CN1733927A - 酶催化生产蔗糖脂肪酸酯 - Google Patents
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Abstract
一种酶催化制备蔗糖脂肪酸酯的方法，蔗糖和脂肪酸，按摩尔比1∶1～10的范围，置于150ml的锥形瓶中；按照每mmol蔗糖5－15ml有机溶剂的比例加入有机溶剂；将加入上述混合物的锥形瓶置于HZ－9613Y型油浴恒温震荡器(江苏太仓市科教仪器厂出品)中，恒温20－80℃，震荡10分钟；加入固定化脂肪酶，固定化脂肪酶的用量是蔗糖的0.01－0.5倍；转速120－200r/min，恒温20－80℃，反应0.05－24小时后，用氢氧化钠中和反应液中残留的月桂酸，提纯产物，真空干燥、结晶得到蔗糖脂肪酸酯。本发明的方法在常压下进行反应，生产工艺简单，反应温度低；采用了低毒性的溶剂，可以用于食品和药品，而且产品提纯简便，可以得到高纯度的蔗糖脂肪酸酯。
Description
技术领域
本发明涉及以蔗糖为原料生产蔗糖脂肪酸酯的方法，尤其涉及酶催化生产蔗糖脂肪酸酯的方法。
背景技术
在多元醇型非离子表面活性剂中，糖类脂肪酸酯和烷基葡萄糖苷是两类用途最广的非离子表面活性剂。它们无毒，对皮肤无刺激作用，生物降解性好，具有去污、乳化、洗涤、分散、湿润、渗透、扩散、起泡、抗氧、粘度调节、杀菌、防止老化、抗静电和防止晶析等多种功能，在日化，食品和医药行业得到了广泛的应用。
蔗糖脂肪酸酯(简称蔗糖酯)，英文缩写SE，它是由蔗糖与羧酸反应生成的一大类有机化合物。它在人体可分解为葡萄糖、脂肪酸，进而被人体作为营养物质消化吸收。而且与一般合成的表面活性剂不同，葡糖酯在好氧和厌氧的条件下都能100％生物降解，有利于环保，因此它是一种绿色表面活性剂。同时，由于蔗糖酯的原料蔗糖和脂肪酸是可再生资源，蔗糖酯优良的使用性能，应用范围广等，倍受科技界的重视。近几十年来，对蔗糖酯的研究取得了重大成果，而蔗糖酯已成为一个日益兴旺的工业，其应用领域也在不断扩大。由于其用途不断被开发，市场潜力巨大，极具发展前景。
此外，有研究报道糖酯具有抗肿瘤、抑菌和杀虫等功能，而且适量食用糖苷不饱和脂肪酸酯能降低血液中胆固醇的含量及冠心病的发病率。国外最新报道不饱和脂肪酸糖苷酯可用于皮肤化妆品中。
传统的糖苷脂肪酸酯合成方法是化学法。由于糖环上-OH众多，用化学法合成选择性差，糖环会发生聚合，且不易进行特定位置的酯化，有很多的副产物产生，产率不理想，而且合成反应在高温、高压下进行，条件较苛刻，能耗高，一般会引起糖焦化；而且产物不纯，带有颜色。
脂肪酶催化合成糖酯是近几年出现的合成糖酯的新方法，利用脂肪酶的区域选择性，可以方便地从糖类和脂肪酸或甘油三酯等价廉易得的原料出发合成酯化位置特定的糖酯，而且反应条件温和，操作方便。由于脂肪酶具有高立体选择性、区域专一性和位置选择性，因而可合成光学纯的糖酯，具有重要的理论意义和应用价值。
由于糖和油脂互不溶解，当今有机相中脂肪酶催化合成糖酯的研究主要采用在吡啶等强极性有机溶剂体系中进行糖的直接酯化，或将糖制成缩酮或糖苷的形式以增加其溶解性，或采用亲水载体吸附糖和酶的固定化体系。酶法合成糖酯可以在二甲亚砜和吡啶等有机溶剂中进行，但是由于有机溶剂的影响，酶催化的单步反应产率较低，而且由于有机溶剂的毒性使糖酯产品难以用于食品或药品。
安庆大，吴可克(2004年第29卷第6期《中国油脂》65～68页)以Novozym435脂肪酶为催化剂，正己烷为有机溶剂，丙二醇为乳化剂，酶促合成葡萄糖硬脂酸酯。研究结果表明：酶加入量为脂肪酸质量的10％，底物酸、糖的摩尔比为1∶1，温度为60℃，含水量为有机溶剂的513％，反应时间为4.5h，振荡速率为100r/min时，硬脂酸最大转化率可达93.40％。但反应混合物非常粘稠，分离困难，难以得到纯度高的葡萄糖脂肪酸酯。而且酶的用量大，成本高。
涂茂兵，魏东芝，郑洪(华东理工大学学报，Vol.28 No.2，176～179页)以固定化脂肪酶Novozym435作生物催化剂在无溶剂体系中成功地合成了乙基葡萄糖苷油酸单酯。确定出最适的反应条件为：温度80℃，初始水分为0，酶的浓度为w酶＝0.05，反应时间为12h，油酸的转化率100％，单酯得率为86.55％。
国际专利申请WO8901480A公开了一种方法，其中含有一个2～6个碳原子烷基的烷基糖苷与一个含有C4～C22(优选C6～C22)脂肪酸或其低级烷基酯，在水解酶的存在在反应，水解酶选自Rhizomucor、腐质霉属(Humicola)、假单胞菌属(Pseudomonas)或假丝酵母属(Candida)。在两个实施例中，所用的溶剂为2-丁酮，其用量远远大于反应物的总重量，因此工业化时会存在能耗高，后处理困难的问题。
