CN1730648A - 新的尤马马杜拉放线菌及用其生产马杜拉霉素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种工业用微生物，该微生物为通过诱变分离获得的一种尤马马杜拉放线菌AY－168 DDZL05(Actinomocara yumaensisi AY－168 DDZL05)，其保藏号为CCTCC No.M 205029。本发明还提供了一种用该菌株来生产防治动物球虫病等疾病的马杜拉霉素的方法。目前我国国内工业用菌株的生产效价在8000左右，而本发明方法的生产效价在12000μ/ml以上。

Description

新的尤马马杜拉放线菌及用其生产马杜拉霉素的方法

技术领域

本发明涉及微生物领域。具体地说，本发明涉及一种新的尤马马杜拉放线菌及用该菌生产马杜拉霉素的方法。

背景技术

球虫病的病原为艾美耳球虫，我国已报道的有7种，即柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、堆艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、哈氏艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫和早熟艾美耳球虫。前两种的致病力较强，其余的几种依次减弱。柔嫩艾美耳球虫寄生在盲肠粘膜内，称盲肠球虫。毒害艾美耳球虫寄生在小肠中段粘膜内，称小肠球虫。球虫卵的形态呈卵圆形、圆形或椭圆形。鸡球虫的发育要经过3个阶段：无性生殖和有性生殖阶段是在肠粘膜上皮细胞内进行的，孢子生殖阶段是在体外形成孢子囊和孢子，而成为感染性球虫卵。鸡球虫的感染过程是：从粪便排出的卵囊在适合的温度和湿度下，约经1-2天发育成感染性卵囊。这种卵囊被家禽吃了以后，子孢子游离出来，钻入肠上皮细胞内发育成裂殖子(无性生殖)、配子、合子(有性生殖)。合子周围形成一层被膜，被排出体外。鸡球虫在肠上皮细胞内不断进行有性和无性生殖，使上皮细胞遭受到严重破坏，遂引起发病。球虫的宿主有特异性，即侵袭鸡的球虫不会侵袭火鸡等其它家禽，而感染其他家禽的球虫不会感染鸡。各品种的鸡均有易感性，一日龄雏鸡对本病也敏感，但有母源抗体保护，所以10日龄以内很少发病。15-50日龄发病率和死亡率很高，成年鸡对球虫也是敏感的。球虫的卵囊抵抗力非常强，在土壤中可以保持生活期达4-9个月，在有树荫的运动场上，可达15-18个月。当气温在22-30℃时一般只需要18-36小时，就可能成为感染性卵囊。卵囊对高温和干燥的抵抗力较弱。病鸡是主要传染源。凡被带虫鸡污染过的饲料、饮水、土壤或用具等，都有卵囊存在。鸡感染球虫的途径主要是吃了感染性卵囊。人及其衣服、用具等可以成为机械性传播者。苍蝇、甲虫、蟑螂、鼠类和野鸟都可成为机械传播媒介。当存有带虫鸡(传染源)并有传染性卵囊时，就会爆发球虫病。发病时间与气温、雨量有密切关系，通常在温暖的月份流行。室内温度高达30-32℃，湿度80％-90％时，最易发病。外界环境和饲养管理，对球虫病的发生有重大关系。天气潮湿多雨，雏鸡过于拥挤，运动场积水，饲料中缺乏维生素A、维生素K以及日粮配备不当等，都是本病流行的诱因。鸡的球虫病是一种严重危害养鸡业的寄生虫病，它降低鸡的产蛋量，降低体重，提高死亡率，尤其4-6周龄雏鸡，一旦感染球虫，死亡率可高达50％-100％，病禽产卵率减少20％-80％，体重减轻可达30％-70％，对养鸡业危害很大。

为了防止耐药性对药物疗效的影响，七十年代美国礼来公司和日本相继开发了多醚类抗生素莫能霉素、盐霉素，提高了抗球生病药物的质量，并取得相当大的经济效益和社会效益，八十年代末，美国的两个公司同时推出马杜霉素，这是迄今发现的用量最少、抗球虫活性最高的抗生素。多醚类抗生素作为抗球虫病具有疗效高、毒性低，不易产生耐药性等特点。但长期使用一种抗生素，也会使敏感性降低并产生部分抗药性，所以应积极开发新的抗生素，并在开发新抗生素的同时考虑到交叉耐药问题。试验证明，对一种单价的多醚类抗生素产生耐药性的球虫也抗另一种单价多醚抗生素，但可能对其它形式的多醚类抗生素敏感，如：不能用单价多醚类抗生素能霉素、盐霉素控制的球虫病，可由单价单糖苷多醚抗生素的耐药性机制是不同的。通过试验可知，马杜拉霉素对引起鸡球虫病的绝大多数球虫都有很好的抗球虫活性，在已使用了几年其它多醚类抗球虫抗生素的地方也是如此，所以马杜拉霉素是新一代抗球虫剂和增重剂，具有广阔的前景，可替代莫能霉素、盐霉素，减少由于耐药性产生而给畜牧业带来的威胁。

马杜拉霉素是一种由马杜拉放线菌产生的新型的多醚类离子载体抗生素。马杜霉素临床上常用其铵盐，为白色结晶粉末，性质稳定，不溶于水，可溶于有机溶剂。由于其抗球虫广谱高效，耐药性小，应用十分广泛。但其用量极小，安全范围非常窄，推荐使用剂量与中毒剂量很接近。主要用来治疗鸡的球虫病，还可防治酮病，提高饲料利用率，防治猪的痢疾，它对多种G+细菌有较强的抗菌活性，因此是一种高效的防腐杀菌剂。

马杜霉素的生物学特征为具有促进阳离子通过细胞膜的能力，对金属离子有特殊的选择性，可与钾、钠等一价阳离子结合成络合物，选择性地输送钾、钠离子进入球虫的子孢子和第一代裂殖体，使球虫细胞内钾(钠)离子浓度急剧增加，为平衡渗透压，大量的水分进入球虫细胞，从而破坏了球虫细胞膜内外离子的正常平衡和移动能力，对经过生物膜的细胞内外运输的糖、氨基酸、有机酸等的通透性以及离子特异性蛋白质与核酸的机能均产生影响，最终导致球虫新陈代谢紊乱，虫体膨胀而死。

马杜拉霉素与其它多醚类抗生素相比较，具有以下特点：

1、使用剂量低，每吨饲料只需添加500克，用户投入少。

2、可杀灭球虫孢子和裂殖子，是一种球虫杀灭剂。

3、由于其特殊的作用机理，球虫不易产生耐药性，可以长期使用。

4、对非目标禽畜安全，如蛋鸡、种鸡、火鸡、鸭、牛、羊、马等。而其它离子载体抗球虫抗生素对诸如火鸡、马等具有毒性。

目前我国大部分生产厂所用的马杜拉霉素工业生产菌株为马杜拉放线菌，摇瓶效价在5000μ/ml以下，生产效价一般在7000μ/ml左右，因此，本领域中迫切需要高效价的工业用马杜拉霉素生产菌株。

发明内容

为实现上述目的，本发明第一方面提供了一种尤马马杜拉放线菌(Actinomocarayumaensisi)AY-168DDZL05，其保藏号为CCTCC No.M 205029。

本发明另一方面涉及本发明的尤马马杜拉放线菌在发酵生产马杜拉霉素中的用途。

本发明还有一个方面提供了一种发酵生产马杜拉霉素的方法，其特征在于，该方法包括：

a)培养本发明的的尤马马杜拉放线菌；

b)从发酵液中分离纯化获得马杜拉霉素。

用于培养本发明菌株的培养基中的营养源没有特别的限制。本领域技术人员可以采用现有技术中已知用于发酵生产马杜拉霉素的培养基。当然，本领域技术人员也可以根据公知的技术来选择其它合适的碳源、氮源和其它营养源。例如，碳源可以是淀粉、糊精、甘油、葡萄糖、蔗糖、等。氮源可以是蛋白胨、大豆粉、蛋白粉、肉膏、米糖、麦皮、酵母粉、玉米浆、铵盐以及其它有机或无机含氮化合物。另外，培养基中还可适当加入一些无机盐类，如氯化钠、磷酸盐如磷酸氢二钾和磷酸二氢钾、硫酸铵、硫酸锰、硫酸镁、碳酸钙等金属盐。通常可采用各种已知的常规培养基，如LB琼脂培养基、营养琼脂培养基、葡萄糖酵母膏琼脂培养基和牛肉浸汁琼脂培养基等。在下文实施例中给出了一个较佳的培养基的配方：6％葡萄糖、0.4％玉米浆、2.2％黄豆饼粉、0.3％NaCl、0.005％Fe₃(SO₄)₂、0.015％K₂HPO₄、pH值：7.2-7.4。但是，本领域技术人员应当理解，本发明并不局限于本文中列举的这些具体培养基配方。

培养本发明菌株时的温度、pH、通气比、罐压、转速等条件没有特别严格的限制，只要该条件适合所述菌的生长即可。在培养时可采用豆油、泡敌等消泡剂进行消泡。在一些较佳的实施方案中，pH值宜控制在7.2～7.4之间。培养温度宜在30-32℃之间。培养时间通常在12小时至48小时之间。最终的菌浓度通常可高达1×10¹¹CFU/ml至1×10¹²CFU/ml。

在一个较佳的实施方案中尤马马杜拉放线菌在30-33℃、0.03-0.06MPa、160-200转/分钟搅拌速度以及体积比为1∶0.8至1∶1的空气流量下进行培养。在更佳的实施方案中，尤马马杜拉放线菌在31.5-32.5℃、0.035-0.04MPa、180转/分钟搅拌速度以及体积比为1∶1的空气流量下进行培养。另外，所述发酵培养宜维持在pH6.7-6.9左右，更佳的为pH6.8左右。

然而，上述列举的这些参数只是实现本发明目的的较佳方案。因此，本领域技术人员在上述范围以外选择合适的培养条件也能获得生产出高效价的马杜拉霉素。

在发酵培养结束后，可采用本领域常规方法对发酵液进行纯化，这些纯化方法包括但不局限于，过滤、结晶、离心、干燥、离子交换和脱色等。

本发明还提供了一种防治动物球虫病的微生物制剂，该微生物制剂包含用上述方法制得的马杜拉霉素。

目前国内工业用马杜拉放线菌的摇瓶效价在5000μ/ml以下，生产效价一般在7000μ/ml左右，发明者以此生产用菌为出发菌，经过人工诱变，筛选分离获得到一株摇瓶效价8000μ/ml以上的工业用菌，经中试(5L)发酵单位提高达12000μ/ml以上，其生产效价是目前工业用同类菌株的2倍以上。该菌株已经于2005年4月5日保藏于中国典型培养物包藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC No.M 205029。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将结合实施例来进一步详细描述本发明。然而，这些实施例只是起说明的作用，而本发明并不局限于这些实施例。在下文实施例中，除非另有特指，所有百分数均指每100毫升培养基所含克数。

实施例1尤马马杜拉放线菌AY-168DDZL05的分离筛选

本发明者以从山东青岛郊区土壤中筛选分离获得的一株马杜拉放线菌(Actinomocara yumaensisi Qingsb)为出发菌，经过人工诱变，筛选分离获得到一株摇瓶效价在8000μ/ml以上的工业用菌，经中试发酵单位提高到12000μ/ml以上。基本工作步骤如下：

基本步骤

原种(出发菌株)→纯化→斜面→同步培养→离心洗涤→振荡打散→过滤→菌悬液→诱变处理→平板分离→斜面→斜面→斜面→保藏及扩大试验(活菌计数)  (计数) (变异率)(初筛)(复筛)  (再复筛)

出发菌株为生产菌株(Actinomocara yumaensisi Qingsb山东青岛郊区土壤中筛选分离获得)。一般要求出发菌株是生长快，营养要求粗放，发育早，产孢子多，对诱变剂敏感性高，已能积累少量产品或前体物的菌株。然后，将出发菌株制成菌悬液。菌悬液制备一般采用单细胞悬液。制备菌悬液时要注意生理状态、均一性、细胞浓度、菌悬液介质(生理盐水或缓冲液)。

诱变处理为紫外线处理诱变以提高突变率；扩大产量变异幅度；使变异朝正变方向移动，以在高诱变率基础上，既能扩大变异幅度，又能使变异移向正变范围的剂量为宜。较佳的剂量为以44厘米的照射距离连续照射5次(2600紫外)，每次照射30秒钟。然后，对变异株进行筛选。筛选分为初筛和复筛，初筛重点在于分离培养尽可能多菌株，采用预先设计的相同培养条件，以量为主，准确性其次，减少漏筛机会。复筛以质为主，反复多次。将经诱变处理的菌液按一定浓度稀释后，涂布在平板培养基上。培养后，将单个菌落挑到斜面培养基上，经培养后，再将斜面上的菌落逐个接种到摇瓶中，振荡培养后测它们的抗生素效价。初筛中所得到的超过对照(出发菌Actinomocara yumaensisi Qingsb)效价10％以上的菌种，再进行复筛。复筛的过程与初筛基本相同，不同的是一般将斜面上的单个菌落接种到三个摇瓶中，得出平均效价。复筛可进行1-3次。由此筛选出的高产稳定菌种再经过小型甚至中型试验，用于发酵生产。按100∶1，10∶1，5∶1，3∶1的比例层层筛选，结果筛选出一株摇瓶效价在8000μ/ml以上的工业用菌株，将其命名为尤马马杜拉放线菌(Actinomocarayumaensisi)AY-168DDZL05。

实施例2尤马马杜拉放线菌的性能鉴定

经过近一年的性能考查，工艺验证证明本发明诱变分离的该菌株尤马马杜拉放线菌(Actinomocara yumaensisi)AY-168DDZL05无论在生长代谢还是生理代谢方面都优于其它菌株和对照菌株。

具体验证方案为：用该菌种接种母瓶，同时作一对照(出发菌Actinomocarayumaensisi Qingsb)，其工艺流程为：速冻管瓶→→子瓶(I代)→→子瓶(II代)→→转发酵。考查实例结果见下表一和表二：

                                           表一

分类	A(周期48h)				B(周期48h)
									pH	生物量(％)	还原糖含量(g/100mL)	菌丝形态	pH	生物量(％)	还原糖含量	菌丝形态
	母瓶种子情况	7.54	18	1.72	深粗网	7.60	20	1.82									深舒粗芽多
7.36									20	1.46	深舒展	7.54	22	1.71	深舒芽多
		7.49	21	1.37	较深粗舒	7.57	29	1.65								深舒粗
子瓶I代									7.62	19	1.47	深舒粗有芽	7.47	19	1.55		深舒粗有芽
	7.62	20	1.57	深舒粗有芽	7.66	20	1.76	深舒粗网
									7.46	19	1.55	深舒网	7.54	20	1.49	深舒粗芽较长
	子瓶II代	7.40	18	1.47	分散芽短	7.38	20	1.46									深粗有芽
7.58									19	1.19	分散舒	7.62	20	1.33	深较舒有芽
		7.17	16	1.74	浅细不舒	7.54	22	1.71								深舒粗

注：表格中A为对照；B为该发明菌株

                                                               表二(1)

周期	母瓶					子瓶I代					子瓶II代
																pH	％	C	效价μ/mL	平均效价	pH	％	C	效价μ/mL	平均效价	pH	％	C	效价μ/mL	平均效价
	120h	7.10	48	3.8	2907	2907	7.01	22	3.4	4168	4168	6.92	34	2.0.	4033																4033
144h																7.11	51	2.55	3853	3216	7.01	40	2.16	4522	4624	7.46	36	1.20	4716	4470
	7.16	55	3522	7.06	34	4485	7.11	30	4440
										7.19	56	2273	7.08	34	4866	7.51	43		4255
	168h	8.39	44	0.68	3399	4083	7.19	40	0.8												4884	4626		8.31		26	0.90		4408		4409
8.06										47	4338	7.13	35	4883	8.38	24	4719
		8.18	42		4513		7.11	34										4111	8.32	22	4102

                                                            表二(2)

周期	母瓶					子瓶I代					子瓶II代
																pH	％	C	效价μ/mL	平均效价	pH	％	C	效价μ/mL	平均效价	pH	％	C	效价μ/mL	平均效价
	120h	7.04	36	3.17	5056	5056	7.18	36	3.25	4885	4885	7.25	34	3.75	3937																3937
144h																6.97	42	1.70	8142	6832	7.15	38	0.75	8058	8284	7.65	26	2.20	6184	6288
	6.97	30	6860	7.14	37	8511	7.58	28	6250
										7.02	36	6804	7.11	39	6435	7.31	30		6430
	168h	8.31	32	1.15	8130	8169	8.33	34	0.30												9479	9131		7.30		26	1.40		9236		9377
8.30										28	8183	8.34	25	9232	8.45	34	9241
		8.15	31		8195		8.39	25										8682	8.46	31	9655

注：表二对应表格一，为对照(1)及本发明菌株(2)发酵摇瓶检测结果(C为还原糖；％为生物量)。

由上表一和表二可以证明，本发明的菌株尤马马杜拉放线菌(Actinomocarayumaensisi)AY-168DDZL05具有生产性能稳定、代谢力强，生长繁殖快，效价单位高等特征。

实施例3尤马马杜拉放线菌的发酵培养

a)生产工艺流程：

其中：

1、原始接种量为5％。

2、母瓶、子瓶：为按比例配制且经过灭菌后装量分别为100ML和120ML的培养基。

3、摇瓶培养条件：为32℃48小时，摇瓶转速为每分钟200±3转，湿度控制在35-45％。

4、实消：为实际消毒，先预热40分钟后计时，保压30分钟再降温至30℃左右。

5、连消：为通过连消塔消毒灭菌。

b)培养基配方、灭菌方法和注意事项

1.种子培养基：2％葡萄糖，0.8％玉米浆，2％黄豆饼粉，pH值：7.2～7.4

2.发酵培养基：6％葡萄糖，0.4％玉米浆，2.2％黄豆饼粉，0.3％NaCL，0.005％Fe₃(SO₄)₂，0.015％K₂HPO₄，pH值：7.2～7.4。

3.高氏一号培养基：0.2％酵母膏，2％琼脂，0.05％MgSO4，0.05％NaCL，0.05％K₂HPO₄，0.1％KNO₃，2％可溶性淀粉，0.1％FeSO4溶液，pH值：7.4。

4.配制包装及灭菌方法：配制后的种子培养基用750毫升三角瓶分装，母瓶装量为100毫升，子瓶装量为120毫升，塞上棉塞(纱布单层包上8克棉花)后加盖两层纱布。外包一层牛皮纸，用棉线绳扎紧，用250毫升三角瓶则装量为60毫升，用八层纱布塞紧，外包一层牛皮纸，棉线绳扎紧，放入灭菌锅，121℃0.1兆帕灭菌30分钟后冷却到30度左右，方可使用。

