CN1788549A - 槲蕨的一种繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种槲蕨的繁殖方法，是将槲蕨的孢子经消毒后，接种于1/2MS固体培养基上进行培养，获得孢子体苗，再经移栽得到槲蕨。所述消毒液为含有0.1－0.2％吐温－80和4－6％NaOCl的溶液。所述孢子的培养条件为：在25±2℃下，先暗培养24－72h，然后将其转至光照下继续培养，光照强度为2000－2300lx，光照时间为10－14h·d^－1。利用本发明的方法，用少量的孢子材料，即可快速繁育出大量孢子体，使槲蕨的规模化工业生产成为可能，从而满足市场对槲蕨的需求，同时可减少对其野生资源和环境的破坏。此外，本发明还为开展该物种遗传育种和保护生物学等方面的研究提供了良好的试验体系，具有广泛的应用前景。

Description

槲蕨的一种繁殖方法

技术领域

本发明涉及植物的繁殖方法，特别是涉及槲蕨的一种繁殖方法。

背景技术

《本草纲目拾遗》记载“骨碎补，本名猴姜，以其主伤折、补骨碎，故命此名。或作骨碎布，讹矣。江西人呼为胡姜，象形也。”现代药理实验表明骨碎补具有多种功效：1)和卡那霉素合用可减轻卡那霉素对耳蜗的毒性作用(广西医学院耳鼻喉科.新医学，1977，8(4-5)：168)；2)对心肌细胞具有起搏作用，并能增强搏动频率(王维信等.中国药学会庆祝建会80周年学术会议，1986，06-K-2)；3)对骨关节软骨具有刺激细胞代偿性增生的作用(赵湘洪等，中药通报，1987，12(10)：41；Lin ChunYu等，The effect of Chinese medicine on bone cell activities，American Journalof Chinese Medicine，American Journal of Chinese Medicine，2002.30：2/3，271-285)。

槲蕨(Drynaria fortunei(Kze.)J.Sm)，又名石岩姜、岩连姜、猴姜，属于槲蕨科(Drynariaceae)槲蕨属的中型附生蕨类。在我国主要分布于浙江、福建、台湾、广东、广西、江西、湖北、四川、贵州、云南等地。槲蕨作为骨碎补正品之一被收载于《中国药典》，现已成为骨碎补商品的主流品种(周铜水，周荣汉.骨碎补类生药商品调查和性状鉴定研究.中国中药杂志，1998，18(12)：710-712)，具有补肾坚骨、续伤止痛等功效，可用于治疗肾虚腰痛、耳鸣耳聋、筋骨伤折等病症(江苏新医学院，中药大辞典，上海：上海人民出版社，1979，1658-1660)。

目前市售的骨碎补药材除现行《中国药典》收载的槲蕨外，还有中华槲蕨、团叶槲蕨、光叶槲蕨、栎叶槲蕨、川滇槲蕨、崖姜蕨、大叶骨碎补、海州骨碎补、圆盖阴石蕨、鳞轴小膜盖蕨及光叶瘤蕨共12种之多，分属于3科6属，其中槲蕨占商品来源的70％以上(周铜水，周荣汉.骨碎补类生药商品调查和性状鉴定研究.中国中药杂志，1998，18(12)：710-712)。经薄层色谱法(TLC)分析发现不同来源的骨碎补组成成分有所不同，表现为橙皮甙、柚皮甙和总黄酮的含量不同。其中，槲蕨根茎中的橙皮甙(hesperidin)、柚皮甙(naringin)及总黄酮含量在同类产品中均较高，而柚皮甙是骨碎补中具有活血去瘀、接骨疗伤和增强心肌细胞机能作用的主要活性成分(江苏新医学院.中药大辞典.上海：上海人民出版社，1979，1658-1660；周铜水，刘晓东，周荣汉.骨碎补对大鼠实验性骨损伤愈合的影响.中草药，1994，25(5)：249-250)。此外，中国药科大学的周铜水等还从槲蕨根茎的石油醚提取物中分离并鉴定了15种化合物，例如：何帕-22(29)-烯(hop-22(29)-ene)、何帕-21-烯(hop-21-ene)、何帕-22-醇(hop-22-ol)、羊齿-9(11)-烯(fern-9(11)-ene)、24-甲基-9，19-环羊毛甾-25-烯-3β-醇(24-methyl-9，19-cyclolanost-25-en-3β-ol)、24-乙基-9，19-环羊毛甾-25-烯-3β-醇(24-ethyl-9，19-cyclolanost-25-en-3β-ol)、24-甲基-9，19-环羊毛甾-25-烯-3-酮(24-methyl-9，19-cyclolanost-25-en-3-one)、正三十二烷酸(n-dotriacontanic acid)及β-谷甾醇等(周铜水，周荣汉.槲蕨根茎脂溶性成分的研究.中草药，1994，25(4)：175-178)。

