苯丙酰基-L-天冬酰胺甲酯(I_B-2)

将L-谷氨酰胺(0.73g，5mmol)替换成L-天冬酰胺(0.66g，5mmol)，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5-8制得目标物。

实施例16

N-(4-甲氧基-L-苯丙酰基)-L-谷氨酰胺甲酯(I_B-3)

将L-苯丙氨酸(1.65g，10mmol)替换成4-甲氧基-L-苯丙氨酸(1.95g，10mmol)，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5-8制得目标物。

实施例17

N-(4-氟-L-苯丙酰基)-L-谷氨酰胺甲酯(I_B-4)

将L-苯丙氨酸(1.65g，10mmol)替换成4-氟-L-苯丙氨酸(1.83g，10mmol)，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5-8制得目标物。

实施例18

N-L-3-(2-萘基)丙氨酰基-L-天冬氨酸(I_C-2)

将L-谷氨酸(0.75g，5mmol)替换成L-天冬氨酸(0.66g，5mmol)，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例2，9-12制得目标物。

实施例19

N-L-3-(2-萘基)丙氨酰基-D-天冬氨酸(I_C-3)

将L-谷氨酸(0.75g，5mmol)替换成D-天冬氨酸(0.66g，5mmol)，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例2，9-12制得目标物。

实施例20

2-L-3-(2-萘基)丙氨酰氨基-L-己二酸(I_C-4)

将L-谷氨酸(0.75g，5mmol)替换成2-氨基-L-己二酸(0.81g，5mmol)，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例2，9-12制得目标物。

下面再结合具体筛选实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。

下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括：

NTA-Ni²⁺树脂购自Novagen公司；

Biacore3000专用CM5芯片购自安玛西亚公司；

酵母菌株AH109(基因型为MATa，trp1-901，leu2-3，112，ura3-52，his3-200，gal4，gal80LYS2：：GAL 1UAS-GAL 1TATA-HIS3，MEL1UAS-MEL1TATA-MEL1，GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2，URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-lacZ)、酵母表达质粒pGBKT7和pGADT7为中科院上海生命科学学院龚毅教授惠赠；

COS-7细胞由上海生物化学与细胞研究所提供；

模板CMV-mCBP由M.G.Rosenfeld提供；

模板pcDNA3.1-PPARγ由成都地奥公司提供；

模板pMT-RXRα由美国盐湖城研究所的Mangerdorf提供；

报告基因PPRE3-TK-luc由美国盐湖城研究所Evan提供；

限制性内切酶、DNA聚合酶、连接酶、dNTP等均购自TaKaRa公司；

10×buffer随pyrobet^TM DNA聚合酶一起购自TaKaRa公司；

胶回收试剂盒购自华舜公司；

氨苄青霉素、卡那霉素、Ni₂SO₄、咪唑、Tris、NaCl、HEPES、DMSO、LiAc、PEG 3500、PNP-α-Gal、各培养基的配制原料均购自sigma公司；

DMEM购自美国Gibco/BRL公司；

胎牛血清购自美国HyClone公司；

脂质体Transfectamine2000购自Invitrogen公司；

去内毒素质粒纯化试剂盒和萤火虫荧光素酶报告基因测活试剂盒Steady-Glo LuciferaseAssay购自美国Promega公司。

SS-carrier DNA购自Strategene；

DNAmarker购自鼎国生物公司；

引物合成与DNA测序由上海博亚公司完成；

96孔板、24孔板和细胞培养瓶均购自丹麦Nunc公司。

96孔白色平底冷光检测板购自美国Corning公司；

下述实施例中常规的基因操作参照有关文献，其中限制性酶切方法参照分子克隆第二版：P259-P262；用T₄ DNA连接酶连接方法参照分子克隆第二版：P282-P283；连接产物转化入感受态细胞DH5α方法参照分子克隆第二版：P55-P56；用酶切鉴定方法参照分子克隆第二版：P259-P262；此外琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物方法参照分子克隆第二版：P680-P682；胶回收按照华舜公司的试剂盒说明书；蛋白纯化方法参照His-Bind Kit(Novagen)；蛋白偶连到CM5芯片方法按照Biacore3000自带软件进行；质粒提取方法参照C.Hoffman and F.Winston，Gene 57：267；1987；LB培养基的配制方法参照分子克隆第二版：P908；酵母各培养基的配制方法参照Yeast Protocol Handbook(CLONTECH)。

实施例1  PPARγLBD和pET15b融合蛋白(pET15b-PPARγLBD)的质粒构建：

(一)试验方法：

1)以pcDNA3.1-PPARγ为模板，用PCR技术复制扩增获得PPARγLBD(206-475aa)的DNA片段(基因序列依据NM_138712(GENEBANK))：

引物设计：FW：5’AAC ATA TGT CCG CTG ACC TCC GGG CCC T3’

