CN1732010A - 含有人参皂甙F1作为活性成分用于控制Bc1－2表达的试剂 - Google Patents

含有人参皂甙F1作为活性成分用于控制Bc1－2表达的试剂 Download PDF

Info

Publication number
CN1732010A
CN1732010A CNA2003801078408A CN200380107840A CN1732010A CN 1732010 A CN1732010 A CN 1732010A CN A2003801078408 A CNA2003801078408 A CN A2003801078408A CN 200380107840 A CN200380107840 A CN 200380107840A CN 1732010 A CN1732010 A CN 1732010A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ginsenoside
cell
bcl
apoptosis
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2003801078408A
Other languages
English (en)
Other versions
CN100404034C (zh
Inventor
曹始泳
李恩嬉
金修晶
申宜锡
张希景
金德姬
廉明勋
禹光植
李泰龙
沈荣哲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Amorepacific Corp
Original Assignee
Amorepacific Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amorepacific Corp filed Critical Amorepacific Corp
Publication of CN1732010A publication Critical patent/CN1732010A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100404034C publication Critical patent/CN100404034C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/16—Emollients or protectives, e.g. against radiation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及用于控制Bcl－2表达的试剂，其中该试剂含有由下列分子式1表示的人参皂甙F1(20－氧－β－D－吡喃葡萄糖基－20(S)－原人参萜三醇)作为活性成分。