由于槲蕨的人工繁殖栽培技术相对滞后，导致目前市售的槲蕨药材主要来源于浙江、湖北、广东、广西和四川的野生槲蕨资源。且由于市场需求量较大，使得这些地区的槲蕨资源被过度开采，野生槲蕨资源遭到严重破坏。

槲蕨的人工繁殖方法有分株繁殖和组织培养方法。其中，分株繁殖的生长周期长且效率低，组织培养的成本较高，因而上述两种方法均不利于药用槲蕨的规模化生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种培育周期较短、成本较低廉的槲蕨的繁殖方法。

本发明所提供的槲蕨的繁殖方法，是将槲蕨的孢子经消毒后，接种于1/2MS固体培养基上进行培养，获得孢子体苗，再经移栽得到槲蕨。

所述1/2MS固体培养基包含的大量和微量元素为MS培养基全量的1/2，铁盐和有机物的含量与MS培养基相同，用0.5％(W/V)的琼脂固化，调pH值至5.8。

消毒所用的消毒液为含有浓度为0.1-0.2％吐温-80和4-6％NaOCl的溶液。

所述吐温-80的浓度优选为0.1％，NaOCl的浓度优选为5％；在此浓度下，所需的消毒时间为4min。

所述接种方法为：在无菌条件下，先用无菌水将1/2MS固体培养基的表面湿润，使其表面形成一薄层水膜(以倾斜三角瓶时汇集在底部的水不能让滴管吸上连续的水滴为宜)，然后将无菌的孢子以悬浊液的形式均匀接种在培养基上。

所述孢子的培养条件为：在25±2℃下，先暗培养24-72h，然后将其转至光照下继续培养，光照强度为2000-2300lx(光源为荧光灯)，光照时间为10-14h·d^-1；所述培养温度优选为25℃；所述暗培养时间优选为24h；所述光照时间优选为12h·d^-1。

所述孢子体苗移栽的方法可包括以下步骤：1)将无菌孢子体苗置于自然光照下炼苗6-8d，再置于空气中在相同的光照条件下炼苗6-8d；2)将其移栽至经消毒的素砂中进行培养，培养温度为25±2℃，光照强度为2000-2300lx，光照时间为10-14h·d^-1；3)25-35d后将其定植到穴盘中(培养基质的成分及混合比例为：草炭土∶蛭石∶细砂∶有机肥＝4∶2∶2∶1)，置温室培养，并按其生长特性对孢子体苗进行栽培管理；4)待幼苗长出3-4片叶时，可结合分株上盆。

所述孢子体苗的栽培管理条件为：夏秋季遮荫，春冬季保持白天温度21-26℃，夜间温度10-15℃，空气湿度70-90％，缓苗20-35d后每月施一次稀液肥。

本发明是以孢子为材料，利用组织培养技术，再结合对蕨类植物的专有栽培管理措施，建立的槲蕨的孢子繁殖方法。弥补了现有槲蕨繁殖技术培育周期长、成本高和效率低的不足，开辟了一条人工繁殖槲蕨的新途径，并填补了国内槲蕨孢子无菌培养方法的空白。利用本发明的方法，用少量的孢子材料，即可快速繁育出大量孢子体，90天即可成苗，成苗率可达95％，使槲蕨的规模化工业生产成为可能，从而满足市场对槲蕨的需求，同时可减少对其野生资源和环境的破坏。此外，本发明还为开展该物种遗传育种和保护生物学等方面的研究提供了良好的试验体系，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为定植到穴盘中的孢子体苗

图2为定植到牛眼盆中的孢子体苗

图3为引种到温室中的槲蕨

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、槲蕨的孢子培养

培养基：

1/2MS培养基：大量和微量元素为MS培养基全量的1/2，铁盐和有机成分的浓度与MS培养基相同，0.5％(W/V)琼脂，pH5.8。煮沸后分装至100mL三角瓶中，然后121℃，高压蒸汽灭菌20min。

一、槲蕨孢子的灭菌

取成熟的槲蕨孢子5mg置于1.5mL离心管内，滴入无菌水，充分振荡使成悬浊液，静置2h后，4000r/min离心1min，弃上清；然后向离心管内滴入约1.2mL的5％NaOCl溶液(每100mL该溶液中含0.1mL吐温-80)对孢子进行消毒灭菌，4min后，4000r/min离心1min，弃上清；最后用无菌水冲洗4-5次，获得无菌的孢子悬浊液。

二、无菌孢子的接种及培养

在无菌条件下，先用无菌水将上述配制的1/2MS培养基的表面湿润，使其表面形成一层薄薄的水膜(以倾斜三角瓶时汇集在底部的水不能让滴管吸上连续的水滴为宜)，然后用滴管将步骤一获得的无菌孢子悬浊液均匀接种在培养基上。接种后，在25℃下，先暗培养24h，然后将其转至光照下继续培养，光照强度为2000-2300lx(光源为荧光灯)，光照时间为12h·d^-1。

三、槲蕨幼孢子体苗的移栽及管理

培养12天后，孢子开始萌发，30-35天形成配子体，90天形成孢子体苗，待孢子体长出1片叶(叶长约1-2cm)时，将三角瓶置于自然光照下炼苗7d，再打开瓶盖炼苗7d，然后用镊子轻轻夹出试管苗，洗净培养基后，将其移栽至经1‰多菌灵消毒4h的素砂中，并置于培养室内培养，培养室温度设为25℃，光照强度2000-2300lx(光源为荧光灯)，光照时间为12h·d^-1；1个月后将其定植到穴盘中(培养基质的成份及混合比例为：草炭土∶蛭石∶细砂∶有机肥＝4∶2∶2∶1)，如图1所示，置温室培养，夏秋遮荫，春冬季保持白天温度21-26℃，夜间温度10-15℃，空气湿度70-90％，缓苗1个月后每月施一次稀液肥，待幼苗长出3-4片叶时，可结合分株进行上盆，定植到牛角盆的孢子体幼苗如图2所示。待其成活后，还可对其进行引种栽培，如图3所示，图中可看到其营养叶及根茎。

Claims (10)

1、一种槲蕨的繁殖方法，是将槲蕨的孢子经消毒后，接种于1/2MS固体培养基上进行培养，获得孢子体苗，再经移栽得到槲蕨。

2、根据权利要求1所述的繁殖方法，其特征在于：所述1/2MS固体培养基包含的大量和微量元素为MS培养基全量的1/2，铁盐和有机物的含量与MS培养基相同，用0.5％(W/V)的琼脂固化，调pH值至5.8。

3、根据权利要求1或2所述的繁殖方法，其特征在于：所述消毒液为含有0.1-0.2％吐温-80和4-6％NaOCl的溶液。

4、根据权利要求3所述的繁殖方法，其特征在于：所述吐温-80的浓度为0.1％，NaOCl的浓度为5％。

5、根据权利要求4所述的繁殖方法，其特征在于：所述吐温-80的浓度为0.1％，NaOCl的浓度为5％时，消毒时间为4min。

6、根据权利要求1所述的繁殖方法，其特征在于：所述孢子的培养条件为：在25±2℃下，先暗培养24-72h，然后将其转至光照下继续培养，光照强度为2000-23001x，光照时间为10-14h·d^-1。

7、根据权利要求6所述的繁殖方法，其特征在于：所述培养温度为25℃。

8、根据权利要求6所述的繁殖方法，其特征在于：所述暗培养时间为24h。

9、根据权利要求6所述的繁殖方法，其特征在于：所述光照时间为12h·d^-1。

10、根据权利要求6-9任一所述的繁殖方法，其特征在于：所述移栽过程中对孢子体苗的管理条件为：夏秋季遮荫，春冬季保持白天温度21-26℃，夜间温度10-15℃，空气湿度70-90％，缓苗20-35d后每月施一次稀液肥。

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