发明内容
为了克服现有技术的不足之处，本发明的发明人经过探索和研究，对现有的蔗糖脂肪酸酯生产进行了改造，找到了在常压下酶催化蔗糖脂肪酸酯的方法，生产工艺简单、反应温度低，产品提纯简便，可以得到高纯度的蔗糖脂肪酸酯。
本发明的酶催化制备蔗糖脂肪酸酯的方法，其步骤为：
a)蔗糖和脂肪酸，按摩尔比1∶1～10的范围，置于150ml的锥形瓶中；
b)按照每mmol蔗糖5～15ml有机溶剂的比例加入有机溶剂；
c)将加入上述混合物的锥形瓶置于HZ-9613Y型油浴恒温震荡器(江苏太仓市科教仪器厂出品)中，恒温20～80℃，震荡10分钟；
d)加入固定化脂肪酶，固定化脂肪酶的用量是蔗糖的0.01～0.5倍；
e)转速120～200r/min，恒温20～80℃，反应0.05～24小时后，以酚酞为指示剂，用5mol/L的氢氧化钠中和反应液中残留的月桂酸，然后向反应体系中加入5～15mL无水乙醇和20～40mL氯仿，充分摇匀，转移到分液漏斗中，静置分层后分离出下层提取液，上层用氯仿萃取，将下层提取液和氯仿萃取液合并，蒸去溶剂，真空干燥，结晶得到蔗糖脂肪酸酯。
以上所述的蔗糖为甘蔗糖或甜菜糖；
以上所述的脂肪酸为饱和的或非饱和的、直链的或支链的、含6至22个碳原子的脂肪酸；优选的，所述的脂肪酸为饱和的或非饱和的、直链的或支链的、含8至20个碳原子的脂肪酸；更优选的，所述的脂肪酸为饱和的或非饱和的、直链的或支链的、含10至18个碳原子的脂肪酸；更优选的，所述的脂肪酸为：癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、和/或油酸中的一种或几种；最优选的，所述的脂肪酸为月桂酸、油酸、和/或硬脂酸。
上述步骤c)和e)中，反应温度为20～80℃，优选30～50℃，更优选35～45℃。
上述步骤a)中蔗糖与脂肪酸的摩尔比为1∶1～1∶10，优选1∶1～1∶8；更优选1∶1.2～1∶4。
以上所述的有机溶剂是C2～C10烷烃、烯烃、醇、酮或其混合物、或与水的混合物。优选的，有机溶剂为丙酮、2-丁酮、乙醇、丙醇、异丙醇、叔丁醇、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、石油醚、丙二醇、和/或水中的一种或几种；更优选的，有机溶剂为丙酮、2-丁酮、乙醇、叔丁醇、戊烷、己烷、庚烷、石油醚、丙二醇和/或水中的一种或几种。其最佳加入量为每mmol蔗糖5～15ml溶剂。
上述步骤e)中的反应时间为0.05～24小时，优选5分钟～18小时，更优选5分钟～10小时，更优选5分钟～10小时，更优选5分钟～5小时；更优选10分钟～3小时。
以上所述的固定化脂肪酶是固定在载体上的脂肪酶，载体为硅藻土、活性炭、树脂或纺织品膜；固定化脂肪酶选自Rhizomucor miehei(Lipozyme，Trake Mark，ex.Novo，DenmarR)，Candida antarctica，candida cylindracea Lipase(Sigma Chemical Co.USA)，Novozym435(NovoNordisk)，猪胰脂肪酶(PPL，Sigma公司)，柱状假丝酵母脂肪酶(AYL，日本天野制药株式会社)，假单胞杆菌脂肪酶(PSL日本天野制药株式会社)，扩展青霉脂肪酶(PEL，南通生化制药厂)，酵母脂肪酶(CLL，无锡酶制剂厂)，Lipozyme RM(来源于Mucor m iehei)(北京Novo Nordisk公司)产生的脂酶。优选的，固定化脂肪酶选自Candida antarctica，candidacylindracea Lipase(Sigma Chemical Co.USA)，Novozym435(Novo Nordisk)，猪胰脂肪酶(PPL，Sigma公司)，柱状假丝酵母脂肪酶(AYL，日本天野制药株式会社)，酵母脂肪酶(CLL，无锡酶制剂厂)，Lipozyme RM(来源于Mucor m iehei)(北京Novo Nordisk公司)产生的脂酶。
固定化脂肪酶的用量是蔗糖的0.01～0.5倍，优选0.02～0.2倍，更优选0.02～0.1倍。
反应后加入酚酞做指示剂用0.05mol/l的NaOH滴定，通过测定反应体系前后的脂肪酸量确定转化率。
用薄层色谱法在展开剂：乙酸乙酯∶甲醇∶丙乙酸∶水(60∶30∶5∶5)中测定反应产物。
可通过载体结合技术，实现载体上脂酶的固定化，也可以直接购买固定化的脂肪酶。纤维固定化脂肪酶的制备是以棉纤维作为固定化材料，将棉纤维剪成小块，并浸在酶液中，浸泡12h，取出后用水冲洗2次，40℃真空干燥。化学修饰脂肪酶的制备是将游离酶和非离子表面活性剂溶于一定体积的正己烷，然后在4℃下搅拌24小时，离心获得滤饼，真空干燥并粉碎。
脂酶活性的测定方法是采用BP63法测定脂酶的活性，其原理和步骤如下：
(1)原理：脂酶从甘油三醋酸酯中分解出醋酸来，用氢氧化钠溶液滴定分解出来的醋酸的浓度。
(2)定义：一个脂酶单位相当于在实验条件下释放出1μmol醋酸所需的酯量。
(3)试剂：底物溶液：取5.9ml甘油三醋酸酯滴入90ml蒸馏水中，振摇，直至甘油三醋酸酯完全溶解，然后用蒸馏水定容至100ml。
氢氧化钠溶液：0.05mol/l。
酶溶液：用蒸馏水溶解酶，1ml溶液中应含有大约400u。
(4)作步骤：将50.0ml底物溶液移入一支可以调温的试管内(水浴加热)，边搅动边加热至30摄氏度，加氢氧化钠溶液把PH值调至6.2至6.4。然后滴加1.0ml酶溶液，并按动秒表，在30摄氏度下以中等速度搅动此反应混合液达30分钟，滴加氢氧化钠溶液，使这时的PH值保持在6.2至6.4。保温时间结束时读取氢氧化钠溶液的耗量，用同样方法测定空白值。只是这时用的是已在100摄氏度水浴中钝化了4min的酶溶液。
主值 空白值
底物溶液 50.0ml 50.0ml
升温至30摄氏度，用氢氧化钠溶液把PH值调至6.2至6.4加酶溶液 1.0ml -----
已钝化的酶溶液 ----- 1.0ml
于30摄氏度边搅动边精确保温30min，用0.05mol/l的氢氧化钠溶液连续滴定。30min后读取氢氧化钠溶液的耗量。
(5)计算：按以下公式计算脂酶的活性
(H-B)*5Q/Ew＝u/g
式中H：用于主值的耗量(ml)
B：用于空白值的耗量(ml)
50：50umol醋酸＝1ml0.05mol氢氧化钠溶液
Ew：1ml所用酶溶液中含酶的重量(g)
本发明的方法在常压下进行反应，生产工艺简单；反应温度为20～80℃，反应温度低；采用了低毒性的溶剂，可以用于食品和药品，而且产品提纯简便，可以得到高纯度的蔗糖脂肪酸酯。
附图说明
图1为蔗糖月桂酸酯的红外光谱图。各吸收峰的归属如下：
3400～3500cm-1为C＝O伸缩振动的倍频吸收峰；
3000～2860cm-1为甲基或亚甲基上的C-H伸缩振动吸收峰；
1740cm-1为酯基上的C＝O伸缩振动吸收峰(γC＝O)；
1460cm-1为亚甲基上的C-H弯曲振动吸收峰；
1375cm-1为甲基中的C-H弯曲振动吸收峰；
1230～1100cm-1为酯中的C-O-C结构的C-O伸缩振动吸收峰；
1015～950cm-1为呋喃环的特征吸收峰；
730cm-1为(CH2)n的骨架振动吸收峰；
红外光谱结果可以看出，我们所得到的结果与文献值基本一致[CasimirC，Akoh，BarryG，etal，Optimizedsynthesisofsucrose polyester：comparsion of physical properties of sucrose polyester，raffinosepolyesterandsaladoils[J]，JofFoodScience，1990，55(1)：236-243；谢得明，郑建仙，高大维，新型油脂蔗糖聚酯的合成与分析[J]，中国油脂，1997，22(4)：32-34.]，因此可认为，所得的样品是多酯且纯度也较高。
具体实施方式
再下面的实施例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
实施例1
准确称取1.6025g月桂酸3份，分别置于3个150ml的锥形瓶中，向每个锥形瓶中再各加入0.3964g的葡萄糖(酸糖摩尔比为4∶1)，加入10ml正丁醇，置于HZ-9613Y型油浴恒温震荡器(江苏太仓市科教仪器厂出品)中，恒温40℃，震荡10分钟后再加入0.4000g固定化酶，恒温40℃，转速150r/min，反应10小时。
反应后加入酚酞做指示剂用0.05mol/l的NaOH滴定，通过测定反应体系前后的脂肪酸量确定转化率。测得月桂酸转化率为10％。
用薄层色谱法在展开剂：乙酸乙酯∶甲醇∶丙乙酸∶水(60∶30∶5∶5)中测定反应产物。
以酚酞为指示剂，用5mol/L的氢氧化钠中和反应液中残留的月桂酸，然后向反应体系中加入10mL无水乙醇和30mL氯仿，充分摇匀，转移到分液漏斗中，静置分层后分离出下层提取液，上层用氯仿萃取，将下层提取液和氯仿萃取液合并，蒸去溶剂，真空干燥，得到提纯产物0.062g。
实施例2
准确称取1.6025g月桂酸3份，分别置于3个150ml的锥形瓶中，向每个锥形瓶中再各加入0.3964g的葡萄糖(酸糖摩尔比为4∶1)，加入10ml正己烷，置于HZ-9613Y型油浴恒温震荡器(江苏太仓市科教仪器厂出品)中，恒温40℃，震荡10分钟后再加入0.4000g固定化酶，恒温40℃，转速150r/min，反应8小时。
反应后加入酚酞做指示剂用0.05mol/l的NaOH滴定，通过测定反应体系前后的脂肪酸量确定转化率。测得月桂酸转化率为70％。
用薄层色谱法在展开剂：乙酸乙酯∶甲醇∶丙乙酸∶水(60∶30∶5∶5)中测定反应产物。
以酚酞为指示剂，用5mol/L的氢氧化钠中和反应液中残留的月桂酸，然后向反应体系中加入10mL无水乙醇和30mL氯仿，充分摇匀，转移到分液漏斗中，静置分层后分离出下层提取液，上层用氯仿萃取，将下层提取液和氯仿萃取液合并，蒸去溶剂，真空干燥，得到提纯产物0.402g。
实施例3
准确称取1.6025g月桂酸3份，分别置于3个150ml的锥形瓶中，向每个锥形瓶中再各加入0.3964g的葡萄糖(酸糖摩尔比为4∶1)，加入5ml丙二醇、5ml正己烷和1ml水，置于HZ-9613Y型油浴恒温震荡器(江苏太仓市科教仪器厂出品)中，恒温40℃，震荡10分钟后再加入0.4000g固定化酶，恒温40℃，转速150r/min，反应10小时。
反应后加入酚酞做指示剂用0.05mol/l的NaOH滴定，通过测定反应体系前后的脂肪酸量确定转化率。测得月桂酸转化率为61％。
用薄层色谱法在展开剂：乙酸乙酯∶甲醇∶丙乙酸∶水(60∶30∶5∶5)中测定反应产物。
以酚酞为指示剂，用5mol/L的氢氧化钠中和反应液中残留的月桂酸，然后向反应体系中加入10mL无水乙醇和30mL氯仿，充分摇匀，转移到分液漏斗中，静置分层后分离出下层提取液，上层用氯仿萃取，将下层提取液和氯仿萃取液合并，蒸去溶剂，真空干燥，得到提纯产物0.351g。
实施例4
准确称取1.6025g月桂酸3份，分别置于3个150ml的锥形瓶中，向每个锥形瓶中再各加入0.3964g的葡萄糖(酸糖摩尔比为4∶1)，加入10ml叔丁醇，置于HZ-9613Y型油浴恒温震荡器(江苏太仓市科教仪器厂出品)中，恒温40℃，震荡10分钟后再加入0.4000g固定化酶，恒温40℃，转速150r/min，反应12小时。
反应后加入酚酞做指示剂用0.05mol/l的NaOH滴定，通过测定反应体系前后的脂肪酸量确定转化率。测得月桂酸转化率为5％。
用薄层色谱法在展开剂：乙酸乙酯∶甲醇∶丙乙酸∶水(60∶30∶5∶5)中测定反应产物。
以酚酞为指示剂，用5mol/L的氢氧化钠中和反应液中残留的月桂酸，然后向反应体系中加入10mL无水乙醇和30mL氯仿，充分摇匀，转移到分液漏斗中，静置分层后分离出下层提取液，上层用氯仿萃取，将下层提取液和氯仿萃取液合并，蒸去溶剂，真空干燥，得到提纯产物0.028g。
实施例5
准确称取1.6025g月桂酸3份，分别置于3个150ml的锥形瓶中，向每个锥形瓶中再各加入0.3964g的葡萄糖(酸糖摩尔比为4∶1)，不添加溶剂，直接置于HZ-9613Y型油浴恒温震荡器(江苏太仓市科教仪器厂出品)中，恒温40℃，震荡10分钟后再加入0.4000g固定化酶，恒温40℃，转速150r/min，反应5小时。
反应后加入酚酞做指示剂用0.05mol/l的NaOH滴定，通过测定反应体系前后的脂肪酸量确定转化率。测得月桂酸转化率为57％。
用薄层色谱法在展开剂：乙酸乙酯∶甲醇∶丙乙酸∶水(60∶30∶5∶5)中测定反应产物。
以酚酞为指示剂，用5mol/L的氢氧化钠中和反应液中残留的月桂酸，然后向反应体系中加入10mL无水乙醇和30mL氯仿，充分摇匀，转移到分液漏斗中，静置分层后分离出下层提取液，上层用氯仿萃取，将下层提取液和氯仿萃取液合并，蒸去溶剂，真空干燥，得到提纯产物0.324g。
实施例6
准确称取1.6000g月桂酸3份，分别置于3个150ml的锥形瓶中，向每个锥形瓶中再各加入0.3963g的葡萄糖(酸糖摩尔比为4∶1)，加入15ml正己烷，置于HZ-9613Y型油浴恒温震荡器(江苏太仓市科教仪器厂出品)中，恒温40℃，震荡10分钟后再加入0.1280g固定化酶，恒温40℃，转速150r/min，反应5小时。
反应后加入酚酞做指示剂用0.05mol/l的NaOH滴定，通过测定反应体系前后的脂肪酸量确定转化率。测得月桂酸转化率为58％。
用薄层色谱法在展开剂：乙酸乙酯∶甲醇∶丙乙酸∶水(60∶30∶5∶5)中测定反应产物。
以酚酞为指示剂，用5mol/L的氢氧化钠中和反应液中残留的月桂酸，然后向反应体系中加入10mL无水乙醇和30mL氯仿，充分摇匀，转移到分液漏斗中，静置分层后分离出下层提取液，上层用氯仿萃取，将下层提取液和氯仿萃取液合并，蒸去溶剂，真空干燥，得到提纯产物0.348g。
实施例7
准确称取1.6000g月桂酸3份，分别置于3个150ml的锥形瓶中，向每个锥形瓶中再各加入0.3963g的葡萄糖(酸糖摩尔比为4∶1)，加入15ml正己烷，置于HZ-9613Y型油浴恒温震荡器(江苏太仓市科教仪器厂出品)中，恒温40℃，震荡10分钟后再加入0.1600g固定化酶，恒温40℃，转速150r/min，反应4小时。
反应后加入酚酞做指示剂用0.05mol/l的NaOH滴定，通过测定反应体系前后的脂肪酸量确定转化率。测得月桂酸转化率为64.7％。
用薄层色谱法在展开剂：乙酸乙酯∶甲醇∶丙乙酸∶水(60∶30∶5∶5)中测定反应产物。
以酚酞为指示剂，用5mol/L的氢氧化钠中和反应液中残留的月桂酸，然后向反应体系中加入10mL无水乙醇和30mL氯仿，充分摇匀，转移到分液漏斗中，静置分层后分离出下层提取液，上层用氯仿萃取，将下层提取液和氯仿萃取液合并，蒸去溶剂，真空干燥，得到提纯产物0.360g。
实施例8
准确称取1.6000g月桂酸3份，分别置于3个150ml的锥形瓶中，向每个锥形瓶中再各加入0.3963g的葡萄糖(酸糖摩尔比为4∶1)，加入15ml正己烷，置于HZ-9613Y型油浴恒温震荡器(江苏太仓市科教仪器厂出品)中，恒温40℃，震荡10分钟后再加入0.2037g固定化酶，恒温40℃，转速150r/min，反应8小时。
反应后加入酚酞做指示剂用0.05mol/l的NaOH滴定，通过测定反应体系前后的脂肪酸量确定转化率。测得月桂酸转化率为69.6％。
用薄层色谱法在展开剂：乙酸乙酯∶甲醇∶丙乙酸∶水(60∶30∶5∶5)中测定反应产物。
以酚酞为指示剂，用5mol/L的氢氧化钠中和反应液中残留的月桂酸，然后向反应体系中加入10mL无水乙醇和30mL氯仿，充分摇匀，转移到分液漏斗中，静置分层后分离出下层提取液，上层用氯仿萃取，将下层提取液和氯仿萃取液合并，蒸去溶剂，真空干燥，得到提纯产物0.366g。
实施例9
准确称取1.6000g月桂酸3份，分别置于3个150ml的锥形瓶中，向每个锥形瓶中再各加入0.3963g的葡萄糖(酸糖摩尔比为4∶1)，加入15ml正己烷，置于HZ-9613Y型油浴恒温震荡器(江苏太仓市科教仪器厂出品)中，恒温40℃，震荡10分钟后再加入0.3030g固定化酶，恒温40℃，转速150r/min，反应12小时。
反应后加入酚酞做指示剂用0.05mol/l的NaOH滴定，通过测定反应体系前后的脂肪酸量确定转化率。测得月桂酸转化率为70％。
用薄层色谱法在展开剂：乙酸乙酯∶甲醇∶丙乙酸∶水(60∶30∶5∶5)中测定反应产物。
以酚酞为指示剂，用5mol/L的氢氧化钠中和反应液中残留的月桂酸，然后向反应体系中加入10mL无水乙醇和30mL氯仿，充分摇匀，转移到分液漏斗中，静置分层后分离出下层提取液，上层用氯仿萃取，将下层提取液和氯仿萃取液合并，蒸去溶剂，真空干燥，得到提纯产物0.412g。
实施例10
准确称取1.6000g月桂酸3份，分别置于3个150ml的锥形瓶中，向每个锥形瓶中再各加入0.3963g的葡萄糖(酸糖摩尔比为4∶1)，加入15ml正己烷，置于HZ-9613Y型油浴恒温震荡器(江苏太仓市科教仪器厂出品)中，恒温40℃，震荡10分钟后再加入0.5020g固定化酶，恒温40℃，转速150r/min，反应3小时。
反应后加入酚酞做指示剂用0.05mol/l的NaOH滴定，通过测定反应体系前后的脂肪酸量确定转化率。测得月桂酸转化率为70.1％。
用薄层色谱法在展开剂：乙酸乙酯∶甲醇∶丙乙酸∶水(60∶30.5∶5)中测定反应产物。
以酚酞为指示剂，用5mol/L的氢氧化钠中和反应液中残留的月桂酸，然后向反应体系中加入10mL无水乙醇和30mL氯仿，充分摇匀，转移到分液漏斗中，静置分层后分离出下层提取液，上层用氯仿萃取，将下层提取液和氯仿萃取液合并，蒸去溶剂，真空干燥，得到提纯产物0.412g。
实施例11
准确称取1.6025g(8mmol)月桂酸3份，分别置于3个150ml的锥形瓶中，向每个锥形瓶中再各加入0.1982g(1mmol)的葡萄糖，加入10ml正己烷，置于HZ-9613Y型油浴恒温震荡器(江苏太仓市科教仪器厂出品)中，恒温40℃，震荡10分钟后再加入0.1923g固定化酶，恒温40℃，转速150r/min，反应15小时。
反应后加入酚酞做指示剂用0.05mol/l的NaOH滴定，通过测定反应体系前后的脂肪酸量确定转化率。测得月桂酸转化率为85％。
用薄层色谱法在展开剂：乙酸乙酯∶甲醇∶丙乙酸∶水(60∶30∶5∶5)中测定反应产物。
以酚酞为指示剂，用5mol/L的氢氧化钠中和反应液中残留的月桂酸，然后向反应体系中加入10mL无水乙醇和30mL氯仿，充分摇匀，转移到分液漏斗中，静置分层后分离出下层提取液，上层用氯仿萃取，将下层提取液和氯仿萃取液合并，蒸去溶剂，真空干燥，得到提纯产物0.480g。
实施例12
准确称取1.6025g(8mmol)月桂酸3份，分别置于3个150ml的锥形瓶中，向每个锥形瓶中再各加入0.1982g(1mmol)的葡萄糖，加入10ml正己烷，置于HZ-9613Y型油浴恒温震荡器(江苏太仓市科教仪器厂出品)中，恒温30℃，震荡10分钟后再加入0.1923g固定化酶，恒温30℃，转速150r/min，反应15小时。
反应后加入酚酞做指示剂用0.05mol/l的NaOH滴定，通过测定反应体系前后的脂肪酸量确定转化率。测得月桂酸转化率为67％。
用薄层色谱法在展开剂：乙酸乙酯∶甲醇∶丙乙酸∶水(60∶30∶5∶5)中测定反应产物。
以酚酞为指示剂，用5mol/L的氢氧化钠中和反应液中残留的月桂酸，然后向反应体系中加入10mL无水乙醇和30mL氯仿，充分摇匀，转移到分液漏斗中，静置分层后分离出下层提取液，上层用氯仿萃取，将下层提取液和氯仿萃取液合并，蒸去溶剂，真空干燥，得到提纯产物0.405g。
实施例13
准确称取1.6025g(8mmol)月桂酸3份，分别置于3个150ml的锥形瓶中，向每个锥形瓶中再各加入0.1982g(1mmol)的葡萄糖，加入10ml正己烷，置于HZ-9613Y型油浴恒温震荡器(江苏太仓市科教仪器厂出品)中，恒温35℃，震荡10分钟后再加入0.1923g固定化酶，恒温35℃，转速150r/min，反应15小时。
反应后加入酚酞做指示剂用0.05mol/l的NaOH滴定，通过测定反应体系前后的脂肪酸量确定转化率。测得月桂酸转化率为94％。
用薄层色谱法在展开剂：乙酸乙酯∶甲醇∶丙乙酸∶水(60∶30∶5∶5)中测定反应产物。
以酚酞为指示剂，用5mol/L的氢氧化钠中和反应液中残留的月桂酸，然后向反应体系中加入10mL无水乙醇和30mL氯仿，充分摇匀，转移到分液漏斗中，静置分层后分离出下层提取液，上层用氯仿萃取，将下层提取液和氯仿萃取液合并，蒸去溶剂，真空干燥，得到提纯产物0.525g。
实施例14
准确称取1.6025g(8mmol)月桂酸3份，分别置于3个150ml的锥形瓶中，向每个锥形瓶中再各加入0.1982g(1mmol)的葡萄糖，加入10ml正己烷，置于HZ-9613Y型油浴恒温震荡器(江苏太仓市科教仪器厂出品)中，恒温40℃，震荡10分钟后再加入0.1923g固定化酶，恒温40℃，转速150r/min，反应15小时。
反应后加入酚酞做指示剂用0.05mol/l的NaOH滴定，通过测定反应体系前后的脂肪酸量确定转化率。测得月桂酸转化率为87％。
用薄层色谱法在展开剂：乙酸乙酯∶甲醇∶丙乙酸∶水(60∶30∶5∶5)中测定反应产物。
以酚酞为指示剂，用5mol/L的氢氧化钠中和反应液中残留的月桂酸，然后向反应体系中加入10mL无水乙醇和30mL氯仿，充分摇匀，转移到分液漏斗中，静置分层后分离出下层提取液，上层用氯仿萃取，将下层提取液和氯仿萃取液合并，蒸去溶剂，真空干燥，得到提纯产物0.465g。
实施例15
准确称取1.6025g(8mmol)月桂酸3份，分别置于3个150ml的锥形瓶中，向每个锥形瓶中再各加入0.1982g(1mmol)的葡萄糖，加入10ml正己烷，置于HZ-9613Y型油浴恒温震荡器(江苏太仓市科教仪器厂出品)中，恒温45℃，震荡10分钟后再加入0.1923g固定化酶，恒温45℃，转速150r/min，反应15小时。
反应后加入酚酞做指示剂用0.05mol/l的NaOH滴定，通过测定反应体系前后的脂肪酸量确定转化率。测得月桂酸转化率为72％。
用薄层色谱法在展开剂：乙酸乙酯∶甲醇∶丙乙酸∶水(60∶30∶5∶5)中测定反应产物。
以酚酞为指示剂，用5mol/L的氢氧化钠中和反应液中残留的月桂酸，然后向反应体系中加入10mL无水乙醇和30mL氯仿，充分摇匀，转移到分液漏斗中，静置分层后分离出下层提取液，上层用氯仿萃取，将下层提取液和氯仿萃取液合并，蒸去溶剂，真空干燥，得到提纯产物0.405g。
实施例16
准确称取1.6025g(8mmol)月桂酸3份，分别置于3个150ml的锥形瓶中，向每个锥形瓶中再各加入0.1982g(1mmol)的葡萄糖，加入10ml正己烷，置于HZ-9613Y型油浴恒温震荡器(江苏太仓市科教仪器厂出品)中，恒温50℃，震荡10分钟后再加入0.1923g固定化酶，恒温50℃，转速150r/min，反应15小时。
反应后加入酚酞做指示剂用0.05mol/l的NaOH滴定，通过测定反应体系前后的脂肪酸量确定转化率。测得月桂酸转化率为53％。
用薄层色谱法在展开剂：乙酸乙酯∶甲醇∶丙乙酸∶水(60∶30∶5∶5)中测定反应产物。
以酚酞为指示剂，用5mol/L的氢氧化钠中和反应液中残留的月桂酸，然后向反应体系中加入10mL无水乙醇和30mL氯仿，充分摇匀，转移到分液漏斗中，静置分层后分离出下层提取液，上层用氯仿萃取，将下层提取液和氯仿萃取液合并，蒸去溶剂，真空干燥，得到提纯产物0.308g。
实施例17
准确称取0.5688g(2mmol)硬脂酸3份，分别置于3个150ml的锥形瓶中，向每个锥形瓶中再各加入0.3960g(2mmol)的葡萄糖，加入15ml正己烷、lml丙二醇和1ml水，置于HZ-9613Y型油浴恒温震荡器(江苏太仓市科教仪器厂出品)中，恒温50℃，震荡10分钟后再加入0.1016g固定化酶，恒温50℃，转速150r/min，反应0.5小时。
反应后加入酚酞做指示剂用0.05mol/l的NaOH滴定，通过测定反应体系前后的脂肪酸量确定转化率。测得月桂酸转化率为88％。
用薄层色谱法在展开剂：乙酸乙酯∶甲醇∶丙乙酸∶水(60∶30∶5∶5)中测定反应产物。
以酚酞为指示剂，用5mol/L的氢氧化钠中和反应液中残留的月桂酸，然后向反应体系中加入10mL无水乙醇和30mL氯仿，充分摇匀，转移到分液漏斗中，静置分层后分离出下层提取液，上层用氯仿萃取，将下层提取液和氯仿萃取液合并，蒸去溶剂，真空干燥，得到提纯产物0.487g。
实施例18
准确称取0.5688g(2mmol)硬脂酸3份，分别置于3个150ml的锥形瓶中，向每个锥形瓶中再各加入0.3960g(2mmol)的葡萄糖，加入15ml正己烷、1ml丙二醇和1ml水，置于HZ-9613Y型油浴恒温震荡器(江苏太仓市科教仪器厂出品)中，恒温60℃，震荡10分钟后再加入0.1130g固定化酶，恒温60℃，转速150r/min，反应5小时。
反应后加入酚酞做指示剂用0.05mol/l的NaOH滴定，通过测定反应体系前后的脂肪酸量确定转化率。测得月桂酸转化率为84.2％∶甲醇∶丙乙酸∶水(60∶30∶5∶5)中测定反应产物。
以酚酞为指示剂，用5mol/L的氢氧化钠中和反应液中残留的月桂酸，然后向反应体系中加入10mL无水乙醇和30mL氯仿，充分摇匀，转移到分液漏斗中，静置分层后分离出下层提取液，上层用氯仿萃取，将下层提取液和氯仿萃取液合并，蒸去溶剂，真空干燥，得到提纯产物0.470g。
实施例19
准确称取0.5690g(2mmol)硬脂酸3份，分别置于3个150ml的锥形瓶中，向每个锥形瓶中再各加入0.3965g(2mmol)的葡萄糖，加入15ml正己烷、1ml丙二醇和1ml水，置于HZ-9613Y型油浴恒温震荡器(江苏太仓市科教仪器厂出品)中，恒温50℃，震荡10分钟后再加入0.0573g固定化酶，恒温50℃，转速150r/min，反应2.5小时。
反应后加入酚酞做指示剂用0.05mol/l的NaOH滴定，通过测定反应体系前后的脂肪酸量确定转化率。测得月桂酸转化率为81％。
用薄层色谱法在展开剂：乙酸乙酯∶甲醇∶丙乙酸∶水(60∶30∶5∶5)中测定反应产物。
以酚酞为指示剂，用5mol/L的氢氧化钠中和反应液中残留的月桂酸，然后向反应体系中加入10mL无水乙醇和30mL氯仿，充分摇匀，转移到分液漏斗中，静置分层后分离出下层提取液，上层用氯仿萃取，将下层提取液和氯仿萃取液合并，蒸去溶剂，真空干燥，得到提纯产物0.467g。
实施例20
准确称取0.5249g(2mmol)油酸3份，分别置于3个150ml的锥形瓶中，向每个锥形瓶中再各加入0.1982g(1mmol)的葡萄糖，加入15ml正己烷、6滴丙二醇和3ml水，置于HZ-9613Y型油浴恒温震荡器(江苏太仓市科教仪器厂出品)中，恒温40℃，震荡10分钟后再加入0.2g固定化酶，恒温40℃，转速150r/min，反应10分钟。
反应后加入酚酞做指示剂用0.05mol/l的NaOH滴定，通过测定反应体系前后的脂肪酸量确定转化率。测得月桂酸转化率为95％。
用薄层色谱法在展开剂：乙酸乙酯∶甲醇∶丙乙酸∶水(60∶30∶5∶5)中测定反应产物。
