CN1733932A

CN1733932A - 一种腺癌标志物及其应用

Info

Publication number: CN1733932A
Application number: CNA2005100440479A
Authority: CN
Inventors: 常晓天; 朱有名; 韩金祥
Original assignee: Shandong Provincial Pharmaceutical Biological Tech Research Center
Current assignee: Shandong Provincial Pharmaceutical Biological Tech Research Center
Priority date: 2005-07-18
Filing date: 2005-07-18
Publication date: 2006-02-15
Anticipated expiration: 2025-07-18
Also published as: CN100595281C

Abstract

本发明公开了一种腺癌标志物——肽基精氨酸脱亚胺酶4(PAD4酶)，所述PAD4酶特异表达在所有的腺癌组织或细胞中，并在癌细胞分化过程中持续表达。本发明还公开了所述标志物在制备肿瘤临床诊断试剂，特别是腺癌临床诊断试剂及其治疗药物中的应用。本发明所述腺癌标志物的发现，对癌发病机制的研究有着重要的意义；同时对肿瘤临床诊断试剂以及抗癌药物的研究开发也有着非常重要的意义。

Description

一种腺癌标志物及其应用

技术领域

本发明涉及一种癌标志物及其应用，尤其涉及一种腺癌标志物及其应用。

背景技术

长期以来许多研究都发现类风湿关节炎与肿瘤在组织学上有很多相似性，包括大量细胞外纤维蛋白沉淀(fibrin deposit)、异常组织细胞增殖(abnormal cell proliferation)和分化(cell differentiation)、过高毛细血管增生(angiogenesis)和高凝血活性(coagulation activity)。一些临床医生也经常用治疗肿瘤的药物治疗类风湿关节炎。但是这两种疾病在分子水平上的内在联系还不清楚。

肽基精氨酸脱亚胺酶(Peptidylarginine deiminase，PAD)是在人体组织中一种酶，目前，共发现了五种PAD酶(即PAD1、2、3、4和6)。这些酶由坐落在人类染色体1p36区域上的一簇基因所编码，并具有不同的组织分布。它可以在钙离子存在的情况下对其它一些组织蛋白进行后翻译修饰(post-translational modification)。这个酶可将多肽链中的精氨酸(arginine)的氨基催化成羰基，从而使精氨酸转化成瓜氨酸(citrulline)。瓜氨酸是一个非自然氨基酸。这个由PAD催化的多肽中精氨酸转化成瓜氨酸的过程被称做瓜氨酸化(citrullination)。(见图1)。

近年来，通过免疫学、细胞生物化学和分子遗传学的研究，肽基精氨酸脱亚胺酶4(Peptidylarginine deiminase 4，PAD4)(一些文章中也称为PADI4或PAD5)被证明在人类类风湿关节炎发病过程中起着非常重要的作用。2004年，常晓天发现PAD4酶在类风湿关节炎关节滑膜组织中有着广泛的表达，并且使滑膜组织中的纤维连接蛋白被瓜氨酸化；在对类风湿关节炎病人，全身性红斑性狼疮病人，正常人的血浆进行的进一步的检测后发现，类风湿关节炎病人血浆中的纤维连接蛋白(fibronectin)也呈现明显瓜氨酸化。那么，肽基精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)除在类风湿关节炎关节滑膜组织中有着广泛的表达并对类风湿关节炎发病过程有影响外，结合类风湿关节炎与肿瘤在组织学上的诸多相似性，是不是肽基精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)也在癌细胞中有着同样明显的表达？它对细胞的分化和癌变的影响和作用是什么？经检索，还未见相关的报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是：在研究肽基精氨酸脱亚胺酶4(PAD4酶)对类风湿性关节炎病理作用的基础上，进一步研究该酶在各种各样的肿瘤组织中的表达调控。提出一种腺癌标志物及其在制备肿瘤临床诊断试剂和其治疗药物中的应用。