Description

含有人参皂甙F1作为活性成分用于控制Bcl-2表达的试剂
技术领域
本发明涉及用于控制Bcl-2表达的试剂，该试剂含有由下列分子式1表示的人参皂甙F1(20-氧-β-D-吡喃葡萄糖基-20(S)-原人参萜三醇)(20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxatriol)作为活性成分。
【分子式1】
Figure A20038010784000031
背景技术
紫外辐射线是太阳光线的一部分，波长在200-400纳米之间，并且是电磁波谱的一部分；特别的是波长在280-320纳米之间的UVB(紫外光-B)是造成皮肤衰老、导致皮肤灼伤和皮肤癌的紫外辐射线的主要部分。当皮肤暴露于紫外辐射时，细胞中的DNA、蛋白、类脂等受到损伤，由此产生太阳灼伤细胞(sunburn-cell)。这些太阳灼伤细胞发生凋亡，同时伴随着DNA片段化、凋亡酶(caspase)的激活等等。高剂量的辐射会对细胞造成严重的不能修复的DNA损伤；而凋亡则通过诱导细胞死亡来阻止细胞发育成肿瘤。因此，为防止癌症并保持细胞的内稳态，根据细胞损伤程度选择性地诱导或阻止细胞凋亡是非常重要的。
Bcl-2在皮肤细胞凋亡过程中起非常重要的作用。Bcl-2基因对存在于核膜和线粒体外膜上的26kDa蛋白进行编码。Bcl-2是抑制细胞凋亡的蛋白，其通过粘附到加速凋亡的蛋白如Bax上来抑制它的功能。因此，细胞凋亡能够用Bcl-2与Bax的浓度比例来确定。
已知UVB辐射可降低人体角质细胞中Bcl-2的表达。另外，Bcl-2转染的HaCaT细胞或Bcl-2过量表达的转基因小鼠显示对UVB-诱导型凋亡有抵抗作用。然而，Bcl-2的过量表达会阻止DNA严重损伤的细胞的凋亡，从而引起癌症。因此，有选择地控制Bcl-2的表达是非常重要的。
到目前为止，与Bcl-2的功能相比，用于控制Bcl-2表达的技术或方法还未被大量公开。只公开了神经细胞中的一些转录因子如pRb、c-myb和Bm-3a。特别是，据报道，IV型POU区转录因子Bm-3a可粘附到Bcl-2的P2启动子上并控制Bcl-2基因的表达从而保护神经细胞免于凋亡。
然而，在源于人类皮肤的HaCaT细胞中，还没有公开控制Bcl-2表达的机制或因子。
另外，还未公开无毒并易于施用于人体的用于控制Bcl-2表达的物质。
发明内容
在这些情况下，本发明人发现从纯化的人参皂角苷(ginseng saponin)中获得的人参皂甙(ginsenoside)F1通过保持Bcl-2的恒定水平来保护人体HaCaT细胞免于UVB-诱导型凋亡。也就是说，本发明人发现人参皂甙F1可控制Bcl-2的表达并因此能抑制细胞凋亡，由此完成了本发明。
因此，本发明的目的是提供含有人参皂甙F1作为活性成分用于控制Bcl-2表达的试剂。
本发明另一目的是提供含有人参皂甙F1作为活性成分的凋亡促进剂或凋亡抑制剂。
本发明提供用于控制Bcl-2表达的试剂，该试剂含有由下列分子式1表示的人参皂甙F1作为活性成分。
【分子式1】
Figure A20038010784000051
低剂量UVB辐射时，人参皂甙F1通过保持Brn-3a的恒定水平以及对Bcl-2下调的相应抑制，来保护细胞免受UVB-诱导型凋亡。也就是说，人参皂甙F1本身不能促进Bcl-2的表达，但可以抑制由紫外辐射造成的Bcl-2的下调。相反，在高剂量紫外线辐射下，它能诱导Bcl-2表达的降低来促进凋亡。
总之，人参皂甙F1在低剂量紫外线辐射下能抑制Bcl-2表达的降低从而避免细胞凋亡；然而相反，在高剂量紫外线辐射下它能诱导凋亡，由此防止皮肤癌。因此，人参皂甙F1可以用作能抑制细胞损伤的抗衰老物质。
本发明证实，人参皂甙F1可控制Bcl-2的转录因子Brn-3a的表达，由此能将Bcl-2的表达程度维持在正常水平。
因此，人参皂甙F1能通过将细胞内Bcl-2的表达程度维持在适宜水平来避免凋亡。然而，人参皂甙F1本身不能促进Bcl-2的表达。这些表明人参皂甙F1具有防止由紫外线辐射引起的凋亡和细胞损伤而不产生皮肤癌的功效。
附图说明
图1是从MTT化验结果得到的HaCaT皮肤细胞存活率的示意图，其中将用人参皂甙F1处理过并暴露于紫外线中的细胞与未用人参皂甙F1处理的对照细胞进行比较；
图2显示细胞形状的变化，其中将用人参皂甙F1处理过并暴露于紫外线中的细胞与未用人参皂甙F1处理的对照细胞进行比较；
图3显示细胞DNA片段化的程度，其中将用人参皂甙F1处理过并暴露于紫外线中的细胞与未用人参皂甙F1处理的对照细胞进行比较；
图4显示由蛋白质印迹法结果获得的细胞PARP分裂程度，其中将用人参皂甙F1处理过并暴露于紫外线中的细胞与未用人参皂甙F1处理的对照细胞进行比较；
图5显示mRNA水平Bcl-2的表达程度，其中将用人参皂甙F1处理过并暴露于紫外线中的细胞与未用人参皂甙F1处理的对照细胞进行比较；
图6显示由蛋白质印迹法获得的Bcl-2的转录因子Brn-3a的表达程度，其中将用人参皂甙F1处理过并暴露于紫外线中的细胞与未用人参皂甙F1处理的对照细胞进行比较。Hsp70代表使用的蛋白量相同。
具体实施方式
下面将参照实施例对本发明进行详细描述。然而，这些实施例并不限制本发明的范围。
参考实施例1  纯化人参皂角苷的制备