以酚酞为指示剂，用5mol/L的氢氧化钠中和反应液中残留的月桂酸，然后向反应体系中加入10mL无水乙醇和30mL氯仿，充分摇匀，转移到分液漏斗中，静置分层后分离出下层提取液，上层用氯仿萃取，将下层提取液和氯仿萃取液合并，蒸去溶剂，真空干燥，得到提纯产物0.537g。
Claims (10)
1.一种酶催化制备蔗糖脂肪酸酯的方法，其步骤为：
a)蔗糖和脂肪酸，按摩尔比1∶1～10的范围，置于150ml的锥形瓶中；
b)按照每mmol蔗糖5-15ml有机溶剂的比例加入有机溶剂；
c)将加入上述混合物的锥形瓶置于HZ-9613Y型油浴恒温震荡器中，恒温20-80℃，震荡10分钟；
d)加入固定化脂肪酶，固定化脂肪酶的用量是蔗糖的0.01-0.5倍；
e)转速120-200r/min，恒温20-80℃，反应0.05-24小时后，以酚酞为指示剂，用5mol/L的氢氧化钠中和反应液中残留的月桂酸，然后向反应体系中加入5-15mL无水乙醇和20-40mL氯仿，充分摇匀，转移到分液漏斗中，静置分层后分离出下层提取液，上层用氯仿萃取，将下层提取液和氯仿萃取液合并，蒸去溶剂，真空干燥，结晶得到蔗糖脂肪酸酯。
2.如权利要求1所述的酶催化制备蔗糖脂肪酸酯的方法，其特征在于：
以上所述的蔗糖为甘蔗糖或甜菜糖；
以上所述的脂肪酸为饱和的或非饱和的、直链的或支链的、含6至22个碳原子的脂肪酸；
以上所述的固定化脂肪酶是固定在载体上的脂肪酶，载体为硅藻土、树脂或纺织品膜；
以上所述的有机溶剂是C2-C10烷烃、烯烃、醇、酮或其混合物、或与水的混合物。
3.如权利要求1或2所述的酶催化制备蔗糖脂肪酸酯的方法方法，其特征在于，所述的脂肪酸为饱和的或非饱和的、直链的或支链的、含10至18个碳原子的脂肪酸；步骤c)和e)中所述温度范围为30-50℃。
4.如权利要求3所述的酶催化制备蔗糖脂肪酸酯的方法方法，其特征在于，以上所述的脂肪酸为：癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、和/或油酸中的一种或几种；步骤c)和e)中所述温度范围为35-45℃。
5.如权利要求1或2所述的酶催化制备蔗糖脂肪酸酯的方法方法，其特征在于步骤a)中蔗糖和脂肪酸的摩尔比为1∶1～1∶8；固定化脂肪酶的用量是蔗糖的0.02-0.2倍。
6.如权利要求5所述的酶催化制备蔗糖脂肪酸酯的方法方法，其特征在于其特征在于蔗糖和脂肪酸的摩尔比为1∶1.2～1∶4；固定化脂肪酶的用量是蔗糖的0.02-0.1倍。
7.如权利要求1或2所述的酶催化制备蔗糖脂肪酸酯的方法方法，其特征在于所述的固定化脂肪酶选自Rhizomucor miehei(Lipozyme，Trake Mark，ex.Novo，DenmarR)，Candida antarctica，candida cylindracea Lipase(Sigma Chemical Co.USA)，Novozym435(Novo Nordisk)，猪胰脂肪酶(PPL，Sigma公司)，柱状假丝酵母脂肪酶(AYL，日本天野制药株式会社)，假单胞杆菌脂肪酶(PSL日本天野制药株式会社)，扩展青霉脂肪酶(PEL，南通生化制药厂)，酵母脂肪酶(CLL，无锡酶制剂厂)，L ipozyme RM(来源于Mucor m iehei)(北京Novo Nordisk公司)产生的脂酶。
8.如权利要求1或2所述的酶催化制备蔗糖脂肪酸酯的方法方法，其特征在于所述的固定化脂肪酶选自Candida antarctica，candida cylindracea Lipase(Sigma Chemical Co.USA)，Novozym435(Novo Nordisk)，猪胰脂肪酶(PPL，Sigma公司)，柱状假丝酵母脂肪酶(AYL，日本天野制药株式会社)，酵母脂肪酶(CLL，无锡酶制剂厂)，L ipozyme RM(来源于Mucorm iehei)(北京Novo Nordisk公司)产生的脂酶。
9.如权利要求1或2所述的酶催化制备蔗糖脂肪酸酯的方法方法，其特征在于所述的有机溶剂为丙酮、2-丁酮、乙醇、丙醇、异丙醇、叔丁醇、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、石油醚、丙二醇、和/或水中的一种或几种。
10.如权利要求1或2所述的酶催化制备蔗糖脂肪酸酯的方法方法，其特征在于所述的有机溶剂为丙酮、2-丁酮、乙醇、叔丁醇、戊烷、己烷、庚烷、石油醚、丙二醇和/或水中的一种或几种。
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