本发明所述的腺癌标志物，由肽基精氨酸脱亚胺酶4(Peptidylarginine deiminase 4，PAD4)组成。即为肽基精氨酸脱亚胺酶4。

上述肽基精氨酸脱亚胺酶4特异表达在所有的腺癌组织或细胞中。

上述肽基精氨酸脱亚胺酶4起始于CD34胚胎性干细胞并在癌细胞分化过程中持续表达。

确定和支持上述腺癌标志物是肽基精氨酸脱亚胺酶4(PAD4酶)的实验证据：

用免疫组织化学法对48种癌组织进行的实验检测表明：PAD4酶在许多种癌组织特别是几乎所有的腺癌(adenocarcinoma)癌细胞中有着非常明显的表达(见图2)。用Western blotting法对许多肿瘤组织进行了检测分析，其结果也证实了上述结论(见图3)。更令人信服的是，利用免疫组织化学法实验发现：PAD4酶与高分化腺癌中的细胞角蛋白(cytokeratin)有着基本一致的表达图案(expressional profile)(见图4)。可以证明PAD4酶在几乎所有的腺癌和一些非腺癌组织中与细胞角质蛋白共表达。细胞角蛋白是已知的癌细胞标志物。它主要出现在上皮细胞来源的癌细胞中。细胞角质蛋白与PAD4酶的共表达(co-expression)强有力地证实PAD4酶在癌组织的存在。

本发明所述的腺癌标志物PAD4酶在癌细胞中有特异性高表达的发现，对癌发病机制的研究有着重要的意义。

第一，这项发现解释了为什么许多癌症病人的血液中存在高凝血酶活性(thrombinactivity)。常晓天在研究类风湿关节炎时发现PAD4酶可以体内和体外通过瓜氨酸化抑制抗凝血酶(antithrombin)活性，从而导致病变组织中凝血酶活性失控、增高。

第二，这项发现解释了为什么类风湿关节炎与肿瘤在组织学上有很多相似性。正因为两种病变组织都含有大量的PAD4酶和因此失活的抗凝血酶，增高的凝血酶活性被证明能够刺激组织的外细胞纤维蛋白沉淀生成、细胞异常增殖、细胞转移，毛细血管异常增生和抑止细胞凋亡。

第三，这项发现解释了病人血清中的高浓度30,000道尔顿(Da.)细胞角质蛋白片段的存在。实验结果表明瓜氨酸化后的细胞角质蛋白易断裂为此3万Da.的片段。而血液中这一片段的存在是临床诊断肿瘤的一个标准。

第四，这项发现解释了为什么癌细胞失去了正常的细胞凋亡机制。实验结果表明被PAD4酶瓜氨酸化后的细胞角质蛋白可以抵抗细胞各种caspase的消化。而细胞角质蛋白的正常消化降解是细胞凋亡一个关键步骤之一。

第五，这项发现印证了一百多年来关于癌细胞起源于胚胎性细胞的假说，也证实了腺癌可能起源于CD34干细胞。本发明发现PAD4酶最初特异地存在于骨髓来源的CD34造血前体干细胞，并持续地在CD34的衍生细胞中表达。许多癌细胞(特别是腺癌)特异地表达PAD4酶，建议这些癌组织可能是CD34+细胞在各种因素的诱导下进行了不正常的增殖所产生的。

本发明所述的腺癌标志物PAD4酶在癌细胞中有特异性高表达的发现，对肿瘤临床诊断试剂以及抗癌药物的制备也有着非常重要的意义。

A：本发明所述腺癌标志物PAD4酶在制备肿瘤临床诊断试剂特别是腺癌临床诊断试剂中的应用。

PAD4酶可以作为一个新的癌细胞标志物用于临床肿瘤病理切片的检查和判定。尽管科学家已发现许多癌细胞标志物，但到目前为止还未有一个标志物能广泛并特异地标记出所有的腺癌组织。细胞角质蛋白作为标志物只存在于高分化的癌细胞中，它不能用于跟踪细胞的分化和癌化过程；CD34只存在于干细胞和一些未分化的癌细胞中，它不在已分化的癌细胞中表达。PAD4酶起始于CD34胚胎性干细胞并在癌细胞分化过程中持续表达。因此，PAD4酶是一个非常好的癌细胞标志物。在临床上和实验室中，可按常规方法制备抗肽基精氨酸脱亚胺酶4抗体，建立检测肽基精氨酸脱亚胺酶4的定性或定量方法及配套试剂盒。以用于判断癌的类型和进行发病机制的研究。到目前为止，经查询，尚无一个肿瘤标志物能标记出如此多的癌细胞，并能示踪癌细胞的分化和癌化过程。