将2千克红人参(KT&G公司，6年的红人参)加入到4升含水的甲醇中，回流3次，然后15℃沉淀6天。通过过滤和离心来分离残渣和滤液(remainders)，然后减压浓缩滤液来获得提取物。将提取物悬浮于水中，再用1升乙醚重新抽提5次来除掉色素，然后用500毫升1-丁醇将所得到的水层抽提3次。上述获得的1-丁醇层用5％KOH处理并用蒸馏水洗涤，然后减压浓缩来获得1-丁醇提取物。将所述提取物(1-丁醇提取物)溶解在少量甲醇中，并往其中加入大量乙酸乙酯来获得沉淀。将沉淀干燥，获得70克纯化的人参皂角苷提取物。
参考实施例2  人参皂甙F1的制备
将10克上述参考实施例1中获得的纯化的人参皂角苷溶解在1000毫升柠檬酸盐缓冲液(pH 4.0)中，并加入15克从青霉菌(penicillium sp.)中获得的柚苷酶，在40℃搅拌反应48小时。反应后，将反应混合物加热10分钟使酶失活，然后用相同量的乙酸乙酯将反应混合物抽提3次，并浓缩。获得的产物进行柱层析(氯仿∶甲醇＝9∶1)，最后分离到1.5克人参皂甙F1。
实施例1  用人参皂甙F1处理时，对紫外线诱导的HaCaT细胞凋亡的抑制作用
<步骤1>细胞系和细胞培养
人体角质细胞HaCaT(得自Dr.Fusenig in German Cancer ResearchCenter(DKFZ))在含10％胎牛血清的DMEM培养基(Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium；Gibco 1210-0038)中，于37℃、5％CO2条件下培养。
<步骤2>用人参皂甙F1处理时对紫外线诱导的细胞凋亡的抑制作用
用胰蛋白酶处理在步骤1中培养的细胞来获得单细胞悬浮液，以每孔2×105个细胞将其接种到6孔培养瓶中培养24小时。之后，细胞在新的不含胎牛血清的DMEM中再培养24小时，然后用1、5、10μM的人参皂甙F1处理。人参皂甙F1溶解在100％乙醇中形成的浓度为培养基浓度的1/1000。用人参皂甙F1处理24小时后，细胞培养物用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤，并在含有PBS的状态下暴露于60-120毫焦/平方厘米的UVB辐射下。然后除去PBS，将培养基更换成含相同浓度人参皂甙F1的新鲜培养基。另外，培养未用人参皂甙F1处理的细胞作为对照。UVB辐射24小时后，在用人参皂甙F1处理和未用人参皂甙F1处理的所有细胞中加入3-[4，5-二甲基四唑]-2，5-二苯基四唑溴鎓盐(3-[4，5-dimethyl tetrazole]-2，5-diphenyltetrazoliumbromide)(MTT，Sigma)，然后在37℃下培养4小时。培养后，细胞用二甲亚砜溶解，然后用ELISA计数仪(Thermo Max，Molecular Devices公司)测量540纳米时甲臜染料(formazan dye)产生的光密度(OD)值。未暴露于UVB的细胞的OD值假定为100％，然后计算并确定其它细胞的相对值作为其存活率。结果在图1中显示。当暴露于UVB中时，与未处理的细胞相比，用人参皂甙F1处理的细胞显示出的凋亡抑制作用提高了1.5倍。然而在120毫焦/平方厘米的UVB辐射下，用人参皂甙F1处理的细胞与未处理的细胞相比显示出更多凋亡。
实施例2  用人参皂甙F1处理时，对紫外线诱导的HaCaT细胞DNA片段化的抑制作用
<步骤1>细胞系和细胞培养
使用与实施例1中步骤1相同的方法。
<步骤2>用人参皂甙F1处理时，对紫外线诱导的HaCaT细胞DNA片段化的抑制作用
用胰蛋白酶处理在步骤1中培养的细胞来获得单细胞悬浮液，以每孔2×105个细胞将其接种到6孔培养瓶中培养24小时。之后，细胞在新的不含胎牛血清的DMEM中再培养24小时，然后用5μM的人参皂甙F1处理。用人参皂甙F1处理24小时后，培养物用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤，并在含有PBS的状态下暴露于60毫焦/平方厘米的UVB辐射下。然后除去PBS，将培养基更换成含相同浓度人参皂甙F1的新鲜培养基。另外，培养未用人参皂甙F1处理的细胞作为对照。
UVB辐射24小时后，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤所有用人参皂甙F1处理和未用人参皂甙F1处理的细胞，并用含4％低聚甲醛的磷酸缓冲盐溶液处理15分钟来固定细胞。然后用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤细胞，并在含有0.05％吐温20和0.2％牛血清蛋白(BSA)的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中反应15分钟。在反应混合物中加入末端脱氧核苷转移酶(terminaldeoxynucleotide transferase)反应液(TUNEL凋亡检测试剂盒，Upstate，美国)，反应1小时。之后加入反应中止缓冲液(reaction termination buffer)(TUNEL凋亡检测试剂盒，Upstate，美国)以结束反应，并往其中加入封闭液(TUNEL凋亡检测试剂盒，Upstate，美国)，反应20分钟。之后再加入抗生物素蛋白-异硫氰酸荧光素(FITC)(TUNEL凋亡检测试剂盒，Upstate，美国)，反应30分钟，然后用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤。