          RV：5’AAG GAT CCC TAG TAC AAG TCC TTG TAG ATC3’

PCR扩增反应(体系100μl)：

pcDNA3.1-PPARγ模板：2μl；10×buffer：10μl；dNTP(2.5mM)：8μl；FW：4μl；RV：4μl；pyrobest^TM DNA聚合酶：1μl；水：71μl。

反应条件为95℃变性5min，开始循环95℃1min，58℃1min，72℃1min30s，重复29循环，72℃10min。

采用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，回收DNA。

2)将PPARγLBD(206-475aa)的PCR产物克隆到pET15b载体上

PPARγLBD(206-475aa)的PCR产物和pET15b分别用Nde I和BamH I酶切；用试剂盒方法回收酶切产物，其中回收PPARγLBD(206-475aa)的PCR酶切产物近800bp；pET15b酶切产物近5.7kb；用T4DNA连接酶连接；连接产物转化入感受态细胞DH5α；涂布在含氨苄青霉素(100mg/l)的平板上；用酶切鉴定挑选正确的克隆，并送往测序。

(二)试验结果：

1)采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。酶切鉴定结果：在载体上187bp，1666bp处有两个EcoRV的酶切位点，319bp-331bp间为多克隆位点，PPARγLBD(206-475aa)就克隆在这个区域内，因而正确的克隆应切出约2300bp和4200bp左右的两片段。

2)DNA测序报告也显示pET15b-PPARγLBD中PPARγLBD的序列与NM_138712(GENEBANK)中序列完全一致。

实施例2  6His标记PPARγLBD融合蛋白(pET15b-PPARγLBD)的表达纯化：

(一)试验方法：

1、将pET15b-PPARγLBD转化入大肠杆菌BL21中，酶切鉴定得到正确的克隆。挑取单克隆到50ml含100mg/L安苄青霉素的LB培养基中，37摄氏度摇床中250rpm培养过夜。然后按1∶1000转接到1升含100mg/L安苄青霉素的LB培养基中，当OD600达到0.6时，将温度降到25摄氏度，并加入0.2mM的IPTG诱导5小时。5000rpm收集细菌到两个50ml离心管中。零下80度冰箱放置过夜。取出收集的菌体，重悬于20ml Binding buffer中(10mM咪唑、500mM NaCl和20mM Tris，PH8.0)，超声破碎。15000rpm离心20分钟，取上清穿过NTA-Ni柱。先用5倍体积的Binding buffer洗去杂蛋白，进一步用Washing buffer洗去杂蛋白(60mM咪唑、500mM NaCl和20mM Tris，PH8.0)。最后用Elute buffer将PPARγLBD洗下(120mM咪唑、500mM NaCl和20mM Tris，PH8.0)。

(二)试验结果：

10％SDS-PAGE电泳并用考马氏亮蓝染色检测蛋白，如图1：PPARγLBD蛋白全长270个氨基酸残基，再加上6个组胺酸，整个蛋白约为30KD。染色后的电泳胶上可以清楚的看到单一的一条30KD的条带，如图一所示，最左边道为蛋白分子量标准，后三道纯化时收集的不同洗脱体积的PPARγLBD蛋白。

实施例3  生物传感器检测2-取代酰氨基二羧酸类化合物与蛋白PPARγLBD结合活性：

(一)试验方法：

将PPARγLBD蛋白透析到20mM磷酸缓冲液(PH7.4)。Biacore3000系统运行环境为10mMHEPES-EP(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA和500μl P20)缓冲液。按照BIAcore手册所述方法将蛋白偶连到Biacore3000专用CM5芯片上。HEPES-EP配置不同浓度的2-取代酰氨基二羧酸类化合物，DMSO的终浓度都为0.1％。将不同浓度2-取代酰氨基二羧酸类化合物流经PPARγLBD芯片，然后利用系统自带分析软件得到该化合物与PPARγLBD的K_D。

(二)试验结果：

2-取代酰氨基二羧酸类化合物表现出跟PPARγLBD很高的结合活性K_D＝0.20μM。如图2所示，从结合曲线可以看出：化合物跟芯片上的蛋白可以很快结合达到平台，然后又很容易脱离解离开，说明该化合物可以很轻易进出PPARγLBD的结合口袋。

实施例4  RXRαLBD和pET22b融合蛋白(pET22b-PPARγLBD)的质粒构建：

(一)试验方法：

1)以pcDNA3.1-RXRα为模板，用PCR技术复制扩增获得RXRαLBD(223-462aa)的DNA片段(基因序列依据NM_002957(GENEBANK))：

引物设计：FW：5’AAT CATATGACC AGC AGC GCC AAC3’

RV：5’TAA CTC GAG CTAAGT CAT TTG GTG CGG3’

PCR扩增反应(体系100μl)：

pcDNA3.1-RXRα模板：2μl；10×buffer：10μl；dNTP(2.5mM)：8μl；FW：4μl；RV：4μl；pyrobest^TM DNA聚合酶：1μl；水：71μl。

反应条件为95℃变性5min，开始循环95℃1min，55℃1min，72℃1min30s，重复29循环，72℃10min。

采用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，回收DNA。

2)将RXRαLBD(223-462aa)的PCR产物克隆到pET22b载体上

RXRαLBD(223-462aa)的PCR产物和pET22b分别用Nde I和Xho I酶切；用试剂盒方法回收酶切产物，其中回收RXRαLBD(223-462aa)的PCR酶切产物近750bp；pET22b酶切产物近5.5kb；用T₄DNA连接酶连接；连接产物转化入感受态细胞DH5α；涂布在含氨苄青霉素(100mg/l)的平板上；用酶切鉴定挑选正确的克隆，并送往测序。

(二)试验结果：

1)采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。酶切鉴定结果：在载体上217bp，1564bp处有两个EcoRV的酶切位点，158bp-326bp间为多克隆位点，RXRαLBD(223-462aa)就克隆在这个区域内，因而正确的克隆应切出约2100bp和4200bp左右的两片段。

2)DNA测序报告：pET22b-RXRαLBD表达载体测序报告显示，pET22b-RXRαLBD测序结果和RXRαLBD(223-462aa)原DNA序列比较，完全正确。

实施例5  6His标记RXRαLBD融合蛋白(pET22b-RXRαLBD)的表达纯化：

(一)试验方法：

将pET22b-RXRαLBD转化入大肠杆菌BL21中，酶切鉴定得到正确的克隆。挑取单克隆到50ml含100mg/L安苄青霉素的LB培养基中，37摄氏度摇床中250rpm培养过夜。然后按1∶1000转接到1升含100mg/L安苄青霉素的LB培养基中，当OD600达到0.6时，将温度降到25摄氏度，并加入0.5mM的IPTG诱导5小时。5000rpm收集细菌到两个50ml离心管中。零下80度冰箱放置过夜。取出收集的菌体，重悬于20ml Binding buffer中(10mM咪唑、500mM NaCl和20mM Tris，PH8.0)，超声破碎。15000rpm离心20分钟，取上清穿过NTA-Ni柱。先用5倍体积的Binding buffer洗杂蛋白，进一步用Washing buffer洗去杂蛋白(60mM咪唑、500mM NaCl和20mM Tris，PH8.0)。最后用Elute buffer将PPARγLBD洗下(150mM咪唑、500mM NaCl和20mM Tris，PH8.0)。

(二)试验结果：

10％SDS-PAGE电泳并用考马氏亮蓝染色检测蛋白，RXRαLBD蛋白全长240个氨基酸残基，再加上6个组胺酸，整个蛋白约为28KD。染色后的电泳胶上可以清楚的看到单一的一条28KD的条带。如图3，最左边道为蛋白分子量标准，后二道纯化时收集的不同洗脱体积的RXRαLBD蛋白。

实施例6  生物传感器检测2-取代酰氨基二羧酸类化合物对蛋白PPARγLBD和RXRαLBD结合活性的抑制作用：

(一)试验方法：

将RXRalphaLBD蛋白透析到20mM磷酸缓冲液(PH7.4)。Biacore3000系统运行环境为10mMHEPES-EP(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA和500μl P20)缓冲液。利用系统所带的程序将蛋白偶连到Biacore3000专用CM5芯片上。将0.2mM的PPARγLBD蛋白分别加入DMSO、罗格列酮、(罗格列酮+GW9662)和(罗格列酮+2-取代酰氨基二羧酸类化合物)一起孵育30分钟。再将样品流经RXRαLBD芯片，检测PPARγLBD与RXRαLBD的结合强度。

(二)试验结果：

1)0.2mM PPARγLBD与RXRαLBD的结合加入10mM的罗格列酮比没有加的Ru值明显增加，并且随罗格列酮浓度的增加结合加强。而GW9662的加入则会降低罗格列酮的增强作用。如图4所示，由上而下第一条为0.2mMPPARγLBD蛋白中加入100μM的罗格列酮(DMSO终浓度为1％)、第二条为0.2mMPPARγLBD蛋白中加入10μM的罗格列酮(DMSO终浓度为1％)、第三条0.2mMPPARγLBD蛋白中加入1％DMSO、第四条为0.2mMPPARγLBD蛋白中加入10μM的罗格列酮和10μM的GW9662(DMSO终浓度为1％)。如图可见：罗格列酮对RXRαLBD与PPARγLBD的结合的促进作用具有浓度依赖性，而GW9662可以有效地抑制罗格列酮的作用。该试验充分说明用此方法检测拮抗剂活性是可行的。

2)与上面步骤相同加入10μM的2-取代酰氨基二羧酸类化合物，该化合物能够有效的降低罗格列酮对PPARγ与RXRα的结合的增强作用。如图5所示，由上而下分别为第一条0.2mMPPARγLBD蛋白中加入10μM罗格列酮、第二条0.2mMPPARγLBD蛋白中加入10μM罗格列酮和10μM 2-取代酰氨基二羧酸类化合物、第三条0.2mMPPARγLBD蛋白中加入1％DMSO。所有样品DMSO终浓度都为1％。

实施例7  CBP和酵母GAL4AD融合蛋白(pGADT7-CBP)的质粒构建：

(一)试验方法：

1)以CMV-mCBP为模板，用PCR技术复制扩增获得CBP(1-464aa)的DNA片段(基因序列依据S66385(GENEBANK))：

引物设计：FW：5’AACATATGATGGCCGAGAACTTGCTGGACG 3’

          RV：5’AAGGATCCCTGTTGCCCTGCACCAACAG 3’

PCR扩增反应(100μl)：

CMV-mCBP模板：2μl；10×buffer：10μl；dNTP(2.5mM)：8μl；FW：4μl；RV：4μl；pyrobestTMDNA聚合酶：1μl；水：71μl。

反应条件为95℃变性8min，开始循环95℃1min，65℃1min，72℃2min30s，重复30循环，72℃10min。

采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，回收DNA。

2)将CBP(1-464aa)的PCR产物克隆到pGADT7载体上

CBP(1-464aa)的PCR产物和pGADT7分别用Nde I和BamH I酶切；用试剂盒方法回收酶切产物，其中回收CBP(1-464aa)的PCR酶切产物近1400bp；pGADT7酶切产物近8.0kb；用T4DNA连接酶连接；连接产物转化入感受态细胞DH5α；涂布在含氨苄青霉素(100mg/l)的平板上；用酶切鉴定挑选正确的克隆。

(二)试验结果：

1、采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。酶切鉴定结果：在载体上1480bp，2280bp处有两个Hind III的酶切位点，1480bp-2280bp间存在着多克隆位点，CBP就克隆在这个区域内，因而正确的克隆应切出约2200bp和7.2kb左右的片段。

2、DNA测序结果与S66385(GENEBANK)上序列完全一致。

实施例8  PPARγLBD和酵母GAL4BD融合蛋白(pGBKT7-PPARγLBD)的构建：

(一)试验方法：

以pcDNA3.1-PPARγ为模板，用PCR技术复制扩增获得PPARγLBD(193aa-475aa)的DNA片段(基因序列依据NM_138712(GENEBANK))：

引物设计：FW：5’AACATATGGCGGAGATCTCCAGT 3’

          RV：5’AAGTCGACCTAGTACAAGTCCTT 3’

PCR扩增反应(100μl)：

pcDNA3.1-PPARγ模板：2μl；10×buffer：10μl；dNTP(2.5mM)：8μl；FW：4μl；RV；4μl；pyrobest聚合酶：1μl；水：71μl。

反应条件为95℃变性8min，开始循环95℃1min，65℃1min，72℃1min30s，重复30循环，72℃10min。

采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，回收DNA。

2)将PPARγLBD的PCR产物克隆到pGBKT7载体上：

PPARγLBD的PCR产物和pGBKT7分别用Nde I和Sal I酶切；用试剂盒方法回收酶切产物(回收PPARγLBD的PCR酶切产物近850bp；pGBKT7酶切产物近7.3kb)；用T4DNA连接酶连接；连接产物转化入感受态细胞DH5α；涂布在含卡那霉素(50mg/l)的平板上用酶切鉴定，挑选正确的克隆。

(二)试验结果：

1、采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。酶切鉴定结果：在载体上6313bp处有一个EcoRV的酶切位点，PPARγLBD基因内部16bp处也有一个EcoRV的酶切位点，因而正确的克隆应切出约2200bp和6kb左右的片段。如图7所示，经进一步酶切鉴定结果显示确实有正确的克隆。

2、DNA测序显示PPARγLBD DNA测序结果和NM 138712(GENEBANK)完全一致。

实施例9  将pGADT7-CBP与pGBKT7-PPARγLBD分步转入酵母细胞AH109中

(一)试验方法

1)按LiAC法将质粒pGBKT7-PPARγLBD转入酵母细胞AH109：

接种酵母菌株AH109于约3ml YPDA中，30℃、250rpm培养16-18h(OD600约为1.4)；菌液按1∶5转接于新鲜的YPDA中，30℃、200rpm培养5-7h(OD600至0.8～1.2)；取10ml菌液，4000rpm离心5min收集酵母细胞；弃上清，1ml无菌水重悬，转移入另一离心管中，再加入约10ml无菌水，混匀；再次4000rpm离心5min收集酵母细胞；弃上清，1ml无菌水重悬，转移入1.5ml eppendorf管中；4000rpm离心5min收集酵母细胞，小心吸去上清；依次加入：240ul PEG 3500(50％W/V)、36ul 1.0M LiAc(pH7.5)、5ul煮沸的SS-carrier DNA(10mg/ml)、60ul无菌水和10ul待转化质粒。剧烈振荡1min；30℃静置30min；42℃水浴静置30min，每隔5min颠倒混匀一次；4000rpm离心5min收集转化的酵母细胞；吸去上清，1ml无菌水重悬，取200ul涂于涂布于色氨酸缺陷(以下简称为T-)的选择平板上，30℃培养3-4天。