B：本发明所述腺癌标志物PAD4酶在制备治疗肿瘤药物中的应用。

研究证明PAD4酶通过对凝血酶和细胞角蛋白的瓜氨酸化刺激细胞外纤维蛋白沉淀、细胞异常增生、毛细血管异常增生，细胞游走和抑止细胞凋亡，从而导致组织肿瘤化。因此，人们可以设计一种像单克隆抗体或降低钙离子浓度的药物，去阻止PAD4酶活性，从而达到癌抑制或癌治疗的目的。

例如：

以常规方法筛选对肽基精氨酸脱亚胺酶4有抑制作用的药物，制备抗肿瘤药物。

以常规方法制备抗肽基精氨酸脱亚胺酶4单克隆抗体，加载抗肿瘤药物，制备成抗肿瘤“生物导弹”药物。

针对PAD4酶设计、制备药物去阻止该酶对凝血酶，细胞角蛋白和其他细胞蛋白的催化。

附图说明

图1.PAD酶能催化肽链中的精氨酸残基成瓜氨酸.

图2.免疫组织化学法证明PAD4酶在几乎所有的腺癌和一些非腺癌肿瘤的癌细胞都有很强的高表达.

其中：A排是各种各样的癌组织(物镜10X)，B排是A排的局部放大(物镜40X)，C排是相对应的健康组织(物镜10X).1A-1B十二指肠腺癌，2A-2B食管腺癌，3A-3B前列腺腺癌，4A-4B腮腺腺癌，5A-5B胃腺癌，6A-6B肝胆管癌.

图3.Western blot法证明许多腺癌组织都表达PAD4酶。

从结肠癌(1)，肺腺癌(2)，腮腺腺癌(3)，前列腺腺癌(4)和胸腺癌(5)组织中提取的组织总蛋白经SDS-PAGE电泳后被转印到PVDF膜上。经与抗PAD4抗体杂交后，所有腺癌组织都呈现67kDa.的PAD4表达信号。

图4.免疫组织化学法证明PAD4酶在几乎所有的腺癌和一些非腺癌组织中与细胞角质蛋白共表达.

其中：A排和B排是各种各样的癌组织，C排和D排是相对应的健康组织.A排和C排表示PAD4酶在各种各样癌和健康组织中的表达，B排和D排表示细胞角质蛋自酶在相对应的组织中的表达.结果表明PAD4酶与细胞角质蛋白在几乎所有的腺癌和一些非腺癌组织中表达在同一区域.1，大肠腺癌.2，十二指肠腺癌.3，胆囊腺癌.4，肺腺癌.5，直肠腺癌.6，胃腺癌.7，子宫腺癌.8，乳腺纤维腺瘤。(物镜10X).

图5.各种各样的caspase对细胞角质蛋白质CK8，18和19的降解。

体外重组的细胞角质蛋白质CK8，18和19分别和caspase 1(4，15，26)，caspase 2(5，16，27)，caspase 3(6，17，28)，caspase 6(7，18，29)，caspase7(8，19，30)，caspase 8(9，20，31)，caspase 9(10，21，32)and caspase 10(11，22，33)在37℃下反应孵育。其中：A代表caspase对细胞角质蛋白质的处理，B代表caspase对瓜氨酸化后的细胞角质蛋白质的处理。C代表在caspase抑制剂存在时caspase对瓜氨酸化后细胞角质蛋白质的处理。对照组包括未瓜氨酸化和未caspase降解的细胞角质蛋白质(1，12，23)；瓜氨酸化处理但未被caspase降解的细胞角质蛋白质(2，13，24)；瓜氨酸化和caspase抑制剂处理的细胞角质蛋白质(3，14，25)。结果表明，经PAD4酶瓜氨酸化处理的细胞角质蛋白能有效地抵抗caspase的降解。箭头代表信号的分子量。