用500nM碘化丙啶(propidium iodide)溶液进行复染色，并用显微镜观察。通过观察大约200个细胞，计算所有细胞中DNA片段化的数量。当暴露在UVB时，与未处理的细胞相比，用人参皂甙F1处理的细胞DNA片段化降低了2.4倍。结果在图3中显示。
实施例3用人参皂甙F1处理时，对紫外线诱导的PARP蛋白分解程度的抑制作用
<步骤1>细胞系和细胞培养
使用与实施例1中步骤1相同的方法。
<步骤2>用人参皂甙F1处理时，对紫外线诱导的PARP蛋白分解程度的抑制作用
用胰蛋白酶处理在步骤1中培养的细胞来获得单细胞悬浮液，以每孔2×105个细胞将其接种到6孔培养瓶中培养24小时。之后，细胞在新的不含胎牛血清的DMEM中再培养24小时，然后用5μM的人参皂甙F1处理。用人参皂甙F1处理24小时后，细胞培养物用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤，并在含有PBS的状态下暴露于60毫焦/平方厘米的UVB辐射下。然后除去PBS，将培养基更换成含5μM人参皂甙F1的新鲜培养基。另外，培养未用人参皂甙F1处理的细胞作为对照。
UVB辐射24小时后，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤所有用人参皂甙F1处理和未用人参皂甙F1处理的细胞，用胰蛋白酶处理来收集细胞，再用8M尿素、2％CHAPS、50mM1，4-二硫酥糖醇(DTT)、2M硫脲、2mM苯甲基磺酰氟(PMSF)和500微升的含100微克/毫升亮抑酶肽(leupeptine)的蛋白提取缓冲液处理这些细胞，并在室温下放置10分钟；然后用15,000克力于4℃离心10分钟，收集上清液，然后用BIO-Rad Protein Dye ReagentTM确定蛋白的量。用8％十二烷基磺酸钠-聚丙烯醯胺胶电泳(SDS-PAGE)根据分子大小分离出20微克蛋白，并将所得蛋白用50伏电压印迹到PDF膜(BioRad)上，维持12小时。获得的印迹用5％脱脂牛奶溶液封闭1小时，用Amersham Bioscience的增强化学发光(ECL)试剂盒，通过使用抗PARP多克隆抗体(Santa Cruz)作为初次抗体并使用结合辣根过氧化物酶的抗兔IgG(amersham)作为二次抗体进行蛋白质印迹。
将反应的印迹曝光到X线富士胶片上并冲洗显影以观察蛋白表达程度。用PowerLook 2100XL(umax)对胶片上的条带进行扫描，并用ImageMaster2D Elite(Amersham Bioscience)图像分析程序进行分析。用与对照相比的相对量来评价PARP蛋白分裂的量。当暴露在UVB时，用人参皂甙F1处理的细胞与那些未处理的细胞相比，其PARP蛋白分裂显示降低了1.4倍。结果在图4中显示。
实施例4用人参皂甙F1处理时，对紫外线诱导的Bcl-2表达降低的抑制作用
<步骤1>细胞系和细胞培养
使用与实施例1中步骤1相同的方法。
<步骤2>用人参皂甙F1处理时，对紫外线诱导的Bcl-2表达降低的抑制作用
用胰蛋白酶处理在步骤1中培养的细胞来获得单细胞悬浮液，以每孔2×105个细胞将其接种到6孔培养瓶中培养24小时。之后，细胞在新的不含胎牛血清的DMEM培养基中再培养24小时，然后用5μM的人参皂甙F1处理。用人参皂甙F1处理24小时后，细胞培养物用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤，并在含有PBS的状态下暴露于60毫焦/平方厘米的UVB辐射下。然后除去PBS，将培养基更换成含5μM人参皂甙F1的新鲜培养基。另外，培养未用人参皂甙F1处理的细胞作为对照。
UVB辐射24小时并在预定的时间间隔不受UVB辐射，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤所有用人参皂甙F1处理和未用人参皂甙F1处理的细胞，并用Oligotex Direct mRNA试剂盒(QIAGEN，Hilden，德国)提取mRNA，然后进行定量反转录PCR(RT-PCR)。进行定量RT-PCR的Bcl-2引物序列和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物序列在表1中显示。
  表1进行定量RT-PCR的Bcl-2和GAPDH引物序列
引物 序列
Bcl-2正向引物 5′-TACGATAACCGGGAGATAGTGA-3′(人体Bcl-2cDNA的55-67核苷酸)
Bcl-2反向引物 5′-CAGGTGCCGGTTCAGGTACT-3′(人体Bcl-2cDNA的566-586核苷酸)
GAPDH正向引物 5′-CAACTACATGGTTTACATGTTCC-3′(人体GAPDHcDNA的174-194核苷酸)
GAPDH反向引物 5′-GGACTGTGGTCATGAGTCCT-3′(人体GAPDHcDNA的570-589核苷酸)