5.注意事项：配制细菌与高氏一号培养基时，要求十分严格，需注意如下事项：

(1)需用蒸馏水洗净，烘干，表面无污迹无灰尘的容器盛装

(2)各成分称量必需精确

(3)其它各类易溶试剂必需用蒸馏水逐一溶解后加入量筒，并用少量蒸馏水三次冲洗溶解该试剂的容器，并将冲洗用的水加入量筒内。

(4)对于不易溶解的试剂如牛肉膏，蛋白冻，酵母膏等成分也必需用蒸馏水加热溶化，再按按照第(4)条的方法加入量筒内。

(5)加入全部的试剂后用蒸馏水定溶，为保证培养基质量必需将pH值用10％氢氧化钠溶液调至7.2-7.4。

(6)调好pH值的培养基加入按比例称好的琼脂粉。

(7)配制好的培养基要先分装在三角瓶内，包扎灭菌，然后倒平皿后方可使用，因此分装在三角瓶里时装量不可太多，一般来说用750毫升三角瓶分装250毫升。

(8)种子发酵培养基原辅料尽量与罐上相同，灭菌后的培养基需检测消毒后培养基的pH值及还原糖(种子培养基的pH值在7.0左右，还原糖在1.8左右，发酵培养基的pH值在6.8左右，还原糖在6.0左右)。

c)发酵工艺控制参数

发酵过程的各工艺参数，包括温度，压力，搅拌转速，空气流量(48小时后二级罐为1∶1)见下表三。

                               表三

d)发酵过程主要分析指标

发酵过程中对包括还原糖，氨基氮，生物量，pH值，效价等各项指标进行分析，必须能够使该菌株始终处于繁殖快，代谢力强，性能稳定，效价高，且不被其它杂菌所污染的状态，并能作中间体发酵液的监控依据，随时反映该菌株发酵过程中的生长动态。

e)发酵结果

下表四中显示出本发明菌株在发酵过程的跟踪记录。

                          表四

周期	PH	生物量(％)	还原糖含量(g/100mL)	u/ml
					84h	7.01	16	5.71	3942
96h	7.23	18	5.30	5014
					108h	7.38	19	4.28	5829
120h	7.45	21	3.95	6534
					132h	7.51	20	3.23	7328
144h	7.72	27	2.71	8978
					156h	7.78	30	1.78	11058
168h	8.25	36	0.65	12975

结果表明，用本发明分离获得的尤马马杜拉放线菌进行发酵生产马杜拉霉素的效价可达12000μ/ml。

尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均纳入本文作参考。

Claims (8)

1.一种尤马马杜拉放线菌(Actinomocara yumaensisi)AY-168DDZL05，其保藏号为CCTCC No.M 205029。

2.权利要求1所述的尤马马杜拉放线菌在发酵生产马杜拉霉素中的用途。

3.一种发酵生产马杜拉霉素的方法，其特征在于，该方法包括：

a)培养权利要求1所述的尤马马杜拉放线菌；

b)从发酵液中分离纯化获得马杜拉霉素。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤a)中，所述尤马马杜拉放线菌在30-33℃、0.03-0.06MPa、160-200转/分钟搅拌速度以及体积比为1∶0.8至1∶1的空气流量下进行培养。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤a)中，所述尤马马杜拉放线菌在31.5-32.5℃、0.035-0.04MPa、180转/分钟搅拌速度以及体积比为1∶1的空气流量下进行培养。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤a)中用于培养尤马马杜拉放线菌的培养基为6％葡萄糖、0.4％玉米浆、2.2％黄豆饼粉、0.3％NaCL、0.005％Fe₃(SO₄)₂、0.015％K₂HPO₄、pH值：7.2-7.4。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤a)的培养维持在pH6.7-6.9。

8.一种防治动物球虫病的微生物制剂，其特征在于，该微生物制剂包含用权利要求3所述的方法制得的马杜拉霉素。