具体实施方式

下面结合实施例中的验证实验对本发明的内容作进一步的阐述：

实施例1：用免疫组织化学方法证明PAD4酶在癌组织中的表达

(1)将0.5立方厘米左右新鲜肿瘤组织置于10％福尔马林缓冲液中固定十二个小时。固定后的组织块按着标准程序进行脱水，包埋并制成10微米厚的石蜡切片。

(2)将载有石蜡切片的载玻片按着标准程序在二甲苯和酒精中脱蜡，复水，并暂停于蒸馏水中。

(3)将组织切片置于95℃度的柠檬酸缓冲液(CM buffer)处理品十五分钟.然后将载有切片的柠檬酸缓冲液转移到常温下再冷却十五分钟.柠檬酸缓冲液可以大大增强PAD4蛋白的组织抗原性。

(4)将组织切片重新置于蒸馏水中水浸泡两次，每次三分钟。

(5)将组织切片置于PBS缓冲液(NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，NaHPO₄ 1.15g/L和KH2PO₄0.2g/L，pH7.4-7.6)中浸泡三次，每次三分钟。

(6)用S上述PBS缓冲液配制的3％脱脂奶粉稀释PAD4酶抗体。将实验浓度的抗体滴加在组织切片上。在4℃度下进行抗原抗体反应十二小时。

(7)将组织切片置于PBS缓冲液中浸泡三次，每次五分钟。

(8)用PBS缓冲液配制的3％脱脂奶粉稀释磷酸化酶标记的抗兔IgG第二抗体。将实验浓度的抗体滴在加组织切片上。在室温下让反应进行一小时。

(9)将组织切片置于PBS缓冲液中浸泡三次，每次五分钟。

(10)用适当的发色剂(例如New Fuchsin)处理组织切片，显示PAD4酶的位置。

(11)用苏木精对组织切片进行对比染色。

(12)脱水，封片。

(13)镜检。

结果表明：PAD4酶在许多种癌组织特别是几乎所有的腺癌癌细胞中有着非常明显的表达(见图2)。

实施例2：Western blot法证明PAD4蛋白在各种腺癌组织中表达

(1)将手术中获得的各种癌组织按常规步骤匀浆提取组织总蛋白。

(2)按常规步骤将提取的组织总蛋白SDS-PAGE电泳，然后转印在PVDF膜上.

(3)按常规步骤用抗PAD4抗体杂交PVDF膜，探测PAD4酶在癌组织总蛋白中的表达。

结果表明：PAD4酶存在于各类腺癌组织的总蛋白中(图3)。此结果印证了以上免疫组织化学的发现。

实施例3：用免疫组织化学方法证明PAD4在许多癌组织中与细胞角质蛋白共表达

按实施例1描述的免疫组织化学方法，将各种各样癌组织的连续石蜡切片分别与抗PAD4抗体和抗细胞角质蛋白杂交。对连续切片上两种靶蛋白表达的图案进行比较，发现PAD4酶在几乎所有的腺癌和一些非腺癌组织中与细胞角质蛋白的表达是一致的(图4)。此结果表明：PAD4酶与细胞角质蛋白在许多癌细胞中共表达。

实施例4：用体外酶切反应和Western blot证明PAD4对细胞角质蛋白的作用

用基因工程的方法构建的含PAD4基因人工质粒，按常规步骤体外生产PAD4酶蛋白。经活性鉴定后，将该酶与细胞角质蛋白分别与各种各样caspase(caspase 1-10)在37℃下反应两小时，然后用Western blot检查酶切结果。结果表明，经PAD4酶瓜氨酸化后的细胞角质蛋白能有效地抵抗caspase的降解(见图5)。