在含有50mM Tris-HCl(pH8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、0.1M DTT、10mM dNTP和40单位/毫升核糖核酸酶抑制剂的25微升反转录反应缓冲液中加入1微克mRNA，然后再加入0.5微克/毫升寡聚(oligo)(dT)16引物和200单位SuperScript II(GiboBRL)反转录聚合酶并在42℃下反应1小时。2.5微升反转录反应液与含有50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH8.3)、5mM MgCl2、100μM dNTP的50微升PCR缓冲液混合，再加入10μM引物和0.5单位TaqDNA聚合酶，然后重复下列循环30次：95℃30秒、58℃30秒、72℃30秒。PCR产物通过琼脂糖凝胶进行电泳并扫描，然后用ImageMaster 2D Elite(Amersham Bioscience)图像分析程序进行分析。Bcl-2的表达量用与GAPDH表达量的相对值来评价。
当细胞只用人参皂甙F1处理时，Bcl-2按时间阶段的表达跟未处理的细胞没有差别。当用UVB辐射时，未用人参皂甙F1处理的细胞中Bcl-2的表达降低，在24小时后Bcl-2几乎不表达。然而，甚至是当UVB辐射时，用人参皂甙F1处理的细胞中Bcl-2的表达与未被UVB辐射时相比几乎保持相同。也就是说，当用人参皂甙F1处理细胞时，与未处理的细胞相比，Bcl-2的表达增加3倍。结果在图5中显示。
实施例5用人参皂甙F1处理时，对紫外线诱导的Brn-3a表达降低的抑制作用
<步骤1>细胞系和细胞培养
使用与实施例1中步骤1相同的方法。
<步骤2>用人参皂甙F1处理时，对紫外线诱导的Brn-3a表达降低的抑制作用
用胰蛋白酶处理在步骤1中培养的细胞来获得单细胞悬浮液，以每孔2×105细胞将其接种到6孔培养瓶中培养24小时。之后，细胞在新的不含胎牛血清的DMEM培养基中再培养24小时，然后用5μM的人参皂甙F1处理。用人参皂甙F1处理24小时后，细胞培养物用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤，并在含有PBS的状态下暴露于60毫焦/平方厘米的UVB辐射下。然后除去PBS，将培养基更换成含5μM人参皂甙F1的新鲜培养基。另外，培养未用人参皂甙F1处理的细胞作为对照。
UVB辐射24小时后，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤所有用人参皂甙F1处理和未用人参皂甙F1处理的细胞，用胰蛋白酶处理来收集细胞，再用8M尿素、2％CHAPS、50mM DTT、2M硫脲、2mM PMSF和500微升含100微克/毫升亮抑酶肽的蛋白提取缓冲液处理这些细胞，在室温下放置10分钟；然后用15,000克力于4℃离心10分钟，收集上清液，然后用BIO-RadProtein Dye ReagentTM确定蛋白的量。用8％SDS-PAGE根据分子大小分离出20微克蛋白，并将所得蛋白以50伏电压印迹到PDF膜(BioRad)上，保持12小时。获得的印迹用5％脱脂牛奶溶液封闭1小时，用AmershamBioscience的增强化学发光(ECL)试剂盒，通过使用抗PARP多克隆抗体(Santa Cruz)作为初次抗体并使用结合辣根过氧化物酶的抗兔IgG(amersham)作为二次抗体进行蛋白质印迹。
将反应的印迹曝光到X线富士胶片上并冲洗显影来观察蛋白表达量。用PowerLook 2100XL(umax)对胶片上的条带进行扫描，用ImageMaster 2DElite(Amersham Bioscience)的图像分析程序进行分析。当被UVB辐射时，Brn-3a的表达降低，然而当用人参皂甙F1处理时所述表达得到恢复。结果在图6中显示。
如上所述，本发明的人参皂甙F1能抑制由紫外辐射造成的Bcl-2表达的下降，从而抑制紫外辐射诱导的凋亡，相反，在高剂量紫外线辐射下，人参皂甙F1能促进细胞凋亡从而避免细胞发育成癌细胞。
                          序列表
<110>株式会社太平洋(AMOREPACIFIC CORPORATION)
<120>含有人参皂甙F1作为活性成分用于控制Bcl-2表达的试剂
<130>I5O76YOL
<150>KR10-2002-0085716
<151>2002-12-28
<160>4
<170>PatentIn 3.1
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Bcl-2正向引物
<400>1
tacgataacc gggagatagt ga                                        22
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Bcl-2反向引物
<400>2
caggtgccgg ttcaggtact                                           20
<210>3
<211>23
<219>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>GAPDH正向引物
<400>3
caactacatg gtttacatgt tcc                                  23
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>GAPDH反向引物
<400>4
ggactgtggt catgagtcct                                      20