2)鉴定携带pGBKT7-PPARγLBD质粒的阳性克隆：

以上T-选择平板上长出的克隆中，挑取克隆至T-液体培养基中，30℃、250rpm培养16-18h；收集酵母，提取质粒，PCR鉴定所提质粒：

引物序列：FW：5’GTAATACGACTCACTATAGGGCGA 3’

          RV：5’TCCGAGTCACTTTAAAATTTGTAT 3’

PCR扩增反应(20μl)：

模板(所提质粒)：14μl；10×buffer：2μl；dNTP(2.5mM)：2μl；

FW：1μl；RV：1μl；taq DNApolymerase：0.5μl。

反应条件为95℃变性5min，开始循环95℃45s；50℃45s；72℃1min，重复35循环，72℃变性10min。

3)PCR鉴定得到拥有pGBKT7-PPARγLBD质粒的阳性克隆。

4)将质粒pGADT7-CBP转入到上述阳性克隆中

接种克隆于约3ml T-液体培养基中，30℃、250rpm培养16-18h(OD600约为1.4)；菌液按1∶5转接于新鲜的T-液体培养基中，30℃、200rpm培养5-7h(OD600至0.8～1.2)；按以上所述步骤转化pGBKT7-PPARγLBD，最终涂布于色氨酸、亮氨酸双缺陷(以下简称为T-L-)平板，30℃培养3-4天；

5)PCR鉴定质粒pGADT7-CBP是否转入

挑取T-L-平板上的克隆至T-L-液体培养基中，30℃、250rpm，培养16-18h后提质粒(方法同前)，PCR鉴定：

引物序列：FW：5’GTAATACGACTCACTATAGGGCGA 3’

          RV：5’AGATGGTGCACGATGCACAGTT 3’

PCR扩增反应(20μl)：

模板(所提质粒)：14μl；10×buffer：2μl；dNTP(2.5mM)：2μl；FW：1μl；RV：1μl；taq DNA聚合酶：0.5μl。

反应条件：95℃变性5min，开始循环95℃45s；50℃45s；72℃1min，重复35循环；72℃变性10min

6)鉴定得到拥有pGBKT7-PPARγLBD&pGADT7-CBP两个质粒的阳性克隆。

实施例10  酵母水平2-取代酰氨基二羧酸类化合物拮抗活性检测

1、罗格列酮(阳性化合物)对CBP与PPARγ相互作用影响的鉴定：

(一)试验步骤：

1)将拥有双质粒pGBKT7-PPARγLBD和pGADT7-CBP的克隆划线于T-L-平板上，30℃培养3-4d后，挑取单克隆接种于2ml T-L-液体培养基中，30℃、250rpm，过夜培养16-18h；

2)转接到新鲜T-L-液体培养基中，使OD600约0.1左右。继续30℃、250rpm培养至OD600到0.8至1.0，然后再用新鲜T-L-液体培养基稀释至OD600约0.05，并取出989ul加入11ulDMSO(DMSO终浓度为1.1％)作为空白对照，接着将其剩下的稀释好的菌液按1∶1000加入20mM的罗格列酮(DMSO终浓度为0.1％)，并分装成990ul每小份到eppendorf管中，再按1∶100加入0.01mM化合物GW9662和各浓度的2-取代酰氨基二羧酸类化合物(DMSO终浓度为1.1％(化合物GW9662为阳性拮抗剂)。各个样品都做3份完全一样的作为平行对照。30℃培养至OD600达到0.8至1.0后，测定α-半乳糖苷酶活性(按照Yeast ProtocolHandbook(CLONTECH)进行)：

96孔板中每孔加入198ulT-L-培养基和2ul DMSO、GW9662或不同浓度2-取代酰氨基二羧酸类化合物。然后混匀酵母培养液，取200ul加入到96孔板中，测定OD 600(BIO-RAD酶标仪MODEL 550)；

将平板3000rpm离心30分钟，取16ul上清于96孔板中，每孔加入48ul分析缓冲液(100mM PNP-α-Gal水溶液与0.5M醋酸钠，pH4.5按体积比1∶2混合)；

30℃避光孵育60分钟；

加入136ul 10X终止缓冲液(1M Na₂CO₃)，终止反应；测定410nm处的OD值(BIO-RAD酶标仪MODEL 550)。

(二)试验结果

1、所用公式：

1)α-半乳糖苷酶活性的计算公式为：

α-半乳糖苷酶活性[mIU/(ml×cell)]＝(菌_OD410-相应化合物_OD410)×Vf×1,000/[(ε×b)×t×Vi×(菌_OD600-相应化合物_OD600)]

其中，t＝反应时间(分)

Vf＝测值时的终体积(200ul)

Vi＝加入酵母培养液上清的体积(16ul)

OD600＝酵母培养液中酵母在600nm处的吸光度

ε×b＝对-硝基苯酚在410nm处的摩尔吸光度×检测液光程(cm)

2)α-半乳糖苷酶相当活性的计算公式为：

T_n＝A₀/A_x；

A₀＝(菌DMSO_OD410-DMSO_OD510)/(菌DMSO_OD600-DMSO_OD600)；

A_x＝(菌_OD410-相应化合物_OD410)/(菌_OD600-相应化合物_OD600)；

其中：

A_n为各样品α-半乳糖苷酶相当活性。

A₀为只加入DMSO样品的OD410与OD600的比值；

A_x为加入各化合物样品的OD410与OD600的比值；

菌DMSO_OD410为只加入1.1％DMSO的菌样在410nm的吸光度；

DMSO_OD410为1.1％DMSO在410nm的吸光度；

菌DMSO_OD600为只加入1.1％DMSO的菌样在600nm的吸光度；

DMSO_OD600为1.1％DMSO在600nm的吸光度；

菌_OD410为加入各化合物的菌样在410nm的吸光度；

相应化合物_OD410为加入的各化合物在410nm的吸光度；

菌_OD600为加入各化合物的菌样在600nm的吸光度；

相应化合物_OD600为加入的各化合物在600nm的吸光度；

3)化合物抑制率计算公式为：

I_x＝(A_x-A_R)/(A₀-A_R)×100％

其中：

A_R为罗格列酮终浓度为20μM、DMSO终浓度为1.1％的样品的OD410与OD600的比值；

2、试验结果：

2-取代酰氨基二羧酸类化合物能够在酵母细胞水平很好地抑制PPARγ激动剂罗格列酮(20μM)的激活活性；如图六所示，用Origin软件作图得到2-取代酰氨基二羧酸类化合物的IC₅₀为8.67μM。

实施例11  哺乳动物表达载体pcDNA3.1-RXRα质粒的构建

(一)试验方法：

1)以pMT-RXRα为模板，用PCR技术复制扩增获得RXRα的DNA片段(基因序列依据NM_002957(GENEBANK)：

引物：FW：5’ATAAGCTTATGGACACCAAACATTTCCTGC 3’

      RV：5’ATGAATTCCTAAGTCATTTGGTGCGGCGC 3’

PCR扩增反应(100μl)：

pMT-RXRα模板：2μl；10×buffer：10μl；dNTP(2.5mM)：8μl；FW：4μl；RV：4μl；pyrobest^TMDNA聚合酶：1μl；水：71μl。

反应条件为95℃变性5min，开始循环95℃1min，65℃1min，72℃1min30s，重复30循环，72℃10min。

采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，回收DNA。

2)将RXRα的PCR产物克隆到pcDNA3.1载体上

RXRα的PCR产物和pcDNA3.1分别用HindIII和EcoRI酶切；用试剂盒方法回收酶切产物，其中回收RXRα的PCR酶切产物近1.5kb；pcDNA3.1酶切产物近5.5kb；用T₄DNA连接酶连接；连接产物转化入感受态细胞DH5α；涂布在含氨苄青霉素(100mg/l)的平板上；用酶切鉴定挑选正确的克隆。

(二)试验结果：

1、采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。酶切鉴定结果：在载体上910bp，950bp处有分别有Hind III和EcoRI的酶切位点，RXRα就克隆在这个区域内，因而用HindIII和EcoRI双酶切，正确的克隆应切出约1.5kb和5.5kb左右的片段。

2、DNA测序结果与NM_002957(GENEBANK)上序列完全一致。

实施例12  哺乳动物反式激活试验

(一)试验方法

1)转染质粒的纯化，本步骤采用Invitrogen公司的质粒纯化试剂盒，得到无内毒素的PPAR、RXR和报告基因质粒以及内参质粒pSV-β-gal(表达β-半乳糖苷酶)，并用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法定量质粒浓度。

2)细胞培养

COS-7细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM完全细胞培养基中并补加青霉素和链霉素，于37度5％二氧化碳孵箱中静止培养。细胞在25平方厘米培养瓶中调养，每24小时更换培养基，并用PBS清洗细胞碎片一次。细胞覆盖率达90％左右时，用胰蛋白酶消化传代。当细胞状态好时，以2×10⁵个细胞每孔将细胞接种24孔板中。

3)质粒转染和加药

接种于24孔板的细胞孵育过夜后，细胞覆盖率达到70％左右。将细胞用PBS和无血清无抗生素的DMEM各洗两次，每孔加入500μl DMEM。将pcDNA3.1-PPAR(0.3μg/孔)、pcDNA3.1-RXR(0.3μg/孔)和报告基因(0.3μg/孔)加入DMEM(50μl/孔)中，脂质体(2μl/孔)加入DMEM(50μl/孔)中，然后将二者混在一起室温孵育15分钟后，加入待转染的细胞中。孵箱中孵育6小时后，换成DMEM完全培养基孵育过夜。转染后24小时后，加入罗格列酮(0.1μM/孔)和各浓度梯度的化合物GW9662和2-取代酰氨基二羧酸类化合物(DMSO终浓度为0.11％，化合物GW9662为阳性拮抗剂)。

4)β-半乳糖苷酶活性测定

加药后24小时，弃掉细胞培养基。加入Promega的细胞裂解缓冲液(200μl/孔)室温30分钟裂解细胞。取细胞裂解液(50μl/孔)于96孔板中，加入2×测活缓冲液，混匀，37摄氏度放置30分钟。加入1M乙酸钠(150μl/孔)终止反应，混匀。读取410nM波长的光吸收值。测得的β-半乳糖苷酶活性作为内参。

5)报告基因荧光素酶活性的测定

将Steady-Glu Luciferase Assay缓冲液和底物混匀加入96孔白色平底冷光检测板中(100μl/孔)，然后加入细胞裂解液(100μl/孔)室温反应5分钟。用全自动完全酶标仪Teacon读取荧光素酶催化底物的荧光强度。

(二)试验结果

1.所用公式：

抑制率＝[(化合物+罗格列酮)报告基因活性-罗格列酮报告基因活性]/(DMSO报告基因活性-罗格列酮报告基因活性)×100％

2.试验结果：

β-半乳糖苷酶活性为转染效率评价的内参。当各孔的β-半乳糖苷酶活性在同一水平时，说明各孔质粒转染效率相近。这时可以忽略各孔转染效率不同的影响，而各孔报告基因的活性就真实的反应了该孔化合物的活性。试验结果表明2-取代酰氨基二羧酸类化合物能够在哺乳动物细胞水平很好地抑制PPARγ激动剂罗格列酮(0.1μM)的激活活性；如图七所示，用Origin软件作图得到2-取代酰氨基二羧酸类化合物的IC₅₀为31.9μM。

Claims (10)

1、如下通式(I)结构的2-取代酰氨基二羧酸类化合物或其药学上可接受的盐：

其中：

X，Y各自独立地选自O，S，NH

R₁选自氢，苄基，乙酰基，叔丁氧酰基；

当X＝O时，R₂＝R₃，可选自氢，C₁-C₃直链或支链烃基，苄基，环己基，芳香基Ar，5-7元芳香杂环(含有1-3个选自氧、硫、氮的杂原子)；

当X＝NH时，R₃＝H，R₂可选自氢，C₁-C₃直链或支链烃基，苄基，环己基，芳香基Ar，5-7元芳香杂环(含有1-3个选自氧、硫、氮的杂原子)；

当X，Y为O时，

Ar为

R₄，R₅各自独立自氢，卤素，C₁-C₆直链或支链烃基，氰基，硝基，氨基，羟基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，C₁-C₄烷氧基，巯基，C₁-C₄酰基；

m是0-3的整数，n是0-3的整数

当X为NH，Y为O时

Ar为

R₄，R₅各自独立自氢，卤素，C₁-C₆直链或支链烃基，氰基，硝基，氨基，羟基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，C₁-C₄烷氧基，巯基，C₁-C₄酰基；

m是0-3的整数，n是0-3的整数

2位和3’位手性碳原子的绝对构型各自独立的选R型或S型。

2、根据权利要求1所述的2-取代酰氨基二羧酸类化合物其药学上可接受的盐，其特征在于其中X，Y为O时，R₁，R₂，R₃，m和n的定义同前所述1一致，2位和3’位手性碳原子的绝对构型均为R型。

3、根据权利要求1所述的2-取代酰氨基二羧酸类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于其中X是NH，Y是O时，R₁，R₂，R₃，m和n的定义同前所述1一致，2位和3’位手性碳原子的绝对构型均为R型。

4、根据权利要求1所述的2-取代酰氨基二羧酸类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于其中X，Y为O时，R₁，R₂，R₃，m和n的定义同前所述1一致，2位和3’位手性碳原子的绝对构型均为S型。

5、根据权利要求1所述的2-取代酰氨基二羧酸类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于其中X是NH，Y是O时，R₁，R₂，R₃，m和n的定义同前所述1一致，2位和3’位手性碳原子的绝对构型均为S型。

6、根据权利要求1所述的2-取代酰氨基二羧酸类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于当式(I_A)所示2-取代酰氨基二羧酸类化合物时，

其中，R₂＝R₃，可选自氢，C₁-C₃直链或支链烃基，苄基，环己基，芳香基Ar，5-7元芳香杂环(含有1-3个选自氧、硫、氮的杂原子)；

R₄，R₅各自独立自氢，卤素，C₁-C₆直链或支链烃基，氰基，硝基，氨基，羟基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，C₁-C₄烷氧基，巯基，C₁-C₄酰基；

m是0-3的整数，n是0-3的整数；

2位和3’位手性碳原子的绝对构型各自独立的选R型或S型。

7、根据权利要求1所述的2-取代酰氨基二羧酸类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于当式(I_B)所示2-取代酰氨基二羧酸类化合物时，

其中，R₂可选自氢，C₁-C₃直链或支链烃基，苄基，环己基，芳香基Ar，5-7元芳香杂环(含有1-3个选自氧、硫、氮的杂原子)；

R₄，R₅各自独立自氢，卤素，C₁-C₆直链或支链烃基，氰基，硝基，氨基，羟基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，C₁-C₄烷氧基，巯基，C₁-C₄酰基；

m是0-3的整数，n是0-3的整数；

2位和3’位手性碳原子的绝对构型各自独立的选R型或S型。

8、根据权利要求1所述的2-取代酰氨基二羧酸类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于当式(I_C)所示2-取代酰氨基二羧酸类化合物时，

其中

R₄，R₅各自独立自氢，卤素，C₁-C₃直链或支链烃基，氰基，硝基，氨基，羟基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，C₁-C₄烷氧基，巯基，C₁-C₄酰基；

m是0-3的整数，n是0-3的整数；

2位和3’位手性碳原子的绝对构型各自独立的选R型或S型。

9、如权利要求1所述的2-取代酰氨基二羧酸类化合物或其药学上可接受的盐的制备方法如下：

I_A类化合物的合成是以3-取代吲哚烷基氨基酸为原料，与BOC酸酐在二氧六环/水/四氢呋喃4∶4∶1V/V/V溶剂中，在无机碱存在下0～20℃反应得分别经叔丁氧酰基(BOC)保护的化合物，酯活化，再在NMM，氯甲酸异丁酯，EtoAC或CH₂Cl₂或CH₃Cl₃低于10℃反应得酯化合物，然后N-酰化，脱保护基制得；

Scheme 1^α

^α(a)(i)BOC酸酐，dioxane/H₂O/DMF(4∶4∶1，v/v/v)，无机碱(如NaHCO₃)，0-20℃(ii)无机酸(如HCl)；(b)NMM，氯甲酸异丁酯，EtOAc(或CH₂Cl₂或CHCl₃)，＜10℃；(c)MeOH，SOCl2(或HCl)，20-40℃；(d)EtOAc(或CH₂Cl₂或CHCl₃)，＜10℃；(e)EtOAc(或CH₂Cl₂或CHCl₃)，＜0℃，CF₃COOH；

I_B类化合物的合成是以取代苯烷基氨基酸为原料，分别经叔丁氧酰基(BOC)保护，酯活化，酯化，N-酰化，脱保护基制得；

Scheme 2^α

^α(a)(i)BOC酸酐，dioxane/H₂O/DMF(4∶4∶1，v/v/v)，无机碱(如NaHCO₃)，0-20℃(ii)无机酸(如HCl)；(b)NMM，氯甲酸异丁酯，EtOAc(或CH₂Cl₂或CHCl₃)，＜10℃；(c)MeOH，SOCl2(或HCl)，20-40℃；(d)EtOAc(或CH₂Cl₂或CHCl₃)，＜10℃；(e)EtOAc(或CH₂Cl₂或CHCl₃)，＜0℃，CF₃CCOH；

I_C类化合物的合成是以2-取代萘烷基氨基酸为原料，分别经叔丁氧酰基(BOC)保护，酯活化，酯化，N-酰化，皂化，脱保护基制得；

^α(a)(i)BOC酸酐，dioxane/H₂O/DMF(4∶4∶1，v/v/v)，无机碱(如NaHCO₃)，0-20℃(ii)无机酸(如HCl)；(b)NMM，氯甲酸异丁酯，EtOAc(或CH₂Cl₂或CHCl₃)，＜10℃；(c)MeOH，SOCl2(或HCl)，20-40℃；(d)EtOAc(或CH₂Cl₂或CHCl₃)，＜10℃；(e)(i)MeOH(或THF，或两者混合液)，无机碱(如LiOH)(ii)无机酸(如HCl)；(f)EtOAc(或CH₂Cl₂或CHCl₃)，＜0℃，CF₃COOH

10、如权利要求1所述的2-取代酰氨基二羧酸类化合物或其药学上可接受的盐的用途作为在制备预防、治疗糖尿病、肥胖症疾病药物中的应用。

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