实施例5：制备抗肽基精氨酸脱亚胺酶4抗体，制作抗PAD4蛋白预包被酶标板(条)试剂盒

(1)人工合成短肽(氨基酸序列：PAKKKSTGSSTWPC)。然后按常规多克隆抗体制备程序多次注射此短肽于兔子皮下，获取抗PAD4蛋白抗血清。

(2)按常规程序纯化抗PAD4抗体。

(3)用PH9.6碳酸盐缓冲液按1∶3000-5000的比例稀释该抗体。

(4)将酶标板每孔中滴加100ul抗体稀释液，置室温4小时。

(5)用含0.05％Tween-20PBS洗涤酶标板孔3遍，然后每孔加200ul2％BSA。置酶标板与37℃2小时，吹干后放入锡铂袋中真空封上，4℃保存。

*抗PAD4抗体，用辣根过氧化物酶常规标记。

品稀释液：含2％BSA、PBS。

涤液：含0.05％Tween-20PBS。

显色剂：0.4％TMB。

终止液：2％H₂SO₄。

实施例6：检测应用肿瘤组织抗肽基精氨酸脱亚胺酶

(1)工合成短肽(氨基酸序列：PAKKKSTGSSTWPC)。然后按常规多克隆抗体制备程序多次注射此短肽于兔子皮下，获取抗PAD4蛋白抗血清。

(2)按常规程序纯化抗PAD4抗体。

(3)按常规匀浆肿瘤组织，提取肿瘤组织总蛋白。

(4)将待检组织总蛋白用样品稀释液4000稀释后，加100ul于ELISA板样品孔中。37℃下放置1小时。

(5)洗涤液洗5遍。

(6)加用辣根过氧化物酶标记的抗PAD4抗体100ul，37℃下反应1小时。

(7)用洗涤液洗5遍。

(8)每孔加显色剂100ul，37℃15分钟。

(9)每孔加终止液50ul，于酶标仪405nm处测各孔的吸光度值。

(10)根据各孔吸光度值大小，与对照孔吸光度值比较，计算结果。

实施例7：筛选对肽基精氨酸脱亚胺酶4有抑制作用的药物，制备抗肿瘤药物

HL60培养细胞来源于造血系统干细胞。实验证明该培养细胞用phorbol 12，13-dibutyrate(PMA)刺激后能表达PAD4蛋白。以此细胞为模型可建立体外实验系统筛选各种抗PAD4酶的抗癌药物。具体内容如下：(1)按常规无血清培养HL60细胞。(2)加PMA和各待选抗癌药物培养细胞中。(3)用western blot，Northernhybridizationhel ELISA等方法检测PAD4蛋白和mRNA是否被抑制，从而选出潜在的抗癌药物。

实施例8：制备抗肽基精氨酸脱亚胺酶4单克隆抗体，加载抗肿瘤药物，制备成抗肿瘤生物导弹”药物

生物导弹是将抗癌药物与单克隆抗体化学偶联，然后注入病人体内，利用抗原抗体结合的原理，将抗癌药物带给癌细胞，进而发挥特异性杀死癌细胞的作用。具体步骤如下：(1)制备抗PAD4单克隆抗体。(2)将抗癌药物如阿霉素，碘131或其它抗癌药物与该单克隆抗体化学偶联。同时也可将多种药物混合制成“多弹头”。(3)静脉或直接显微注射方式，将药物导入肿瘤，达到治疗目的。(4)也可用同样方式将放射性标记物结合抗PAD4单克隆抗体上，然后将结合物注入病人体内，进行显像诊断。此法准确率可达90％以上。

Claims

1.一种腺癌标志物，由肽基精氨酸脱亚胺酶4组成。

2.如权利要求1所述的腺癌标志物，其特征是，所述肽基精氨酸脱亚胺酶4特异表达在所有的腺癌组织或细胞中。

3.如权利要求1或2所述的腺癌标志物，其特征是，所述肽基精氨酸脱亚胺酶4起始于CD34胚胎性干细胞并在癌细胞分化过程中持续表达。

4.权利要求1所述腺癌标志物在制备肿瘤临床诊断试剂中的应用。

5.权利要求1所述腺癌标志物在制备腺癌临床诊断试剂中的应用。

6.权利要求5所述腺癌标志物在制备腺癌临床诊断试剂中的应用，其特征是，以常规方法制备抗肽基精氨酸脱亚胺酶4抗体，建立检测肽基精氨酸脱亚胺酶4的定性或定量方法及配套试剂盒。

7.权利要求1所述腺癌标志物在制备治疗肿瘤药物中的应用。

8.权利要求7所述腺癌标志物在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征是，以常规方法筛选对肽基精氨酸脱亚胺酶4有抑制作用的药物，制备抗肿瘤药物。

9.权利要求7所述腺癌标志物在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征是，以常规方法制备抗肽基精氨酸脱亚胺酶4单克隆抗体，加载抗肿瘤药物，制备成抗肿瘤“生物导弹”药物。

10.权利要求7所述腺癌标志物在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征是，针对PAD4酶设计、制备药物去阻止该酶对凝血酶，细胞角蛋白和其他细胞蛋白的催化。