Claims (6)

1、一种用于控制Bcl-2表达的试剂，其特征在于，该试剂含有人参皂甙F1作为活性成分。
2、根据权利要求1所述的试剂，其中，所述人参皂甙F1通过控制Brn-3a的表达来控制Bcl-2的表达。
3、一种凋亡抑制剂，其中，该抑制剂含有人参皂甙F1作为活性成分，并抑制由低剂量紫外辐射诱导的凋亡。
4、根据权利要求1所述的凋亡抑制剂，其中，所述人参皂甙F1通过抑制Bcl-2表达的降低来抑制凋亡。
5、一种凋亡促进剂，其中，该促进剂含有人参皂甙F1作为活性成分，并促进由高剂量紫外辐射诱导的凋亡。
6、一种用于控制Brn-3a表达的试剂，其中，该试剂含有人参皂甙F1作为活性成分。
CNB2003801078408A 2002-12-28 2003-12-27 含有人参皂甙F1作为活性成分用于控制Bc1-2表达的试剂 Expired - Fee Related CN100404034C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020020085716A KR100820072B1 (ko) 2002-12-28 2002-12-28 진세노사이드 Ｆ1을 유효성분으로 하는 Ｂｃｌ-2 발현조절제
KR1020020085716 2002-12-28

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1732010A true CN1732010A (zh) 2006-02-08
CN100404034C CN100404034C (zh) 2008-07-23

Family

ID=36241075

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB2003801078408A Expired - Fee Related CN100404034C (zh) 2002-12-28 2003-12-27 含有人参皂甙F1作为活性成分用于控制Bc1-2表达的试剂

Country Status (7)

Country Link
US (2) US20070155829A1 (zh)
EP (1) EP1575599A2 (zh)
JP (1) JP4654040B2 (zh)
KR (1) KR100820072B1 (zh)
CN (1) CN100404034C (zh)
AU (1) AU2003289538A1 (zh)
WO (1) WO2004058141A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8647610B2 (en) 2007-10-31 2014-02-11 Amorepacific Corporation Use of melanin biosynthesis inhibitors from korean ginseng and the cosmetic composition containing thereof for skin whitening

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2345166T3 (es) 2006-03-23 2010-09-16 Actelion Pharmaceuticals Ltd. Derivados antibioticos del tipo de ciclohexil- o piperidinilcarboxamida.
US9657073B2 (en) 2010-09-01 2017-05-23 Case Western Reserve University Inhibitors of Bcl-2
KR101777920B1 (ko) 2015-07-27 2017-09-14 재단법인 지능형 바이오 시스템 설계 및 합성 연구단 진세노사이드 f1을 포함하는 아밀로이드 플라크 제거용 조성물

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2695561B1 (fr) 1992-09-17 1994-12-02 Lvmh Rech Gie Composition cosmétique ou dermatologique contenant au moins une saponine de type ginsenoside, et ses applications, notamment pour le soin des cheveux.
US6001992A (en) * 1999-01-07 1999-12-14 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of novel anti-apoptotic bcl-2-related proteins
JP3193542B2 (ja) * 1993-09-08 2001-07-30 カネボウ株式会社 皮膚老化防止化粧料
KR100192678B1 (ko) * 1995-06-07 1999-06-15 손경식 약효가 증강된 가공인삼 제품
JP2001511344A (ja) * 1997-07-25 2001-08-14 ニューロヴェックス リミテッド 転写因子Ｂｒｎ−３ａの使用
KR100361433B1 (ko) * 1998-05-28 2003-01-24 주식회사 태평양 인삼추출물을함유하는피부노화방지용화장료조성물
US6261603B1 (en) * 1999-05-11 2001-07-17 Mcelwain Elizena A. Skin cream
KR100418604B1 (ko) * 2001-11-01 2004-02-11 주식회사 태평양 인삼 사포닌으로부터 화합물 ｋ 및 진세노사이드 ｆ1을제조하는 방법
KR100465976B1 (ko) * 2002-01-05 2005-01-13 주식회사 태평양 나노유화기술에 의해 진세노사이드 ｆ1을 함유하는 미세 유화 입자 및 이를 사용한 피부 외용제 조성물
KR100835864B1 (ko) * 2002-05-27 2008-06-09 (주)아모레퍼시픽 인삼사포닌 대사 산물을 유효 성분으로 한 미세 유화 입자 및 그 제조방법, 이를 함유한 피부 노화방지용 화장료 조성물
JP4549625B2 (ja) * 2002-01-05 2010-09-22 株式會社アモーレパシフィック 人参サポニン代謝産物を有効成分とする微細乳化粒子及びその製造方法、並びにこれを含有する皮膚老化防止用の化粧料組成物
KR200337005Y1 (ko) 2003-07-09 2003-12-31 (주) 그린죤 향액 자동분사기
KR200360017Y1 (ko) 2004-06-01 2004-08-26 김길평 교량용 풍속감속벽
KR200394523Y1 (ko) 2005-06-20 2005-09-02 이기태 다용도 케이스 세트

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8647610B2 (en) 2007-10-31 2014-02-11 Amorepacific Corporation Use of melanin biosynthesis inhibitors from korean ginseng and the cosmetic composition containing thereof for skin whitening

Also Published As

Publication number Publication date
CN100404034C (zh) 2008-07-23
KR20040059139A (ko) 2004-07-05
WO2004058141A2 (en) 2004-07-15
EP1575599A2 (en) 2005-09-21
US8258272B2 (en) 2012-09-04
JP4654040B2 (ja) 2011-03-16
KR100820072B1 (ko) 2008-04-10
AU2003289538A8 (en) 2004-07-22
JP2006512384A (ja) 2006-04-13
US20080261899A1 (en) 2008-10-23
AU2003289538A1 (en) 2004-07-22
WO2004058141A3 (en) 2004-12-02
US20070155829A1 (en) 2007-07-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1812795A (zh) 外用组成物
CN103565699B (zh) 一种黑果枸杞祛斑美白抗衰老精华液及其制备方法
JP6868724B2 (ja) メラニン生成促進活性を示すペプチド及びその用途
CN1404387A (zh) 含植物提取物的化妆制剂
CN1610828A (zh) 通过抑制干细胞因子的生成和释放、用于改善瘙痒、皮肤粗糙或皮肤敏感或用于增白的药物
CN1732010A (zh) 含有人参皂甙F1作为活性成分用于控制Bc1－2表达的试剂
CN105175500B (zh) 采用高效液相色谱制备的活性多肽及其用途
CN1717414A (zh) 用于产生透明质酸的含有人参皂甙化合物k的促进剂
JP2011126850A (ja) 幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現上昇抑制剤及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現上昇抑制剤
CN1780603A (zh) 预防或治疗上皮组织损伤或毛发脱落
KR20190107248A (ko) 연잎 추출물을 포함하는 근기능 및 운동능 강화 기능성 식품 조성물 및 그 제조방법
CN1098707C (zh) 含藻蛋白多糖提取物的药物组合物以及藻蛋白多糖的提取
Simpson et al. Regulation of gingival collagenase: A possible role for a mast cell factor
CN1561222A (zh) 基质金属蛋白酶抑制剂
CN1053568C (zh) 草药健康美容产品
CN1253469C (zh) 人的肿瘤－睾丸抗原hca587的抗原决定簇多肽及其用途
CN1348358A (zh) Cecropia属植物的提取物的应用
CN1132571C (zh) 增白化妆品
Reed Oestradiol-17β hydroxysteroid dehydrogenase: its family and function
Jörgensen et al. Serogenetic investigations on malignant melanomas with reference to the incidence of AB0 system, Rh system, Gm, Inv, Hp and Gc systems
CN1261449C (zh) 促黑素细胞激素抑制剂
CN1319431A (zh) 含苦杏仁苷物质抗肿瘤活性的增进方法及其组合物和评价方法
CN1593390A (zh) 和厚朴酚在制备抗肿瘤血管形成药物中的用途
JP5300223B2 (ja) 発現抑制剤及び被験物質の評価方法
CN1291017C (zh) 一种抑癌用含有酰基携带蛋白样结构域的基因p40

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C19 Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee