CN1726044A - 用于增强y2受体结合肽的粘膜传递的组合物和方法及治疗和预防肥胖症的方法 - Google Patents

Abstract

本发明描述了药物组合物和方法，该药物组合物含有至少一种肽YY化合物和用于增强肽YY的鼻粘膜传递的一种或多种鼻内传递增强剂，该组合物用于治疗哺乳动物受试者中的各种疾病和病症，包括肥胖症。一方面，鼻内传递制剂和方法提供了肽YY向血浆或中枢神经系统(CNS)组织或流体的增强的传递，例如，通过在受试者的血浆或CNS组织或流体中产生肽YY的峰浓度(C_max)，该峰浓度与通过皮下注射将肽YY的相同浓度或剂量施用于受试者后该受试者的血浆或CNS组织或流体中肽YY的峰浓度相比为20％或更大。

Description

用于增强Y2受体结合肽的粘膜传递的组合物和方法及 治疗和预防肥胖症的方法

发明背景

肥胖症及其相关失调是美国和全世界普遍并且非常严重的公共健康问题。上身肥胖症是2型糖尿病的公知的最大的危险因素，并且是心血管疾病的强烈的危险因素。肥胖症是高血压、动脉硬化、充血性心力衰竭、中风、胆囊病、骨关节炎、睡眠呼吸暂停、生殖失调如多囊性卵巢综合症、乳腺、前列腺和结肠癌，和全身麻醉并发症发生率增加的公认的危险因素。肥胖症缩短寿命并且具有上面的失调以及诸如感染、曲张静脉、黑色棘皮症、湿疹、锻炼不耐性、胰岛素抗性、高血压高胆固醇血症、胆石病、矫形损伤和血栓栓塞性疾病的共同-发病的严重危险。肥胖症也是被称为胰岛素抗性综合症，或者“综合症X”的一组病症的危险因素。

已经表明结合Y2受体的某些肽当被外周施用于哺乳动物时诱导体重减轻。Y2受体结合肽是结合Y2受体的神经肽。神经肽是起源于肽能神经元和内分泌/旁分泌细胞合成的大前体蛋白质的小肽。通常，前体含有多个生物活性肽。在脑中有各种神经肽，它们由初级基因转录物和可变剪接和差别前体加工导致。神经肽受体起分辨配体和活化适当的信号的作用。这些Y2受体-结合肽属于肽的一个家族，该家族包括肽YY(PYY)、神经肽Y(NPY)和胰腺肽(PP)。

NPY是一种36个氨基酸的肽并且是在哺乳动物脑中鉴定的最丰富的神经肽。NPY是中枢和外周神经系统的重要的调节剂并且影响各种生理学参数，包括对精神运动活性、食物摄入、中央内分泌分泌和心血管系统中的血管活性的影响。在供给冠状、大脑、和肾脉管系统的交感神经中发现高浓度NPY并且这些NPY有助于血管收缩。已经在各种组织中鉴定了NPY结合位点，这些组织包括脾脏、肠膜、脑、主动脉平滑肌、肾、睾丸和胎盘。

当前通过胰腺多肽家族内结构活性关系定义神经多肽Y(NPY)受体药理学。该家族包括NPY，其主要在神经元中合成；PYY，其主要在肠的内分泌细胞中合成；和PP，其主要在胰腺的内分泌细胞中合成。这些约36个氨基酸的肽具有一个紧密的螺旋结构，其包括在该肽的中间的“PP-折叠”。特定特征包括残基1到8中的聚脯氨酸螺旋、残基9到14的β-转角、残基15到30中的α-螺旋、残基30到36中的向外突出的C-末端，和羧基末端酰胺，其似乎对于生物学活性是关键的。这些肽已经被用于定义称作Y1、Y2、Y3、Y4和Y5的至少5种受体亚型。NPY对Y1受体的识别包括该肽的N-和C-末端区；用Pro³⁴交换Gln³⁴被相当好地耐受。NPY对Y2受体的识别主要依赖于两亲性α-螺旋居先的肽的C-末端残基(Arg³³-Gln³⁴-Arg³⁵-Tyr³⁶-NH₂)；用Pro³⁴交换Gln³⁴不被良好耐受。区别Y1和Y2的关键药理学特征之一是Y2受体(不是Y1受体)对NPY肽羧基-末端片段NPY-(13-36)和PYY片段PYY22-36具有高亲和性的事实。

已经表明一种称作肽YY(1-36)[PYY(1-36)][YPIKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY，SEQ ID NO.：1]的36个氨基酸肽当通过注射外周施用于个体时导致体重减轻并且可用作药物以治疗肥胖症和相关疾病，Morley，J.Neuropsychobiology 21：22-30(1989)。后来发现为了产生该效果，PYY结合Y2受体，并且Y2激动剂与Y2受体的结合导致糖、蛋白质和饭量的摄入减少，Leibowitz，S.F.等人，Peptides，12.1251-1260(1991)。PYY的一种可变分子形式是PYY(3-36)IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY[SEQ ID NO.：2]，Eberlein，Eysselein等人，Peptides 10：797-803，1989)。该片段组成人和犬肠提取物的总类-PYY免疫反应性的约40％，和禁食状态中总血浆PYY免疫反应性的约36％到饭后稍高于50％。其显然是PYY的一种二肽酰肽酶-IV(DPP4)切割产物。据报导PYY3-36是Y2和Y5受体的选择性配体，这些受体在优选的N-末端截短的(即，C-末端片段)NPY类似物中似乎是在药学上独特的。已经表明仅有残基22-36的PYY片段将仍然结合Y2受体。然而，如果该肽的羧基末端任何一个被切除，那么该肽结合Y2受体的能力丧失。因此PYY激动剂是一种肽，其具有全长PYY的部分序列，并且能够结合下丘脑的弓状核中的Y2受体。此后，术语PYY指全长PYY和结合Y2受体的PYY的任一片段。

公知PYY和PYY3-36可以通过静脉输注或注射施用以治疗如在休克中遇到，特别是内毒素导致的威胁生命的低血压(美国专利4,839,343)，以通过灌注、肠胃外、静脉内，或皮下施用，和通过移植以抑制哺乳动物中胰腺肿瘤的增殖(美国专利5,574,010)和治疗肥胖症(Morley，J.Neuropsychobiology 21：22-30(1989)和美国专利申请20020141985)。还声称可以将PYY通过肠胃外、经口、鼻、直肠和局部途径以有效量施用于驯养的动物或人以通过增强依赖钠共转运的营养物的胃肠吸收而增加所述受试者的体重(美国专利5,912,227)。然而，对于肥胖症和相关疾病，包括糖尿病的治疗，施用模式局限于静脉内IV输注，没有为PYY3-26的备选施用优化的有效制剂。这些现有文献教导都没有提供用于增强粘膜(即，鼻、口腔、口)传递的含有与赋形剂组合的PYY或PYY(3-36)的制剂，也没有教导不含内毒素的Y2受体结合肽制剂对于非输注给药的价值。从而，需要开发施用PYY3-36的制剂和方法。

发明概述

本发明通过提供新的用于粘膜，特别鼻内传递Y2受体-结合肽如PYY、胰腺肽(PP)和NPY的有效方法和组合物以治疗肥胖症、诱导个体的饱满感和促进个体中体重减轻或者预防或治疗糖尿病而完成了前面的需求并且满足另外的目的和优点。在本发明的某些方面，Y2受体-结合肽以制剂传递到鼻内粘膜从而当一剂量的Y2受体激动剂的制剂被鼻内施用时，能够使哺乳动物血浆中Y2受体-结合肽的浓度增加至少5pmol，优选至少10pmol。此外，当Y2受体-结合肽被鼻内施用时，优选的制剂将能够使哺乳动物血浆中Y2受体-结合肽的浓度升高10pmol，优选20pmol。当鼻内施用150μg时，优选制剂将能够使哺乳动物血浆中Y2受体激动剂的浓度升高每升血浆至少40pmol。当鼻内施用200μg Y2受体-结合肽时，本发明的制剂诱导Y2受体-结合肽增加至少80pmol/l血浆。

优选地，Y2受体-结合肽是PP、PYY或NPY肽，并且哺乳动物是人。在最优选的实施方案中，Y2受体-结合肽是PYY肽，优选PYY(3-36)并且哺乳动物是人。

本发明还涉及Y2受体-结合肽制剂，当含有至少50μg Y2受体-结合肽的剂量被施用于哺乳动物时，其能够使该哺乳动物血浆中Y2受体-结合肽的浓度升高至少5pM。

本发明还涉及Y2受体-结合肽制剂，当含有至少100μg Y2受体-结合肽的剂量被施用于哺乳动物时，其能够使该哺乳动物血浆中Y2受体-结合肽的浓度升高至少20pM。

本发明还涉及Y2受体-结合肽制剂，当含有至少150μg Y2受体-结合肽的剂量被鼻内施用于哺乳动物时，其能够使该哺乳动物血浆中Y2受体-结合肽的浓度升高至少30pM。优选地，哺乳动物是人。

本发明还涉及Y2受体-结合肽制剂，当含有至少200μg Y2受体-结合肽的剂量被鼻内施用于哺乳动物时，其能够使该哺乳动物血浆中Y2受体-结合肽的浓度升高至少60pM。优选地，哺乳动物是人。

本发明还涉及Y2受体-激动剂的鼻内制剂，该制剂基本上不含用于稳定该制剂的蛋白质或多肽。具体地，本发明基本上不含诸如白蛋白的蛋白质，和诸如明胶的胶原蛋白-衍生的蛋白质。

在本发明的其他方面，透粘膜的Y2受体-结合肽制剂含有Y2受体-结合肽、水和增溶剂，pH为3-6.5。在优选实施方案中，增溶剂是环糊精。

在本发明的另一实施方案中，透粘膜的Y2受体-结合肽制剂含有Y2受体-结合肽、水和增溶剂，优选环糊精，和至少一种多元醇，优选2种多元醇。在备选实施方案中，制剂可以含有如下的一种或全部：螯合剂、表面活性剂和缓冲剂。

在本发明的另一实施方案中，制剂由Y2受体-结合肽、水、螯合剂和增溶剂组成。

在本发明的另一实施方案中，制剂由Y2受体-结合肽、水和螯合剂组成，pH为3-6.5。

在本发明的另一实施方案中，制剂含有Y2受体-结合肽、水、螯合剂和至少一种多元醇，优选2种多元醇。另外的实施方案可以包括下面各项中的一种或多种：表面活性剂、增溶剂和缓冲剂。

在本发明的另一实施方案中，制剂含有Y2受体-结合肽、水和至少2种多元醇，如乳糖和山梨糖醇。可以加入该制剂的另外试剂包括，但不限于，增溶剂、螯合剂、一种或多种缓冲剂和表面活性剂。

根据本发明的方法和组合物的Y2受体-结合肽激动剂的鼻内传递的增强允许这些试剂的有效药物应用以治疗哺乳动物受试者中的各种疾病和病症。

本发明通过提供液体或脱水的Y2受体-结合肽制剂满足了该需求，其中该制剂基本上不含作为稳定剂的多肽或蛋白质。该液体PYY制剂由水、PYY和至少一种添加剂组成，该添加剂选自：多元醇、表面活性剂、增溶剂和螯合剂。该制剂的pH优选为3.0到约7.0，优选4.5到约6.0，最优选约5.0±0.03。

本发明的另一个实施方案是本发明的水性Y2受体结合制剂，该制剂由水、Y2受体-结合肽、多元醇和表面活性剂组成，其中该制剂的pH为约3到约6.5，该制剂基本上不含作为稳定剂的蛋白质或多肽。

本发明的另一个实施方案是水性Y2受体结合制剂，该制剂由水、Y2受体-结合肽、多元醇和增溶剂组成，其中该制剂的pH为约3.0到约6.5，并且该制剂基本上不含作为稳定剂的蛋白质或多肽。

本发明的另一个实施方案是水性Y2受体结合制剂，该制剂由水、Y2受体-结合肽、增溶剂和表面活性剂组成，其中该制剂的pH为约3.0到约6.5，并且该制剂基本上不含作为稳定剂的蛋白质或多肽。

本发明的另一个实施方案是水性Y2受体结合制剂，该制剂由水、Y2受体-结合肽、增溶剂、多元醇和表面活性剂组成，其中该制剂的pH为约3到约6.5，并且该制剂基本上不含作为稳定剂的蛋白质或多肽。

在本发明的另一方面，将稳定的水性制剂脱水产生脱水的Y2受体-结合肽制剂，其由Y2受体结合肽和至少一种添加剂组成，该添加剂选自：多元醇、表面活性剂、增溶剂和螯合剂，其中所述脱水的Y2受体-结合肽制剂基本上不含作为稳定剂的蛋白质或多肽，如白蛋白、胶原蛋白或胶原蛋白衍生的蛋白，如明胶。通过各种方法如冻干、喷雾干燥、盐-诱导的沉淀和干燥、真空干燥、旋转蒸发，或者超临界CO₂沉淀可以实现脱水。

在一个实施方案中，脱水的Y2受体-结合肽由Y2受体结合肽、多元醇和增溶剂组成，其中该制剂基本上不含作为稳定剂的蛋白。

在另一个实施方案中，脱水的Y2受体-结合肽制剂由Y2受体结合肽、多元醇和表面活性剂组成，其中Y2受体-结合肽制剂基本上不含作为稳定剂的蛋白质或多肽。

在另一个实施方案中，脱水的Y2受体-结合肽制剂由Y2受体结合肽、表面活性剂和增溶剂组成，其中Y2受体-结合肽制剂基本上不含作为稳定剂的蛋白质或多肽。

在本发明的另一个实施方案中，脱水的Y2受体-结合肽制剂由Y2受体结合肽、多元醇、表面活性剂和增溶剂组成，其中Y2受体-结合肽制剂基本上不含作为稳定剂的蛋白质或多肽。

可以使用任一增溶剂，但是优选的增溶剂选自羟丙基-β-环葡聚糖、硫丁醚-β-环葡聚糖、甲基-β-环糊精和壳聚糖。

通常，多元醇选自乳糖、山梨糖醇、海藻糖、蔗糖、甘露糖和麦芽糖及其衍生物或同系物。

令人满意的表面活性剂选自二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱(DDPC)、聚山梨酯20(吐温20)、聚山梨酯80(吐温80)、聚乙二醇(PEG)、十六醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、羊毛脂醇和失水山梨糖醇单月桂酸酯。

在优选制剂中，Y2受体结合肽制剂还含有螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇四乙酸(EGTA)。还可以将防腐剂如氯丁醇或苯扎氯铵加入制剂以抑制微生物生长。

通常使用缓冲剂如柠檬酸钠和柠檬酸，和乙酸钠和乙酸调节pH。备选缓冲剂是乙酸和乙酸钠或琥珀酸和氢氧化钠。

选的Y2受体结合肽是PYY、PP或NPY肽，优选PYY(3-36)肽。

本发明还包括一种制剂，其中Y2受体结合肽的浓度为0.1-15.0mg/mL，优选1.0-2mg/mL，水性溶液的pH为3.0-6.5，优选约5.0±0.3。

本发明还包括Y2受体结合肽制剂，其中多元醇的浓度为约0.1％到10％(w/v)，并且其中多元醇的浓度为约0.1％到约3％(w/v)。

本发明还包括一种制剂，其中表面活性剂的浓度为约0.00001％到约5％(w/v)，并且其中表面活性剂的浓度为约0.0002％到约0.1％(w/v)。

本发明还包括一种制剂，其中增溶剂的浓度为1％-10％(w/v)，并且其中增溶剂的浓度为2％到5％(w/v)。

使用本领域普通技术人员熟知的方法，并且按照冻干设备生产商的使用说明书，可以将所完成的溶液过滤并冻干。这产生了脱水的Y2受体结合肽制剂，其基本上不含作为稳定剂的蛋白质。

在本发明的另一实施方案中，Y2受体结合肽制剂由Y2受体结合肽和药学上可接受的载体组成，其中在体外组织渗透测定中，Y2受体结合肽制剂的渗透比对照制剂高至少1％，优选3％，最优选至少6％，其中对照制剂由水、氯化钠、缓冲液和Y2受体结合肽组成，通过如实施例2和7中所示的透上皮电阻测定法测定渗透。在优选实施方案中，Y2受体结合制剂还含有至少一种赋形剂，该赋形剂选自表面活性剂、增溶剂、多元醇、和螯合剂。优选地，Y2受体结合肽是PYY肽、NPY肽或PP肽。

在本发明的另一实施方案中，提供了Y2受体结合肽制剂，当对哺乳动物鼻内施用100μL该制剂时，该制剂能够使哺乳动物的血浆中Y2受体结合肽的浓度升高至少5，优选10、20、40、60、80或更多皮摩尔/升血浆。

在代表性实施方案中，本发明的增强的传递方法和组合物提供了Y2受体结合肽激动剂的治疗上有效粘膜传递，用于预防或治疗哺乳动物受试者中的肥胖症和进食失调。在本发明的一个方面，提供了适于鼻内施用的药物制剂，其含有治疗有效量的Y2受体结合肽和如此处描述的一种或多种鼻内传递增强剂，这些制剂可有效用于本发明的鼻粘膜传递方法以防止哺乳动物受试者中肥胖症或进食失调的发病或进展。治疗有效量的Y2受体结合肽激动剂和一种或多种鼻内传递增强剂的鼻粘膜传递导致受试者中Y2受体结合肽激动剂的升高的治疗水平并抑制哺乳动物受试者中食物摄入，减轻肥胖症或进食失调的症状。

本发明的增强的传递方法和组合物提供了Y2受体结合肽的治疗有效的粘膜传递，用于预防或治疗哺乳动物受试者中各种疾病和病症。Y2受体结合肽可以通过各种粘膜途径施用，例如，可以通过将Y2受体结合肽与鼻粘膜上皮、支气管或肺粘膜上皮、口腔表面或口和小肠粘膜表面接触。在代表性实施方案中，方法和组合物针对或被配制而用于鼻内传递(例如，鼻粘膜传递或鼻内粘膜传递)。

在本发明的一方面，提供了适于鼻内施用的药物制剂，其含有治疗有效量的Y2受体结合肽激动剂和如此处描述的一种或多种鼻内传递增强剂，该制剂可有效用于本发明的鼻粘膜传递方法以防止哺乳动物受试者中肥胖症、糖尿病、癌症或癌症相关的营养不良或消瘦，或者减轻肥胖症的一种或多种临床上熟知的症状，以及治疗阿尔茨海默氏病、结肠癌、结肠腺癌、胰癌、胰腺癌、乳腺癌。

在本发明的另一方面，药物制剂和方法涉及Y2受体结合肽激动剂联合维生素E琥珀酸的施用。可以联合施用Y2受体结合肽激动剂与维生素E琥珀酸以减轻癌症，例如结肠腺癌、胰腺癌，或乳腺癌的症状或防止它们的发作或降低发病率或严重性。

在本发明的另一方面，令人惊奇地发现使用不含内毒素的Y2受体结合肽，例如，PYY(3-36)，产生与内毒素未被除去的肽相比增强的粘膜传递。从而不含内毒素的Y2受体结合肽在药物制剂中的使用使得可以通过非输注途径施用，这些非输注途径包括粘膜传递、鼻、口、肺、阴道、直肠等等。

本发明的前面的粘膜Y2受体-结合肽制剂和制备和传递方法提供了Y2受体-结合肽向哺乳动物受试者的改良的粘膜传递。这些组合物和方法可以包括一种或多种Y2受体-结合肽与一种或多种粘膜传递增强剂的组合制剂或协调施用。可以选择用于实现这些制剂和方法的粘膜传递增强剂为：(a)增溶剂；(b)电荷修饰剂；(c)pH控制剂；(d)降解酶抑制剂；(e)粘液溶解或粘液清除剂；(f)纤毛抑制剂(ciliostatic agent)；(g)膜渗透增强剂(例如，(i)表面活性剂，(ii)胆汁盐，(ii)磷脂或脂肪酸添加剂，混合微团、脂质体或载体，(iii)醇，(iv)烯胺，(v)NO供体化合物，(vi)长链两亲性分子，(vii)小疏水性渗透增强剂；(viii)钠或水杨酸衍生物；(ix)乙酰乙酸的甘油酯；(x)环糊精或β-环糊精衍生物；(xi)中链脂肪酸；(xii)螯合剂；(xiii)氨基酸或其盐；(xiv)N-乙酰氨基酸或其盐；(xv)对所选择的膜组分降解性的酶；(ix)脂肪酸合成的抑制剂；(x)胆固醇合成抑制剂；或(xi)(i)-(x)的膜渗透增强剂的任一组合；(h)上皮连接生理的调节剂，如一氧化氮(NO)刺激剂、壳聚糖，和壳聚糖衍生物；(i)血管舒张剂；(j)选择性转运增强剂；和(k)稳定传递赋形剂、载体、支持体或复合体形成种类，利用该稳定传递赋形剂、载体、支持体或复合体形成种类，Y2受体结合肽被有效组合、结合、包含、包封或者结合而稳定活性剂以增强粘膜传递。

在本发明的各种实施方案中，肽YY与上面(a)-(k)中引用的粘膜传递-增强剂的1、2、3、4或多种组合。这些粘膜传递-增强剂可以单独或者一起与肽YY混合，或者与肽YY在药学上可接受的制剂或传递载体中组合。肽YY与根据此处的教导的一种或多种粘膜传递增强剂(任选包括选自上面(a)-(k)的两种或多种粘膜传递增强剂的任一组合)的制剂在其被传递到哺乳动物受试者的粘膜表面后提供了肽YY的增加的生物利用度。

从而，本发明是用以抑制胃口、促进体重减轻、减少食物摄入，或者治疗哺乳动物中肥胖症和/或糖尿病的一种方法，该方法包括透粘膜施用含有Y2受体-结合肽的一种制剂，从而当Y2受体以50μg透粘膜施用于哺乳动物时该哺乳动物血浆中Y2受体结合肽的浓度增加至少5pmol/l血浆，优选至少10pmol/l血浆。上面描述了这些制剂的实例。

本发明还提供了Y2受体结合肽在生产药物中的应用，该药物用于透粘膜施用Y2受体结合肽以抑制胃口、促进体重减轻、减少食物摄入，或者治疗哺乳动物中肥胖症，从而当Y2受体以50μg透粘膜施用于哺乳动物时该哺乳动物血浆中Y2受体结合肽的浓度增加至少5pmol/l血浆。当100μg Y2受体结合肽被鼻内施用于该哺乳动物时，该哺乳动物中Y2受体激动剂的浓度增加至少20pmol/升血浆。当施用150μg时，浓度。

本发明的药物制剂中肽YY的粘膜有效剂量含有，例如，约0.001pmol到约100pmol/kg体重，约0.01pmol到约10pmol/kg体重，或约0.1pmol到约5pmol/kg体重。在其他代表性实施方案中，肽YY的剂量为约0.5pmol到约1.0pmol/kg体重。在优选实施方案中，鼻内剂量将为50μg到400μg，优选100μg到200μg，最优选约100μg到约150μg。本发明的药物制剂可以每天施用1或多次(例如，餐前)，或者每周3次或每周一次每隔一周施用并且持续至少96周或者甚至该个体患者或受试者终身施用。在一些实施方案中，本发明的药物制剂每天施用一次或多次、每天两次、每天四次、每天六次，或者每天八次。

使用鼻内传递增强剂，它们增强肽YY进入或跨过鼻粘膜表面的传递。对于被动吸收的药物，细胞侧或跨细胞途径对药物转运的相对贡献取决于药物的pKa、分配系数、分子半径和电荷、腔环境(药物在其中传递)的pH，和吸收表面的面积。本发明的鼻内传递增强剂可以是pH控制剂。本发明的药物制剂的pH是影响通过药物运输的细胞侧或跨细胞途径对肽YY的吸收的一个因素。在一个实施方案中，本发明的药物制剂的pH被调节到约3.0到6.5。在另一实施方案中，本发明的药物制剂的pH被调节到约3.0到5.0。在另一实施方案中，本发明的药物制剂的pH被调节到约4.0到5.0。通常，pH为5.0±0.3。

附图简述

图1显示了高温(40℃)下从3.0到7.4的各种pH下PYY3-36的稳定性。

图2显示了透性增强剂的TEER数据。

图3显示了候选PYY制剂的细胞生存力。

图4显示了候选制剂的细胞毒性效果。在图2-4中

EN1＝PBS pH5.0

EN2＝L-精氨酸(10％w/v)

EN3＝聚-L-精氨酸(0.5％w/v)

EN4＝γ-环糊精(1％w/v)

EN5＝α-环糊精(5％w/v)

N6＝甲基-β-环糊精(3％w/v)

EN7＝正癸酸钠(0.075％w/v)

EN8＝壳聚糖(0.5％w/v)

EN9＝二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱(3.5％w/v)

EN10＝S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺(0.02％w/v)

EN11＝棕榈酰-DL-肉碱(0.5％w/v)

EN12＝泊洛沙姆-127(0.3％w/v)

EN13＝硝普钠(0.3％w/v)

EN14＝甘胆酸钠(1％w/v)

图5显示了各种组分对药物渗透的协同贡献。在图5中，EN1为DDPC，EN2为甲基-β-环糊精，EX1为EDTA。

图6显示了大鼠血浆中PYY3-36，正方形代表4.1μg/kg剂量，三角形代表41μg/kg剂量，圆形代表205μg/kg剂量。

图7以Cmax-Cbas(pg/mL)对剂量(μg/kg)显示了鼻内施用PYY3-36后的剂量线性。

图8以AUC对剂量(μg/kg)显示了鼻内施用PYY3-36后的剂量线性。

图9显示了PYY的平均血浆浓度对三个人类志愿者中的时间(时间)，其中这些志愿者每人都被鼻内施用20μg PYY(3-36)。

图10显示了显示了PYY的平均血浆浓度对三个人类志愿者中的时间(分钟)，其中这些志愿者每人都被鼻内施用50μg PYY(3-36)。

图11显示了显示了PYY的平均血浆浓度对三个人类志愿者中的时间(分钟)，其中这些志愿者每人都被鼻内施用100μg PYY(3-36)。

图12显示了显示了PYY的平均血浆浓度对三个人类志愿者中的时间(分钟)，其中这些志愿者每人都被鼻内施用150μg PYY(3-36)。

图13显示了显示了PYY的平均血浆浓度对三个人类志愿者中的时间(分钟)，其中这些志愿者每人都被鼻内施用200μg PYY(3-36)。

图14显示了5组健康人类志愿者的PYY血浆浓度(pmol/L)对时间，其中这些志愿者接受鼻内施用PYY(3-36)。剂量为200μg、150μg、100μg、50μg、和20μg PYY3-36。

图15显示了PYY的Cmax(pg/mL)对施用于志愿者的PYY(3-36)的剂量的剂量线性。

图16显示了PYY平均AUC(pg/mL)对施用于人类志愿者的PYY(3-36)的剂量的剂量线性。

图17显示了直观类比评分法(visual analog scale，VAS)对施用于人类志愿者的PYY(3-36)剂量。问题是：“你多么饥饿？”在100点的尺度上得分越低，个体越不饥饿。

图18显示了直观类比评分法(VAS)对施用于人类志愿者的PYY(3-36)剂量。问题是：“你可以吃多少？”在100点的尺度上得分越低，个体越不饥饿。

图19显示了直观类比评分法(VAS)对施用于人类志愿者的PYY(3-36)剂量。问题是：“你感觉多么饱？”在100点的尺度上得分越低，个体越没有吃饱。

图20显示了含有内毒素的PYY(3-36)对不含内毒素PYY(3-36)的百分数渗透。

发明详述

如上面所提到的，本发明提供了用于将Y2受体结合肽经粘膜传递到哺乳动物受试者以治疗或预防各种疾病和病症的改良的方法和组合物。根据本发明方法治疗和预防的适当的哺乳动物受试者的实例包括，但不限于，人和非人灵长类，牲畜物种，如马、牛、绵羊和山羊，和研究和驯养物种，包括狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠和兔。

为了提供本发明的更好理解，提供了下面的定义：

Y2受体结合肽

用于本发明的粘膜制剂中的Y2受体结合肽包括如此处所用的胰腺多肽家族，包括三种天然存在的生物活性肽家族，PP、NPY和PYY。Y2受体结合肽和它们的应用的实例在美国专利号5,026,685、美国专利号5,574,010、美国专利号5,604,203、美国专利号5,696,093、美国专利号6,046,167、Gehlert等人，Proc Soc Exp Biol Med 218：7-22(1998)；Sheikh等人，Am J Physiol，261：701-15(1991)；Foumier等人，Mol Pharmacol 45：93-101(1994)；Kirby等人，J Med Chem 38：4579-4586(1995)；Rist等人，Eur J Biochem 247：1019-1028(1997)；Kirby等人，J Med Chem 36：3802-3808(1993)；Grundemar等人，Regulatory Peptides 62：131-136(1996)；美国专利号5,696,093(PYY激动剂的实例)；美国专利号6,046,167中描述。根据本发明，Y2受体结合肽包括游离碱、酸加成盐或金属盐，如钾或钠盐或者通过诸如酰胺化、糖基化、酰化、硫酸化、磷酸化、乙酰化或环化(美国专利号6,093,692；和美国专利号6,225,445)和PEG化修饰的肽Y2受体结合肽。

肽YY激动剂

如此处所用的，“PYY”指天然序列或者变异形式的PYY(1-36)，以及来自任何来源的衍生物、片段和类似物，它们可以是天然的、合成的或重组的。PYY必须含有PYY序列的最后15个氨基酸残基或者其类似物，PYY(22-36)(SEQ ID NO：3)。可以使用的其他PYY肽为PYY(1-36)(SEQID NO：1)、PYY(3-36)SEQ ID NO：2)、PYY(4-36)(SEQ ID NO：4)、PYY(5-36)(SEQ ID NO：5)、PYY(6-36)(SEQ ID NO：6)、PYY(7-36)(SEQ IDNO：7)、PYY(8-36)(SEQ ID NO：8)、PYY9-36(SEQ ID NO：9)、PYY(10-36)(SEQ ID NO：10)、PYY(11-36)(SEQ ID NO：11)、PYY(12-36)(SEQ ID NO：12)、PYY(13-36)(SEQ ID NO：13)、PYY(14-36)(SEQ ID NO：14)、PYY(15-36)(SEQ ID NO：15)、PYY(16-36)(SEQ ID NO：16)、PYY(17-36)(SEQID NO：17)、PYY(18-36)(SEQ ID NO：18)、PYY(19-36)(SEQ ID NO：19)、PYY(20-36)(SEQ ID NO：20)和PYY(21-36)(SEQ ID NO：21)。这些肽通常结合到脑和别处的Y2受体，特别是Y2和/或Y5受体。通常，合成的这些肽是不含内毒素或不含热原的形式，尽管这不总是必须的。

其他PYY肽包括其中已经进行了保守氨基酸残基改变的那些PYY肽，例如，PYY肽的位点特异诱变，包括[Asp¹⁵]PYY(15-36)(SEQ ID NO：90)、[Thr¹³]PYY(13-36)(SEQ ID NO：91)、[Val¹²]PYY(12-36)(SEQ ID NO：92)、[Glu¹¹]PYY(11-36)(SEQ ID NO：93)、[Asp¹⁰]PYY(10-36)(SEQ ID NO：94)、[Val⁷]PYY(7-36)(SEQ ID NO：95)、[Asp⁶]PYY(6-36)(SEQ ID NO：96)、[Gln⁴]PYY(4-36)(SEQ ID NO：97)、[Arg⁴]PYY(4-36)(SEQ ID NO：98)、[Asn⁴]PYY(4-36)(SEQ ID NO：99)、[Val³]PYY(3-36)(SEQ ID NO：100)和[Leu³]PYY(3-36)(SEQ ID NO：101)。其他PYY肽包括其中已经进行了至少两个保守氨基酸残基改变的那些肽，包括[Asp¹⁰，Asp¹⁵]PYY(10-36)(SEQ ID NO：102)、[Asp⁶，Thr¹³]PYY(6-36)(SEQ ID NO：103)、[Asn⁴，Asp¹⁵]PYY(4-36)(SEQ ID NO：104)和[Leu³，Asp¹⁰]PYY(3-36)(SEQ ID NO：105)。还包括PYY的类似物，例如在美国专利5,604,203和5,574,010；Balasubramaniam，等人，Peptide Research 1：32(1988)；日本专利申请2,225,497(1990)；Balasubramaniam，等人，Peptides 14：1011，1993；Grandt，等人，Reg.Peptides 51：151，(1994)；PCT国际申请94/03380；美国专利5,604,203和5,574,010中公开的那些PYY类似物。这些肽通常结合脑和别处的Y受体，特别是Y2和/或Y5受体。通常，合成的这些肽是不含内毒素或不含热原的形式，尽管这不总是必须的。

PYY激动剂包括大鼠PYY(SEQ ID NO：72)和相应于人的氨基末端截短的形式，猪PYY(SEQ ID NO：73)和相应于人的氨基末端截短的形式和豚鼠PYY(SEQ ID NO：74)和相应于人的氨基末端截短的形式。

根据本发明，PYY肽还包括游离碱、酸加成盐或金属盐，如该肽的钾或钠盐，和通过诸如酰胺化、糖基化、酰化、硫酸化、磷酸化、乙酰化、环化及其他熟知的共价修饰方法修饰的PYY肽。这些肽通常结合脑和别处的Y受体，特别是Y2和/或Y5受体。通常，合成的这些肽是不含内毒素或不含热原的形式，尽管这不总是必须的。

神经肽Y激动剂

NPY是另一种Y2受体结合肽。NPY肽包括全长NPY(1-36)(SEQ IDNO：22)以及NPY(1-36)的片段，其已经在氨基末端被截短。为了有效结合Y2受体，NPY激动剂应该具有羧基末端的最后11个氨基酸残基，即含有NPY(26-36)(SEQ ID NO：23)。结合Y2受体的NPY激动剂的其他实例是NPY(3-36)(SEQ ID NO：24)、NPY(4-36)(SEQ ID NO：25)、NPY(5-36)(SEQ ID NO：26)、NPY(6-36)(SEQ ID NO：27)、NPY(7-36)(SEQ ID NO：28)、NPY(8-36)(SEQ ID NO：29)、NPY(9-36)(SEQ ID NO：30)、NPY(10-36)(SEQ ID NO：31)、NPY(11-36)(SEQ ID NO：32)、NPY(12-36)(SEQ ID NO：33)、NPY(13-36)(SEQ ID NO：34)、NPY(14-36)(SEQ ID NO：35)、NPY(15-36)(SEQ ID NO：36)、NPY(16-36)(SEQ ID NO：37)、NPY(17-36)(SEQID NO：38)、NPY(18-36)(SEQ ID NO：39)、NPY(19-36)(SEQ ID NO：40)、NPY(20-36)(SEQ ID NO：41)、NPY(21-36)(SEQ ID NO：42)、NPY(22-36)(SEQ ID NO：43)、NPY(23-36)(SEQ ID NO：44)、NPY(24-36)(SEQ ID NO：45)和NPY(25-36)(SEQ ID NO：46)。

其他NPY激动剂包括大鼠NPY(SEQ ID NO：75)和如人形式的从NPY(3-36)到NPY(26-36)的氨基末端截短形式、兔NPY(SEQ ID NO：76)和如人形式的从NPY(3-36)到NPY(26-36)的氨基末端截短形式、狗NPY(SEQID NO：77)和如人形式的从NPY(3-36)到NPY(26-36)的氨基末端截短形式、猪NPY(SEQ ID NO：78)和如人形式的从NPY(3-36)到NPY(26-36)的氨基末端截短形式、牛NPY(SEQ ID NO：79)和如人形式的从NPY(3-36)到NPY(26-36)的氨基末端截短形式、绵羊NPY(SEQ ID NO：80)和如人形式的从NPY(3-36)到NPY(26-36)的氨基末端截短形式和豚鼠NPY(SEQID NO：81)和如人形式的从NPY(3-36)到NPY(26-36)的氨基末端截短形式。

根据本发明，NPY肽还包括游离碱、酸加成盐或金属盐，如该肽的钾或钠盐，和通过诸如酰胺化、糖基化、酰化、硫酸化、磷酸化、乙酰化、环化及其他公知的共价修饰方法修饰的NPY肽。这些肽通常结合脑和别处的Y受体，特别是Y2和/或Y5受体。通常，合成的这些肽是不含内毒素或不含热原的形式，尽管这不总是必须的。

胰腺肽

胰腺肽(PP)和PP激动剂也结合Y2受体。PP激动剂的实例为全长PP(1-36)(SEQ ID NO：47)和许多PP片段，它们在氨基末端被截短。为了结合Y2受体，PP激动剂必须具有羧基末端的最后11个氨基酸残基——PP(26-36)，(SEQ ID NO：48)。结合Y2受体的其他PP的实例为PP(3-36)(SEQID NO：49)、PP(4-36)(SEQ ID NO：50)、PP(5-36)(SEQ ID NO：51)、PP(6-36)(SEQ ID NO：52)、PP(7-36)(SEQ ID NO：53)、PP(8-36)(SEQ ID NO：54)、PP(9-36)(SEQ ID NO：55)、PP(10-36)(SEQ ID NO：56)、PP(11-36)(SEQ ID NO：57)、PP(12-36)(SEQ ID NO：58)、PP(13-36)(SEQ ID NO：59)、PP(14-36)(SEQ ID NO：60)、PP(15-36)(SEQ ID NO：61)、PP(16-36)(SEQ ID NO：62)、PP(17-36)(SEQ ID NO：63)、PP(18-36)(SEQ ID NO：64)、PP(19-36)(SEQ ID NO：65)、PP(20-36)(SEQ ID NO：66)、PP(21-36)(SEQ ID NO：67)、PP(22-36)(SEQ ID NO：68)、PP(23-36)(SEQ ID NO：69)、PP(24-36)(SEQ ID NO：70)和PP(25-36)(SEQ ID NO：71)。

其他PP激动剂包括绵羊PP(SEQ ID NO：82)和如人形式的从PP(3-36)到PP(26-36)的氨基末端截短形式、猪PP(SEQ ID NO：83)和如人形式的从PP(3-36)到PP(26-36)的氨基末端截短形式、狗PP(SEQ ID NO：84)和如人形式的从PP(3-36)到PP(26-36)的氨基末端截短形式、猫PP(SEQ ID NO：85)和如人形式的从PP(3-36)到PP(26-36)的氨基末端截短形式、奶牛PP(SEQ ID NO：86)和如人形式的从PP(3-36)到PP(26-36)的氨基末端截短形式、大鼠PP(SEQ ID NO：87)和如人形式的从PP(3-36)到PP(26-36)的氨基末端截短形式、小鼠PP(SEQ ID NO：88)和如人形式的从PP(3-36)到PP(26-36)的氨基末端截短形式、和豚鼠PP(SEQ ID NO：89)。

根据本发明，PP肽还包括游离碱、酸加成盐或金属盐，如该肽的钾或钠盐，和通过诸如酰胺化、糖基化、酰化、硫酸化、磷酸化、乙酰化、环化及其他公知的共价修饰方法修饰的PP肽。这些肽通常结合脑和别处的Y受体，特别是Y2和/或Y5受体。通常，合成的这些肽是不含内毒素或不含热原的形式，尽管这不总是必须的。

粘膜传递增强剂

“粘膜传递增强剂”被定义为化学试剂或其他赋形剂，当它们被加入含有水、盐和/或普通缓冲剂和Y2受体结合肽的制剂(对照制剂)中时产生一种制剂，该制剂导致Y2受体结合肽经过粘膜运输的显著增加，这可通过最大血液、血浆或脑脊液浓度(C_max)或者通过浓度对时间曲线下的面积AUC来测量。粘膜包括鼻、口、肠、颊、支气管肺、阴道和直肠粘膜表面并且实际上包括与外界沟通的所有体腔或通道内衬的所有分泌粘液的膜。粘膜传递增强剂有时被称为载体。

不含内毒素的制剂

“不含内毒素的制剂”指一种制剂，其含有Y2受体结合肽和一种或多种粘膜传递增强剂，该制剂基本上不含内毒素和/或相关热原物质。内毒素包括限制在微生物内并且仅当该微生物被破坏或者死亡时才会释放的毒素。热原物质包括来自细菌及其他微生物的外膜的可诱导发热的耐热物质(糖蛋白)。这两种物质如果被施用于人都可以导致发热、低血压和休克。生产不含内毒素的制剂需要特别的设备、内行的技术人员，并且比制备有热原的制剂昂贵得多。因为已经表明在啮齿动物中静脉内施用NPY或PYY同时输注内毒素可以防止低血压和甚至与仅施用内毒素相关的死亡(美国专利4,839,343)，所以对于非肠胃外(非注射)施用，预期生产这些治疗剂的不含内毒素制剂不是必要的。

非输注施用

“非输注施用”指任一传递方法，其不包括直接注射到动脉或静脉，是通过针头、注射器或其他侵入性方法强迫或驱使(通常为流体)进入某物，特别是导入身体部分的一种方法。非输注施用包括皮下注射、肌内注射、腹膜内注射和传递到粘膜的非注射方法。

肥胖症的治疗和预防

如上面所指出的，本发明提供了改良的并且有用的方法和组合物，它们用以通过鼻粘膜传递Y2受体结合肽以预防和治疗哺乳动物受试者中的肥胖症。如此处所用的，肥胖症的预防和治疗指在通过减少进餐期间食物摄入和/或减小施用期间的体重或体重减轻后和体重增加前保持所减少的体重来防止临床肥胖症的发病或降低发病率或严重性。

本发明提供了改良的并且有用的方法和组合物，它们用以通过鼻粘膜将Y2受体结合肽传递到脑的区域，例如，下丘脑或阿黑皮素原(POMC)和NPY弓状神经元，以预防和治疗哺乳动物受试者中的肥胖症。Y2受体结合肽也可以与Y1受体拮抗剂如二氢吡啶联合施用。

传递方法和组合物

用于Y2受体结合肽经粘膜施用于哺乳动物受试者的改良方法和组合物优化了Y2受体结合肽给药方案。本发明提供了与一种或多种粘膜传递增强剂配制的Y2受体结合肽的粘膜传递，其中Y2受体-结合肽剂量释放被基本上标准化和/或粘膜施用后维持Y2受体结合肽释放的有效传递时间，通常为约0.1到2.0小时；0.4到1.5小时；0.7到1.5小时；或0.8到1.0小时。利用本发明的方法和组合物，通过外源Y2受体结合肽的反复施用可以促进所实现的Y2受体-结合肽的缓释。

缓释组合物和方法

用于Y2受体结合肽经粘膜施用于哺乳动物受试者的改良的组合物和方法优化了Y2受体结合肽给药方案。本发明提供了制剂的改良的粘膜(例如，经鼻)传递，该制剂含有Y2受体结合肽联合一种或多种粘膜传递增强剂和任选一种或多种缓释增强剂。本发明的粘膜传递增强剂导致传递的有效增加，例如，最大血浆浓度(C_max)的增加，以增强经粘膜施用的Y2受体结合肽的治疗活性。影响血浆中Y2受体-结合肽的治疗活性和CNS的另一因素是滞留期(RT)。缓释增强剂，联合鼻内传递增强剂增加了C_max并增加了Y2受体-结合肽的滞留期(RT)。此处公开了本发明的聚合物传递载体及其他试剂和方法，它们可以产生缓释增强制剂，例如，聚乙二醇(PEG)。本发明提供了改良的Y2受体结合肽传递方法和剂型，它们用于治疗哺乳动物受试者中肥胖症、结肠癌、胰腺癌或乳腺癌相关的症状。

在本发明的粘膜传递制剂和方法内，Y2受体结合肽通常与适于粘膜传递的载体或赋形剂组合或协同施用。如此处所用的，术语“载体”指药学上可接受的固态或液态填充剂、稀释剂或包封材料。含水的液态载体可以含有药学上可接受的添加剂如酸化剂、碱化剂、抗微生物的防腐剂、抗氧化剂、缓冲剂、螯合剂、络合剂、增溶剂、湿润剂、溶剂、悬浮和/或粘性增强剂、张力剂、增湿剂或其他生物相容的材料。可以在U.S.PharmacopeiaNational Formulary，1857-1859，(1990)中发现按照上面的分类列出的成分的列表。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些实例为糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状西黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可油和栓剂蜡；油，如花生油、棉籽油、红花油、蓖麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；褐藻酸；不含热原水；等渗盐水；林格溶液；乙醇和磷酸盐缓冲液，以及用于药物制剂中的其他无毒相容的物质。根据配方设计师的愿望，这些组合物中也可以存在增湿剂、乳化剂和润滑剂，如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和增香剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括水可溶的抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等等；油可溶的抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸，等等。可以与载体材料组合产生单一剂型的活性成分的量将根据施用的具体模式而变。

在本发明的粘膜传递组合物和方法中，使用各种传递增强剂，它们增强Y2受体结合肽向粘膜表面内或经过粘膜表面的传递。在这点上，Y2受体结合肽经过粘膜上皮的传递可以“跨细胞”或“细胞侧”地发生。这些途径对于Y2受体结合肽的总流量和生物利用度的程度取决于粘膜的环境、活性剂的理化性质，和粘膜上皮的性质。细胞侧运输仅包括被动扩散，而跨细胞运输可以通过被动的、促进或主动过程发生。通常，亲水的、被动运输的、极性溶剂通过细胞侧途径扩散，而更亲脂的溶质利用跨细胞途径。对于本发明内任何选择的Y2受体结合肽，可以按照细胞侧和跨细胞传递组分容易地评价不同的、被动和主动吸收的溶质的吸收和生物利用度(例如，通过透性系数和生理测定反映的)。对于被动吸收的药物，细胞侧和跨细胞途径对药物运输的相对贡献取决于pKa、分配系数、分子半径和药物的电荷、腔环境(药物在其中传递)的pH，和吸收表面的面积。细胞侧途径代表鼻粘膜上皮的可接近表面积的相对较小的部分。概括地，已经报导细胞膜占据粘膜的表面积是细胞侧部分占据的面积的1000倍以上。从而，可接近面积越小，针对大分子渗透的基于大小和电荷的区分将表明细胞侧途径将通常是比药物运输的跨细胞途径的较不利的途径。令人惊奇地，本发明的方法和组合物提供了生物治疗剂经过细胞侧途径运输向粘膜上皮细胞内或经过粘膜上皮细胞的显著增强的运输。因此，本发明的方法和组合物成功地靶定细胞侧和跨细胞途径，备选地或者在单一方法或组合物内。

如此处所用的，“粘膜传递增强剂”包括增强Y2受体结合肽或其他生物学活性化合物的释放或溶解性(例如，从制剂传递载体)、扩散速度、渗透能力和时间选择、吸收、滞留期、稳定性、有效半寿期、峰或持续的浓度水平、清除率及其他所希望的粘膜传递特征(例如，如在传递部位，或者在活性的所选的靶标部位，如血流或中枢神经系统中测量的)的试剂。从而，通过多种机理之一，例如，通过增强Y2受体结合肽的扩散、运输、持久性或稳定性，增加膜流动性，调节钙及其他离子的可用性或作用，该其他离子调节细胞内或细胞侧渗透，使粘膜组分(例如，脂质)增溶，改变粘膜组织中的非蛋白质和蛋白质巯基水平，增加经过粘膜表面的水流量，调节上皮连接生理学，减少粘膜上皮上覆盖的粘膜的粘性，减小粘膜纤毛清除速度，及其他机理可以增强粘膜传递。

如此处所用的，“Y2受体结合肽的粘膜有效量”预期Y2受体结合肽向个体中药物活性靶位点的有效粘膜传递，该传递可包括各种传递和转移途径。例如，给定活性剂可以通过粘膜的细胞之间的间隙找到出路并到达邻近血管壁，而通过另一途径，该试剂可以被动地或主动地摄入到粘膜细胞而在细胞内作用或者被释放或运输到细胞外面而到达次级靶标部位，如全身循环。本发明的方法和组合物可以促进活性剂沿着一条或多条这种备选途径的迁移，或者可以直接作用于粘膜组织或邻近血管组织以促进活性剂的吸收或渗透。上下文中吸收或渗透的促进不限于这些机理。

如此处所用的，“血浆中Y2受体结合肽的峰浓度(C_max)”、“血浆中Y2受体结合肽的浓度对时间曲线下的面积(AUC)”、“血浆中Y2受体结合肽的最大血浆浓度(t_max)的时间”是本领域中技术人员公知的药物动力学参数。Laursen等人， Eur.J.Endocrinology，135：309-315，1996。“浓度对时间曲线”测量通过鼻内、肌内、皮下或给药的其他肠胃外途径将Y2受体结合肽的剂量施用于受试者后受试者血清Y2受体结合肽对时间的浓度。“C_max”是Y2受体结合肽的单剂量施用于受试者后该受试者血清中Y2受体结合肽的最大浓度。“t_max”是Y2受体结合肽的单剂量施用于受试者后该受试者血清中Y2受体结合肽的浓度达到最大值的时间。

如此处所用的，根据线性梯形规则并加入剩余的面积计算“血浆中Y2受体结合肽的浓度对时间下的面积(AUC)”。检测到两个剂量之间23％的减少或30％的增加的概率为90％(II型误差β＝10％)。通过比较达到最大浓度(C_max)的时间(t_max)估计“传递速度”或“吸收速度”。利用非参数方法分析C_max和t_max。通过方差分析(ANOVA)实施肌内、皮下、静脉内或鼻内Y2受体结合肽施用的药物动力学比较。对于逐对比较，用Bonferroni-Holmes连续方法评价显著性。通过回归分析估计三个鼻剂量之间的剂量应答关系。认为P＜0.05是显著的。结果以平均值+/-SEM给出。

尽管吸收促进的机理可以随着本发明的不同粘膜传递增强剂而变，但是在这方面有用的试剂将基本上不会对粘膜组织造成不利影响并且将根据具体Y2受体结合肽或其他活性或传递增强剂的理化特征选择。在这方面，增加粘膜组织的渗透性或通透性的传递增强剂将通常导致粘膜的保护性透性屏障的一些变化。对于在本发明内有价值的这些传递增强剂，通常希望在对药物传递的所希望的持续时间适当的时间范围内粘膜的透性的任何重要的改变都是可逆的。此外，在长期使用中，应该没有重要的、积累性毒性，粘膜的屏障性质也没有任何持久的有毒变化。

在本发明的一些方面，用于与本发明的Y2受体结合肽协同施用或组合配制的吸收促进剂选自小亲水分子，包括但不限于，二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺、乙醇、丙二醇，和2-吡咯烷酮。备选地，长链两亲性分子，例如去酰基甲基亚砜、月桂氮酮、十二烷基硫酸钠、油酸、和胆汁盐可用于增强Y2受体结合肽的粘膜渗透。在另外的方面，表面活性剂(例如，聚山梨酯)被用作辅助化合物、加工试剂或制剂添加剂以增强Y2受体结合肽的鼻内传递。诸如DMSO、聚乙二醇和乙醇的试剂如果以足够高的浓度存在于传递环境(例如，通过预施用或掺入治疗制剂中)，可以进入粘膜的水相并改变其溶解性质，从而增强Y2受体结合肽从载体向粘膜的分配。

可用于本发明的协同施用和处理方法和组合制剂中的另外的粘膜传递增强剂包括，但不限于，混合的微团、烯胺、一氧化氮供体(例如，S-亚硝基-N-乙酰基-DL-青霉胺、NOR1、NOR4，它们优选与NO清除剂如羧基-PITO或doclofenac钠)；水杨酸钠、乙酰乙酸的甘油酯(例如，甘油基-1，3-二乙酰乙酸或1，2-异亚丙基甘油-3-乙酰乙酸)；和与粘膜传递在生理上相容的其他释放-扩散或上皮内或透上皮渗透促进剂。其他吸收促进剂选自各种载体、碱和赋形剂，这些载体、碱和赋形剂增强Y2受体结合肽的粘膜传递、稳定性、活性或透上皮渗透。这些包括环糊精和β-环糊精衍生物(例如，2-羟丙基-β-环糊精和heptakis(2，6-二-O-甲基-β-环糊精)。这些化合物任选与一种或多种活性成分结合并进一步任选在油质基质中配制，增强本发明的粘膜制剂中的生物利用度。适于粘膜传递的另外的吸收增强剂包括中链脂肪酸，包括单甘油酯和二甘油酯(例如，硅酸钠——可可油的提取物，Capmul)，和甘油三酯(例如，淀粉糊精，Estaram 299，Miglyol 810)。

可以对本发明的粘膜治疗和预防组合物补加任一适当的渗透促进剂，该渗透促进剂促进Y2受体结合肽经过粘膜屏障的吸收、扩散或渗透。渗透促进剂可以是药学上可接受的任一种促进剂。从而，在本发明的更详细方面，提供了掺入一种或多种渗透促进剂的组合物，该渗透促进剂选自水杨酸钠和水杨酸衍生物(乙酰水杨酸、胆碱水杨酸、水杨酰胺，等等)；氨基酸及其盐(例如，单氨基羧酸，如甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸，等等；羟基氨基酸，如丝氨酸；酸性氨基酸如天冬氨酸、谷氨酸；和碱性氨基酸如赖氨酸等——包括它们的碱金属或碱土金属盐)；和N-乙酰氨基酸(N-乙酰丙氨酸、N-乙酰苯丙氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-乙酰甘氨酸、N-乙酰赖氨酸、N-乙酰谷氨酸、N-乙酰脯氨酸、N-乙酰羟脯氨酸，等等)和它们的盐(碱金属盐和碱土金属盐)。在本发明的方法和组合物内作为渗透促进剂还提供的为通常用作乳化剂的物质(例如，油烯基磷酸钠、月桂基磷酸钠、月桂基磷酸钠、肉豆蔻基硫酸钠、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基酯，等等)、己酸、乳酸、苹果酸和柠檬酸及其碱金属盐、吡咯烷酮羧酸、烷基吡咯烷酮羧酸酯、N-烷基吡咯烷酮、脯氨酸酰基醚，等等。

在本发明的各个方面，提供了改良的鼻粘膜传递制剂和方法，它们允许穿过施用和所选的靶标部位之间的粘膜屏障传递Y2受体结合肽和本发明内的其他治疗剂。某些制剂特别适于所选的靶细胞、组织或器官，或者甚至具体疾病状态。在其他方面，制剂和方法提供了Y2受体结合肽特别沿着限定的细胞内或细胞间途径的有效的、选择性内吞或胞转。通常，Y2受体结合肽在载体或其他传递载体中以有效浓度水平装载，并且例如在鼻粘膜和/或穿过细胞内隔室和膜到达药物作用的遥远的靶标部位(例如，血流或限定的组织，器官或细胞外隔室)期间的传递并保持稳定的形式。可以在传递载体或其他修饰的(例如，前药形式)形式中提供Y2受体结合肽，其中Y2受体结合肽释放和活化由生理刺激(例如，pH变化、溶酶体酶，等等)触发。通常，Y2受体结合肽在其到达活性的靶标位点之前为药学上无活性的。在多数情况中，Y2受体结合肽及其他制剂组分是无毒的和无免疫原性的。在这方面，通常选择能够在生理条件下快速分解并分泌的载体及其他制剂组分。同时，为了有效储存，剂量形式的制剂是化学和生理上稳定的。

肽和蛋白质类似物和模拟物

在用于本发明的生物活性肽和蛋白质的定义中包括天然的或合成的、治疗或预防上有活性的肽(含有两个或多个共价连接的氨基酸)、蛋白质、肽或蛋白质片段、肽或蛋白质类似物，和活性肽或蛋白质的化学修饰的衍生物或盐。预期Y2受体结合肽的各种有用的类似物和模拟物用于本发明并且可以根据公知的方法生产并试验生物学活性。通常，用于本发明内的Y2受体结合肽的肽或蛋白质或其他生物活性肽或蛋白质是突变蛋白，通过天然存在的或者天然(例如，野生型、天然存在的突变体，或等位基因变体)肽或蛋白质序列的部分置换、加入或缺失可以容易地得到这些突变蛋白。此外，还包括天然肽或蛋白质的生物活性片段。这些突变衍生物和片段基本上保持该天然肽或蛋白质的所希望的生物学活性。对于具有糖链的肽或蛋白质，本发明还包括由于这些糖种类的改变而导致的生物活性变体。

如此处所用的，术语“保守氨基酸置换”指具有类似侧链的氨基酸残基的一般互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组一般互换性氨基酸为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸，和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸为丝氨酸和苏氨酸；具有含有酰胺侧链的一组氨基酸为天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香侧链的一组氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸为半胱氨酸和甲硫氨酸。保守置换的实例包括非极性(疏水)残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸的相互置换。同样，本发明预期极性(亲水)残基如精氨酸和赖氨酸之间、谷氨酰胺和天冬氨酸之间，和苏氨酸和丝氨酸之间的置换。另外地，还预期碱性残基如赖氨酸、精氨酸或组氨酸被另一残基置换或者酸性残基如天冬氨酸或谷氨酸被另一残基置换。代表性保守氨基酸置换基团为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，和天冬氨酸-谷氨酰胺。通过将一种肽或蛋白质类似物最优地与相应的天然肽或蛋白质比对，并通过使用适当的测定，例如，粘着蛋白或受体结合测定，以确定所选的生物学活性，可以容易地鉴定用于本发明的方法和组合物中的可操作的肽或蛋白质类似物。可操作的肽和蛋白质类似物通常与针对相应天然肽或蛋白质产生的抗体具

有特异免疫反应性。

稳定本发明的固态蛋白制剂的一种方法是增加所纯化的，例如，冻干的蛋白质的物理稳定性。这将抑制通过疏水相互作用以及通过共价途径产生的聚集，该聚集可以随着蛋白质解折叠而增加。稳定在该背景下的制剂通常包括基于聚合物的制剂，例如，生物可降解的水凝胶制剂/传递系统。如上面提到的，水在蛋白质结构、功能和稳定性中的关键作用是熟知的。通常，当除去大量水时，固态蛋白质是相对稳定的。然而，在高湿度下保存或者从缓释组合物或装置传递期间，固态治疗蛋白制剂可以被水合。蛋白质的稳定性通常随着水合增加而降低。水也在固态蛋白质聚集中起重要的作用，例如，可通过增加蛋白质柔性而导致反应性基团的更易接近性，通过提供反应物的流动相，和通过作为一些有害过程如β-消去和水解中的反应物而起作用。

含有约6％到28％水的蛋白质制剂是最不稳定的。在该水平以下，结合的水和蛋白质内部运动是低的。高于该水平时，水运动性和蛋白质运动接近完全水合的那些运动性。到某一点，在一些体系中已经观察到随着水合的增加，固相聚集的敏感性增加。然而，在更高水含量下，由于稀释效应，观察到更少的聚集。

根据这些原理，用于稳定肽和蛋白质防止粘膜传递的固态聚集的一种有效方法时是控制固态制剂中的水含量并保持该制剂中水活度在最佳水平。该水平取决于该蛋白质的性质，但是通常，保持在低于它们的“单层”水盖度下的蛋白质将显示出较高的固态稳定性。

在本发明内提供了各种添加剂、稀释剂、碱和传递载体，它们有效控制水含量以增加蛋白质稳定性。有效用作该意义中的抗聚集剂的这些试剂和载体材料包括，例如，各种功能性的聚合物，如聚乙二醇、葡聚糖、二乙基氨基乙基葡聚糖，和羧甲基纤维素，它们显著增加与之混合或结合的肽和蛋白质的稳定性并降低它们的固相聚集。在一些情况中，通过肽或蛋白质药物的水性溶液的各种添加剂也可以增强蛋白质活性或物理稳定性。例如，可以使用诸如多元醇(包括糖)、氨基酸、蛋白质，如胶原蛋白和明胶，和各种盐的添加剂。

某些添加剂，尤其糖及其他多元醇，也对干燥的，例如，冻干的蛋白质赋予重要的物理稳定性。这些添加剂也可用于本发明，用以不仅在冻干期间而且在干燥状态的储存期间保护蛋白质防止聚集。例如，蔗糖和聚蔗糖(Ficoll)70(蔗糖单位的一种聚合物)在各种条件下固相温育期间显示出重要保护性以防止肽或蛋白质聚集。这些添加剂也可以增强包埋在聚合物基质中的固体蛋白的稳定性。

另外的添加剂，例如，蔗糖，稳定湿润空气高温下的蛋白质防止固态聚集，该聚集可能在本发明的某些缓释制剂中发生。诸如明胶和胶原蛋白的蛋白质也可以作为稳定或膨胀剂以减小该背景中不稳定蛋白质的变性和聚集。这些添加剂可以被掺入本发明的聚合熔解方法和组合物。例如，通过将含有上述各种稳定添加剂的溶液简单地冻干或喷雾干燥可以制备多肽微粒。从而可以得到未聚集的肽和蛋白质在更长时期内的缓慢释放。

此处提供了各种另外的制备组分和方法，以及特定制剂添加剂，它们产生了易于聚集的肽和蛋白质的粘膜传递制剂，其中使用增溶剂，该肽或蛋白质被稳定为基本上纯的、未聚集的形式。预期各种组合物和添加剂被用于这些方法和制剂中。代表性增溶剂连接到环糊精(CDs)的二聚体，这些二聚体选择性结合多肽的疏水侧链。已经发现这些CD二聚体以显著抑制聚集的方式结合蛋白质的疏水斑。该抑制关于CD二聚体和相关蛋白质是选择性的。蛋白质聚集的这种选择性抑制提供了本发明的鼻内传递方法和组合物的另外的优点。用于该背景中的另外试剂包括具有不定的几何形状的CD三聚体和四聚体，这些几何形状受到特异阻断肽和蛋白质的聚集的连接体的控制。掺入本发明的其他增溶剂和方法包括使用肽和肽模拟物选择性阻断蛋白质-蛋白质相互作用。在一个方面，通过使用类似地阻断蛋白质聚集的肽和肽模拟物，将对于CD多聚体报导的疏水侧链的特异结合延伸到蛋白质。各种适当的方法和抗聚集剂可用于掺入本发明的组合物和方法内。

电荷修饰和pH控制剂和方法

为了提高生物活性剂(包括Y2受体结合肽，其他活性肽和蛋白质，和大分子和小分子药物)的转运特征以增强穿过疏水粘膜屏障的传递，本发明还提供了用于所选的生物活性剂或此处描述的传递增强剂的电荷修饰的技术和试剂。关于这一点，大分子的相对透性通常与它们的分配系数相关。分子的离子化程度依赖于该分子的pKa和粘膜表面的pH，该离子化程度也影响该分子的透性。用于粘膜传递的生物活性剂(包括本发明的Y2受体结合肽和类似物)的透性和分配可以通过活性剂或渗透剂的电荷改变或电荷散布而被促进，通过，例如，改变带电的官能团，通过修饰传递载体或溶液的pH，其中活性剂在该传递载体或溶液中传递，或者通过将电荷-或pH-改变剂与活性剂协同施用，可以实现电荷改变或电荷散布。

与这些一般教导一致的是，当活性剂以基本上未离子化，或者中性带电状态传递到粘膜表面时，本发明方法和组合物内的带电大分子种类(包括Y2受体结合肽及其他生物活性肽和蛋白质)的粘膜传递被充分改善。

用于本发明的粘膜制剂的某些Y2受体结合肽及其他生物活性肽和蛋白质组分将被电荷修饰以导致该肽或蛋白质的正电荷密度增加。这些修饰也扩大到此处公开的肽和蛋白质偶联物、载体及其他传递形式的阳离子化。阳离子化提供了改变本发明内蛋白质和大分子的生物分布和运输特征的便利的方法。以一种方式实施阳离子化，该方式基本保存活性剂的生物活性并且限制潜在的不利副作用，包括组织损伤和毒性。

降解酶抑制剂和方法

可以包括在透粘膜制剂中的另一赋形剂为降解酶抑制剂。用于本发明的粘膜传递制剂和方法的代表性粘膜粘附聚合物-酶抑制剂复合体包括，但不限于：羧甲基纤维素-胃蛋白酶抑制剂(具有抗-胃蛋白酶活性)；聚(丙烯酸)-Bowman-Birk抑制剂(抗-胰凝乳蛋白酶)；聚(丙烯酸)-胰凝乳蛋白酶抑制剂(抗-胰凝乳蛋白酶)；聚(丙烯酸)-弹性蛋白酶抑制剂(抗-弹性蛋白酶)；聚卡波非-弹性蛋白酶抑制剂(抗-弹性蛋白酶)；壳聚糖-抗蛋白酶(抗-胰蛋白酶)；聚(丙烯酸)-杆菌肽(抗-氨肽酶N)；壳聚糖-EDTA(抗-氨肽酶N，抗-羧肽酶A)；壳聚糖-EDTA-抗蛋白酶(抗-胰蛋白酶，抗-胰凝乳蛋白酶；抗弹性蛋白酶)。如在下面详述的，本发明的一些实施方案将任选掺入新的壳聚糖衍生物或壳聚糖的化学修饰形式。用于本发明的一种该新衍生物被表示为β-[1→4]-2-胍基-2-脱氧-D-葡萄糖聚合物(聚GuD)。

抑制酶活性以保护生物活性剂的任一抑制剂可用于本发明的组合物和方法中。用于保护生物活性蛋白质和肽的有用的酶抑制剂包括，例如，大豆胰蛋白酶抑制剂、胰腺胰蛋白酶抑制剂、胰凝乳蛋白酶抑制剂和从马铃薯(solanum tuberosum L.)块茎分离的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶抑制剂。可以使用抑制剂的组合或混合物。用于本发明蛋白水解酶的另外抑制剂包括卵类粘蛋白酶、加贝酯甲磺酸盐、α-抗胰蛋白酶、抑蛋白酶肽、氨肽霉抑制剂、苯丁抑制素、嘌呤霉素、杆菌肽、亮抑蛋白酶肽、α2-巨球蛋白、胃蛋白酶抑制剂和蛋白或者大豆胰蛋白酶抑制剂。这些及其他抑制剂可以单独或者联合使用。抑制剂可以掺入或者结合载体，例如，亲水聚合物，包被在将与鼻粘膜接触的剂型的表面，或者掺入表面的表面相，与生物活性剂联合或者单独施用(例如，预施用)的制剂中。

任选掺入本发明组合物的抑制剂，例如蛋白水解酶抑制剂的量将依赖于如下因素而变：(a)特定抑制剂的性质，(b)该分子中存在的官能团的数目(其可以反应而导入与形成水凝胶的单体共聚必需的乙烯不饱和)，和(c)抑制分子中存在的凝集素基团(如糖苷)数目。抑制剂的量还取决于计划施用的特定治疗剂。一般说来，酶抑制剂的有用量为约0.1mg/ml到约50mg/ml，通常约0.2mg/ml到约25mg/ml，更通常约0.5mg/ml到约5mg/ml制剂(即，单独的蛋白酶抑制剂制剂或者与抑制剂和生物活性剂的组合制剂)。

对于胰蛋白酶抑制，适当的抑制剂可以选自例如，抑蛋白酶肽、BBI、大豆胰蛋白酶抑制剂、鸡卵类粘蛋白、鸡卵抑制剂、人胰腺胰蛋白酶抑制剂、卡莫司他甲磺酸盐、类黄酮抑制剂、抗蛋白酶、亮抑蛋白酶肽、对-氨基苯甲酰胺、AEBSF、TLCK(甲苯磺酰基氯甲基酮)、APMSF、DFP、PMSF，和聚(丙烯酸)衍生物。对于胰凝乳蛋白酶抑制，适当的抑制剂可以选自例如，抑蛋白酶肽、BBI、大豆胰蛋白酶抑制剂、胰凝乳蛋白酶抑制剂、苄氧羰基-Pro-Phe-CHO、FK-448、鸡卵抑制剂、糖二苯基硼酸络合物、DFP、PMSF、β-苯基丙酸，和聚(丙烯酸)衍生物。对于弹性蛋白酶抑制，适当的抑制剂可以选自例如，弹性蛋白酶抑制剂、甲氧基琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Val-氯甲基酮(MPCMK)、BBI、大豆胰蛋白酶抑制剂、鸡卵抑制剂、DFP，和PMSF。

用于本发明的另外的酶抑制剂选自各种非蛋白质抑制剂，它们在效力和毒性的程度方面不同。如下面详细描述的，将这些辅助剂固定到基质或其他传递载体，或者开发化学修饰的类似物，可以被容易的实现以减小或甚至除去它们所遇到的毒性效果。用于本发明的该大类候选酶抑制剂包括有机磷抑制剂，如二异丙基氟磷酸(DFP)和苯甲基磺酰氯(PMSF)，它们是丝氨酸蛋白酶(例如，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)的强烈的、不可逆的抑制剂。这些化合物对乙酰胆碱酯酶的另外抑制使得它们在未受控制的传递设置中是高度毒性的。另一种候选抑制剂4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氯(AEBSF)具有与DFP和PMSF相当的抑制活性，但是毒性显著更小。(4-氨基苯基)-甲磺酰氟盐酸盐(APMSF)是胰蛋白酶的另一强烈抑制剂，但是在未受控制的设置中是有毒的。与这些抑制剂相比，1，2，3，4-四氢-1-萘甲酸甲磺酸4-(4-异丙基哌啶子基(piperadino)羰基)苯酯(FK-448)是低毒物质，代表胰凝乳蛋白酶的强烈且特异的抑制剂。也显示出低毒危险的抑制剂候选者的该非蛋白组的其他代表为卡莫司他甲磺酸盐(N，N’-二甲基氨基甲酰甲基-对-(p’-胍基-苯甲酸基)苯乙酸甲磺酸)。

用于本发明的方法和组合物的再一类酶抑制剂是干扰特定治疗化合物的酶促降解的氨基酸和修饰氨基酸。为了用于该方面，氨基酸和修饰氨基酸基本上无毒并且可以以低成本产生。然而，由于它们的低分子大小和良好溶解性，它们可以被容易地稀释并在粘膜环境中吸收。然而，在适当条件下，氨基酸可以作为蛋白酶的可逆的竞争性抑制剂。某些修饰氨基酸可以表现出强得多的抑制活性。在这方面所希望的修饰氨基酸为所称作的“过渡态”抑制剂。这些化合物的强抑制活性是基于它们与过渡态几何中底物的结构相似性，然而，通常选择的这些化合物对酶的活性位点的亲和性比对底物自身的亲和性高得多。过渡态抑制剂是可逆的竞争性抑制剂。这类抑制剂的实例是α-氨基硼酸衍生物，如硼-亮氨酸、硼-缬氨酸和硼-丙氨酸。这些衍生物中的硼原子可以形成四面体硼酸盐离子，认为其类似氨肽酶对肽的水解过程中这些肽的过渡态。这些氨基酸衍生物是氨肽酶的强烈并且可逆的抑制剂并且据报导硼-亮氨酸在酶抑制中的有效性比贝他定强100倍，比嘌呤霉素强1000倍。已经报导具有强蛋白酶抑制活性的另一修饰氨基酸是N-乙酰基半胱氨酸，其抑制氨肽酶N的酶活性。该辅助剂也显示出粘液溶解性质，该辅助剂可用于本发明的方法和组合物内以减小粘膜扩散屏障的影响。

用于本发明的协调施用方法和组合制剂的再一有用的酶抑制剂可以选自肽和修饰的肽酶抑制剂。这类抑制剂的另一重要的代表是环十二肽杆菌肽，其可从地衣型芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)得到。除了这些类型的肽，某些二肽和三肽显示出针对某些蛋白酶的弱的、非特异性抑制活性。通过与氨基酸类比，通过化学修饰可以提高它们的抑制活性。例如，次膦酸二肽类似物也是“过渡态”抑制剂，具有针对氨肽酶的强抑制活性。已经报导它们被用于稳定经鼻施用的亮氨酸脑啡肽。过渡态类似物的另一实例是修饰的五肽胃蛋白酶抑制剂，其是胃蛋白酶的一种非常强的抑制剂。通过试验一些合成类似物的抑制活性，对胃蛋白酶抑制剂的结构分析阐明了该分子的负责抑制活性的主要结构-功能特征。另一特定类型的修饰肽包括在它们的结构中具有位于末端的醛官能的抑制剂。例如，已经发现序列(该序列满足胰凝乳蛋白酶的公知的一级和二级特异性要求)苄氧羰基-Pro-Phe-CHO是该靶标蛋白酶的强烈的可逆抑制剂。具有位于末端的醛官能的其他抑制剂(例如抗蛋白酶、亮胰蛋白酶肽、胰凝乳蛋白酶抑制剂和弹性蛋白酶抑制剂)的化学结果也是本领域中公知的，其他公知的、可逆的、修饰肽抑制剂，如磷酰二肽、贝他定、嘌呤霉素和抑氨肽酶A素的结构也是公知的。

由于它们较高的分子量，多肽蛋白酶抑制剂比更小的化合物更容易在药物载体基质中浓缩传递。本发明的制剂和方法内的蛋白酶抑制的另外试剂包括使用络合剂。这些试剂通过夺取鼻内环境(或者预备或治疗性组合物)的二价阳离子介导酶抑制，这些二价阳离子是许多蛋白酶的辅因子。例如，作为协同使用或组合配制的辅助剂的适当浓度的络合剂EDTA和DTPA将有效抑制所选的蛋白酶，从而增强根据本发明的生物活性剂的鼻内传递。这类抑制剂的其他代表为EGTA、1，10-二氮杂菲和羟基喹啉。此外，由于它们倾向于螯合二价阳离子，这些及其他螯合剂可用于本发明作为直接吸收促进剂。

如本文别处更详细指出的，还预期使用各种聚合物，尤其酶抑制剂作为本发明的协同施用、多-加工和/或组合制剂方法和组合物中的酶抑制剂。例如，聚(丙烯酸)衍生物，如聚(丙烯酸)和聚卡波非，可以影响各种蛋白酶(包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶)的活性。这些聚合物的抑制效果还可以基于二价阳离子如Ca²⁺和Zn²⁺的络合。还预期这些聚合物可以作为如上述的另外的酶抑制剂的偶联配偶体或载体。例如，已经开发了壳聚糖-EDTA偶联物并且其可用于本发明，该偶联物显示出针对依赖锌的蛋白酶的酶活性的强抑制效果。共价粘附该背景中的其他酶抑制剂后，预期聚合物的粘膜粘附性质不受到实质性损害，还预期这些聚合物作用本发明内生物活性剂的传递载体的一般效用不被减小。相反，粘膜粘附机理提供的传递载体和粘膜表面之间减小的距离将使活性剂的前全身代谢最小，而共价结合的酶抑制剂在药物传递部位保持浓缩，使得不希望的抑制剂稀释效应以及由此导致的毒性及其他副作用最小。这样，由于排除了稀释效应，可以减小协同施用的酶抑制剂的有效量。

用于本发明的粘膜制剂和方法的代表性粘膜粘附聚合物-酶抑制剂复合体包括，但不限于：羧甲基纤维素-胃蛋白酶抑制剂(具有抗-胃蛋白酶活性)；聚(丙烯酸)-Bowman-Birk抑制剂(抗-胰凝乳蛋白酶)；聚(丙烯酸)-胰凝乳蛋白酶抑制剂(抗-胰凝乳蛋白酶)；聚(丙烯酸)-弹性蛋白酶抑制剂(抗-弹性蛋白酶)；羧甲基纤维素-弹性蛋白酶抑制剂(抗-弹性蛋白酶)；聚卡波非-弹性蛋白酶抑制剂(抗-弹性蛋白酶)；壳聚糖-抗蛋白酶(抗-胰蛋白酶)；聚(丙烯酸)-杆菌肽(抗-氨肽酶N)；壳聚糖-EDTA(抗-氨肽酶N，抗-羧肽酶A)；壳聚糖-EDTA-抗蛋白酶(抗-胰蛋白酶，抗-胰凝乳蛋白酶；抗弹性蛋白酶)。

粘液溶解和粘液清除剂和方法

生物治疗剂通过鼻内施用的有效传递必须考虑穿过鼻粘膜的保护性粘液内衬的降低的药物运输速度，以及由于结合粘液层的糖蛋白导致的药物损失。通常的粘液是粘弹性的、类似凝胶的物质，其由水、电解质、粘蛋白、大分子，和脱落的上皮细胞组成。粘液主要作为下面的粘膜组织的细胞保护和润滑覆盖物。粘液由鼻上皮及其他粘膜上皮中的随机分布的分泌性细胞分泌。粘膜的结构单位是粘蛋白。该糖蛋白主要负责粘蛋白的粘弹性性质，尽管其他大分子也对该性质有贡献。在气道粘液中，这些大分子包括局部产生的分泌性IgA、IgM、IgE、溶菌酶、和支气管转铁蛋白，它们在宿主防御机制中也起重要的作用。

本发明的协同施用方法任选掺入有效粘液溶解或粘液清除剂，其用于分解、变薄或清除来自鼻内粘膜表面的粘液以促进鼻内施用的生物治疗剂的吸收。在这些方法内，粘液溶解或粘液清除剂被作为辅助化合物协同施用以增强生物活性剂的鼻内传递。备选地，粘液溶解或粘液清除剂的有效量作为加工剂被掺入本发明的多加工方法，或者作为本发明的组合物制剂的添加剂以提供改良制剂，其通过减小鼻内粘液的屏障效应而增强生物治疗化合物的鼻内传递。

各种粘液溶解或粘液清除剂可用以掺入本发明的方法和组合物。基于它们的作用机理，粘液溶解或粘液清除剂通常可以分成下面的组：蛋白酶(例如，链霉蛋白酶、木瓜蛋白酶)，其切割粘蛋白糖蛋白的蛋白核心；巯基化合物，其切割粘蛋白二硫键；和去污剂(例如，Triton X-100，吐温20)，其破坏粘蛋白内的非共价键。这方面的另外化合物包括，但不限于，胆汁盐和表面活性剂，例如，脱氧胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠、甘胆酸钠和溶血磷脂酰胆碱。

胆汁盐导致粘液的结构破坏的有效性的顺序为脱氧胆酸盐＞牛磺胆酸盐＞甘胆酸盐。减小粘液粘性或粘附以增强根据本发明方法的鼻内传递的其他有效试剂包括，例如，短链脂肪酸，和通过螯合起作用的粘液溶解剂，如N-酰基胶原蛋白肽、胆汁酸，和皂甙(后者部分通过螯合Ca²⁺和/或Mg²⁺起作用，Ca²⁺和/或Mg²⁺在保持粘液层结构中起重要作用)。

用于本发明方法和组合物的另外的粘液溶解剂包括N-乙酰基-L-半胱氨酸(ACS)，它是一种有效的粘液溶解剂，其减小支气管肺粘液的粘性和粘附并且还被报导适当地增加被麻醉的大鼠中人生长激素的鼻生物利用度(从7.5到12.2％)。这些及其他粘液溶解或粘液清除剂与鼻粘膜接触，通常浓度范围为约0.2到20mM，与生物活性剂协调施用，用于减小鼻内粘膜的极性粘性和/或弹性。

其他粘液溶解或粘液清除剂可选自各种糖苷酶，它们能够切割粘液糖蛋白内的糖苷键。α-淀粉酶和β-淀粉酶是这类酶的代表，尽管它们的粘液溶解效果可能有限。相反，细菌糖苷酶允许这些微生物透过它们的宿主的粘液层。

对于与本发明内的多数生物活性剂(包括肽和蛋白治疗剂)的组合使用，非-电离化去污剂通常也可用作粘膜溶解或粘膜清除剂。这些试剂通常不会修饰或实质性地削弱治疗多肽的活性。

纤毛抑制剂和方法

因为某些粘膜组织(例如，鼻粘膜组织)通过粘膜纤毛清除产生的自身清除能力是作为保护功能(例如，以除去灰尘、变应原、和细菌)所必需的，已经一般地认为该功能应该不被粘膜药物实质性损害。呼吸道中粘膜纤毛运输是针对感染的尤其重要的防御机理。为了实现该功能，鼻和气道中的纤毛搅动沿着粘膜除去一层粘液以除去吸入的微粒和微生物。

纤毛抑制剂可用于本发明的方法和组合物以增加经粘膜(例如，鼻内)施用的此处公开的Y2受体结合肽、类似物和模拟物，及其他生物学活性剂的滞留期。具体地，通过一种或多种纤毛抑制剂的协同施用或组合配制，本发明方法和组合物内的这些试剂的传递在某些方面被显著增强了，该纤毛抑制剂可逆地抑制粘膜细胞的纤毛活动，以提供经粘膜传递的活性剂的滞留期的暂时的可逆增加。对于本发明的这些方面的应用，前面的纤毛抑制因子(它们的活性为特异的或间接的)都是以适当的量成功地用作纤毛抑制剂的候选者，从而它们在施用的粘膜部位产生粘膜纤毛清除的暂时(即可逆的)减少或停止以增强此处公开的Y2受体结合肽、类似物和模拟物，及其他生物学活性剂的传递，而没有不可接受的不利副作用。

在更详细的方面，特定纤毛抑制因子与此处公开的一种或多种Y2受体结合肽、蛋白质、类似物和模拟物，和/或其他生物学活性剂用于组合制剂中或者协同施用方案中。本发明的这些实施方案中可以使用文献中分离和表征的各种细菌纤毛抑制因子。从细菌绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)得到的纤毛抑制因子包括吩嗪衍生物、pyo化合物(2-烷基-4-羟基喹啉)，和鼠李糖酯(也称作溶血素)。Pyo化合物在50μg/ml的浓度下产生纤毛抑制而无明显的超结构损伤。吩嗪衍生物也抑制纤毛运动性但是导致一定的膜损伤(尽管是在更高浓度400μg/ml下)。气管外植体有限暴露于鼠李糖酯导致纤毛抑制，其与纤毛膜改变有关。更广泛地暴露于鼠李糖酯与从轴丝除去动力蛋白臂有关。

表面活性剂和方法

在本发明的更详细的方面，一种或多种膜渗透增强剂可用于本发明的粘膜传递方法或制剂以增强此处公开的Y2受体结合肽蛋白、类似物和模拟物，及其他生物活性剂的粘膜传递。在这方面膜渗透增强剂可以选自：(i)表面活性剂，(ii)胆汁盐，(ii)磷脂添加剂、混合微团、脂质体或载体，(iii)醇，(iv)烯胺，(v)NO供体化合物，(vi)长链两亲性分子，(vii)小疏水性渗透增强剂；(viii)钠或水杨酸衍生物；(ix)乙酰乙酸的甘油酯；(x)环糊精或β-环糊精衍生物；(xi)中链脂肪酸；(xii)螯合剂；(xiii)氨基酸或其盐；(xiv)N-乙酰氨基酸或其盐；(xv)对所选择的膜组分降解性的酶；(ix)脂肪酸合成的抑制剂；或(x)胆固醇合成抑制剂；或(xi)(i)-(x)的膜渗透增强剂的任一组合。

某些表面活性剂可以作为粘膜吸收增强剂容易地掺入本发明的粘膜传递制剂和方法。这些试剂可以与此处公开的Y2受体结合肽蛋白、类似物和模拟物，及其他生物活性剂协同使用或组合制备，这些试剂可以选自各种公知的表面活性剂。表面活性剂通常分成三类：(1)非离子型聚氧乙烯醚；(2)胆汁盐，如甘胆酸钠(SGC)和脱氧胆酸盐(DOC)；和(3)梭链孢酸的衍生物，如牛磺二氢梭链孢酸钠(STDHF)。这些各类表面活性剂的作用机理通常包括生物活性剂的增溶。对于通常形成聚集体的蛋白质和肽，这些吸收促进剂的表面活性性质可以允许与蛋白质相互作用从而更小的单位诸如表面活性剂包被的单体可以更容易地在溶液中保持。其他表面活性剂的实例为二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱(DDPC)聚山梨酯80和聚山梨酯20。这些单体通常是比聚集体更容易运输的单位。另一个可能的机理是肽或蛋白质受到保护而不被粘膜环境中的蛋白酶通过蛋白水解降解。据报道胆汁盐和一些梭链孢酸衍生物在小于或等于增强蛋白质吸收所需的浓度时抑制鼻匀浆对蛋白质的蛋白水解降解。这些蛋白酶抑制对于具有短的生物学半寿期的肽特别重要。

降解酶和脂肪酸和胆固醇合成的抑制剂

在本发明的相关方面，Y2受体结合肽蛋白、类似物和模拟物，和用于粘膜施用的其他生物活性剂与选自降解酶的渗透增强剂，或代谢刺激剂或脂肪酸、甾醇类合成的抑制剂或其他所选的上皮屏障组分(美国专利号6,190,894)配制或协同施用。例如，降解酶如磷脂酶、透明质酸酶、神经氨酸酶和软骨素酶可以用于增强Y2受体结合肽蛋白、类似物和模拟物，及其他生物活性剂的粘膜渗透而不导致对粘膜屏障的不可逆伤害。在一个实施方案中，软骨素酶被用于此处提供的方法或组合物以改变粘膜的渗透屏障的糖蛋白或糖酯成分，从而增强此处公开的Y2受体结合肽蛋白、类似物和模拟物，及其他生物活性剂的粘膜吸收。

关于粘膜屏障成分合成的抑制剂，注意到游离脂肪酸按重量计占上皮脂质的20-25％。游离脂肪酸的生物合成中的两种限速酶是乙酰CoA羧化酶和脂肪酸合成酶。通过一系列步骤，游离脂肪酸被代谢成磷脂。从而，用于本发明的方法和组合物中的游离脂肪酸合成和代谢的抑制剂包括，但不限于，乙酰CoA羧化酶的抑制剂，如5-十四氧基-2-呋喃羧酸(TOFA)；脂肪酸合成酶的抑制剂；磷脂酶A的抑制剂，如五味子醇B、2-(对-戊基肉桂基)氨基-4-(氯苯甲酸)、溴苯甲酰甲基溴、monoalide、7，7-二甲基-5，8-二十碳二烯酸、麦角溴烟酯、千金藤碱、尼卡地平、栎精、双丁酰-环腺苷酸、R-24571、N-油酰乙胺醇、N-(7-硝基-2，1，3-苯并噁二唑-4-基)磷脂酰丝氨酸、环孢菌素A，局部麻醉剂、包括地布卡因、普尼拉明、类维生素A，如全反式和13-顺式视黄酸、W-7、三氟拉嗪、R-24571(卡米达佐)、1-hexadocyl-3-三氟乙基丙三基-sn-2-磷薄荷醇(MJ33)；钙通道阻断剂，包括尼卡地平、维拉帕米、地尔硫、硝苯地平，和尼莫地平；抗疟药，包括阿的平、米帕林、氯喹和羟氯奎；β阻断剂，包括propanalol和拉贝洛尔；钙调蛋白拮抗剂；EGTA；硫柳汞；糖皮质类固醇，包括地塞米松和泼尼松龙；和非类固醇消炎剂，包括吲哚美辛和萘普生。

游离甾醇类，主要是胆固醇，按重量计占上皮脂质的20-25％。胆固醇的生物合成中限速酶是3-羟基-3-甲基戊二酰(HMG)CoA还原酶。用于本发明的方法和组合物的胆固醇合成的抑制剂包括，但不限于，(HMG)CoA还原酶的竞争性抑制剂，如辛伐他汀、洛伐他汀、氟伐他汀(氟伐地汀)、普伐他汀、美伐他汀，以及其他HMG辅酶A还原酶抑制剂，如胆固醇油酸酯、胆固醇硫酸酯和磷酸酯，和氧化甾醇类，如25-OH-和26-OH-胆固醇；角鲨烯合成酶抑制剂；角鲨烯环氧酶抑制剂；DELTA7或者DELTA24还原酶的抑制剂，如22，25-重氮胆固醇、20，25-重氮胆甾烯醇、AY9944，和曲帕拉醇。

脂肪酸合成的抑制剂或者固醇合成抑制剂的每一种都可与此处公开的一种或多种Y2受体结合肽蛋白、类似物和模拟物，及其他生物活性剂协同施用或组合配制以实现活性剂的增强的上皮渗透。用于粘膜传递的治疗或辅助制剂中固醇抑制剂的有效浓度范围为按总重量计约0.0001％到约20％，更典型地约0.01％到约5％。

一氧化氮供体剂和方法

在本发明的其他相关方面，选择一氧化氮(NO)供体作为膜渗透增强剂以增强此处公开的一种或多种Y2受体结合肽蛋白、类似物和模拟物，及其他生物活性剂的粘膜传递。各种NO供体是本领域中公知的并且以有效浓度用于本发明的方法和制剂中。代表性NO供体包括，但不限于，硝化甘油、硝普盐、NOC5[3-(2-羟基-1-(甲基-乙基)-2-亚硝基肼基)-1-丙烷胺]、NOC12[N-乙基-2-(1-乙基-羟基-2-亚硝基肼基)-乙烷胺]、SNAP[S-亚硝基-N-乙酰基-DL-青霉胺]、NORI和NOR4。在本发明的方法和组合物内，所选NO供体的有效量与此处公开的一种或多种Y2受体结合肽蛋白、类似物和模拟物，和/或其他生物活性剂协同施用或组合配制进入或穿过粘膜上皮。

调节上皮连接结构和/或生理的试剂

本发明提供了药物组合物，其含有一种或多种Y2受体结合肽蛋白、类似物和模拟物，和/或其他生物活性剂联合此处公开的粘膜传递增强剂，将它们以药物制剂配制用于粘膜传递。

渗透剂通常通过调节受试者中粘膜上皮表面的上皮连接结构和/或生理可逆地增强粘膜上皮细胞侧运输。该效应通常包括渗透剂抑制周围上皮细胞的上皮膜粘连蛋白之间的同型或异型结合。同型或异型结合的这种阻断的靶蛋白可以选自各种相关连接粘连分子(JAMs)、occludins或claudins。

在另外详细实施方案中，本发明提供了用于增强粘膜上皮细胞侧运输的渗透肽和肽类似物和模拟物。主题肽和肽类似物和模拟物通常通过调节哺乳动物受试者中上皮连接结构和/或生理而在本发明的组合物和方法中起作用。在一些实施方案中，肽和肽类似物和模拟物有效抑制选自连接粘连分子(JAMs)、occludins或claudins的上皮膜粘连蛋白的同型和/或异型结合。

被详尽研究的一种该试剂是来自霍乱菌(Vibrio cholerae)的称作“闭锁小带毒素”(zonula occludens toxin，ZOT)的细菌毒素。该毒素介导增加的肠粘膜渗透性并导致疾病症状，包括受感染的受试者的腹泻。Fasano等人，Proc.Nat.Acad.Sci.，U.S.A.，8：5242-5246(1991)。当在兔回肠粘膜上试验时，ZOT通过调节细胞间紧密连接的结构增加肠渗透性。最近，已经发现ZOT能够可逆地打开肠粘膜中的紧密连接。已经报导ZOT能够可逆地打开鼻粘膜中的紧密连接。美国专利号5,908,825。

在本发明的方法和组合物内，ZOT，以及作为ZOT活性的激动剂或拮抗剂的ZOT的各种类似物和模拟物可用于增强生物活性剂的鼻内传递——通过增加进入或穿过鼻粘膜的细胞侧吸收。在这方面，ZOT通常通过导致紧密连接的结构重新组织起作用，紧密连接的结构重新组织的标志是连接蛋白ZO1的定位改变。在本发明的这些方面，ZOT与生物活性剂以有效量协同施用或组合配制，通过可逆地增加鼻粘膜渗透性产生该活性剂的显著增强的吸收而无实质的不利副作用。

血管舒张剂和方法

在本发明的协同施用和组合配制方法和组合物中显示出有益效用的另一类吸收促进剂是血管活性化合物，更具体地血管舒张剂。这些化合物在本发明内起作用而调节粘膜下层脉管系统的结构和生理，增加Y2受体结合肽、类似物和模拟物及其他生物活性剂进入或穿过粘膜上皮和/或到达特定靶标组织或隔室(例如，系统循环或中枢神经系统)的运输速度。

用于本发明的血管舒张剂典型地通过胞浆钙的降低、一氧化氮(NO)增加，或通过抑制肌球蛋白轻链激酶导致粘膜下层血管松弛。它们通常被分成9类：钙拮抗剂、钾通道打开剂、ACE抑制剂、血管紧张肽-II受体拮抗剂、α-肾上腺素能和咪唑受体拮抗剂、β1-肾上腺素能激动剂、磷酸二酯酶抑制剂、类二十烷酸和NO供体。

尽管在化学上不同，但是钙拮抗剂的药物动力学性质是类似的。这些试剂向全身循环的吸收是高的，并且这些试剂因此经历肝脏的初次通过代谢，导致药物动力学的个体差异。除了二氢吡啶型的更新的药物(氨氯地平、非洛地平、伊拉地平、尼伐地平、尼索地平和尼群地平)，钙拮抗剂的半寿期是短的。因此，为了保持有效药物浓度，这些钙拮抗剂的许多都需要通过多剂量，或者控释制剂传递，如本文别处描述的。由于可能的不利副作用，使用钾通道开放剂米诺地尔的治疗在方式和施用水平上可能也受到限制。

ACE抑制剂防止血管紧张肽-I向血管紧张肽-II的转化，并且当肾素产生增加时最有效。因为ACE与激肽酶-II(其使有效内源血管舒张剂缓激肽失活)相同，所以ACE抑制导致缓激肽降解减少。ACE抑制剂通过防止和逆转动物模型中心纤维样变性和室性肥大而提供了心脏保护和心修复的另外益处。大多数ACE抑制剂的主要清除途径是通过肾排泄。因此，肾损伤与清除减小有关并且推荐在具有中度或严重肾损伤的患者中剂量减少25到50％。

关于NO供体，这些化合物由于它们对粘膜渗透性的另外影响而尤其有效用于本发明。除了上面提到的NO供体，被称为NO/亲核试剂或者NONOates的NO与亲核试剂的复合体当溶于生理pH下的水性溶液时自发或非酶促地释放NO。相比，含硝基的血管舒张剂如硝化甘油需要特定酶活性以释放NO。NONOates以明确的化学剂量和可以预测的速度释放NO，对于二乙胺/NO，释放速度为＜3分钟，对于二亚乙基三胺/NO(DETANO)，释放速度为约20小时。

在本发明的一些方法和组合物中，所选的血管舒张剂与一种或多种Y2受体结合肽、类似物和模拟物及其他生物活性剂以有效量协同施用(例如，全身地或鼻内，同时或组合有效的暂时结合)或者组合配制以增强活性剂的粘膜吸收而到达受试者中的靶标组织或隔室(例如，肝、肝门静脉、CNS组织或流体，或血浆)。

选择性运输-增强剂和方法

本发明的组合物和传递方法任选掺入一种选择性运输增强剂，其促进一种或多种生物活性剂的运输。这些运输增强剂可以与一种或多种Y2受体结合肽蛋白、此处公开的类似物和模拟物用于组合制剂或协同施用方案以协同地增强一种或多种另外的生物活性剂穿过粘膜运输屏障的传递，增强活性剂到达受试者中靶标组织或隔室(例如，粘膜上皮、肝、CNS组织或液体，或血浆)的粘膜传递。备选地，运输增强剂可用于组合制剂或协同施用方案中以直接增强一种或多种Y2受体结合肽蛋白、类似物和模拟物的粘膜传递，另外的生物活性剂的传递被增强或不被增强。

用于本发明的该方面的代表性选择性运输增强剂包括，但不限于，糖苷、含有糖的分子，和结合剂，诸如凝集素结合剂，公知它们与上皮运输屏障组分特异相互作用。例如，特异“生物粘附”配体包括各种植物和细菌凝集素，它们通过受体介导的相互作用结合细胞表面糖部分，这些“生物粘附”配体可用作载体或偶联的运输介质以增强本发明中生物活性剂的粘膜(例如鼻)传递。用于本发明的某些生物粘性配体将介导生物信号向上皮靶细胞的传递，这些上皮靶细胞通过专门的细胞运输过程(内吞或胞转)触发粘附配体的选择性吸收。因此这些运输介质可用作“载体系统”以刺激或指导一种或多种Y2受体结合肽蛋白、类似物和模拟物及其他生物活性剂进入和/或通过粘膜上皮的选择性吸收。这些及其他选择性运输增强剂显著增强本发明内大分子生物药物(尤其肽、蛋白质、寡核苷酸和多核苷酸载体)的粘膜传递。凝集素是植物蛋白，它们结合在真核细胞的糖蛋白和糖酯表面上发现的特定糖。凝集素的浓溶液具有“mucotractive”作用，各种研究已经表明凝集素和凝集素偶联物(例如，伴刀豆蛋白A与胶体金颗粒偶联)穿过粘膜表面的快速受体介导的内吞(RME)。其他研究已经报导凝集素的摄取机理可用于体内肠药物靶定。在这些研究的某些研究中，聚苯乙烯纳微粒(500nm)与番茄凝集素共价偶联并被报导被经口施用于大鼠后产生改善的全身性摄取。

除了植物凝集素，微生物粘附和侵染因子提高了用作本发明的粘膜传递方法和组合物中粘附/选择性运输载体的候选者的丰富来源。两种组分是细胞粘附过程必要的：细菌“粘附素”(粘附或定居因子)和宿主细胞表面上的受体。细菌导致粘膜感染在它们粘附上皮表面前需要穿透粘液层。该粘附通常受到细菌纤毛或菌毛结构的介导，尽管其他细胞表面组分也可以参加该过程。粘附的细菌通过增殖并通过信号转导机理(有或无毒素的帮助)在靶细胞中启动一系列生化反应而在粘膜上皮定居。公知由各种细菌和病毒最初产生的各种生物粘附蛋白(例如，侵染素、internalin)与这些侵染机理有关。这些生物粘附蛋白允许这些微生物的细胞外附着对宿主种类和甚至特定靶组织具有令人难忘的选择性。通过这些受体-配体相互作用传递的信号触发通过内吞和胞转过程使完整的活的微生物被运输进入，并最后穿过上皮细胞。根据此处的教导可以利用(例如，通过将生物活性剂如Y2受体结合肽与粘附素络合)这些天然存在的现象以增强生物活性化合物的传递而进入或穿过粘膜上皮和/或到达药物作用的其他指定的靶标部位。

在本发明的方法和组合物内也可以使用以特异的、类似凝集素的方式结合上皮表面的各种细菌和植物毒素。例如，白喉毒素(DT)通过RME快速进入宿主细胞。同样，大肠杆菌热不稳定毒素的B亚单位以高度特异的、类似凝集素的方式结合肠上皮细胞的刷状缘。已经报导该毒素体内和体外被摄取并胞转到肠细胞的基底外侧边。其他研究人员已经将白喉毒素的跨膜结构域在大肠杆菌中作为麦芽糖结合融合蛋白表达并将其化学偶联到高分子量聚-L-赖氨酸。所得复合物被成功用于介导体外报导基因的内部化。除了这些实例，金黄色葡萄球菌(Staphylcoccus aureus)产生一组蛋白(例如，葡萄球菌肠毒素A(SEA)、SEB、毒性休克综合症毒素1(TSST-1))，它们同时作为超级抗原和毒素起作用。关于这些蛋白质的研究已经报导了Caco-2细胞中SEB和TSST-I的依赖剂量的促进的胞转。

病毒血细胞凝集素含有另一类型运输剂以促进本发明的方法和组合物内的生物活性剂的粘膜传递。许多病毒感染中的最初步骤是表面蛋白(血细胞凝集素)与粘膜细胞的结合。已经为大多数病毒鉴定了这些结合蛋白，这些病毒包括轮状病毒、水痘带状疱疹病毒、semliki森林病毒、腺病毒、马铃薯卷叶病毒和呼肠孤病毒。这些及其他代表性病毒血细胞凝集素可以与此处公开的一种或多种Y2受体结合肽、类似物和模拟物用于组合制剂(例如，混合物或偶联物制剂)或者协同施用方案以协同地增强一种或多种另外的生物活性剂的粘膜传递。备选地，病毒血细胞凝集素可用于组合制剂或协同施用方案以直接增强一种或多种Y2受体结合肽、类似物和模拟物的粘膜传递，并且另外的生物活性剂的传递被或不被增强。

各种内源选择性运输介导因子也可用于本发明。哺乳动物细胞已经发展了一类机制以促进特定底物的内化和将这些底物靶定到限定的隔室。总起来说，膜变形的这些过程被称为“内吞”并且包括吞噬、胞饮、受体介导的内吞(网格蛋白介导的RME)，和摄液作用(非-网格蛋白-介导的RME)。RME是高度特异的细胞生物过程，通过该过程，如其名称所暗示的，各种配体结合到细胞表面受体并随后被内化和在细胞内运输。在许多细胞中，内吞过程如此活跃以致全部膜表面都被内化并在小于半小时内被置换。基于它们在细胞膜中的定向提出了两类受体；I型受体的氨基末端位于膜的细胞外侧上，而II型受体使该相同蛋白尾部嵌入细胞内环境中。

本发明的还有的实施方案利用转铁蛋白作为经粘膜传递的生物活性剂的RME的载体或者刺激剂。转铁蛋白是一种80kDa的铁转运糖蛋白，通过RME被有效摄入细胞内。在多数增殖细胞的表面上、许多成红细胞和许多类型的肿瘤上发现转铁蛋白。据报导在一种真菌代谢物布雷菲德菌素A(BFA)的存在下，转铁蛋白(Tf)和转铁蛋白偶联物的胞转被增强。在其他研究中，已经报导BFA处理快速增加MDCK细胞中蓖麻毒蛋白和HRP的顶端内吞。从而，BFA和刺激受体介导的转运的其他试剂可用于本发明的方法中作为组合配制的(例如，偶联的)和/或协同施用的试剂以增强生物活性剂(包括Y2受体结合肽蛋白、类似物和模拟物)的受体介导的运输。

聚合传递载体和方法

在本发明的某些方面，此处公开的Y2受体-结合肽蛋白、类似物和模拟物，其他生物活性剂，和如上面描述的传递增强剂单独或者联合掺入经粘膜(例如，经鼻)施用的制剂，该制剂含有作为载体或基质的生物相容的聚合物。这种聚合物载体包括聚合粉末、基质或微粒传递载体，以及其他聚合物形式。该聚合物可以来自植物、动物或合成来源。通常，该聚合物是交联的。此外，在这些传递载体中，Y2受体结合肽、类似物或模拟物可以以某种方式功能化，通过该方式Y2受体结合肽、类似物或模拟物可以共价结合该聚合物并且使得不能通过简单洗涤与该聚合物分开。在其他实施方案中，聚合物被酶抑制剂或其他试剂修饰，该酶抑制剂或其他试剂可以降解或钝化生物活性剂和/或传递增强剂。在某些制剂中，聚合物为部分或完全水不溶但是水可膨胀的聚合物，例如，水凝胶。希望用于本发明的该方面的聚合物本质上是水相互作用的和/或亲水的以吸收大量水，并且当它们与水或水性介质接触一段时间以达到与水的平衡时通常形成水凝胶。在更详细的实施方案中，聚合物是水凝胶，其当与过量水接触时，当室温下暴露于水时吸收至少两倍其重量的水(美国专利号6,004,583)。

在许多生物医学应用中优选基于生物可降解的聚合物的药物传递系统，因为这些系统通过水解或通过酶反应被分解成无毒分子。通过操作生物可降解的聚合物基质的组成可以控制降解速度。因此这些类型的系统可用于某些设置中以长期释放生物活性剂。生物可降解的聚合物如聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸)(PLA)，和聚(D，L-乳-共-乙醇酸)(PLGA)作为可能的药物传递载体已经受到的大量关注，因为已经发现这些聚合物的降解产物是低毒性的。在身体的正常代谢功能期间，这些聚合物被降解成二氧化碳和水。这些聚合物还显示出优秀的生物相容性。

为了延长此处公开的Y2受体结合肽、类似物和模拟物，及其他生物活性剂以及任选的传递增强剂的生物活性，可以将这些试剂掺入聚合基质，例如，聚原酸酯、聚酸酐，或聚酯。这产生了活性剂的持续活性和释放(例如，如通过聚合物基质的降解所确定的)。尽管将生物治疗分子包封在合成的聚合物中可以在保存和传递期间使它们稳定，但是基于聚合物释放技术的最大的障碍是制备过程期间治疗分子的活性损失，这些制备过程通常包括加热、超声处理或有机溶剂。

预期用于本发明的促进吸收的聚合物包括前面类型的聚合物的衍生物和化学或物理修饰的形式，以及其他天然存在的或合成的聚合物、树胶、树脂，及其他试剂，以及这些材料相互之间或与其他聚合物的混合物，只要该改变、修饰或混合不会不利地影响有用的应用所希望的性质，如水吸收、水凝胶形成、和/或化学稳定性。在本发明的更详细方面，通过反应可以使聚合物诸如尼龙、acrylan及其他通常疏水的合成聚合物被足够修饰而变得水可膨胀和/或在水性介质中形成稳定的凝胶。

本发明的吸收促进聚合物可以包括来自均聚物和共聚物的聚合物，这些均聚物和共聚物基于下面的乙烯基单体的各种组合：丙烯酸和甲基丙烯酸、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、羟乙基丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯、乙烯基吡咯烷酮，以及聚乙烯醇及其共聚物和三聚物、聚乙烯基乙酸，其与上面所列的单体和2-丙烯酰胺-2-甲基-丙磺酸(AMPS)的共聚物和三聚物。非常有用的是上面所列的单体与可以共聚的功能单体的共聚物，这些功能单体为诸如丙烯基或甲基丙烯酰胺丙烯酸或甲基丙烯酸酯，其中酯基团来自直链或支链的烷基、具有可达4个芳环的芳基，这些芳香环可以含有1到6个碳的烷基取代基；类固醇、硫酸酯、磷酸酯或阳离子单体，如N，N-二甲基氨基烷基(甲)丙烯酰胺、二甲基氨基烷基(甲)丙烯酸、(甲)丙烯氧基烷基三甲基氯化铵、(甲)丙烯氧基烷基二甲基苯甲基氯化铵。

用于本发明的另外的吸收促进剂为葡聚糖、糊精类，和天然树胶和树脂类，或者天然聚合物如加工的胶原蛋白、壳多糖、壳聚糖、pullalan、zooglan、藻酸盐和改性的藻酸盐，如“Kelcoloid”(一种聚丙二醇改性的藻酸盐)，gellan树胶，如“Kelocogel”、黄原胶，如“Keltrol”、estastin、α-羟基丁酸及其共聚物、透明质酸及其衍生物、乳酸和乙醇酸的聚合物。

可用于本发明的一类非常有用的聚合物是烯不饱和羧酸，它们含有至少一个活化的碳-碳烯双键，和至少一个羧基；即，酸或官能团，其可容易地转化成含有烯双键的酸，该烯双键由于其存在于单体分子而可以在聚合作用中容易起作用，在羧基中，该烯双键存在于α-β位置，或者作为末端亚甲基基团的部分。这类烯不饱和酸包括诸如通过丙烯酸自身代表的丙烯酸、α-氰基丙烯酸、β甲基丙烯酸(巴豆酸)、α-苯基丙烯酸、β-丙烯氧基丙酸、肉桂酸、对-氯肉桂酸、1-羧基-4-苯基丁二烯-1，3、衣康酸、柠康酸、甲基延胡索酸、戊烯二酸、乌头酸、马来酸、富马酸，和三羧基乙烯。如此处所用的，术语“羧酸”包括聚羧酸和那些酸酐，如马来酸酐，其中通过从位于相同羧酸分子上的两个羧基消去一分子水形成酸酐。

用作本发明内的吸收促进剂的代表性丙烯酸酯包括丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸异丙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸异丁酯、甲基丙烯酸甲酯、乙基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、丙烯酸辛酯、丙烯酸庚酯、甲基丙烯酸辛酯、甲基丙烯酸异丁酯、甲基丙烯酸2-乙基己酯、丙烯酸壬酯、丙烯酸己酯、甲基丙烯酸正己酯，等等。更高级丙烯酸烷基酯为丙烯酸癸酯、甲基丙烯酸异癸酯、丙烯酸十二酯、丙烯酸十八酯、丙烯酸二十二酯、丙烯酸三十酯及其甲基丙烯酸酯。两种或三种或更多长链丙烯酸酯的混合物可以与一种羧酸单体成功地聚合。其他共聚单体包括烯烃，包括α烯烃、乙烯醚、乙烯酯和它们的混合物。

其他亚乙烯基单体(包括丙烯酸腈)也可用作本发明的方法和组合物内的吸收促进剂以增强一种或多种Y2受体结合肽蛋白、类似物和模拟物及其他生物活性剂的传递和吸收，包括增强活性剂向受试者中的靶组织或隔室(例如，肝、肝门静脉、CNS组织或流体，或者血浆)传递活性剂。有用的α、β-烯不饱和腈优选为具有3到10个碳原子的单烯属不饱和腈，如丙烯腈、甲基丙烯腈，等等。最优选的为丙烯腈和甲基丙烯腈。还可以使用含有3到35个碳原子的丙烯酰胺，如单烯不饱和酰胺。代表性酰胺包括丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、N-叔丁基丙烯酰胺、N-环己基丙烯酰胺、更高级烷基酰胺，其中N上的烷基含有8到32个碳原子；丙烯酰胺，包括α、β-烯属不饱和羧酸的N-烷基醇酰胺，包括具有4到10个碳原子的N-烷基醇酰胺，如N-羟甲基丙烯酰胺、N-丙醇丙烯酰胺、N-甲基醇甲基丙烯酰胺、N-甲基醇马来酰亚胺、N-甲基醇马来酰胺酸酯、N-甲基醇-对-乙烯基苯甲酰胺，等等。

还有用的吸收促进剂材料为α-烯烃，其含有2到18个碳原子，更优选2到8个碳原子；二烯类，其含有4到10个碳原子；乙烯酯和丙烯基酯，如乙酸乙烯酯；乙烯芳香烃，如苯乙烯、甲基苯乙烯和氯-苯乙烯；乙烯基和烯丙基醚和酮，如乙烯基甲基醚和甲基乙烯基酮；氯丙烯酸酯；丙烯酸氰烷基酯，如丙烯酸α-氰甲酯，和丙烯酸α-、β-、和γ-氰丙酯；烷氧基丙烯酸酯，如丙烯酸甲氧基乙酯；卤代丙烯酸酯，如丙烯酸氯乙酯；卤乙烯和氯乙烯、偏二氯乙烯等等；二乙烯、二丙烯酸酯及其他多官能单体如二乙烯醚、二丙烯酸二甘醇酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、亚甲基-二-丙烯酰胺、烯丙基季戊四醇，等等；和膦酸二(β-卤烷基)链烯酯，如膦酸二(β-氯乙基)乙烯酯，和本领域中技术人员公知的那些。按照此处公开的方法容易制备共聚物，其中含有羧基的单体是少数取代基，并且其他亚乙烯基单体作为主要组分存在。

当水凝胶被用作本发明的吸收促进剂时，它们可以由合成共聚物组成，这些共聚物来自丙烯酸和甲基丙烯酸、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、羟乙基丙烯酸酯(HEA)或甲基丙烯酸酯和乙烯基吡咯烷酮的共聚物，它们是水相互作用的和可膨胀的。有用的聚合物，特别用于传递肽或蛋白质的特定阐明性实例为下面类型的聚合物：(甲)丙烯酰胺和0.1到99wt％(甲)丙烯酸；(甲)丙烯酰胺和0.1-75wt％(甲)丙烯氧基乙基三甲基氯化铵；(甲)丙烯酰胺和0.1-75wt％(甲)丙烯酰胺；丙烯酸和0.1-75wt％烷基(甲)丙烯酸；(甲)丙烯酰胺和0.1-75wt％AMPS.RTM(Lubrizol Corp.的商标)；(甲)丙烯酰胺和0-30wt％烷基(甲)丙烯酰胺和0.1-75wt％AMPS.RTM；(甲)丙烯酰胺和0.1-99wt％HEMA；(甲)丙烯酰胺和0.1-75wt％HEMA和0.1到99％(甲)丙烯酸；(甲)丙烯酸和0.1-99wt％HEMA；50摩尔％乙烯醚和50摩尔％马来酸酐；(甲)丙烯酰胺和0.1-75wt％(甲)丙烯氧基烷二甲基苄基氯化铵；(甲)丙烯酰胺和0.1-99wt％乙烯基吡咯烷酮；(甲)丙烯酰胺和50wt％乙烯基吡咯烷酮和0.1-99.9wt％(甲)丙烯酸；(甲)丙烯酸和0.1到75wt％AMPS.RTM和0.1-75wt％烷基(甲)丙烯酰胺。在上面的实施例中，烷基指C₁到C₃₀，优选C₁到C₂₂，直链和支链的和C₄到C₁₆环状的；其中使用(甲)，它表示包括有或没有甲基的单体。其他非常有用的水凝胶聚合物是聚(乙烯基吡咯烷酮)淀粉、羧甲基纤维素和聚乙烯醇的可膨胀的，但是不可溶的形式。

可用于本发明的另外的聚合的水凝胶材料包括(聚)羟烷基(甲)丙烯酸：阴离子酸和阳离子水凝胶：聚(电解质)复合物；具有低乙酸残基的聚(乙烯醇)：交联琼脂和交联羧甲基纤维素的可膨胀混合物：含有甲基纤维素与少量交联琼脂的混合的可膨胀组合物；通过将马来酸酐与苯乙烯、乙烯、丙烯、或异丙烯的细碎共聚物分散产生的水可膨胀的共聚物；N-乙烯基内酰胺的水可膨胀的聚合物；羧甲基纤维素的可膨胀的钠盐；等等。

用于形成亲水的水凝胶以经粘膜传递本发明的生物活性剂的其他可形成凝胶的、吸收并保留流体的聚合物包括果胶；多糖，如琼脂、阿拉伯胶、刺梧桐树胶、西黄蓍胶、藻胶和瓜尔胶和它们的交联形式；丙烯酸聚合物、共聚物和盐衍生物、聚丙烯酰胺；水可膨胀的茚马来酸酐聚合物；淀粉接枝共聚物；丙烯酸型聚合物和共聚物，其水吸收性为其最初重量的约2到400倍；聚葡聚糖的二酯；交联聚(乙烯醇)和聚(N-乙烯基-2-吡咯烷酮)的混合物；聚氧化丁烯-聚乙烯嵌段共聚物凝胶；角豆树胶；聚酯凝胶；聚脲凝胶；聚醚凝胶；聚酰胺凝胶；聚酰亚胺凝胶；多肽凝胶；聚氨基酸凝胶；聚纤维素凝胶；交联的茚-马来酸酐丙烯酸酯聚合物；和多糖。

通过几种单体以几种比例的无限组合可以制备用于本发明的合成的水凝胶聚合物。水凝胶可以被交联并且通常能够吸收液体并膨胀或扩大到放大的平衡态。水凝胶通常在传递到鼻粘膜表面时膨胀或扩大，吸收的水为其重量的约2-5、5-10、10-50、高达50-100或更高倍。给定水凝胶的最佳膨胀程度将由不同生物活性剂确定，取决于诸如被该聚合物携带或捕获或包封的活性剂的分子量、大小、溶解度和扩散特征，和与每种个别聚合物相关的特定间隔和合作的链运动。

用于本发明的亲水聚合物为水不溶但是水可膨胀的。这些水膨胀的聚合物通常被称为水凝胶或凝胶。通过用适当的交联剂交联聚合物的方法可以从水可溶的聚合物方便地制备这些凝胶。然而，根据本领域中公知的方法，在pH、温度和/或离子浓度的限定条件下从特定聚合物也可以形成稳定的水凝胶。通常，聚合物被交联，即，交联到一定程度使得聚合物具有良好的亲水性质，具有改善的物理完整性(与相同或类似类型的非交联的聚合物相比)并且显示出能够更好地将目标生物活性剂和与其共同施用的另外化合物如细胞因子或酶抑制剂保留在凝胶网络内，而保持在适当的位置和时间释放活性剂的能力。

通常，用于本发明的水凝胶聚合物通过双功能交联与0.01到25重量百分数(基于形成共聚物的单体的重量)，更优选0.1到20重量百分数，更通常0.1到15重量百分数的交联剂交联。交联剂的另一有用的量为0.1到10重量百分数。还可以使用三、四或更高多功能交联剂。当使用这些试剂时，可能需要较低的量以达到相当的交联密度，即，交联程度，或者网络性质，这些网络性质足够有效含有生物活性剂。

交联剂可以是共价键、离子键或氢键，所得到的聚合物能够在含有水的流体的存在下膨胀。这些交联剂和交联反应是本领域中技术人员公知的并且在许多情况中依赖于聚合物系统。从而，通过不饱和单体的自由基共聚可以形成交联网络。通过交联预先形成的聚合物，将该聚合物上发现的官能团如醇、酸、胺与诸如乙二醛、甲醛或戊二醛，二酸酐等等反应也可以形成聚合的水凝胶。

聚合物也可以与任一多烯交联，该多烯为例如，癸二烯或三乙烯基环己烷；丙烯酰胺，如N，N-亚甲基-二(丙烯酰胺)；多功能丙烯酸，如三甲基醇丙烷三丙烯酸；或含有至少2个末端CH₂＜基团的多功能亚乙烯基单体，包括，例如，二乙烯基苯、二乙烯基萘、丙烯酸烯丙酯、等等。在一些实施方案中，用于制备共聚物的交联单体为每个分子具有一个以上链烯基醚的聚链烯基聚醚，其可以任选具有链烯基，其中烯属双键附着到末端亚甲基(例如，通过含有至少2个碳原子和至少2个羟基的多元醇的醚化)。将卤代烯烃，如烯丙基氯或烯丙基溴与一种或多种多元醇的强碱性水性溶液反应可以产生这类化合物。产物可以是具有不同数目的醚基团的聚醚的复杂混合物。聚醚交联剂的效率随着该分子上潜在可聚合基团的数目增加。通常，使用每个分子含有平均2个或多个链烯醚基团的聚醚。其他交联单体包括例如，己二烯酯、二甲代烯丙基醚、丙烯酸烯丙酯或甲代烯丙酯和丙烯酰胺、四乙烯基硅烷、聚链烯基甲烷、二丙烯酸酯和二甲基丙烯酸酯、二乙烯基化合物，如二乙烯基苯、磷酸聚烯丙酯、二烯丙氧基化合物和亚磷酸酯，等等。典型的试剂为季戊四醇烯丙酯、蔗糖烯丙酯、三丙烯酸三甲基醇丙酯、二丙烯酸1，6-乙二酯、三甲基醇丙烷二烯丙基醚、三丙烯酸季戊四醇、二甲基丙烯酸四亚甲酯、二丙烯酸乙烯酯、二甲基丙烯酸乙烯酯、二甲基丙烯酸三乙二醇酯，等等。季戊四醇烯丙酯、三甲基醇丙烷二烯丙醚和烯丙基蔗糖提供了适当的聚合物。当存在交联剂时，聚合混合物通常含有约0.01到20重量百分比，例如，按重量计1％、5％、或10％或以上交联单体(基于羧酸单体加上其他单体的总重量)。

在本发明的更详细的方面，通过将活性剂保留在缓释或者酶或生理保护性载体或赋形剂，例如水凝胶中增强了此处公开的Y2受体结合肽、类似物和模拟物，及其他生物活性剂的粘膜传递，这些载体和赋形剂保护活性剂免受降解酶的作用。在某些实施方案中，通过化学方法将活性剂结合到载体和赋形剂，该载体和赋形剂也可以混合或结合其他试剂，如酶抑制剂、细胞因子，等等。通过在载体或赋形剂，例如，聚合物基质内足够的物理捕获也可以备选地固定活性剂。

用于本发明的聚合物诸如水凝胶可以掺入功能交联剂，如糖苷，该功能交联剂通过化学方法掺入聚合物以增强与其配制的活性剂的鼻内生物利用度。这些糖苷的实例为葡糖苷、果糖苷、半乳糖苷、阿拉伯糖苷、甘露糖苷和它们的烷基取代的衍生物和天然糖苷，如熊果苷、根皮苷、苦杏仁苷、毛地黄皂苷、皂角苷，和β-吲哚硫酸钾。有若干方法可用于将典型的糖苷结合到聚合物。例如，糖苷或其他类似糖的羟基的氢可以被来自水凝胶聚合物的烷基置换形成醚。而且，糖苷的羟基可以反应以酯化聚合物水凝胶的羧基而原位形成聚合酯。另一方法是使用乙酰溴葡糖与胆甾-5-烯-3β-醇在马来酸的共聚物上的缩合。通过活化聚合物与ω-氨基烷基糖苷的反应可以合成N-取代的聚丙烯酰胺：(1)(糖-间隔臂)(n)-聚丙烯酰胺，“假多糖”；(2)(糖间隔臂)(n)-磷脂酰乙醇胺(m)-聚丙烯酰胺，新糖酯，磷脂酰乙醇胺的衍生物；(3)(糖-间隔臂)(n)-生物素(m)-聚丙烯酰胺。这些生物素化衍生物可以粘附到粘膜表面上的凝集素以促进生物活性剂(例如，聚合物包封的Y2受体结合肽)的吸收。

在本发明的更详细方面，如此处公开的一种或多种Y2受体结合肽、类似物和模拟物，和/或其他生物活性剂，任选包括次级活性剂如蛋白酶抑制剂、细胞因子、细胞间连接生理的另外的调节剂，等等，被修饰并结合到聚合物载体或基质。例如，这可以通过将肽或蛋白活性剂和其他任选试剂结合在交联的聚合物网络内实现。还可能用反应试剂如含有糖苷的分子通过化学方法单独修饰该聚合物。在某些方面，生物活性剂和任选次级活性剂可以被官能化，即，其中适当的反应基团被鉴定或者通过化学方法加到该活性试剂。更通常，加入乙烯可聚合基团，然后使用标准聚合方法将功能化活性剂与单体和交联剂共聚，该标准聚合方法为诸如溶液聚合(通常在水中)、乳化、悬浮或分散聚合。通常，提供的功能化试剂具有足够高浓度的功能或可聚合的基团以确保活性剂上的一些位点被功能化。例如，在含有16个胺位点的多肽中，通常希望将这些位点的至少2、4、5、7和高达8个和以上的位点功能化。

功能化后，将功能化活性剂与单体和交联剂混合，该单体和交联剂包括目标聚合物从中形成的试剂。然后在该介质中诱导聚合以产生含有结合的活性剂的聚合物。然后用水及其他适当溶剂洗涤聚合物或者将其纯化以除去痕量未反应的杂质，和如果必要，通过物理方法如搅拌研磨和破碎，强迫其通过网眼，超声处理及其他适当的方法以得到所希望的颗粒大小。然后以如此方式除去溶剂，通常水，使得不变性或者降解活性剂。一种希望的方法是冻干(冰冻干燥)，但是可以得到并使用其他方法(例如，真空干燥、空气干燥、喷雾干燥，等等)。

为了在本发明的肽、蛋白质及其他活性剂中导入可聚合的基团，可以将可利用的氨基、羟基、硫醇及其他反应基团与含有不饱和基团的亲电试剂反应。例如，含有N-羟基琥珀酰亚胺基(succinimidyl)基团的不饱和单体、活性碳酸酯，如碳酸对-硝基苯酯、碳酸三氯苯酯、tresylate、氧基羰基咪唑、环氧化物、异氰酸酯和醛和不饱和羧甲基叠氮化物和不饱和原吡啶基-二硫化物属于这类试剂。不饱和试剂的阐明性实例为烯丙基缩水甘油醚、烯丙基氯、烯丙基溴、烯丙基碘、丙烯酰氯、异氰酸烯丙酯、烯丙基磺酰氯、马来酸酐、马来酸酐和烯丙醚的共聚物，等等。

除了醛之外，所有赖氨酸活性衍生物通常可以与其他氨基酸如组氨酸的咪唑基和酪氨酸的羟基和胱氨酸的硫醇基反应，如果局部环境增强了这些基团的亲和性的话。含有功能化试剂的醛对赖氨酸特异。与可以从赖氨酸、半胱氨酸、酪氨酸可以得到的的基团的这些类型的反应已经在文献中详细记载并且是本领域技术人员公知的。

对于含有胺基团的生物活性剂，方便的是将这些基团与酰基酰氯，如丙烯酰氯反应，并向反应试剂上导入可聚合的丙烯酸基团。然后在聚合物的制备期间，如丙烯酰胺和丙烯酸的共聚物的交联期间，功能化活性剂通过丙烯酸基团附着到该聚合物上并与之结合。

在本发明的另外方面，通过将一种和多种活性剂共价结合聚合物可以将生物活性剂，包括肽、蛋白质、核苷、和具有体内生物活性的其他分子偶联稳定，该聚合物掺入亲水部分，例如，直链聚烷撑二醇、亲脂部分作为其整体部分(见，例如，美国专利号5,681,811)。一方面，生物活性剂共价偶联含有(i)直链聚烷撑二醇部分和(ii)亲脂部分的聚合物，其中活性剂、直链聚烷撑二醇部分和亲脂部分相互构象排列从而活性治疗剂对酶降解具有增强的体内抗性(即，相对于没有偶联的聚合物的未偶联形式下其在类似条件下的稳定性)。另一方面，偶联稳定的制剂具有三维构象，其包含与聚山梨酯偶联的生物活性剂复合体，该复合体含有(i)直链聚烷撑二醇部分和(ii)亲脂部分，其中活性剂、直链聚烷撑二醇部分和亲脂部分相互构象地排列从而(a)在三维构象中可以在表面利用亲脂部分，和(b)组合物中的活性剂具有对酶降解的增强的体内抗性。

在另一相关方面，提供了多配体偶联的复合体，其含有生物活性剂，该生物活性剂通过在甘油三酯主链部分的碳原子上结合的聚烷撑二醇间隔臂基团与该甘油三酯主链部分共价偶联，和至少一个脂肪酸部分，该脂肪酸部分直接共价附着到甘油三酯主链部分的碳原子或者通过聚烷撑二醇间隔臂部分共价连接(见，例如，美国专利号5,681,811)。在这种多配体偶联的治疗剂复合体中，甘油三酯生物活性部分的α和β碳原子可以具有脂肪酸部分，该脂肪酸部分通过共价结合直接连接到该碳原子，或者通过聚烷撑二醇间隔臂部分间接共价连接到该碳原子。备选地，脂肪酸部分可以直接或者通过聚烷撑二醇间隔臂部分共价连接到甘油三酯主链部分的α和α’碳原子，生物活性治疗剂与甘油三酯主链部分的γ碳共价偶联，该共价偶联是直接共价连接到该碳原子或者通过聚烷撑二醇间隔臂部分间接连接到该碳原子。应当认识到在本发明范围内，含有甘油三酯主链部分的多配体偶联的治疗剂复合体可能具有各种结构的、组成的、和构象的形式。还注意到在这种多配体偶联的治疗剂复合体中，在本发明范围内，生物活性剂可以有利地通过烷基间隔臂基团，或者备选地其他可接受的间隔臂基团共价偶联甘油三酯修饰的主链部分。如这种背景中所用的，间隔臂基团的可接受性指立体的、组成的，和最终应用特异的可接受性特征。

在本发明的另外方面，提供了偶联稳定的复合体，其包括聚山梨酯复合体，该复合体含有聚山梨酯部分，该聚山梨酯部分包含甘油三酯主链，该主链的α、α’和β碳原子被共价偶联功能化基团，这些功能化基团包括(i)脂肪酸基团；和(ii)聚乙二醇基团，这些基团共价结合生物活性剂或者部分，例如，结合到聚乙二醇基团的适当的官能团。这种共价结合可以是直接的，例如，结合到聚乙二醇基团的羟基末端官能团，或者备选地，该共价结合可以是间接的，例如，通过聚乙二醇基团的羟基末端与末端羧基官能团间隔臂基团的反应性帽化，从而所得帽化聚乙二醇基团具有末端羧基官能团，生物活性剂和部分可以共价结合该末端羧基。

在本发明的另外方面，提供了稳定的、水可溶的、偶联-稳定的复合体，其含有与生理上相容的聚乙二醇(PEG)修饰的糖脂部分共价偶联的此处公开的一种和多种Y2受体结合肽蛋白、类似物和模拟物，和/或其他生物活性剂。在这种复合体中，生物活性剂可以通过该活性剂的游离氨基酸基团上的不稳定共价键共价偶联到生理上相容的PEG修饰的糖脂部分，其中该不稳定的共价键可以通过生物化学水解和/或蛋白水解体内剪切。该生理上相容的PEG修饰的糖脂部分可以有利地含有聚山梨酯聚合物，例如，含有脂肪酸酯基团的聚山梨酯聚合物，该脂肪酸酯基团选自单棕榈酸酯、二棕榈酸酯、单月桂酸酯、二月桂酸酯、三月桂酸酯、单油酸酯、二油酸酯、三油酸酯、单硬脂酸酯、二硬脂酸酯和三硬脂酸酯。在这种复合体中，该生理上相容的PEG修饰的糖脂部分可以适当地含有选自脂肪酸的聚乙二醇醚和脂肪酸的聚乙二醇酯的聚合物，其中脂肪酸例如包括选自月桂酸、棕榈酸、油酸和硬脂酸的脂肪酸。

材料的储存

在本发明的某些方面，此处的组合制剂和/或协同施用方法掺入有效量的肽和蛋白质，该肽和蛋白质附着到带电玻璃，从而减小了容器中的有效浓度。硅烷化容器，例如，硅烷化玻璃容器被用于储存成品以减小玻璃容器对多肽或蛋白质的吸收。

在本发明的其他方面，用于治疗哺乳动物受试者的试剂盒含有一种或多种Y2受体结合肽化合物的稳定的药物组合物，该药物组合物被配制用以经粘膜传递到哺乳动物受试者，其中该组合物可有效减轻所述受试者中肥胖症、癌症或营养不良或消瘦的一种或多种症状而没有不可接受的不利副作用。该试剂盒还含有药物试剂小瓶以容纳一种或多种Y2受体结合肽化合物。该药物试剂小瓶由药物级聚合物、玻璃或其他适当的材料组成。药物试剂小瓶为，例如，硅烷化玻璃瓶。该试剂盒还含有小孔以将该组合物传递到受试者的鼻粘膜表面。传递小孔由药物级聚合物、玻璃或其他适当的材料组成。传递小孔为，例如，硅烷化玻璃。

硅烷化技术结合了一种特别的清洁技术，该技术用硅烷化方法在低压下使表面硅烷化。硅烷为气相并且处于所要硅烷化的表面的较高温度下。该方法提供了具有稳定的、均匀的和功能性硅烷层的可再生表面，该硅烷层具有特征性单层。硅烷化表面防止本发明的多肽或粘膜传递增强剂与玻璃结合。

该方法可用于制备硅烷化药物试剂小瓶以容纳本发明的Y2受体结合肽组合物。使用前通过用双蒸水(ddH₂O)冲洗清洁玻璃盘。然后用95％EtOH冲洗硅烷盘并用丙酮冲洗丙酮盘。将药物试剂小瓶在丙酮中超声处理10分钟。丙酮超声处理后，将试剂小瓶在ddH₂O盘中洗涤至少2次。然后将试剂小瓶在0.1M NaOH中超声处理10分钟。当试剂小瓶在NaOH中超声处理时，在通风厨中制备硅烷溶液。(硅烷溶液：800mL 95％乙醇；96L冰乙酸；25mL glycid氧基丙基三甲氧基硅烷)。NaOH超声处理后，将试剂小瓶在ddH₂O盘中洗涤至少2次。将试剂小瓶在硅烷溶液中超声处理3到5分钟。在100％EtOH盘中洗涤试剂小瓶。在使用前试剂小瓶用预先纯化的N₂气体干燥并在100℃烘箱中保持至少2小时。

生物粘合剂传递载体和方法

在本发明的某些方面，此处的组合制剂和/或协同施用掺入作为辅助化合物或载体的有效量的非毒性生物粘合剂以增强一种或多种活性剂的粘膜传递。在这方面生物粘合剂显示出一般性或特异粘合所靶定的粘膜的一种或多种组分或表面。生物粘合剂保持生物活性剂进入或穿过粘膜的所希望的浓度梯度以确保甚至大分子(例如，肽和蛋白质)可以渗透进入或穿过粘膜上皮。通常，本发明的方法和组合物内施用生物粘合剂使得肽和蛋白质进入或穿过粘膜上皮的渗透性增加2倍到5倍，通常5到10倍。上皮渗透的增强通常允许大分子的有效透粘膜传递，例如，传递到鼻上皮的基质部分或者进入邻近的细胞外隔室或血浆或CNS组织或流体中。

该增强传递极大地提高了生物活性肽、蛋白质及其他大分子治疗种类的传递有效性。这些结果将部分取决于该化合物的亲水性，从而与水不溶性化合物相比使用亲水种类将实现更大的渗透。除了这些效果，使用生物粘合剂增强粘膜表面的药物持久性可以引起储存机制以延长药物传递，从而化合物不仅穿过粘膜组织而且一旦粘膜表面的物质被耗尽，化合物可以向后扩散到粘膜表面。

本领域中公开的用于经口施用的各种适当的生物粘合剂，美国专利号3,972,995、4,259,314、4,680,323、4,740,365、4,573,996、4,292,299、4,715,369、4,876,092、4,855,142、4,250,163、4,226,848、4,948,580、美国专利重颁发33,093，这些生物粘合剂发现了在本发明的新方法和组合物中的应用。容易评估本发明的方法和组合物内作为粘膜，例如鼻传递平台的各种生物粘合聚合物的潜力，这可以通过测定它们保留和释放Y2受体结合肽，以及它们掺入活性剂后与粘膜表面相互作用的能力来评估。此外，将应用熟知的方法来确定所选的聚合物与粘膜施用位点的组织的生物相容性。当靶粘膜被粘液覆盖(即，没有粘液溶解或粘液清除处理)时，该聚合物可作为下面的粘膜上皮的连接物。因此，如此处所用的术语“生物粘合剂”还包括用于增强本发明内生物活性剂的粘膜传递的粘膜粘合性化合物。然而，通过粘液凝胶层的粘合介导的与粘膜组织的粘合可以受到粘液层和下面的组织之间的不完全和暂时粘附(尤其在鼻表面，在这里发生快速粘液清除)的限制。关于这一点，粘蛋白糖蛋白被持续分泌并且，在它们从细胞或腺体释放后立即形成粘弹性凝胶。然后粘着的凝胶层的腔表面被机械的、酶的和/或纤毛作用持续腐蚀。当这些活性更突出或者希望更长的粘合时间时，本发明的协同施用方法和组合制剂方法可以还掺入如上面公开的粘液水解和/或纤毛抑制方法或试剂。

通常，用于本发明的粘膜粘合聚合物是天然的或合成的大分子，它们通过复杂，但是非特异的机理粘附到湿润粘膜组织表面。除了这些粘膜粘合聚合物，本发明还提供了掺入生物粘合剂的方法和组合物，这些生物粘合剂通过特异的，包括受体介导的相互作用直接粘附到细胞表面。以该特定方式起作用的生物粘合剂的一个实例是称为凝集素的一组化合物。它们是糖蛋白，能够特异识别并结合糖分子，例如，糖蛋白或糖脂，这些糖分子形成鼻内上皮细胞膜的一部分并可以被认为是“凝集素受体”。

在本发明的某些方面，用于增强生物活性剂的鼻内粘附的生物粘合材料包含可以粘附湿润粘膜表面的亲水的，例如水可溶的或可膨胀的聚合物或聚合物的混合物的基质。这些粘合剂可被制备成软膏、水凝胶(见上面)薄膜，及其他应用形式。通常，这些粘合剂具有与之混合的生物活性剂以实现该活性剂的缓慢释放或局部传递。一些粘合剂与另外的成分配制以促进活性剂通过鼻粘膜，例如，进入个体的循环系统的渗透。

各种聚合物(天然的和合成的)在生理条件下显示出与粘液和/或粘膜上皮表面的重要结合。通过机械剥离或剪切试验可以容易地测量该相互作用的强度。当应用于湿润粘膜表面时，许多干燥材料将至少轻微地自发粘合。这种最初接触后，一些亲水材料开始通过吸附、膨胀或毛细作用力吸引水，并且如果该水从下面的基质或从聚合物-组织界面吸收，那么该粘合足够实现增强生物活性剂的粘膜吸收的目标。这种“通过水合作用粘附”可以足够强，但是适于利用该机理的制剂必须解决膨胀问题，其中当剂量转化成水合粘胶后该膨胀仍然继续。对于用于本发明内的许多水胶体，特别一些纤维素衍生物，该问题是突出的，这些水胶体当以预先水合的状态应用时无粘合性。然而，当这些材料以干燥聚合物粉末、微球体或薄膜型传递形式时，用于粘膜施用的生物粘合药物传递系统在本发明内是有效的。

其他聚合物不仅干燥应用时，而且以完全水合状态，并且存在过量水时也粘附到粘膜表面。从而粘膜粘合剂的选择将需要对生理以及理化条件的充分考虑，在这些条件下将形成并保持与组织的接触。具体地，公知在预定的粘合部位通常存在水或水份的量和主要pH很大程度上影响不同聚合物的粘膜粘合结合强度。

在过去20年里已经制备并研究了若干聚合物生物粘合药物传递系统，但并不总是成功的。然而各种这些载体当前被用于临床应用，包括牙医、矫形、眼科和手术应用。例如，基于丙烯酸的水凝胶已经被广泛用于生物粘合装置。基于丙烯酸的水凝胶由于在部分膨胀态中的弹性和非摩擦特征而非常适于生物粘合，这些特征减少了对接触的组织的导致破坏的磨损。此外，它们在膨胀态的高渗透性允许聚合后未反应的单体、未交联的聚合物链，和起始物从基质被洗除，这是用于本发明的生物粘合材料的选择的一个重要特征。基于丙烯酸的聚合物装置显示出非常高的粘合结合强度。对于肽和蛋白质药物的受控的粘膜传递，本发明的方法和组合物任选包括使用载体，例如聚合物传递载体，它们部分保护生物活性剂免受蛋白质水解分解，而同时提供肽或蛋白质进入或穿过鼻粘膜的增强的渗透。在这方面，生物粘合聚合物已经展示了增强口服药物传递的重要潜力。作为实例，与粘膜粘合的聚(丙烯酸)衍生物聚卡波非的1％(w/v)盐水分散液一起经十二指肠施用于大鼠的9-去甘氨酰胺，8-精氨酸后叶加压素(DGAVP)的生物利用度与没有该聚合物的该肽药物的水性溶液相比增加3-5倍。

聚(丙烯酸)型粘膜粘附聚合物是某些肠蛋白酶的有效抑制剂。酶抑制的机理通过这类聚合物对二价阳离子，如钙或锌的强亲和性解释，这些二价阳离子是金属蛋白酶，如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的必需辅因子。据报导通过聚(丙烯酸)夺取蛋白酶的辅因子可以诱导酶蛋白的不可逆的结构改变，这伴随着酶活性的损失。同时，其他粘膜粘合聚合物(例如，一些纤维素衍生物和壳聚糖)在某些条件下可以不抑制蛋白水解酶。与预期用于本发明的其他酶抑制剂(例如，抑肽酶、贝他定)(它们是相对小的分子)相比，抑制性聚合物的透鼻吸收鉴于这些分子的大小可能是最小的，并从而消除了可能的不利副作用。从而，特别当考虑安全性问题时，粘膜粘合聚合物，尤其聚(丙烯酸)型粘膜粘合聚合物可作为吸收促进粘合剂和酶保护剂以增强肽和蛋白质药物的受控传递。

除了保护防止酶降解，用于本发明的生物粘合剂及其他聚合或非聚合的吸收促进剂可以直接增加生物活性剂的粘膜渗透性。为了促进大亲水分子，如肽和蛋白质穿过鼻上皮屏障的运输，已经推定粘膜粘合聚合物及其他试剂除了通过延长传递系统的粘膜前滞留期，还产生增强的渗透效果。所报导的药物血浆浓度的时间期限表明生物粘合微球导致胰岛素穿过鼻粘膜的渗透性的急剧但是短暂的增加。用于本发明的其他粘膜粘合聚合物，例如壳聚糖，被报导甚至当它们作用水性溶液或凝胶应用时也增强某些粘膜上皮的渗透性。被报导直接影响上皮渗透性的另一粘膜粘合聚合物是透明质酸及其酯衍生物。本发明的协同施用，和/或组合制剂方法和组合物中的尤其有用的生物粘合剂是壳聚糖，以及其类似物和衍生物。壳聚糖是非毒性的、生物相容的和生物可降解的聚合物，其由于低毒和良好的生物相容性这些有利的性质而被广泛用于药物和医学应用中。壳聚糖是将壳多糖用碱N-脱乙酰化制备的天然多氨基糖。如用于本发明方法和组合物中的，壳聚糖增加此处公开的Y2受体结合肽蛋白、类似物和模拟物，及其他生物活性剂在应用的粘膜部位的保持。该施用模式也改善了患者依从性和接受性。如此处进一步提供的，本发明的方法和组合物将任选包括一种新的壳聚糖衍生物或壳聚糖的化学修饰的形式。用于本发明的一种该新的衍生物被表示为β-[1→4]-2-胍基-2-脱氧-D-葡萄糖聚合物(聚-GuD)。壳聚糖是壳多糖的N-脱乙酰化产物，是一种天然存在的聚合物，其已经被广泛用于制备经口和鼻内施用的微球体。还提出将壳聚糖聚合物作为肠胃外药物传递的可溶载体。在本发明的一方面，用o-甲基异脲将壳聚糖胺转化成其胍盐部分。通过例如，壳聚糖的等生理溶液和o-甲基异脲在高于8.0的pH下反应制备胍盐化合物。

胍盐产物为-[14]-胍基-2-脱氧-D-葡萄糖聚合物。其在这方面被简写为聚-GuD(壳聚糖中胺的单体F.W.＝161；聚-GuD中胍盐的单体F.W.＝203)。

用于本发明的一种代表性聚-GuD制备方法包括下面的方案。

溶液：

制备0.5％乙酸溶液(0.088N)：

吸取2.5mL冰乙酸到500mL容量瓶中，用纯化水定容。

制备2N NaOH溶液：

将20g NaOH小粒转移到装有约150ml纯化水的烧杯中。溶解并冷却到室温。将溶液转移到250mL容量瓶中，用纯化水定容。

制备硫酸O-甲基异脲(0.4N脲基当量)：

将约493mg硫酸O-甲基异脲转移到10ml容量瓶中，溶解并用纯化水定容。

该溶液的pH为4.2。

制备氯化钡溶液(0.2M)：

将约2.086氯化钡转移到50mL容量瓶，溶解并用纯化水定容。

制备壳聚糖溶液(0.06N胺当量)：

将约100mg壳聚糖转移到50mL烧杯中，加入10mL 0.5％乙酸(0.088N)。搅拌以完全溶液。

该溶液的pH为约4.5。

制备氯化O-甲基异脲溶液(0.2N脲基当量)：

吸取5.0mL硫酸O-甲基异脲溶液(0.4N脲基当量)和5mL 0.2M氯化钡溶液置于烧杯中。形成沉淀。继续搅拌溶液5分钟。通过0.45m滤器过滤溶液并丢弃沉淀。上清液中氯化O-甲基异脲的浓度为0.2N脲基当量。

该溶液的pH为4.2。

步骤：

向如部分2.5中描述的制备的壳聚糖溶液10mL(0.06N胺当量)加入1.5mL 2N NaOH。用2N NaOH调节溶液的pH至约8.2到8.4。继续搅拌溶液10分钟。加入如上述制备的3.0mL氯化O-甲基异脲溶液(0.2N脲基当量)。过夜搅拌溶液。

用0.5％乙酸(0.088N)调节溶液pH至5.5。

用纯化水将溶液稀释到终体积25mL。

溶液中聚-GuD浓度为5mg/mL，相当于0.025N(胍鎓(guanidium)基)。

用于本发明的被分类为生物粘合剂的另外的化合物通过介导生物粘合化合物和粘膜上皮表面的组分之间的特异相互作用，通常分类为“受体-配体相互作用”而起作用。许多天然实例阐明了该形式的特异结合生物粘合，如通过凝集素-糖相互作用所例证的。凝集素是非免疫起源的(糖)蛋白，其结合多糖或糖偶联物。

已经研究了作为可能的药物吸收促进剂的一些植物凝集素。一种植物凝集素菜豆(Phaseolus vulgaris)血细胞凝集素(PHA)在喂饲给大鼠后显示出10％以上的高的口服生物利用度。番茄(Lycopersicon esculeutum)凝集素(TL)对于各种施用模式似乎是安全的。

总之，前面的生物粘合剂可用于本发明的组合制剂和协同施用方法中，其任选掺入有效量和有效形式的生物粘合剂以延长一种或多种Y2受体肽蛋白、类似物和模拟物，及其他生物活性剂的持久性或者增加它们的粘膜吸收。生物粘合剂可作为本发明的组合制剂中的辅助化合物或添加剂协同施用。在某些实施方案中，生物粘合剂作为“药物胶水”，而在其他实施方案中，生物粘合剂的辅助传递或组合制剂用于加强生物活性剂与鼻粘膜的接触，该加强在一些实施方案中是通过促进与上皮细胞“受体”的特异受体-配体相互作用，在其他实施方案中是通过增加上皮渗透性以显著增加在传递的靶标部位(例如，肝脏、血浆，或CNS组织或流体)测量的药物浓度梯度。用于本发明的另外的生物粘合剂作为酶(例如，蛋白酶)抑制剂以增强与生物粘合剂协同传递或者在组合制剂中传递的经粘膜施用的生物治疗剂的稳定性。

脂质体和微团传递载体

本发明的协同施用方法和组合制剂任选掺入有效的基于脂质或脂肪酸的载体、加工试剂，或传递载体，以提供Y2受体结合肽蛋白、类似物和模拟物，及其他生物活性剂的粘膜传递的改良制剂。例如，提供了用于粘膜传递的各种制剂和方法，其包含一种或多种这些活性剂，如肽或蛋白质，该活性剂与脂质体、混合的微团载体或乳剂混合或被它们包封或者与它们协同施用以增强粘膜传递时这些生物活性剂(例如，通过减少对蛋白质水解、化学修饰和/或变性的敏感性)的化学和物理稳定性和增加它们的半寿期。

在本发明的某些方面，生物活性剂的特定传递系统含有称作脂质体的小脂质小泡。它们通常由天然的、生物可降解的、非毒性的和非免疫原性脂质分子制成，并且可以有效捕获或结合药物分子，包括肽和蛋白到它们的膜里面或膜上面。由于被包裹的蛋白可以保留在小泡内它们的优选的水性环境中，而脂质体膜保护它们免受蛋白质水解及其他去稳定因素，所以脂质体作为本发明肽和蛋白质传递系统的吸引力增加了。尽管由于它们独特的物理和化学性质，不是所有公知的脂质体制备方法在肽和蛋白质的包裹中都是可行的，但是一些方法允许包裹这些大分子而无实质性失活。

可以利用各种方法制备用于本发明的脂质体，美国专利号4,235,871、4,501,728、和4,837,028。使用脂质体传递，生物活性剂通常被捕获在脂质体，或者脂质小泡中，或者结合到该小泡的外面。

类似脂质体，不饱和长链脂肪酸也可增强粘膜吸收活性，可以形成具有类似双层结构(所称作的“ufasomes”)的封闭小泡。例如，使用油酸捕获用于本发明内经粘膜，例如鼻内传递的生物活性肽和蛋白，可以形成这些封闭小泡。

用于本发明的其他传递系统联合使用聚合物和脂质体以联合两种小泡的有利性质，如包裹在天然聚合物血纤蛋白内。此外，通过利用共价交联和向血纤蛋白聚合物加入抗血纤蛋白溶解剂可以控制生物治疗剂化合物从该传递系统的释放。

用于本发明的更简化的传递系统包括使用阳离子脂质作为传递载体，它们可以被有效用于提供脂质载体和这些带电的生物活性剂如蛋白质和聚阴离子核酸之间的静电相互作用。这允许药物有效包装成适于粘膜施用和/或随后传递到全身隔室的形式。

用于本发明的另外的传递载体包括长链和中链脂肪酸，以及表面活性剂与脂肪酸混合的微团。酯形式的多数天然存在的脂质关于它们自身穿过粘膜表面的运输具有重要的暗示。游离脂肪酸和它们的附着极性基团的单酸甘油酯已经以混合微团的形式表明作为渗透增强剂作用于肠屏障。游离脂肪酸(链长为12到20个碳原子的羧酸)和它们的极性衍生物的屏障修饰功能这一发现已经激起了关于这些试剂用作粘膜吸收增强剂的广泛研究。

对于用于本发明的方法，长链脂肪酸，特别融合脂质(未饱和脂肪酸和单酸甘油酯，如油酸、亚油酸、亚油酸、一油精，等)提供了有用的载体以增强此处公开的Y2受体-结合肽、类似物和模拟物，及其他生物活性剂的粘膜传递。中链脂肪酸(C6到C12)和单酸甘油酯也已经表明在肠药物吸收中具有增强活性并且适于用于本发明的粘膜传递制剂和方法中。此外，中等和长链脂肪酸的钠盐是本发明生物活性剂的粘膜传递的有效的传递载体和吸收增强剂。从而可以将脂肪酸以钠盐的可溶形式或者通过加入非毒性表面活性剂，例如，聚氧乙烯化氢化蓖麻油、牛磺胆酸纳，等等后使用。可以用于本发明的其他脂肪酸和混合微团制剂包括，但不限于，辛酸钠(C8)、癸酸钠(C10)、十二烷酸钠(C12)或油酸钠(C18)，任选与胆汁盐，如甘胆酸盐和牛磺胆酸盐联合。

PEG化

本发明提供的另外的方法和组合物包括通过共价连接的聚合物质，例如，葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、糖肽、聚乙二醇和聚氨基酸对生物活性肽和蛋白质化学修饰。所得偶联肽和蛋白质保持它们的用于粘膜施用的生物活性和溶解性。在备选实施方案中，Y2受体结合肽蛋白、类似物和模拟物，及其他生物活性肽和蛋白质被偶联到聚氧化烯聚合物，尤其聚乙二醇(PEG)。美国专利号4,179,337。

用于本发明的胺-反应性PEG聚合物包括分子量为2000、5000、10000、12000和20000的SC-PEG；U-PEG-10000；NHS-PEG-3400-生物素；T-PEG-5000；T-PEG-12000；和TPC-PEG-5000。通过修饰羧基位点(例如，天冬氨酸或谷氨酸除了羧基末端外的羧基)实现生物活性肽和蛋白质的PEG化。已经描述了在酸性条件下利用PEG-酰肼选择性修饰碳二亚胺活化的蛋白质羧基。备选地，可以使用生物活性肽和蛋白质的双功能PEG修饰。在一些方法中，带电氨基酸残基，包括赖氨酸、天冬氨酸，和谷氨酸显著倾向于在蛋白质表面上被溶剂接近。

活性剂的其他稳定化修饰

除了PEG化，还可以修饰生物活性剂如用于本发明的肽和蛋白质以增加循环半寿期，这可以通过偶联到其他公知的保护或稳定化合物，例如，通过将活性肽、蛋白质、类似物或模拟物连接到一种或多种载体蛋白，如一种或多种免疫球蛋白链产生融合蛋白而保护活性剂实现循环半寿期的增加。

制剂和施用

本发明的粘膜传递制剂含有Y2受体结合肽、类似物和模拟物，通常与一种或多种药学上可接受的载体和，任选地，其他治疗成分组合。载体必须是“药学上可接受的”，即与该制剂的其他成分相容并且不在受试者中引起不可接受的有害效果。这些载体在上文中描述或者是药理学领域技术人员熟知的。希望制剂不包括诸如酶或氧化剂的物质，公知所要施用的生物活性剂与这些物质是不相容的。通过药剂学领域中熟知的任一方面可以制备制剂，

在本发明的组合物和方法内，可以通过各种粘膜施用模式将此处公开的Y2受体结合肽蛋白、类似物和模拟物，及其他生物活性剂施用于受试者，这些施用模式包括经口、直肠、阴道、鼻内、肺内，或透皮传递，或者通过局部传递于眼、耳、皮肤或其他粘膜表面。任选地，此处公开的Y2受体结合肽蛋白、类似物和模拟物，及其他生物活性剂可通过非粘膜途径协同或辅助地施用，这些非粘膜途径包括肌内、皮下、静脉内、心房内、关节内、腹膜内或肠胃外途径。在其他备选实施方案中，通过直接暴露于起源于哺乳动物受试者的细胞、组织或器官可以体外施用生物活性剂，例如作为体外组织或器官治疗制剂的组分，该制剂含有适当的液体或固体载体中的生物活性剂。

根据本发明的组合物通常以水溶液作为鼻或肺喷雾剂施用或者可以通过本领域中技术人员公知的各种方法以喷雾剂形式分配。将液体作为鼻喷雾剂分配的优选系统在美国专利号4,511,069中公开。制剂可以以多剂量容器，例如以美国专利号4,511,069中公开的密封分配系统给出。其他气溶胶传递形式可以包括，例如，压缩的气体-、喷射-、超声-、和压电喷雾器，该喷雾器传递溶解或悬浮在药物溶剂，例如，水、乙醇和它们的混合物中的生物活性剂。

本发明的鼻和肺喷雾溶液通常含有该药物或将要传递的药物，该药物任选与一种表面活性剂，如非离子表面活性剂(例如，聚山梨酯-80)和一种或多种缓冲剂配制。在本发明的一些实施方案中，鼻喷雾溶液还含有推进剂。鼻喷雾溶液的pH任选为约pH3.0到6.0，优选5.0±0.3。用于这些组合物的适当的缓冲液如上描述或者为本领域中公知的。可以加入其他组分以增强或保持化学稳定性，这些组分包括防腐剂、表面活性剂、分散剂，或气体。适当的防腐剂包括，但不限于，苯酚、甲基对羟基苯甲酸酯类、对羟基苯甲酸酯类、间-甲酚、乙基汞硫代水杨酸钠、氯丁醇、苯扎氯铵，等等。适当的表面活性剂包括，但不限于，油酸、三油酸山梨聚糖酯、聚山梨酯、卵磷脂、磷脂酰胆碱，和各种长链甘油二酯和磷脂。适当的分散剂包括，但不限于，乙二胺四乙酸，等等。适当的气体包括，但不限于，氮、氦、氯氟碳(CFCs)、氢氟碳(HFCs)、二氧化碳、气体、等等。

在备选实施方案中，粘膜制剂作为干粉制剂施用，该干粉制剂含有适当颗粒大小，或者适当的颗粒大小范围的干燥，通常冻干形式的生物活性剂，用于鼻内传递。适于沉积在鼻或肺通道中的最小颗粒大小通常为约0.5μ质量中位数等价空气动力学直径(MMEAD)，通常约1μMMEAD，更典型地约2μMMEAD。适于沉积在鼻通道的最大颗粒大小通常为约10μMMEAD，通常约8μMMEAD，更典型地约4μMMEAD。通过各种常规技术，如喷射磨碎、喷雾干燥、溶剂沉淀、超临界液体冷凝，等等可以产生这些大小范围内的鼻内可呼吸的粉剂。适当的MMEAD的这些干燥粉剂可通过常规干粉吸入器(DPI)施用于患者，干粉吸入器依赖于患者的呼吸，当肺或鼻吸入时，将粉剂分散成气溶胶化的量。备选地，通过空气辅助装置可以施用干燥粉剂，该装置利用外部能源将粉剂分散成气溶胶化量，例如，活塞泵。

干粉装置通常需要约1mg到20mg的粉剂质量以产生单一气溶胶化剂量(“喷烟”)。如果生物活性剂的所需要的或希望的剂量低于该量，那么粉状活性剂将通常与药物干燥膨胀(bulking)粉剂联合以提供所需要的总粉剂治疗。优选的干燥膨胀粉剂包括蔗糖、乳糖、右旋糖、甘露醇、甘氨酸、海藻糖、人血清白蛋白(HAS)，和淀粉。其他适当的干燥膨胀粉剂包括纤维二糖、葡聚糖、麦芽三糖、果胶、柠檬酸钠、抗坏血酸钠、等等。

为了配制用于本发明内粘膜传递的组合物，生物活性剂可以与各种药学上可接受的添加剂，以及用于分散活性剂的基质或载体组合。所希望的添加剂包括，但不限于，pH控制剂，如精氨酸、氢氧化钠、甘氨酸、盐酸、柠檬酸，等等。此外，可以包括局部麻醉剂(例如，苯甲醇)、等渗剂(例如，氯化钠、甘露醇、山梨糖醇)、吸收抑制剂(例如，吐温80)、溶解度增强剂(例如，环糊精及其衍生物)、稳定剂(例如，血清白蛋白)，和还原剂(例如，谷胱甘肽)。当用于粘膜传递的组合物为液体时，制剂的张力(参照统一的0.9％(w/v)生理盐水溶液测量)通常被调节到一定值，在该张力值时，施用部位的鼻粘膜中将不会诱导实质性的、不可逆的组织损伤。通常，溶液的张力被调节到约1/3到3，更典型地1/2到2，更通常3/4到1.7。

生物活性剂可以被分散到基质或载体中，该基质或载体可以含有亲水化合物，该亲水化合物能够分散活性剂和任一希望的添加剂。基质可以选自各种适当的载体，包括但不限于，聚羧酸的共聚物或其盐，羧酸酐(例如，马来酸酐)与其他单体(例如，甲基(甲)丙烯酸、丙烯酸，等等)的共聚物，亲水性乙烯基聚合物，如聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素衍生物，如羟甲基纤维素、羟丙基纤维素，等等，和天然聚合物，如壳聚糖、胶原蛋白、海藻酸钠、明胶、透明质酸，和它们的非毒性金属盐。通常，选择可降解的聚合物作为基质或载体，例如，聚乳酸、聚(乳酸-乙二酸)共聚物、聚羟基丁酸、聚(羟基丁酸-乙二酸)共聚物和它们的混合物。备选地或另外地，合成的脂肪酸酯，如聚甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯，等等可用作载体。亲水性聚合物及其他载体可单独或联合使用，并且通过部分结晶、离子成键、交联等等可以增强载体的结构完整性。可以以各种形式提供载体，这些形式包括，流体或粘性溶液、凝胶、糊剂、粉剂、微球体和膜剂，它们用于直接应用于鼻粘膜。在这方面使用所选的载体可促进生物活性剂的吸收。

根据各种方法，生物活性剂可以与基质或载体组合，并且通过扩散、载体的崩解，或水通道的结合制剂可以释放活性剂。在一些情况中，活性剂分散于从适当的载体，例如，2-氰基丙烯酸异丁酯制备的微胶囊(微球体)或纳胶囊(纳球体)中和分散在应用于鼻粘膜的生物相容的分散介质中，该介质导致生物活性剂在长时间内持续传递。

为了进一步增强本发明内药物试剂的粘膜传递，含有活性剂的制剂可以还含有作为基质或赋形剂的亲水低分子量化合物。这种亲水低分子量化合物提供了通道介质，通过该通道介质水可溶的活性剂，如生理活性肽或蛋白质可以通过基质扩散到身体表面，在身体表面活性剂被吸收。亲水低分子量化合物任选从粘膜或者施用环境吸收水分并溶解水溶性活性肽。亲水低分子量化合物的分子量通常不超过10000，优选不超过3000。代表性亲水低分子量化合物包括多元醇化合物，如寡-、二-、和单糖，如蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、L-阿拉伯糖、D-赤藓糖、D-核糖、D-木糖、D-甘露糖、海藻糖、D-半乳糖、乳果糖、纤维二糖、龙胆二糖、甘油和聚乙二醇。用作本发明的载体的亲水低分子量化合物的其他实例包括N-甲基吡咯烷酮，和醇(例如，寡乙烯醇、乙醇、乙二醇、丙二醇，等等)。这些亲水低分子量化合物可单独使用或者相互联合或者与鼻制剂的其他活性或无活性组分联合使用。

本发明的组合物可任选含有接近生理条件所需的药学上可接受的载体，如pH调节和缓冲剂、张力调节剂、增湿剂，等等，例如，乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、单月桂酸山梨糖醇酐酯、油酸三乙醇胺酯、等等。对于固体组合物，可以使用常规的非毒性的药学上可接受的载体，这些载体包括，例如，药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁、等等。

用于施用生物活性剂的治疗组合物也可被制备成溶液、微乳剂，或适于高浓度活性成分的其他有序结构。载体可以为溶剂或分散介质，其含有例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇，和液态聚乙二醇，等等)，和它们的适当混合物。例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣，对于可分散制剂通过保持所希望的颗粒大小，和通过使用表面活性剂，可以保持溶液的适当流动性。在许多情况中，将希望组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇，如甘露醇、山梨糖醇，或氯化钠。通过在组合物中包括延缓吸收的试剂，例如，单硬脂酸盐和明胶，可以延长生物活性剂的吸收。

在本发明的某些实施方案中，以缓释制剂，例如，以包含缓释聚合物的组合物使用生物活性剂。可以用保护防止快速释放的载体制备该活性剂，例如，控释载体，如聚合物、微包裹的传递系统或生物粘合凝胶。通过在延迟吸收的组合物试剂中包括例如，单硬脂酸铝水凝胶和明胶可以延长本发明的各种组合物中活性剂的传递。当希望生物活性剂的控释制剂时，适于按照本发明使用的控释结合剂包括任何生物相容的控释材料，该控释材料对于活性剂是惰性的并且能够掺入生物活性剂。各种这些材料是本领域中公知的。有用的控释结合剂是在它们的鼻内传递后的生理条件下(例如，在鼻粘膜表面，或者透粘膜传递后体液的存在下)被缓慢代谢的材料。适当的结合剂包括但不限于前面用于本领域中缓释制剂中的生物相容的聚合物和共聚物。这些生物相容的化合物对于周围组织是非毒性的并且惰性的，并且不触发显著的不利副作用，如鼻刺激、免疫应答、炎症，等等。它们被代谢成代谢产物，这些代谢产物也是生物相容的并且容易从身体清除。

用于该方面的代表性聚合物材料包括，但不限于，从具有可水解的酯键的共聚和均聚聚酯得到的聚合基质。许多这些聚合物材料是本领域中公知的并且可导致降解产物，该降解产物是无毒或低毒的。代表性聚合物包括聚乙醇酸(PGA)和聚乳酸(PLA)、聚(DL-乳酸-共-乙醇酸)(DL PLGA)、聚(D-乳酸-共乙醇酸)(D PLGA)和聚(L-乳酸-共-乙醇酸)(L PLGA)。其他有用的生物可降解的或生物可腐蚀的聚合物包括但不限于诸如聚(ε-己内酯)、聚(ε-aprolactone-CO-乳酸)、聚(ε-aprolactone-CO-乙醇酸)、聚(β-羟基丁酸)、聚(烷基-2-氰基丙烯酸酯)、水凝胶，如聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、聚酰胺、聚(氨基酸)(例如，L-赖氨酸、谷氨酸、L-天冬氨酸，等等)、聚(酯脲)、聚(2-羟乙基DL-天冬氨酸酰胺)、聚缩醛聚合物、聚原酸酯、聚碳酸酯、聚马来酰胺、多糖和它们的共聚物。制备这些制剂的许多方法是本领域技术人员公知的。其他有用的制剂包括控释组合物，例如，微胶囊(美国专利号4,652,441和4,917,893)、用于制备微胶囊及其他制剂的乳酸-乙醇酸共聚物(美国专利号4,677,191和4,728,721)和水溶性肽的缓释制剂(美国专利号4,675,189)。

将活性化合物以所需要的量与上面所列举的成分之一或者组合(如果需要)掺入适当的溶剂中，然后过滤除菌可以制备无菌溶液。通常，将活性化合物掺入无菌载体可以制备分散剂，该无菌载体含有基本扩散介质和来自上面所列举的所需要的其他成分。对于无菌粉剂，制备方法包括真空干燥和冰冻干燥，该方法产生含有活性成分加上来自其前面无菌过滤的溶液的任何另外的所希望的成分的粉剂。加入各种抗细菌和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、乙基汞硫代水杨酸钠，等等可以防止微生物作用。

根据本发明的粘膜施用允许由患者进行的有效的自身施用治疗，只要有足够的安全措施控制和监视给药和副作用。粘膜施用还克服了其他施用形式，如注射的某些缺点，该其他施用形式是痛苦的并且将患者暴露于可能的感染并且可以引起药物生物利用度问题。对于鼻和肺传递，将治疗液体作为喷雾分配的受控的气溶胶系统是熟知的。在一个实施方案中，通过特别构造的机械泵阀门传递活性剂的计量的量，美国专利号4,511,069。

剂量

对于预防和治疗目的，此处公开的生物活性剂可以以单次推注传递，在长时间内通过连续传递(例如，连续透皮的、粘膜、或静脉内传递)，或者以反复施用方案(例如，通过每小时、每天或每周重复施用方案)施用于患者。在这方面，生物活性剂的治疗有效剂量可以包括长期预防或治疗方案中的反复剂量，该方案将产生临床上显著的结果以减轻与如上面提出的靶标疾病或病症有关的一种或多种症状或可检测的病症。这方面有效剂量的确定通常基于动物模型研究，接着是人临床试验并且通过确定显著减小受试者中靶标疾病症状或病症的发生或严重性的有效剂量和施用方案来指导有效剂量的确定。在这点上适当的模型包括，例如，鼠、大鼠、猪、猫、非-人灵长类，和本领域中公知的其他可接受的动物模型受试者。备选地，利用体外模型(例如，免疫和组织病理测定)可以确定有效剂量。使用这些模型，通常仅需要常规计算和调节就可以确定施用治疗有效量(例如，鼻内有效、透皮有效、静脉内有效、或肌内有效引起所希望的应答的量)的生物活性剂的适当的浓度和剂量。

生物活性剂的实际剂量将当然根据一些因素而变，这些因素为诸如受试者的疾病指征和具体状态(例如，受试者的年龄、大小、适合度、症状的程度、敏感性因素，等等)、施用的时间和途径，和被同时施用的其他药物或治疗，以及用于引起受试者中所希望的活性或生物学应答的生物活性剂的特定药理学。可以调节剂量方案以提供最佳预防或治疗应答。治疗有效量还包括其中生物活性剂的任何毒性或有害副作用在临床方面都被治疗上有益的效果胜过的量。本发明的方法和制剂内的Y2拮抗剂的治疗有效量的非限制性范围为0.7μg/kg到约25μg/kg。为了促进体重减轻，被施用的Y2受体结合肽的鼻内剂量足够高以促进饱满感但是足够低以便不引起不想要的副作用，如恶心。PYY3_3-36的优选的鼻内剂量为约1μg-10μg/kg患者的体重，最优选约1.5μg/kg到约3μg/kg患者体重。在标准剂量中，患者将接受50μg到1600μg，更优选约75μg到800μg，最优选100μg、150μg、200μg到约400μg。备选地，本发明的方法和制剂内的生物活性剂的治疗有效量的非限制性范围为约0.001pmol到约100pmol/kg体重，约0.01pmol到约10pmol/kg体重，约0.1pmol到约5pmol/kg体重，或约0.5pmol到约1.0pmol/kg体重。通过单次或多次施用可以实现该范围内的剂量，包括，例如，每天多次施用、每天或每周施用。对于每次施用，希望对普通人受试者施用至少1微克生物活性剂(例如，一种或多种Y2受体结合肽蛋白、类似物和模拟物，及其他生物活性剂)，更典型地约10μg到5.0mg，在一些实施方案中约100μg到1.0或2.0mg。对于某些口服施用，为了实现足够血浆水平，高达0.5mg/kg体重的剂量是必要的。还注意到对于每个具体受试者，应该根据个体的需要和施用或监视可渗透肽及其他生物活性剂的施用的人的专业判断随时间评估和调节特定剂量方案。PYY的鼻内剂量将为50μg到1600μg PYY，优选75μg到800μg，更优选100μg到400μg，最优选的剂量为100μg到200μg，认为150μg是高度有效的剂量。本发明制剂的反复鼻内给药，剂量之间约0.1到24小时，优选剂量之间为0.1到2.0小时的方案将保持Y2受体结合肽的正态化的持续治疗水平而使临床益处最大并且使过多暴露和副作用的危险最小。该剂量可以一天施用数次，优选餐前半小时或者发生饥饿时施用以促进饱满感。

Y2拮抗剂如PYY的剂量可以由临床医生或者患者(如果自己施用非处方剂型)以改变以在靶标部位保持所希望的浓度。

在备选实施方案中，本发明提供了Y2受体结合肽的鼻内施用的组合物和方法，其中通过鼻内有效剂量方案反复施用Y2受体结合肽化合物，该方案包括在每天或每周的日程表期间对受试者多次施用Y2受体结合肽以在长期给药期间保持Y2受体结合肽的治疗有效上升的和降低的脉动水平。这些组合物和方法提供了Y2受体结合肽化合物，这些化合物由受试者以鼻制剂自己施用，每天施用2到6次以在8小时到24小时长期给药期间保持Y2受体结合肽的治疗有效上升的和降低的脉动水平。

试剂盒

本发明还包括上述药物组合物、活性成分的试剂盒、包装和多容器单位，和/或施用这些药物组合物、活性成分的方法，这些试剂盒、包装和多容器单位和/或施用方法用于治疗和预防哺乳动物受试者中的疾病及其他病症。简言之，这些试剂盒包括容器或制剂，该容器或制剂含有此处公开的一种或多种Y2受体结合肽蛋白、类似物或模拟物，和/或其他生物活性剂，联合此处公开的粘膜传递增强剂，它们在用于粘膜传递的药物制剂中配制。

使用任何喷雾瓶或注射器可以施用本发明的鼻内制剂。鼻喷雾瓶的一个实例是“鼻喷雾泵w/Safety Clip”，Pfeiffer SAP#60548，其每次喷出传递0.1mL并且其汲取管长度为36.05mm。其可以从美国Princeton，NJ的Pfeiffer购买。Y2受体结合肽如PYY的鼻内剂量可以为0.1μg/kg到约1500μg/kg。当作为鼻内喷雾剂施用时，喷雾剂的颗粒大小优选为10-100μm(微米)，优选20-100μm。

为了促进体重减轻，被施用的Y2受体结合肽PYY的鼻内剂量足够高以促进饱满感但是足够低以便不引起不想要的副作用，如恶心。Y2受体结合肽如PYY(3-36)的优选的鼻内剂量为约3μg-10μg/kg患者体重，最优选约6μg/kg患者体重。在标准剂量中，患者将接受50μg到800μg，更优选约100μg到400μg，最优选150μg到约200μg。Y2受体结合肽如PYY(3-36)优选在进食前10分钟到1小时施用以防止恶心但是不超过进食前约12到24小时。优选每次进餐前对患者施用至少每天一次，直到患者已经减轻了所希望的重量。然后患者接受至少每周优选每天一次的保持剂量以保持体重减轻。

如通过来自上面的实施例的数据所显示的，当使用本发明的Y2受体结合肽制剂鼻内施用时，发现PYY(3-36)降低食欲。这些实施例还表明施用本发明的Y2受体结合肽制剂(其中PYY(3-36)是Y2受体结合肽)通过鼻内途径施用可以达到PYY肽的第一次饭后生理水平。

所提供的下面的实施例用于阐明而不是限制本发明。

实施例1

按照本说明书如下制备并评估用于肽YY的增强的鼻粘膜传递的代表性制剂：

表1：肽YY制剂组成

制剂	每100ml样品中肽YY3-36	粘膜传递增强剂
			A	60μg	磷酸盐缓冲盐水(0.8％)pH7.4(对照1)
B	60μg	磷酸盐缓冲盐水(0.8％)pH5.0(对照2)
			C	60μg	L-精氨酸(10％w/v)
D	60μg	聚-L-精氨酸(0.5％w/v)
			E	60μg	γ-环糊精(1％w/v)
F	60μg	α-环糊精(5％w/v)
			G	60μg	甲基-β-环糊精(3％w/v)
H	60μg	正-癸酸钠(0.075％w/v)
			I	60μg	壳聚糖(0.5％w/v)
J	60μg	二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱(3.5％w/v)
			K	60μg	S-亚硝基-N-乙酰基-青霉胺(0.5％w/v)
L	60μg	棕榈酰-DL-肉碱(0.02％w/v)
			M	60μg	泊洛沙姆-127(0.3％w/v)
N	60μg	硝普钠(0.3％w/v)
			O	60μg	甘胆酸钠(1％w/v)
P	60μg	F1：明胶、DDPC、MBCD、EDTA
			F1		二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱(0.5％w/v)甲基

β环糊精(3％ w/v)EDTA(0.1％w/v，Inf.Conc.0.5M)明胶(0.5％w/v)

实施例2

鼻粘膜传递-渗透动力学和细胞毒性

1.器官型模型

下面的方法通常用于评估本发明的制剂和方法内的肽YY的鼻粘膜传递参数、动力学和副作用，以及用于确定与肽YY组合配制或协同施用的此处公开的各种鼻内传递增强剂的效力和特征。

渗透动力学和细胞毒性也用于确定与粘膜传递增强剂组合配制或系统施用的此处公开的各种粘膜传递增强剂的功效和特征。在一个代表性方案中，为与生物活性治疗剂(由肽YY作为例子)联合的鼻粘膜传递增强剂阐明了渗透动力学和没有不可接受的细胞毒性。

EpiAirway系统由MatTek Corp(Ashland，MA)开发，作为内衬于呼吸道的假复层上皮的模型。上皮细胞生长在气液界面处的底部为多孔膜的细胞培养插入物上，这导致细胞分化成高度极化的形态。上表面有纤毛，具有微绒毛超结构，上皮产生粘液(通过免疫印迹已经证实了粘蛋白的存在)。插入物的直径为0.875cm，提供0.6cm²的表面积。在运输前约3周在工厂将细胞铺在插入物上。一个“试剂盒”由24个单元组成。

A.到达时，将单元置于6孔微量培养板中的无菌支持体上。每个孔接受5mL专利培养基。该基于DMEM的培养基是无血清的并且补加表皮生长因子及其他因子。总是检查培养基的任何细胞因子或生长因子的内源水平，认为该培养基用于鼻内传递，但是除了胰岛素之外没有所有细胞因子和迄今研究的因子。5mL体积刚刚足够提供单元自身的底物的接触，但是允许上皮的上表面保持与空气直接接触。在该步骤和包括将单元转移到含有液体的小孔中的所有随后步骤中都使用无菌镊子以确保在单元的底部和培养基之间没有捕获空气。

B.在平板中的单元在含有5％ CO₂的空气的培养箱中37℃下在空气中保持24小时。在该时间末，用新鲜培养基置换旧培养基并将单元返回到培养箱中继续保持24小时。

2.实验方案-渗透动力学

A.24EpiAirway单元的试剂盒可常规用于评估5种不同制剂，每种制剂都应用于一式四份的孔中。每个孔用于确定渗透动力学(4个时间点)、透表皮抗性、线粒体还原酶活性(通过MTT还原测量)，和细胞裂解(通过LDH的释放测量)。另一组孔被用作对照，它们在确定渗透动力学期间用假处理，但是其他处理与用于确定透上皮抗性和生存力的含有试样的单元处理相同。也常规地以一式四份的单元确定对照，但是我们偶然对对照使用一式三份单元并且将试剂盒中剩余的4个单元用于测量未处理单元的透上皮抗性和存活性，或者我们将这些单元冰冻并解冻以确定总的LDH水平，将其作为100％细胞裂解的参比。

B.在所有实验中，将所要研究的鼻粘膜传递制剂以100μL体积应用于每个单元的上表面，该体积足够覆盖全部上表面。设定在应用于顶端表面的浓度下受试制剂的适当的体积(所需要的通常不超过100μL)而随后通过ELISA或其他指定的测定法确定活性物质的浓度。

C.对于该实验，将单元置于无架台的6孔板中：每孔含有0.9mL培养基，其足够接触该单元的多孔膜底部但是对该单元不产生任何显著的向上的流体静力压。

D.为了使误差的潜在来源最小化并且避免形成浓度梯度，在该研究的每个时间点将单元从一个含有0.9mL的孔转移到另一个孔。在下面的时间点进行这些转移(基于0时间点，此时将100μL体积的试验物质应用于上表面)：15分钟、30分钟、60分钟，和120分钟。

E.在时间点之间，将平板中的单元保持在37℃培养箱中。含有每孔0.9mL培养基的平板也保持在培养箱中从而当移去平板和用无菌镊子将单元从一个孔转移到另一孔时的短暂时间内温度的改变最小。

F.每个时间点完成时，从孔中除去培养基，从该孔转移每个单元，并将培养基等分到两管(一个管接受700μL，另一管接受200μL)以确定渗透的试验物质的浓度，如果试验材料时细胞毒性的，以从上皮释放胞质溶胶酶、乳酸脱氢酶。如果将在24小时内实施测定，那么将这些样品保存在冰箱中，或者进行亚等分并在-80℃冰冻保存直到一旦解冻后就用于测定。将避免反复冰冻-解冻循环。

G.为了使错误最小，在开始实验前将所有管、平板，和孔都预先标记。

H.在120分钟时间点末，将单元从最后一个含有0.9mL的孔转移到24孔微量培养板，其每孔含有0.3mL培养基。该体积再次足够接触单元的底部，但是不会对单元造成向上的流体静力压。在测量跨上皮抗性时将单元返回到培养箱。

3.实验方案-跨上皮电阻

A.呼吸道上皮细胞在体内和体外都形成紧密连接，限制溶质穿过该组织的流动。这些连接在离体气道组织中赋予几百欧姆×cm²的跨上皮电阻；在MatTek EpiAirway单元中，生产商声称跨上皮电阻(TER)通常为约1000欧姆×cm²。我们已经发现在渗透研究中的步骤顺序期间被假暴露的对照EpiAirway单元的TER有点低(700-800欧姆×cm²)，但是因为小分子的渗透与TER的倒数成比例，所以该值仍然足够高而提供渗透的主要屏障。相反，无细胞的底部为多孔膜的单元提供了仅仅最小的跨膜电阻(5-20欧姆×cm²)。

B.TER的准确确定需要欧姆计的电极放置在膜的上面和下面的显著的表面面积，并且电极与膜之间的距离可以被再现地控制。MatTek推荐并且用于这里所有实验的TER确定方法使用来自World Precision Instruments，Inc.，Sarasota，FL的“ENDOHM”^TM上皮欧姆计和“ENDOHM”^TM组织电阻测量室。

C.在TER测定前向室中最初装入Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(PBS)至少20分钟以便平衡电极。

D.用室中的1.5mL PBS和被测量的底部为膜的单元中的350μL PBS测定TER。将顶部电极调节到刚好高于不含有细胞(但是含有350μL PBS)的一个单元的膜，然后固定以确保可再现的定位。无细胞单元的电阻通常为5-20欧姆×cm²(“背景电阻”)。

E.一旦准备了该室并且记录了背景电阻，那么将用于渗透测定的24孔板从培养箱除去并单独置于用于TER测定的室中。

F.首先将每个单元转移到含有PBS的培养皿中以确保膜底部被湿润。向该单元加入350μL PBS等分试样，然后小心吸入标记的管中以洗涤上表面。对该单元用350μL PBS再次洗涤并吸入相同的收集管中。

G.将该单元仅在置于室(含有新鲜的1.5mL PBS等分试样)之前轻轻在该单元的外表面印迹除去过多PBS。将350μL PBS等分试样加入该单元后将顶部电极置于室的上面并在EVOM计上读TER。

H.在ENDOHM室中读出该单元的TER后，除去该单元，吸出PBS并保留，并将该单元返回到含有每孔0.3mL培养基的24孔板，其中该单元的上表面有空气界面。

I.以下面的顺序读取这些单元：所有假处理的对照，然后是所有制剂处理的样品，接着是每个假处理的对照的第二次TER读数。所有TER测定完成后，将24孔微量培养板中的单元返回到培养箱中以通过MTT还原确定生存力。

4.实验方案-通过MTT还原测定生存力

MTT是一种细胞可渗透的四唑盐，其被具有完整线粒体功能的存活细胞的线粒体脱氢酶活性或者来自能够产生呼吸爆发的细胞的非线粒体NAD(P)H脱氢酶活性还原成不可溶的有色甲月替。甲月替的形成是上皮细胞生存力的良好指示剂，因为这些细胞不产生显著的呼吸爆发。我们为它们的单位使用了MatTek Corp生产的MTT试剂试剂盒以评估生存力。

A.MTT试剂作为浓缩物提供并且在测定生存力的当天(通常在该天的下午，其中在上午确定渗透动力学和TER)将MTT试剂稀释成基于专利DMEM的稀释液。使用前通过简单离心除去不溶试剂。最终MTT浓度为1mg/mL。

B.将最终MTT溶液以每孔300μL的体积加到24孔微量培养板的孔中。如上面已经提到的，该体积足够接触EpiAirway单元的膜，但是不对细胞造成显著的正流体静力压。

C.从24孔板除去单元，其中TER测量后这些单元被置于该24孔板中，从单元的外表面除去过多液体后，将这些单元转移到含有MTT试剂的平板中。然后将平板中的单元置于含有5％CO₂气体的培养箱中37℃下保持3小时。

D.在3小时温育结束时，含有存活细胞的单元将已经呈现可见的紫色。必须从单元中的细胞提取不可溶的甲月替以定量MTT还原程度。如前面从单元的外表面除去过多液体后，将单元转移到含有每孔2mL提取溶液的24孔微量培养板实施甲月替的提取。该体积足够完全覆盖单元的膜和上表面。在防光的室中室温下过夜继续进行提取。MTT提取剂通常含有高浓度去污剂并破坏细胞。

E.提取结束时，将来自每个单元内的流体及其周围孔中的流体合并并转移到管中以随后等分到96孔板(200μL等分试样是最佳的)并在Vmax多孔微量培养板分光光度计上测定570nm处的吸收。为了确保来自提取的单元的碎片的浊度不影响吸收，还为VMax中的每个孔中确定650nm处的吸收并从570nm处吸收自动减去。用于测定甲月替吸收的“空白”是提取剂的200μL等分试样，没有单元暴露于该提取剂。假定该吸收值构成0生存力。

F.在渗透动力学和TER测定期间都未处理来自24个EpiAirway单元的每个试剂盒的两个单元。这些单元用作100％细胞生存力的阳性对照。在我们实施的所有研究中，在这些未处理的单元中的细胞中的生存力与对照单元中的细胞中的生存力之间没有统计学显著差异，其中对照单元已经被假处理用于渗透动力学并且还对对照单元进行了TER测定。用受试制剂处理的所有单元的吸收被假定与用MTT温育时单元中的细胞的百分生存力成比例。应该指出通常将试验材料导入上表面后4小时就通常实施该测定，并在TER测定期间随后洗涤单元的上表面。

5.通过LDH释放确定生存力

尽管通过MTT还原测量线粒体还原酶活性是细胞生存力的灵敏探针，但是该测定必须破坏细胞并且因此仅可以在每个研究的末尾实施。当细胞经历坏死裂解时，它们的胞质溶胶内容物流到周围培养基中，并且可以在该培养基中检测胞质溶胶酶如乳酸脱氢酶(LDH)。可以对渗透动力学的两小时测定的每个时间点除去的培养基样品测定该培养基中的LDH。从而，可以检测直到经过大量时间后在发生的制剂的细胞毒性效果，还可以检测制剂暴露于气道上皮头几分钟内诱导的细胞裂解效果。

A.用于评估EpiAirway单元的细胞裂解的推荐的LDH测定是基于乳酸向丙酮酸的转化并从NAD产生NADH。然后NADH被再氧化，同时还原四唑盐INT，该反应由粗“心肌黄酶”制剂催化。INT的还原形成的甲月替是可溶的，从而可以在含有乳酸、NAD、心肌黄酶和INT的同质水性介质中实施LDH活性的全部测定。

B.对从围绕EpiAirway单元的“上清液”培养基并在每个时间点收集的样品的50μL等分试样实施LDH活性的测定。这些样品在冰箱中储存不超过24小时或者收集后几小时内冰冻后解冻。在应用受试物质后15分钟、30分钟、1小时和2小时处收集每个EpiAirway单元产生的上清液培养基样品。将等分试样都转移到96孔微量培养板中。

C.没有暴露于单元的培养基的50μL等分试样被用作“空白”或者0％细胞毒性的阴性对照。我们已经发现测定试剂混合物与未暴露的培养基的反应后存在的“内源”LDH的表观水平在实验误差内与在实施渗透动力学研究所需的2小时完整时间内所有假处理的对照单元释放的LDH的表观水平相同。从而，在实验误差内，在渗透动力学测定的时间内这些假处理的单元没有显示处上皮细胞的细胞毒性。

D.为了制备上清液培养基的样品，该培养基反映单元中100％的细胞已经裂解后LDH释放的水平，将没有受到任何以前的操作的单元加入如在确定渗透动力学的方案中的含有0.9mL培养基的6孔微量培养板的孔中，在-80℃冰冻含有该单元的板，并解冻该孔的内容物。该冰冻-解冻循环有效裂解细胞并将它们的胞质溶胶内容物，包括LDH释放到上清液培养基中。将来自冰冻和解冻循环的培养基的50μL等分试样加入96孔板作为反映100％细胞毒性的阳性对照。

E.向含有上清液培养基的等分试样的每个孔加入LDH测定试剂的50μL等分试样。然后在黑暗中将板温育30分钟。

F.通过加入1M乙酸的“中止”溶液结束反应，并且加入中止溶液的1小时内，在490nm确定板的吸收。

G.百分数细胞裂解的计算是基于假定即吸收和细胞裂解之间的线性关系，从单独的培养基的得到的吸收作为0％细胞裂解的参比，从冰冻并解冻单元周围的培养基得到的吸收作为100％细胞裂解的参比。

6.ELISA测定

确定作为受试物质的生物活性剂的浓度的方法用于评估与本发明的粘膜传递增强剂协同施用或者组合配制的活性剂的增强的渗透，这些方法通常如上面描述并且按照公知的方案和用于每个具体测定的ELISA试剂盒的特定生产商的使用说明书。通常通过生物活性剂与顶部上皮细胞表面接触(可以是顶部细胞表面暴露于传递增强剂同时或之后)后在多个时间点(例如，15分钟、30分钟、60分钟，和120分钟)测量来测定生物活性剂的渗透动力学。

通过肽YY神经肽Y，和胰腺肽的免疫学测定可以确定测定哺乳动物受试者中血清、中枢神经系统(CNS)组织或流体、脑脊液(CSF)、或其他组织或流体中肽YY神经肽Y，和胰腺肽的浓度的步骤。确定作为受试物质的肽YY神经肽Y，和胰腺肽的浓度的步骤用于评估与本发明的粘膜传递增强剂系统施用或组合配制的活性剂的增强的渗透，这些步骤通常如上面描述并按照公知的方法和放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)，和肽YY神经肽Y，和胰腺肽的免疫组织化学的抗体试剂的具体生产商使用说明书。Bachem AG(King of Prussia，PA)。

EpiAirway^TM组织膜被培养于酚红和无氢化可的松的培养基(MatTekCorp.，Ashland，MA)中。将组织膜在37℃培养48小时以允许组织平衡。将每个组织膜置于含有0.9mL无血清培养基的6-孔板的单个孔中。将100μL制剂(试样或对照)施用于膜的上表面。在每个测定中评估每个试样(粘膜传递增强剂联合生物活性剂肽YY)的一式三份或一式四份样品和对照(仅生物活性剂肽YY)。在每个时间点(15、30、60和120分钟)将组织膜转移到含有新鲜培养基的新孔中。在每个时间点收获下面的0.9mL培养基样品并在4℃保存等待用于ELISA和乳酸脱氢酶(LDH)测定中。

ELISA试剂盒通常是两步三明治ELISAs：将所研究的试剂的免疫反应性形式首先通过固定在96孔微量培养板上的抗体“捕获”，并且从孔洗除未结合的物质后，让“检测”抗体与结合的免疫反应性试剂反应。该检测抗体通常偶联酶(最通常为辣根过氧化物酶)，然后通过用生色试剂测量其活性来测量结合到板中免疫复合物的酶的量。除了在渗透动力学研究中每个时间点收集的上清液培养基的样品，还测定了ELISA板中应用于动力学研究开始时单元的上表面的制剂(即，含有主题生物活性试剂)的适当稀释的样品，以及一组生产商提供的标准参照物。通常通过ELISA在一式两份的孔中测定每个上清液培养基样品(将回想起对于渗透动力学测定中每种制剂所用的一式四份单元，产生在所有4个时间点收集的上清液培养基的共16个样品)。

A.ELISA完成后，上清液培养基的样品中或者应用于单元的上表面的物质的稀释样品的活性试剂的表观浓度位于标准参照物的浓度范围之外是不寻常的。没有通过标准参照物的浓度的外推来确定实验样品中存在的物质的浓度；相反，将样品适当稀释以产生受试物质的浓度，该浓度可以通过重复ELISA中标准参照物之间的内插法更准确的确定。

B.生物活性试剂，例如，肽YY的ELISA在其设计和推荐的方案中是独特的。不像多数试剂盒，该ELISA使用了两种单克隆抗体，一种用于捕获，另一种针对生物活性试剂，例如肽YY的非重叠的决定簇，该单克隆抗体作为检测抗体(该抗体偶联到辣根过氧化物酶)。只要实验样品中存在低于该测定上限的肽YY浓度，那么该测定方案就可用作每个生产商的使用说明，其允许将ELISA板上的样品与存在的两种抗体同时温育。当样品中肽YY水平显著高于该上限时，免疫反应性肽YY的水平可以超过温育混合物中抗体的量，并且没有结合检测抗体的某些肽YY可以被捕获在板上，而结合检测抗体的某些肽YY可能不被捕获。这导致对样品中肽YY水平的严重低估(看起来这种样品中肽YY水平显著低于该测定的上限)。为了消除该可能性，已经改进了测定方案：

B1.在不存在任何检测抗体时，将稀释的样品首先在含有固定的捕获抗体的ELISA板上温育。温育1小时后将孔洗涤掉未结合的物质。

B2.将检测抗体与板温育1小时以允许以所有捕获的抗原形成免疫复合体。检测抗体的浓度足够与被捕获抗体结合的肽YY的最大水平反应。然后再次洗涤板以除去任何未结合的检测抗体。

B3.向板加入辣根过氧化物酶并温育15分钟以允许发生显色。

B4.将“中止“溶液加入板，并在VMax微量培养板分光光度计中450nm和490nm处读吸收。490nm处有色产物的吸收比450nm处的低得多，但是在每个波长下的吸收仍然与产物的浓度成比例。这两个读数确保在VMax仪器的工作范围内(我们通常将范围限制为0到2.5OD，尽管据报导该仪器在0到3.0OD的范围内是准确的)吸收与结合的肽YY的量线性相关。通过从ELISA中包括的不同标准参照物所得的OD值之间插入法确定样品中肽YY的量。OD读数在从标准参照物所得的范围之外的样品被再次稀释并在重复ELISA中运行。

结果

通过TER测定测量跨上皮电阻：最终测定时间点后，将膜置于24孔培养板的单个孔中0.3mL清洁培养基中并使用EVOM EpithelialVoltohmmeter和Endohm室(World Precision Instruments，Sarasota，FL)测量跨上皮电阻(TER)。将顶部电极调节到接近但是不接触膜的上表面。从它们的各自孔一次一个地除去组织，并将基底面浸入干净的PBS中洗涤。用PBS轻轻冲洗上表面。将组织单元置于Endohm室，向插入物加入250μLPBS，移去顶部电极并测量和记录电阻。测量后，倒出PBS并将组织插入物返回到培养板中。所有TER值被作为组织的表面面积的函数报告。

如下计算最后的数目：

细胞膜的TER＝(插入物与膜的电阻(R)-空白插入物的R)×膜的面积(0.6cm²)

图1中显示了含有肽YY和鼻内传递增强剂的药物制剂对穿过EpiAirway^TM细胞膜(粘膜上皮细胞层)的TER测量的影响。TER值相对于对照值(对照＝约1000欧姆-cm²；标准化到100)的减少表明细胞膜电阻的减小和粘膜上皮细胞透性的增加。

代表性肽YY制剂(制剂P)表现出细胞膜电阻的最大减小(表2)。结果表明该代表性制剂(例如，制剂P)在所试验的浓度下将膜的电阻减小到对照的1％以下。所示的值是每种制剂的三个平行测定的平均值。制剂A和B是将含有60μg肽Y_3-36的肽YY(Bachem AG，King of Prussia，PA)在pH7.4或5.0的100ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重构制备的对照。没有粘膜传递增强剂的肽YY不降低电阻。

结果表明肽YY的增强的鼻内传递的代表性制剂(例如，制剂P)降低了细胞膜电阻并显著增加了粘膜上皮细胞透性。该代表性制剂将增强肽YY向血清或中枢神经系统组织或流体的鼻内传递。该结果表明这些代表性制剂当与粘膜上皮接触时导致肽YY的粘膜上皮细胞透性的显著增加。

表2：含有肽YY和鼻内传递增强剂的药物制剂对EpiAirway细胞膜的跨上皮电阻(TER)的影响

制剂	粘膜传递增强剂	％TER
			A	PBS pH7.4(对照1)	100
B	PBS pH5.0(对照2)	100
			C	L-精氨酸(10％w/v)	47.88
D	聚-L-精氨酸(0.5％w/v)	3.96
			E	γ-环糊精(1％w/v)	91.67
F	α-环糊精(5％w/v)	88.91
			G	甲基-β-环糊精(3％w/v)	97.51
H	正-癸酸钠(0.075％w/v)	47.72
			I	壳聚糖(0.5％w/v)	4.77
J	二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱(3.5％w/v)	0.49
			K	S-亚硝基-N-乙酰基-青霉胺(0.5％w/v)	44.35
L	棕榈酰-DL-肉碱(0.02％w/v)	1.76
			M	泊洛沙姆-127(0.3％w/v)	97.57
N	硝普钠(0.3％w/v)	92.41
			O	甘胆酸钠(1％w/v)	14.25
P	F1：明胶、DDPC、MBCD、EDTA	0.65

通过ELISA测定测量的渗透动力学：如上面描述的测量含有肽YY和鼻内传递增强剂的本发明的药物制剂对肽YY穿过EpiAirway^TM细胞膜(粘膜上皮细胞层)的渗透的影响。结果在表3中显示。通过ELISA测定测量肽YY穿过EpiAirway^TM细胞膜的渗透。

对于本发明的代表性鼻内制剂(例如，制剂P)，在制剂P中发生肽YY渗透的最大增加，如表3中所示。该方法使用ELISA测定在多个时间点测定已经从上皮细胞渗透到周围培养基的生物活性肽YY的浓度。结果表明与制剂A或B(肽YY对照制剂，60μg肽YY_3-36溶于100ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH7.4或5.0；Bachem AG，King of Prussia，PA)相比制剂P中的肽YY的渗透增加。使用制剂P在120分钟内渗透的累积增加的平均值比制剂A或B对照大约1195倍。

表3：通过ELISA测定法测量含有肽YY和鼻内传递增强剂的药物制剂对肽YY穿过EpiAirway细胞膜的影响

	制剂肽YY3-36(60μg/100ml)	时间点(分钟)处的％渗透					总％渗透	渗透的增加倍数
											0	15	30	60	120
A	PBS pH7.4(对照1)	0	0.00171	0.00096	0.00451	0.00327	0.01	1
									B	PBS pH5.0(对照2)	0	0.00093	0.00048	0.00042	0.00367	0.01	1
C	L-精氨酸(10％w/v)	0	0.00119	0.00277	0.00685	0.00566	0.02	2
									D	聚-L-精氨酸(0.5％w/v)	0	0.00324	0.01587	0.10395	0.49656	0.62	62
E	γ-环糊精(1％w/v)	0	0.00017	0.00042	0.00028	0.0035	0	1
									F	α-环糊精(5％w/v)	0	0.00031	0.000745	0.00147	0.0031	0.01	1
G	甲基-β-环糊精(3％w/v)	0	0.00028	0.00038	0.00059	0.01028	0.01	1
									H	正-癸酸钠(0.075％w/v)	0	0.0004	0.00131	0.00448	0.00821	0.01	1
I	壳聚糖(0.5％w/v)	0	0.00086	0.01098	0.09749	0.82126	0.93	93
									J	二癸酰基L-α-磷脂酰	0	0.00934	0.02	0.08507	1.9642	2.08	208

	胆碱(3.5％w/v)
									K	S-亚硝基-N-乙酰基-青霉胺(0.5％w/v)	0	0.00074	0.0032	0.0688	0.90432	0.98	98
L	棕榈酰-DL-肉碱(0.02％w/v)	0	0.00378	0.03422	0.15141	1.31011	1.5	150
									M	泊洛沙姆-127(0.3％w/v)	0	0.00025	0.00027	0.00066	0.00395	0.01	1
N	硝普钠(0.3％w/v)	0	0.00171	0.00114	0.00079	0.05492	0.05	5
									O	甘胆酸钠(1％w/v)	0	0.00325	0.00313	0.09023	0.70214	0.8	80
P	F1：明胶、DDPC、MBCD、EDTA	0	0.05864	1.3972	2.9799	7.519	11.95	1195

MTT测定：使用MTT-100，MatTek试剂盒实施MTT测定。向每孔加入300mL MTT溶液。用干净的PBS轻轻冲洗组织插入物，并将其置于MTT溶液中。样品在37℃温育3小时。温育后，用每孔2.0mL提取剂溶液浸没细胞培养插入物以完全覆盖每个插入物。将提取板覆盖并密封以减小蒸发。在室温下黑暗中继续过夜提取。提取时期完成后，混合提取溶液并将其吸入96孔微量滴定板中。装入一式三份的每种样品以及提取剂空白。然后在平板读出器(Molecular Devices)上550nm下测量样品的光密度。

表4中显示了与对照制剂(制剂A或B)相比含有按照本说明书的教导的肽YY的增强的鼻粘膜传递的代表性制剂(例如，制剂P)的MTT测定。含有肽YY和一种或多种传递增强剂的制剂，例如制剂P(实验三次平行进行)的结果表明该代表性实施方案对粘膜上皮组织的生存力的毒性效果最小。

表4：含有肽YY和鼻粘膜传递增强剂的药物制剂对EpiAirway细胞膜的生存力的影响(通过％MTT显示)

制剂	处理	％MTT
			A	PBS pH7.4(对照1)	100
B	PBS pH5.0(对照2)	100
			C	L-精氨酸(10％w/v)	91.54
D	聚-L-精氨酸(0.5％w/v)	79.39
			E	γ-环糊精(1％w/v)	100
F	α-环糊精(5％w/v)	96.63
			G	甲基-β-环糊精(3％w/v)	100
H	正-癸酸钠(0.075％w/v)	100
			I	壳聚糖(0.5％w/v)	100
J	二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱(3.5％w/v)	94.25
			K	S-亚硝基-N-乙酰基-青霉胺(0.5％w/v)	97.64
L	棕榈酰-DL-肉碱(0.02％w/v)	91.77
			M	泊洛沙姆-127(0.3％w/v)	100
N	硝普钠(0.3％w/v)	100
			O	甘胆酸钠(1％w/v)	100
P	F1：明胶、DDPC、MBCD、EDTA	88.75

LDH测定：表5中显示了含有按照本说明书的教导的肽YY的增强的鼻粘膜传递的代表性制剂(例如，制剂P)的LDH测定。制剂P的三次平行测定的结果表明该代表性制剂对粘膜上皮组织的生存力的毒性效果最小。

表5：含有肽YY和鼻粘膜传递增强剂的药物制剂对EpiAirway细胞膜的生存力的影响(通过％死亡细胞显示)(LDH测定)

制剂	处理	％死亡细胞
			A	PBS pH7.4(对照1)	1.0
B	PBS pH5.0(对照2)	1.1
			C	L-精氨酸(10％w/v)	0.8
D	聚-L-精氨酸(0.5％w/v)	1.4
			E	γ-环糊精(1％w/v)	0.8
F	α-环糊精(5％w/v)	0.7
			G	甲基-β-环糊精(3％w/v)	0.8
H	正-癸酸钠(0.075％w/v)	1.3
			I	壳聚糖(0.5％w/v)	0.7
J	二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱(3.5％w/v)	1.2
			K	S-亚硝基-N-乙酰基-青霉胺(0.5％w/v)	0.7
L	棕榈酰-DL-肉碱(0.02％w/v)	0.8
			M	泊洛沙姆-127(0.3％w/v)	1.0
N	硝普钠(0.3％w/v)	0.6
			O	甘胆酸钠(1％w/v)	0.8
P	F1：明胶、DDPC、MBCD、EDTA	2.0

实施例3

本发明的制剂P(肽YY)与曲安奈德皮质类固醇提高细胞生存力

本实施例提供了体外研究以确定联合类固醇组合物，例如，曲安奈德，还联合一种或多种鼻内传递增强剂的鼻内施用的肽YY，例如人肽YY的渗透和上皮粘膜炎症的减轻。该研究包括通过TER测定确定上皮细胞渗透性和通过应用含有肽YY和曲安奈德的实施方案在MTT测定中的细胞生存力测量上皮粘膜炎症的减轻。

制剂P(见上表1)与0.5、2.0、5.0或50μg剂量的曲安奈德制剂组合。用于季节性过敏性鼻炎的曲安奈德(Nasacort^，Aventis Pharmaceuticals)的正常剂量为每次喷雾55μg。与曲安奈德皮质类固醇组合的制剂P提高了细胞存活力(通过MTT测量)，而保持上皮细胞透性(通过TER和ELISA测定法测量)。

根据本发明的方法和制剂，通过跨上皮电阻(TER)测定在EpiAirway^TM细胞膜中实施了存在或不存在曲安奈德时制剂P的渗透性的测量。制剂P加每次喷雾为0.5、2.0、5.0或50μg浓度的曲安奈德的TER测定表明肽YY渗透性不降低并且等于仅制剂P时的渗透性。制剂P加浓度为每次喷雾为0到50μg的曲安奈德的渗透性通常比制剂A或B(肽YY对照)的渗透性大至少10倍到100倍。

根据本发明的方法和制剂，通过ELISA测定在EpiAirway^TM细胞膜中实施了存在或不存在曲安奈德时制剂P的渗透性的测量。类似于上面的TER测定，制剂P加每次喷雾为0.5、2.0、5.0或50μg浓度的曲安奈德的ELISA测定表明肽YY渗透性不降低并且等于仅存在制剂P时的渗透性。制剂P加浓度为每次喷雾为0到50μg的曲安奈德的渗透性通常比制剂A或B(肽YY对照)的渗透性大。

根据本发明的方法和制剂，MTT测定法测量存在或不存在曲安奈德时制剂P的细胞生存力。通常，与不存在曲安奈德的制剂P相比，将曲安奈德(浓度为每次喷雾0.5、2.0、5.0或50μg)加入制剂P提高了细胞生存力。

与不存在曲安奈德的制剂P相比，将曲安奈德加入制剂P提高了细胞生存力并保持上皮细胞透性(通过TER测定法测量)。

用肽YY联合一种或多种类固醇或皮质类固醇化合物的鼻内制剂实现了鼻内施用的肽YY的上皮粘膜炎症的减轻，该类固醇或皮质类固醇化合物通常为高效力化合物或制剂，但是在某些情况中为中等效力，或者低效力化合物或制剂。给出了高、中和低效力类固醇的总体效力(等价剂量)。通常，肽YY与高效力类固醇组合物的鼻内制剂包括，但不限于，倍他米松(0.6到0.75mg剂量)，或者地塞米松(0.75mg剂量)。在备选制剂中，肽YY联合中等效力类固醇组合物的鼻内制剂包括，但不限于，甲泼尼龙(4mg剂量)、曲安西龙(4mg剂量)，或泼尼松龙(5mg剂量)。在另一备选制剂中，肽YY联合低效力类固醇组合物的鼻内制剂包括，但不限于氢化可的松(20mg剂量)或可的松(25mg剂量)。

实施例4

制备不含作为稳定剂的蛋白质的PYY制剂

制备了适于鼻内施用PYY的PYY制剂，其基本上不含作为稳定剂的蛋白质，该制剂具有下面所里的配方：

1.将约3/4水加入烧杯并用搅拌棒在搅拌盘上搅拌并加入柠檬酸钠直到其完全溶解。

2.然后加入EDTA并搅拌直到其完全溶解。

3.然后加入柠檬酸并搅拌直到其完全溶解。

4.然后加入甲基-β-环糊精并搅拌直到其完全溶解。

5.然后加入DDPC并搅拌直到其完全溶解。

6.然后加入乳糖并搅拌直到其完全溶解。

7.然后加入山梨糖醇并搅拌直到其完全溶解。

8.然后加入氯丁醇并搅拌直到其完全溶解。

9.加入PYY 3-36并轻微搅拌直到其溶解。

10.检查pH以确保其为5.0±0.25。加入稀HCl或者稀NaOH调节pH。

11.加入水定容。

表6

试剂	等级	供应商	mg/mL	％
					无水氯丁醇	NF	Spectrum	5.0	0.50
甲基-β-环糊精		Sigma	45	4.5
					二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱		Sigma	1	0.1
EDTA二钠	USP	Dow Chemicals	1	0.1
					二水合柠檬酸钠	USP	Spectrum	1.62	0.162
柠檬酸，无水	USP	Sigma	0.86	0.086

一水合α-乳糖		Sigma	9	0.9
					山梨糖醇		Sigma	18.2	1.82
PYY 3-36	GMP	Bachem	1	0.1
					纯化水

制剂pH5+/-0.25

摩尔渗透压浓度～250

实施例5

如上面制备第二种制剂，只是PYY 3-36为15mg/mL，如表7中所示。

表7

试剂	等级	供应商	mg/mL	％
					无水氯丁醇	NF	Spectrum	5.0	0.50
甲基-β-环糊精		Sigma	45	4.5
					二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱		Sigma	1	0.1
EDTA二钠	USP	DowChemicals	1	0.1
					二水合柠檬酸钠	USP	Spectrum	1.62	0.162
柠檬酸，无水	USP	Sigma	0.86	0.086
					一水合α-乳糖		Sigma	9	0.9
山梨糖醇		Sigma	18.2	1.82
					PYY 3-36	GMP	Bachem	15	0.1
纯化水

制剂pH5+/-0.25

实施例6

确定PYY的最适pH40℃下测定对于pH的PYY_3-36稳定性，测定时间为5天。

A.配制PYY(3-36)/pH稳定性研究样品的方案

摩尔渗透压浓度：目标250mM

使用柠檬酸/柠檬酸钠，tri-碱缓冲液，10mM

摩尔渗透压浓度＝no.微粒×摩尔浓度

              ＝(1+4)×10mM＝50mM

因此，用100mM NaCl(2微粒)将摩尔渗透压浓度调节到250mM。

B.如下制备稳定性样品(3500μl)

终浓度

柠檬酸缓冲液1400μL 25mM(所需要的终pH)10mM

PYY 700μl 1.5mg/mL 300μg/ml

氯丁醇 350μl 2.5％，0.25％

NaCl，350μl 1.0M，100mM

检查pH并且如果需要，调节pH

用水补充到3500μL

步骤：

自动取样器小瓶中200μl sialanized插入物中的120μl样品

3次/时间点

样品在40℃温育5天

C.稳定性混合物的目标pH和试剂最终pH的比较

目标pH                        实际pH

3.0                            2.99

3.5                            3.47

4.0                            3.90

4.5                            4.42

5.0                            4.90

7.0                7.38

D.HPLC步骤

柱子：Waters C18Bondapak 10μm 4.6×300mm

HPLC系统：Waters Alliance 2690

检测器：Waters 2487双波长，220nm下

流速：1ml/mim

注射体积：30μl

柱温：30℃

移动相：

缓冲液A：水中的0.1％TFA，1％乙腈

缓冲液B：乙腈的0.11％TFA

梯度：

时间(分钟)           ％A            ％B

0                    75              25

17                   42              58

19                   75              25

28                   75              25

E.结果和结论

结果表明在用于该研究的具体情况下，稳定性的最适pH为4.90。当pH从2.99升高到4.90时稳定性从76增加到87％。

在更高pH，即7.38下，PYY_3-36的稳定性急剧下降，只剩下时间0时稳定性的15％。

实施例7

鼻内制剂开发

与低分子量治疗剂相比，肽和蛋白是相对脆弱的分子。制剂开发阶段的目的是鉴定适于鼻内传递的候选制剂。为了实现该目标，试验了各种候选试剂以鉴定具有可接受的药物稳定性、经过比粘膜的传递、毒性和防腐剂效果的制剂。

最初，检查了pH效果。图1显示了高温(40℃下)从3.0到7.4的各种pH下PYY_3-36的稳定性。在生理pH下，在高温下药物大量损失。在约pH5.0实现了最佳稳定性。选择该pH用于进一步的制剂优化。

为了进一步优化稳定性，试验了各种稳定剂促进药物穿过鼻粘膜的能力。基于能够打开紧密连接并具有有限细胞毒性选择所试验的增强剂。为了实现该目的，使用原代人上皮细胞模型(EpiAirway，MatTek，Inc.，AshlandMA)。该细胞系形成假分层的柱状上皮细胞层，其紧密连接类似于在鼻中发现的呼吸上皮。将药物制剂置于组织层的顶上边，对基础培养基实施药物定量。通过跨上皮电阻(TEER)的降低测量紧密连接打开的程度。分别通过MTT和LDH测定监视细胞生存力和细胞毒性。在图2-5中描绘了来自代表性筛选实验的数据。

图2显示了TEER的数据。在一些情况中，与对照相比TEER几乎没有或没有减少，表明紧密连接保持关闭。在其他情况中，TEER显著降低，表明紧密连接打开。结果表明体外细胞模型能够区分不同制剂打开和关闭紧密连接的能力。在所试验的候选制剂中，细胞生存力(图3；MTT)良好并且细胞毒性(图4；LDH)低。

总之，试验了200种以上的不同制剂，反映了体外筛选模型的高通量性质。使用所有可利用的数据，实施多变量分析以阐明每种制剂组分对7个输出变量(药物渗透性、摩尔渗透压浓度、在冰冻和加速条件下的稳定性、TEER、和MTT和LDH测定)的每一个发挥的影响。多变量分析由与输出参数的一定水平的相关性的每种制剂组分的最初稳定性组成(p＜0.1)。对于所鉴定的子集，使用线性回归或逐步对数选择模型。结果表明一种赋形剂与摩尔渗透压浓度和毒性相关(r²分别＝0.91和0.27)，两种与PYY_3-36渗透相关(r²＝0.44)，三种影响稳定性(r²＝0.24)，5种影响细胞侧电阻(r²＝0.55)。通过该方法确定的最佳试剂与简单缓冲溶液相比使PYY_3-36运输增加了至少30-75倍。

基于这些分析，选择优化的PYY_3-36制剂用于进一步开发。该优化的制剂含有乙酸钠缓冲液(pH5.0)中的两种稳定剂、两种渗透增强剂、一种螯合剂，和一种防腐剂。该制剂通过了USP防腐剂有效性试验。图5中给出了各种组分对药物渗透的协同性贡献。与在相同摩尔渗透压浓度下的简单缓冲制剂相比，优化制剂显示出药物渗透增加100倍以上。

最后，制备了优化制剂的临床前和临床批次并在终产物包装中放置稳定在5℃和25℃下。表8中给出的初步数据揭示在5℃或25℃下1个月后药物基本上不含损失。

	5℃	25℃
			时间点	％PYY	％PYY
0	100.0	100.0
			3天	99.8	100.1
7天	102.6	98.4
			10天	103.3	101.7
2周	101.4	97.9
			3周	100.3	95.4
1个月	100.5	96.3
			1.5个月	100.1	-
2个月	99.8	-

总之，我们的制剂开发方法产生了一种PYY_3-36制剂，其具有适当的药物稳定性、穿过鼻粘膜的传递、毒性和防腐剂有效性，这使得该制剂能够传递4kD的肽。

临床前研究

迄今，已经完成了在大鼠、兔、和狗中的一系列6种临床前研究。通过确认的专利的放射免疫测定方法确定所有物种中血浆PYY_3-36水平。

在大鼠中测定的生物利用度(血浆中鉴定的药物的摩尔部分除以经鼻施用的量)约为6％，在兔中为约8％。这些值可能低估了真实的生物利用度，因为尽管存在蛋白酶抑制剂，但是采样前血浆中的肽降解，或者采样后的降解将减小所测量的生物利用度。

在长达14个连续日内以所预期的人临床剂量的50倍的剂量(基于mg/kg)评估了大鼠和兔中的鼻毒性。对于试验物品没有显微镜或总体上的病理学发现。没有临床观察。

在大鼠和兔模型中评估了静脉内施用后的全身毒性。在所预期的人剂量的高达约160倍的IV剂量(大鼠中400μg/kg，兔中205μg/kg)下没有受试物品相关的微观和宏观发现。

以研究设计的剂量范围在被麻醉的狗中评估心血管毒性。最高剂量——60分钟内高达24μg/kg的PYY_3-36输注相当于基于身体表面积的所预期的人剂量的33倍。所得血浆水平为30ng/mL，是狗基底血浆水平的约380倍。在该血浆水平，对动脉血压、股动脉血流，或者QTc没有影响，并且心率(平均从123到148bpm)和呼吸率(从54到36)仅有微小改变。

在这些临床前研究中收集药物动力学数据。在图6、7和8中显示了来自大鼠的一个研究的各种剂量下鼻内施用后血浆水平。图6表明5分钟内在血浆中发现PYY_3-36，在10-15分钟内达到峰值血浆浓度(Tmax)，末期清除半寿期为约15分钟。C_max和AUC_0-t关于鼻内剂量都是线性的。

临床研究

已经开始了剂量范围临床试验，其目的是建立PYY3-36的鼻内制剂的安全性、PK、和生物利用度。迄今，患者已经参加5个剂量组的头两个。一名患者报告在他的喉咙背面中有味道；迄今没有其他不利事件。

结论

已经开始了对PYY_3-36的鼻内制剂的制备、临床前和最初的临床工作。制备方法已经导致该4kD肽的膜内渗透性增加了100倍以上，并且细胞毒性无增加。临床前研究已经表明PYY_3-36的鼻、心血管和全身毒性的重要的安全性界限。基于前面的剂量范围临床研究，安排了长期施用体重减轻研究。

实施例8a

临床方案

健康人受试者中鼻内肽YY_3-36(PYY_3-36)的经鼻吸收

本研究的目的：

本研究的目的是评估鼻内施用的PYY3-36从鼻向血流的吸收。这是I期、临床、单剂量、剂量递增研究，其包括禁食的、正常的、健康男性和女性志愿者。评估了20μg到200μg之间鼻内PYY3-36的上升剂量以评价PYY3-36的安全性、鼻耐受性和吸收。还评价了每个个体中食欲感觉的评估。

将PYY_3-36施用于15名健康人，他们被分成5组，每组3个个体。

组I

对第一组施用0.1ml溶液中的20μg PYY_3-36的鼻内喷雾。

组II

第二组经鼻内接受0.1ml溶液中的50μg PYY_3-36。

组III

第三组经鼻内接受0.1ml溶液中的100μg PYY_3-36。

组IV

第四组经鼻内接受0.1ml溶液中的150μg PYY_3-36。

组V

第五组经鼻内接受0.1ml溶液中的200μg PYY_3-36。

给药后0(即给药前)、5、7.5、10、15、20、30、45、60分钟时采集血样并测定PYY的血浆浓度。受试者然后进食并且饭后30分钟采集血样并测定PYY浓度。使用有效的分析方法确定PYY_3-36的血浆浓度。

对于每名受试者，在任何可能的情况下，根据模型独立的方法，基于PYY3-36的血浆浓度计算下面的PK参数：

C_max    最大的观察浓度

t_max    浓度达到最大的时间

AUC_0-t  从时间0到最后可测量的浓度的浓度-时间曲线下的面积，通

         过线性梯形法则计算。

当数据允许准确估计这些参数时计算下面的参数：

AUC_0-∞   外推到无穷的浓度-时间曲线下的面积，使用下式计算：

AUC_0-∞＝AUC_0-t+C_t/K_e

其中C_t是最后可测量的浓度，K_e是表观末期速度常数。

K_e   表观末期速度常数，其中K_e是末期期间对数浓度对时间图

      谱的线性回归的斜率的大小。

t_1/2 表观末期半寿期(任何可能的时候)，其中t_1/2＝(In2)/K_e。

使用商业软件如WinNonlin(Pharsight Corporation，3.3版或更高版本)计算PK。结果在下图中显示。

讨论和结论

背景：

每个给药组包括三名受试者，它们被鼻内施用一次本发明的制剂，该制剂含有合成的、不含热原的人PYY_3-36的特定剂量。组织了5个给药组，制剂中的PYY_3-36剂量递增。以特定时间间隔抽取血样并置于含有肝素锂(抑制凝结)和抑肽酶(保存PYY_3-36)的血液收集管中。通过离心收集来自每个血样的血浆并保存在冰冻的等分试样中。将每种血样的一个冰冻等分试样运输到Nastech Analytical Services并且到达时是冰冻的。每种样品都保持冰冻直到通过放射免疫测定(RIA)测定PYY浓度。

观察

组1：该组受试者被给予20微克PYY_3-36。受试者的血浆PYY浓度为“小于20pg/ml”的最小值(低于放射免疫测定的定量的下限)到159pg/ml的最大值。所观察到的浓度趋势与药物向所研究的受试者的血液的显著吸收不一致。

组2：该组受试者被给予50微克PYY_3-36。受试者的血浆PYY浓度为50pg/ml的最小值到255pg/ml的最大值。所观察到的浓度趋势与药物向所研究的受试者的血液的显著吸收一致。

组3：该组受试者被给予100微克PYY_3-36。受试者的血浆PYY浓度为87pg/ml的最小值到785pg/ml的最大值。所观察到的浓度趋势与药物向所研究的受试者的血液的显著吸收一致。

组4：该组受试者被给予150微克PYY_3-36。受试者的血浆PYY浓度为45pg/ml的最小值到2022pg/ml的最大值。所观察到的浓度趋势与药物向所研究的受试者的血液的显著吸收一致。

组5：该组受试者被给予200微克PYY_3-36。受试者的血浆PYY浓度为48pg/ml的最小值到1279pg/ml的最大值。所观察到的浓度趋势与药物向所研究的受试者的血液的显著吸收一致。

这些结果与PYY3-36的依赖剂量的吸收一致。

另外观察和数据：

发现概述：

●在50μg到100μg的鼻内剂量下，存在PYY的依赖剂量的血浆吸收。

●上升的血浆浓度的持续时间比预期的显著更长，理论清除半寿期为55分钟。

●Cmax和AUC0-t显示出与剂量的良好线性。

●在给定剂量下存在重要的受试者间变异性。

●令人惊奇地，该研究不能检测饭后PYY的上升，尽管没有测量实际所吃的食物的量并且如果吃的太少，那么可以解释该观察结果。

●直观类比评分法饥饿问题表明PYY剂量增加导致饥饿降低。

●恶心和头晕目眩似乎与PYY的非常高的血浆浓度有关。

●基于该说明书中描述的测定的值似乎比文献中以前报导的值高2-3倍。

注解：

●在一些情况中，pMol/L被用作PYY测量单元；在其他分析中，使用pg/mL。转换因子为pmol/L^*4.05＝pg/mL。

●在一些情况中，150分钟时间点以图显示。严格说来，这是饭后数据点，并且可能使PK评价混淆。然而，下面更详细的描述的出乎意料的发现是30分钟饭后时间点与基线值无区别。

PYY血浆浓度：

本说明书中描述的PYY测定对于其自身的PYY血浆浓度测定已经被证实。使用该测定法，一式三份地测定每个时间点的样品。注意在180个数据点中，3个(1.6％)似乎是生物学上难以置信的“异常值”。整个该初步分析中的数据使用数据集，其中这三个数据点被除去。

表9

描述性PK参数：

所计算的PK参数包括：

	Tmax(分钟)	Cmax(pg/mL)	AUC0-最后(min*pg/mL)	AUC0-无穷(min*pg/mL)	T1/2(分钟)
						20	60	47	3850
50	18	89	4960	12379	112
						100	32	342	26535	41102	27
150	23	530	31659	39476	39
						200	23	683	34823	48618	42

对平均PK图的检查表明从50-200μg剂量的剂量应答，但是20μg剂量在噪声中。因此，许多随后的分析将基于仅来自50-200μg剂量的数据。我们还提出，因为PYY是内源分子，所以AUC 0-t比AUC0-无穷更相关。

Tmax和T1/2(清除半寿期)：

	Tmax(分钟)	T1/2(分钟)
			500-200μg剂量组的平均值：	24	55

24分钟的Tmax对于鼻产物是典型的。55分钟的清除半寿期比所预期的长得多。参考文献指出t_1/2通常为5-10分钟。清除半寿期也可以受到Tmax后发生的鼻粘膜的一定的持续摄取和影响肽代谢的制剂组分的影响。备选地，因为本说明书中描述的测定法使用提取方法，所以该测定法将捕获游离的和蛋白质结合的PYY，而不使用提取的测定法也可以首先测定游离部分。

从基线的平均VAS变化(10、30和60分钟值的平均减去基线)对剂量的该分析，观察到：

对于VAS Q1“你感觉多饿？”，受试者在接受更高PYY剂量后饥饿程度降低。

对于VAS Q3“你认为可以吃多少？”，受试者接受更高剂量PYY后认为它们可以吃的更少。

然而，对于VAS Q1“你感觉多么饱满？”，受试者接受更高剂量PYY后感觉饱满感降低。

这表明PYY施用后的感觉不包括饱满感、胃气胀，或胃超收缩。

实施例8b

PYY人施用和体重减轻

制备了下面的PYY鼻制剂。

试剂	等级	供应商	Cat#	Lot#	F.W.	Mg/ml	％
								无水氯丁醇	NF	Spectrum	CH123	RI1646	177.46	2.5	0.25
甲基-β-环糊精		Sigma	C-4555	81K1179		45	4.5

二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱		Sigma	P-7081	55H8377	565.7	1	0.1
								EDTA二钠	USP	DowChemicals		1034N-00269-2	372.2	1	0.1
二水合柠檬酸钠	USP	Spectrum	S0165	RH1056	294.1	1.6	0.16
								柠檬酸，无水	USP	Sigma	C-1857	062K003	192.13	0.9	0.09
PYY3-36，不含内毒素		Phoenix	059-02	420338	4049.71	2	0.2
								纯化水

制剂pH5+/-0.25

在10天内每天将1或2次喷雾施用于人类受试者并记录体重减轻2.5磅。在施用后10分钟到12小时的期间内，所记录的受试者饥饿感降低。

实施例9

PYY3-36的口腔制剂(预言的)

以下面的方式制备双层片剂。通过称量70份(按重量计)聚环氧乙烷(Polyox 301N；Union Carbide)、20份(按重量计)聚丙烯酸(Carbopol 934P；B.F.Goodrich)，和10份(按重量计)可压缩的木糖醇/羧甲基纤维素填充剂(Xylitab 200；Xyrofin)制备粘合层。将这些成分在缸中滚动混合3分钟。然后将混合物转移到蒸发盘中并用无水乙醇快速湿润粒化成类似半生面团的稠度。将该物质立即并快速强行通过14目(1.4mm开口)不锈钢筛，湿润粒剂粘附到该筛子。用多孔铝箔覆盖该筛子，并将湿润粒剂在30℃过夜干燥。从筛子除去干燥的粒剂并穿过20目(0.85mm开口)筛子以进一步缩小粒剂的大小。将不穿过20目筛的颗粒用研钵和研棒快速研磨使细屑的量最小，然后穿过20目筛。然后将所得粒剂置于混合缸中，并加入0.25份(按重量计)硬脂酸和0.06份(按重量计)薄荷香料(Universal Flavors)并混合成粒剂。按重量计粒剂的最终百分比为69.78％聚环氧乙烷、9.97％可压缩的木糖醇/羧甲基纤维素填充剂、19.94％聚丙烯酸、0.25％硬脂酸和0.06％薄荷香料。将50mg该混合物置于0.375英寸直径的模子上并以0.25公制吨压力在Carver Press Model C上预压缩3秒保压时间以形成粘合层。

通过称量49.39份(按重量计)甘露醇、34.33份(按重量计)羟丙基纤维素(Klucel L F；Aqualon，Wilmington，Del.)和15.00份牛磺胆酸钠(Aldrich，Milwaukee，Wis.)，并在缸中滚动混合3分钟制备活性层。然后将混合物转移到蒸发盘中并用无水乙醇快速湿润粒化成类似半生面团的稠度。将该物质立即并快速强行通过14目不锈钢筛，湿润粒剂粘附到该筛子。用多孔铝箔覆盖该筛子，并将湿润粒剂在30℃干燥。然后将干燥的粒剂顺序穿过20、40(0.425mm开口)，和60(0.25mm开口)目筛以进一步减小颗粒大小。将不穿过筛的颗粒用研钵和研棒快速研磨使细屑的量最小，然后穿过该筛子。对所筛选的颗粒称重，然后将0.91份(按重量计)PYY3-36和0.06份(按重量计)FD&C黄#6HT铝土染料顺序通过几何稀释与干燥粒剂混合。然后将干燥粒剂置于混合缸中并与0.25份(按重量计)硬脂酸镁(润滑剂)和0.06份(按重量计)薄荷香料通过滚动混合3分钟。将该材料的50mg样品置于部分压缩的粘合层的顶部并以1.0吨压力将两层都压缩3秒的保压时间以产生适于口腔传递的双层片剂。

该方法产生齿龈片剂，其中活性层含有0.91％(按重量计)PYY3-36，15％(按重量计)NaTC，和84.09％(按重量计)填充剂、润滑剂、着色剂、制剂辅助剂，或调味剂。

实施例10

根据实施例1中的步骤，比较不含内毒素的PYY3-36与非-不含内毒素的PYY3-36渗透支气管上皮的能力。已经确定不含内毒素的PYY3-36渗透支气管上皮的量约为含有内毒素的PYY3-36制剂的两倍。

两种制剂都含有氯丁醇2.5mg/ml，2mg/ml DDPC，10mg/ml白蛋白，1mg/ml EDTA和45mg/ml M-B-CD。一种制剂含有不含内毒素的PYY3-36，另一制剂含有70EUs或更多的内毒素。

含有内毒素的PYY3-36的制剂的平均MTT为91.72％，而不含内毒素的PYY3-36制剂的平均MTT为100.16％。

含有内毒素的PYY3-36的制剂的平均渗透为5.36％，而不含内毒素的PYY3-36制剂的平均渗透为10.75％。

许多公知的粘膜传递增强赋形剂可以与不含内毒素的Y2受体结合肽，尤其不含内毒素的PYY3-36有效组合，并且可用于改进非输注制剂，特别是口服传递的制剂。这些赋形剂包含在下面的专利申请中，这些申请被并入作为参考：美国专利申请20030225300、20030198658、20030133953、20030078302、20030045579、20030012817、20030012817、20030008900、20020155993、20020127202、20020120009、20020119910、20020065255、20020052422、20020040061、20020028250、20020013497、20020001591、20010039258、20010003001。

Y2受体结合肽的口服制剂

根据下面的方案可以制备Y2受体结合肽的口服制剂。口服传递的优选制剂含有约0.5mg/kg不含内毒素的PYY和100到约200mg/kg一种或多种粘膜传递增强赋形剂。

(预言的)

实施例11

N-环己酰苯丙氨酸醛的制备：

将苯丙氨酸甲基酯(1g.，0.0046摩尔)溶于5mL吡啶中。加入环己酰氯(0.62mL)并搅拌混合物2小时。将反应混合物倒入盐酸(1N)和碎冰上。用甲苯萃取水性混合物2次。真空浓缩合并的甲苯萃取物得到1.1g粗N-环己酰苯丙氨酸甲酯。

将N-环己酰苯丙氨酸甲酯(0.5g)溶于乙二醇二甲醚(20mL)中。冷却溶液到70℃并加入二异丁基氢化铝(2.04mL甲苯中的1.5M溶液)。在-70℃搅拌所得反应混合物2小时。通过逐滴加入2N盐酸淬灭反应。用冷乙酸乙酯萃取混合物。用盐水洗涤乙酸乙酯溶液并用硫酸钠干燥。真空浓缩得到白色固体，将其通过硅胶层析纯化。¹H NMR(300MHz，DMSO-d6)：9.5(s，1H)，8.2(d，1H)，7.2(m，5H)，4.2(m，1H)，3.2(d，1H)，2.7(d，1H)，2.1(m，1H)，1.6(br.m，4H)，1.2(br.m，6H).R(KBr)：3300，3050，2900，2850，2800，1700，1600，1500cm^-1。

质谱：M+1m/e 261。

实施例12

N-乙酰苯丙氨酸醛的制备：

将N-乙酰苯丙氨酸甲酯(4.2g，19mmol)溶于乙二醇二甲基酯中。溶液冷却到-70℃并加入二异丁基氢化铝(25.3mL甲苯中的1.5M溶液，39mmol)。所得反应混合物在-70℃搅拌2小时。加入2N盐酸淬灭反应。将混合物用冷乙酸乙酯萃取4次并用甲苯萃取4次。合并萃取物，用盐水洗涤并用硫酸镁干燥。真空浓缩并硅胶层析得到2.7g白色固体。NMR如文献中报导，Biochemistry，18：921-926(1979)。

实施例13

3-乙酰胺基-4-(对-羟基)苯基-2-丁酮(N-乙酰基色氨酮(tyrosinone))：

将丝氨酸(28.9g，16mmol)、乙酸酐(97.9g，96mmol)和吡啶(35g，16mmol)的混合物加热到100℃并保持1小时。真空浓缩反应混合物得到黄色油。减压蒸馏该油得到29.9g或者油。

¹H NMR(DMSO-d6)：NMR(d6-DMSO)；8.2(d，1H)，7.3(d，2H)，7.0(d，2H)，4.4(m，1H)，3.1(dd，1H)，2.7(dd，1H)，2.3(s，3H)，1.8(s，3H)。

实施例14

3-乙酰氨基-7-氨基-2-丁酮(N-乙酰赖氨酮)的制备

按照实施例3的步骤将赖氨酸转化成N-乙酰赖氨酮。

¹H NMR(DMSO-d6)：8.1(d，1H)，7.8(br.m.1H)，4.1(m，1H)，3.0(m，2H)，2.0(s，3H)，1.9(s，3H)和1.3(br.m，6H)。

实施例15

3-乙酰氨基-5-甲基-2-丁酮(N-乙酰基亮氨酮)的制备

按照实施例3的步骤将亮氨酸转化成N-乙酰亮氨酮。

¹H NMR(DMSO-d6)：8.1(d，1H)，4.2(m，1H)，2.0(s，3H)，1.8(s，3H)，0.8(d，6H)。

实施例16

用苯磺酰氯修饰4-(4-氨苯基)丁酸

将4-(4-氨基苯基)丁酸(20g，0.11摩尔)溶于110mL水性2N氢氧化钠溶液中。室温下搅拌约5分钟后，15分钟内将苯磺酰氯(14.2mL，0.11摩尔)逐滴加入氨基酸溶液中。室温搅拌约3小时后，加入盐酸将混合物酸化到pH2。这得到浅黄色沉淀，通过过滤分离该沉淀。用温水洗涤沉淀并干燥。熔点为123-25℃。

如果必要，可通过重结晶和/或层析纯化修饰的氨基酸。

实施例17

用苯磺酰氯修饰4-氨基苯甲酸

按照实施例6的方法，将4-氨基苯甲酸转化成4-(苯基磺酰氨基)苯甲酸。

实施例18

用苯磺酰氯修饰4-氨基苯乙酸、4-氨基马尿酸和4-氨基甲基苯甲酸

按照实施例6的方法，将4-氨基苯乙酸、4-氨基马尿酸和4-氨基甲基苯甲酸分别转化成4-(苯基磺酰氨基)苯乙酸、4-(苯基磺酰氨基)马尿酸、和4-(苯基磺氨基甲基)苯甲酸。

实施例19

用苯磺酰氯修饰氨基酸

化学修饰前制备16种氨基酸的混合物。该混合物的成分在下表中概述。将室温下65克氨基酸混合物([-NH₂]基团的总浓度＝0.61摩尔)溶于760mL 1N氢氧化钠溶液(0.7625当量)。搅拌20分钟后，在20分钟内加入苯磺酰氯(78ml，1当量)。然后不加热，搅拌反应混合物2.5小时。由于可能发生一定的沉淀，可以向溶液中加入另外的NaOH溶液(2N)直到其达到pH9.3。室温下过夜搅拌反应混合物。之后，用稀盐酸(38％，1∶4)酸化混合物并析出膏状有色物质沉淀。通过倾析分离所得沉淀并将其溶于氢氧化钠(2N)中。然后将该溶液真空还原得到黄色固体，将其在冰冻干燥机中干燥。

                       表10

                     氨基酸组成

氨基酸    重量(g)    ％总重量    每种氨基酸    [-NH₂]的摩尔

                                 的摩尔数            数

                                 (×10^-2)

Thr        2.47        3.8        2.07            2.07

Ser        2.25        3.46       2.1             2.1

Ala        4.61        7.1        5.17            5.17

Val        4.39        6.76       3.75            3.75

Met        0.53        0.82       0.35            0.35

Ile        2.47        3.8        0.36            0.36

Leu        3.86        5.94       2.95            2.95

Tyr        1.03        1.58       0.56            0.56

Phe        4.39        6.76       0.27            0.27

His        2.47        3.8        1.6             3.2

Lys         4.94    7.6      3.4     6.8

Arg         5.13    7.9      2.95    5.90

谷氨酰胺    9.87    15.18    6.76    13.42

谷氨酸      9.87    15.18    6.70    6.70

天冬酰胺    3.32    5.11     2.51    5.02

天冬氨酸    3.32    5.11     2.50    2.50

实施例20

用苯磺酰氯修饰5种氨基酸混合物

将氨基酸(见下表)的86.1g(0.85摩尔NH₂)混合物溶于643mL(1.5当量)的2N氢氧化钠水溶液中。室温下搅拌30分钟后，在15分钟内向该氨基酸溶液逐份加入苯磺酰氯(108mL，0.86摩尔)。室温下搅拌2.5小时后，用另外的2N氢氧化钠溶液调节反应混合物(pH5)的pH至pH9。室温下过夜搅拌反应混合物。之后，通过加入稀氢氯酸水溶液(4∶1，H₂O∶HCl)调节反应混合物的pH至pH2.5并形成修饰氨基酸沉淀。丢弃上层并将所得沉淀通过倾析分离，用水洗涤并溶于2N氢氧化钠(2N)中。所得溶液真空浓缩得到黄色固体，将其过夜冻干。

                  表11

氨基酸      氨基酸摩尔数(×10^-2)   [-NH₂]摩尔数(×10^-2)

缬氨酸            7.5                 7.5

亮氨酸            10.7                10.5

苯丙氨酸          13.4                13.4

赖氨酸            21.0                42.0

精氨酸            6.0                 12.0

实施例21

用苯甲酰氯修饰5种氨基酸的混合物

将氨基酸(见实施例20中的表)的86g(0.85摩尔NH₂)混合物溶于637mL(1.5当量)的2N氢氧化钠水溶液中。室温下搅拌10分钟后，在10分钟内向该氨基酸溶液逐份加入苯甲酰氯(99mL，0.85摩尔)。室温下搅拌2.5小时后，用稀氢氯酸水溶液(4∶1，H₂O∶HCl)调节反应混合物(pH12)的pH至pH2.5并形成修饰氨基酸沉淀。静置1小时后，将所得沉淀通过倾析分离，用水洗涤并溶于氢氧化钠(2N)中。所得溶液真空浓缩得到黄色固态的粗的修饰氨基酸(预期产率220.5g)。

实施例22

用苯磺酰氯修饰L-缬氨酸

通过室温下搅拌10分钟将L-缬氨酸(50g，0.43mol)溶于376mL(0.75当量)的2N氢氧化钠水溶液中。然后室温下20分钟内向该氨基酸溶液加入苯磺酰氯(68.7mL，0.38mol，1.25当量)。室温下搅拌2小时后，出现沉淀。通过加入200mL 2N氢氧化钠溶液溶解沉淀。再搅拌30分钟后，加入稀氢氯酸水溶液(4∶1，H₂O∶HCl)直到反应混合物的pH达到2.6。形成修饰氨基酸沉淀并通过倾析回收。将该物质溶于2N氢氧化钠中并真空干燥得到白色固体。粗修饰氨基酸的预期产率为84.6g，77％。

实施例23

用马尿酰氯修饰苯丙氨酸甲酯

将L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐(15g，0.084摩尔)溶于二甲基甲酰胺(DMF)(100mL)中并向其中加入吡啶(30mL)。立即将马尿酰氯溶液(16.6g，0084摩尔，溶于100mL DMF)以两份加入该氨基酸酯溶液中。室温下过夜搅拌反应混合物。然后将反应混合物真空浓缩并溶于1N氢氧化钠水溶液中。将该溶液在70℃加热3小时以便使甲酯水解成游离羧基。之后，用稀氢氯酸水溶液(1∶3 HCl/H₂O)将该溶液酸化到pH2.25。形成类似树胶的沉淀并回收该沉淀并溶于1N氢氧化钠中。将该溶液真空浓缩得到所预期的18.6g粗修饰氨基酸产物。从乙腈重结晶后，回收纯的修饰的苯丙氨酸(预期产率12g)，其为白色粉末，熔点223-225℃。

实施例24

PYY(3-36)的给药溶液的制备

在568mg乙酰基苯丙氨酸醛、132mg羧甲基苯丙氨酰亮氨酸和100mg乙酰基-Phe-Leu-Leu-Arg醛的试管中加入2.9ml 5％乙醇。搅拌该溶液并加入NaOH(1.0N)使pH升高到7.2。加入水使总体积为4.0mL。样品的载体浓度为200mg/mL。向溶液加入PYY(3-36)(800μg)。总PYY3-36浓度为200μg/mL。

按照类似步骤，制备了第二种溶液，其含有668mg乙酰苯丙氨酸醛和132mg羧甲基苯丙氨酰亮氨酸作为载体组合物，还制备了第三种溶液，其含有载体乙酰苯丙氨酸醛。每种溶液的不含内毒素的PYY(3-36)的浓度为200μg/mL。

实施例25

修饰氨基酸/PYY(3-36)组合物的制备

制备含有包封的不含内毒素PYY3-36的修饰氨基酸微球体

将按照实施例9制备的修饰氨基酸混合物溶于40℃蒸馏水(pH7.2)，浓度为100mg/ml。然后用0.2微米滤器过滤溶液并保持温度为40℃。将PYY3-36(Bachem)以150mg/ml的浓度溶于柠檬酸水溶液(1.7N)和明胶(5％)中。然后将该溶液加热到40℃。将两种加热的溶液以1∶1(v/v)混合。用玻璃棉过滤所得微球体悬浮液并以1000g离心50分钟。用0.85N柠檬酸重悬沉淀，所得体积为原始体积的1/5到1/7。通过HPLC测定重悬沉淀的PYY3-36浓度。按照上面的步骤不用PYY3-36制备另外的微球体。如果需要，该“空微球体”用于将包封的鲑鱼PYY3-36微球体制剂稀释到最终给药悬浮液。

(b)制备可溶的修饰氨基酸载体/PYY3-36体系

通过将修饰氨基酸物质溶于蒸馏水(pH8)到适当的浓度制备含有PYY3-36的可溶氨基酸给药制剂。加热溶液到40℃然后用0.2微米滤器过滤。将也溶于蒸馏水的PYY3-36在口服施用前加入修饰氨基酸溶液中。

PYY3-36的经肺传递(预言的)

通过将一种或多种化合物或盐、聚氨基酸或肽与不含内毒素的Y2受体结合肽简单混合可以将如下面描述制备的载体化合物直接用作经肺传递的传递载体。

通过刚好在施用前将载体的水性溶液与活性成分的水性溶液混合制备施用混合物。备选地，可以在生产过程期间混合载体和生物学或化学活性成分。该溶液可任选含有添加剂如磷酸盐缓冲盐、柠檬酸、乙酸、明胶，和阿拉伯胶。

许多公知的经肺传递方法可以利用不含内毒素的Y2受体结合肽，特别PYY3-36，以促进PYY向肺的传递。下面的非限制性专利申请被并入本文作为经肺传递的参考：美国专利申请20030223939、20030215514、20030215512、20030209243、20030203036、20030198601、20030183228、200301885765、20030150454、20030124193、20030094173。

实施例26

载体的制备

2-(4-(N-水杨酰)-氨苯基)丙酸(载体B)的制备

用90.11ml(77.13g.0-710mol)氯代三甲硅烷处理58.6g(0.355mol)2-(4-氨苯基)丙酸和500ml二氯甲烷的浆液并将其加热回流120分钟。让反应混合物冷却到0℃并用184.44ml(107.77g，1.065mol)三乙胺处理。搅拌5分钟后，用70.45g(0.355mol)O-乙酰基水杨酰氯和150ml二氯甲烷的溶液处理该混合物。反应混合物升温到25℃并搅拌64小时。真空除去挥发物。将残渣在2N氢氧化钠水溶液中搅拌1小时并用2M硫酸水溶液酸化。将固体从乙醇/水重结晶两次得到棕褐色固体。过滤分离得到53.05g(52％产率)2-(4-(N-水杨酰)氨苯基)丙酸的预期产率。性质：溶解度：200mg/m：200mg+350μL 2N NaOH+650μL H₂O-pH-7.67。分析：C，67.36；H，5.3；N，4.91。

制备2-(4-(N-水杨酰)氨苯基)丙酸钠(载体B的钠盐)

用溶于22ml水的7.59g(0.190mol)NaOH处理53.05g(0.186mol)2-(4-(N-水杨酰)-氨苯基-)丙酸和300ml乙醇的溶液。将反应混合物在25℃搅拌30分钟并在0℃搅拌30分钟。通过过滤分离所得灰黄色固体得到52.61g 2-(4-(N-水杨酰)氨苯基)丙酸钠。性质：溶解度：200mg/ml澄清溶液，pH＝6.85.分析：C，60.45；H，5.45；N，3.92；Na，6.43。熔点236-238℃。

载体C的钠盐的制备

向装备磁力搅拌器和回流冷凝器的2L圆底烧瓶装入3-(4-氨苯基)丙酸(15.0g，0.084摩尔，1当量)在二氯甲烷(250ml)中的悬浮液。一次性加入氯代三甲基硅烷(18.19g，0.856摩尔，2.0当量)，并将混合物在氩气下回流1.5小时。允许反应物冷却到室温并置于冰浴中(内部温度＜10℃)。用含有三乙胺(25.41g.，0.251摩尔，3.0当量)的另外漏斗代替回流冷凝器。15分钟内逐滴加入三乙胺，并且在加入期间形成黄色固体。将该漏斗用含有溶于二氯甲烷(100mL)的2，3-二甲氧基苯甲酰氯(18.31g，0.091摩尔，1.09当量)溶液的漏斗代替。30分钟内逐滴加入该溶液。将反应物在冰浴中再搅拌30分钟并在环境温度下搅拌3h。真空蒸发二氯甲烷得到褐色油。该褐色油在冰浴中冷却，加入饱和碳酸氢钠的冰冷却的溶液(250ml)。除去冰浴，并搅拌反应物1小时得到澄清褐色溶液。用浓HCl酸化该溶液并在约SC下保存1h。以二氯甲烷萃取(3次，每次100mL)混合物，硫酸钠干燥，滤除盐并真空除去二氯甲烷。所得固体从50％乙酸乙酯/水(v/v)重结晶得到载体C酸，其是乳白色针状体(25.92g，90％)。分析：C₁₉H₂₁NO₅：C，66.46；H，6.16；N，4.08，熔点＝99-102℃。

加热下将12g载体C酸溶于75ml乙醇。向该溶液加入8.5M氢氧化钠(1.02摩尔当量，1.426g溶于4.5ml水)溶液。搅拌混合物15分钟。真空中除去约3/4的乙醇并向所得油加入100ml正庚烷形成沉淀。将该固体在真空中50℃干燥。分析：C₁₉H₂₀NO₅0.067H₂O：C，62.25；H，5.54；N，3.82；Na，6.27。

制备N-(4-甲基水杨酰)-8-氨基辛酸(载体D)

(a)制备寡(4-甲基水杨酸)

向安装磁力搅拌棒、温度计、和冷凝器的1L四颈烧瓶中加入乙酸酐(32mL，34.5g，0.338mol，1.03eq)、4-甲基水杨酸(50g，0.329mmol，1.00eq)，和二甲苯(100mL)。将烧瓶置于沙浴并开始加热灰白色混合物。约90℃时反应混合物变清成为黄色溶液。多数挥发的有机物(二甲苯和乙酸)在3小时内(135℃-146℃)蒸馏到Dean-Stark捕集器。继续蒸馏1小时(共蒸馏了110mL)，期间锅温度缓慢升高到204℃，并且馏出物缓慢滴流。将仍然热的残渣导入铝盘中。冷却时形成脆的黄色玻璃状物质。将该固体研磨成细粉。所得到的寡(4-甲基水杨酸)不进一步纯化而直接使用。

(b)制备N-(4-甲基水杨酰)-8-氨基辛酸

向装备磁力搅拌棒、冷凝器和另外燃料的1L圆底烧瓶中加入碳酸钾(45mL，43.2g，0.313mol，0.95eq)、8-氨基辛酸(41.8g，262mol，798eq)和水(20mL)的7M溶液。用寡(4-甲基水杨酸)(44.7g，0.329mmol，1.0eq)溶液处理白色混浊混合物并在30分钟内加入二噁烷(250mL)。将反应混合物加热到90℃并保持3小时(此时通过HPLC确定反应已经完成)。澄清的橙色反应混合物冷却到30℃并用50％含水硫酸(64g)酸化到pH＝2。过滤分离所得固体。从1170mL 50％乙醇-水重结晶白色固体。过滤回收该固体并在真空烘箱中50℃下干燥18小时。分离到N-(4-甲基水杨酰)-8-氨基辛酸，其是白色固体(30.88g，52％)；mp＝113-114℃。分析：C₆H₂₃NO₄：C，65.51；H，7.90；N，4.77。

然后制备PYY(3-36)的水溶液并与一种或多种载体混合得到PYY(3-36)组合物，然后可以将其喷雾到肺中。所得组合物的PYY3-36的适当浓度将为约400μg/mL。见美国专利申请号20030072740。

实施例27

用于测定血浆中PYY浓度的总提取放射免疫测定

1.0介绍

开发放射免疫测定法用以测量人血浆中人肽YY(3-36)(hPYY)的浓度。用抗凝剂(EDTA)和蛋白酶抑制剂(抑肽酶)收集样品并冰冻。该测定为4天过程。用乙醇提取样品、对照和标准物并在第一天干燥。在第二天所有样品都被重构并与针对hPYY的多克隆兔抗血清混合。在第三天加入碘化hPYY。在第四天加入特定沉淀剂(山羊抗兔IgG和正常兔血清)。通过离心将游离示踪剂与结合的示踪剂分离，并在γ计数器中计数结合的示踪剂。通过标准曲线插入法计算浓度，用质量控制样品控制测定性能。

2.0材料：

2.1Peninsula PYY试剂盒(Peninsula Laboratories，Cat.No.S-2043-0001)

2.2试剂乙醇(Fisher Inc.，Cat.No.A995-4)(或等价物)

2.3汽提过的(stripped)人血浆(用肝素锂，禁食，合并)Golden WestBiologics Inc.(Cat.No.，SD 1020-H)(分析SOP#A-003)

2.4冰浴(Fisher，Cat No.11-676-36)(或等价物)

2.5一次性10mL吸管(Fisher Cat.No.13-678-11E)(或等价物)

2.6Nastech QC(3-36)的标准合成的人PYY(Bachem Cat.No.H8585)

2.7蒸馏水(Milli-Q Millipore，Cat.No.ZMQ56VFT1)(或等价物)

2.8Triton X-100(Sigma，Cat.No.T-9284)(或等价物)

2.9铝箔(Fisher，Cat.No.01-213-3)(或等价物)

2.10抑肽酶(ICN Biomedicals Inc.Cat.No.190779)(或等价物)

2.11 12×75mm管(Evergreen Scientific，Cat.No.214-2023-010)(或等价物)

2.12 12×75mm管盖(Evergreen Scientific，Cat.No.300-2912-G20)(或等价物)

2.13 1.5mL微型离心管(Fisher，Cat.No.05-402-25)(或等价物)

2.14

3.0仪器：

3.1Wallac WIZARD 1470自动γ计数器(Perkin Elmer，Model No.1470-002)(或等价物)

3.2Isotemp Basic制冷机，-70℃(Kendro Laboratory Products，ModelNo.C90-3A31)(或等价物)

3.3CentriVap离心机(Labconco，Cat.No.7810000)(或等价物)

3.4VX-2500多管涡旋器(VWR，Cat.No.58816-115)(或等价物)

3.5Marathon 21000R离心机(Fisher，Cat.No.04-977-21000R)(或等价物)

3.6Swinging bucket转子(Fisher，Cat.No.04-976-006)(或等价物)

3.7机动吸管辅助器(Fisher，Cat.No.13-681-15E)(或等价物)

3.8Eppendorf移液器

3.8.1 2μL-20μL(Fisher，Cat.No.21-371-6)(或等价物)

3.8.2 20μL-200μL(Fisher，Cat.No.21-371-10)(或等价物)

3.8.3 100μL-1000μL(Fisher，Cat.No.21-371-13)(或等价物)

3.9 Eppendorf重复移液器(Fisher，Cat.No.21-380-9)(或等价物)

3.10 Eppendorf重复移液器Combi-tips

3.10.1 2.5mL(Fisher，Cat.No.21-381-331)(或等价物)

3.10.2 25mL(Fisher，Cat.No.21-381-115)(或等价物)

3.11 Positive displacement吸管(Fisher，Cat.No.21-169-10A)(或等价物)

4.0步骤

第一天

4.1将该测定法的必需试剂和样品解冻，如果不能得到足够量，制备RIA缓冲液到1×浓度(RIAB)。

4.2制备合并的汽提人血浆中样品的标准曲线。如果使用起始浓度12.8μg/mL，那么制备如下：

4.2.1向管O中加入990μL RIAB。

4.2.2向管A中加入990μL合并的血浆。

4.2.3向管B-H中加入500μL合并的血浆。

4.2.4向管O加入10μL 12.8μg/mL标准物，涡旋处理。

4.2.5向管A加入10μL来自管O的溶液，涡旋处理。

4.2.6向管B加入500μL来自管A的溶液，涡旋处理。

4.2.7向管C加入500μL来自管B的溶液，涡旋处理。

4.2.8如4.2.7通过管H重复稀释(见图表#1)

4.3如果需要，稀释所要处理的未知人血浆样品。应该在合并的汽提人血浆中稀释样品。

4.4向NSB、TB、所有标准、QC样品和所要试验的人血浆样品的空管加入1.2mL冷乙醇。

4.5向NSB和TB管加入400μL合并的汽提人血浆，盖上，涡旋处理。

4.6向各自标准曲线管H-A加入来自4.2.5到4.2.8的每种制备的标准样品400μL(见图表#1)，盖上，涡旋处理。

4.7向各自管加入400μL QC样品，盖上，涡旋处理。

4.8将400μL所要试验的每种样品加入各自管中，盖上，涡旋处理。

4.9在冰上温育所有样品30-60分钟。

4.10打开冷却捕集器，打开浓缩器。

4.11以3000rpm，4℃下将所有管离心15分钟。

4.12将1.3mL上清液从每个样品转移到一组新的空管中。冰浴保存或者如果不立即离心则在2-8℃保存。

4.13将样品置于浓缩器中。

4.14应该在40℃离心样品2小时，然后在环境温度下离心共5小时后者直到干燥。

4.15除去干燥样品，盖上并在2-8℃过夜保存。

第二天

4.16从2-8℃冷却器除去干燥管。

4.17向每管加入100μL 4×RIA缓冲液浓缩物。

4.18向每管加入100μL 0.6％TX100。(附件#1)，涡旋30秒以确保所有提取物都被完全重构。

4.19冰上温育所有样品30-60分钟。

4.20向每管加入200μL蒸馏水，涡旋处理。

4.21将100μL每种样品提取物转移到各自管。

注解：NSB、TB、TC、标准曲线样品，和QCs通常一式三份地运行，需要每种样品三管。根据样品的可用性，所试验的人血浆样品份数可以改变(最多三份)。

4.22如Peninsula Laboratories试剂盒插页中描述的制备兔抗-PYY。

4.23向每个NSB管加入100μL RIAB。

4.24向每个TC管加入200μL RIAB。

4.25向所有剩余的管加入100μL兔抗-PYY，涡旋。

4.26用箔封口并在2-8℃过夜保存。

第三天

4.27从2-8℃冷却器除去管。

4.28制备¹²⁵I-肽YY示踪剂(附件#2)。

4.29向所有管加入100μL所制备的示踪剂，盖上并涡旋。

4.30 2-8℃过夜保存。

第四天

4.31从2-8℃冷却器除去管。

4.32如Peninsula Laboratories试剂盒插页中描述的制备山羊抗兔IgG血清(GARGG)和正常兔血清(NRS)。

4.33向每管(除了TC管之外)加入100μL GARGG。

4.34向每管(除了TC管之外)加入100μL NRS，涡旋。

4.35室温下温育90-120分钟。

4.36向将要立即离心的管(除了TC管之外)加入500μL RIAB，涡旋。

注解：应该刚好在离心前向管中加入500μL RIAB。仅向将要离心的管中加入RIAB。当另外的管将被离心时向这些管中加入500μLRIAB。

4.37 4℃下以3000rpm离心管(含有500μL RIAB)。不离心TC管。

4.38从离心管吸出上清液。

4.39将管置于指定的黑色支架上以在γ计数器上计数。第一个支架应该附上适当的程序号。接下来的所有支架都应该不含有程序号。应该以下面的顺序加入样品：

4.39.1NSB管

4.39.2TB管

4.39.3TC管

4.39.4标准物管(增加浓度)

4.39.5QC样品(三种浓度)

4.39.6未知的人样品

4.39.7QC样品(三种浓度)

4.40在所有要计数的样品后放置一个空的黑色支架，其附上“停止”标签。

4.41按下γ计数器上键区上的“开始”按钮开始计数。

4.42按下γ计数器上键区上的“E”按钮显示CPM结果。

5.0结果评价

5.1应用下面的教导鉴定和拒绝测定中的异常值。为了确定某一结果是异常值并且不被包括在结果的最终计算中，必须满足所有下面的条件。

5.1.1QCs和未知样品：

5.1.1.1所有重复的％CV必须大于20％。

5.1.1.2至少有3个结果用于评价。

5.1.1.3被怀疑的异常值和下一个最接近的值的差异必须大于20％。

5.1.1.4高和低剩余结果之间的差异必须小于20％。

5.1.2标准曲线样品：

5.1.2.1所有复制品的％CV必须大于15％。

5.1.2.2至少有3个结果用于评价。

5.1.2.3被怀疑的异常值和下一个最接近的值的差异必须大于15％。

5.1.2.4高和低剩余结果之间的差异必须小于15％。

6.0测定说明

6.1制备下面浓度的QC样品。在一个测定中试验每个浓度下的两个QC样品。6个受试QC样品中的4个必须在下面的范围(标称浓度的±30％)内。在任一浓度下所试验的两个QC至少之一必须在数据可被接受的测定范围内。

6.1.1QC1(100pg/mL)    70-130pg/mL

6.1.2QC2(200pg/mL)    140-260pg/mL

6.1.3QC3(500pg/mL)    350-650pg/mL

6.2标准曲线参数要求TBD

图表#1

PYY RIA标准：

管名称	标准物浓度
		A	1280pg/mL
B	640pg/mL
		C	320pg/mL
D	160pg/mL
		E	80pg/mL
F	40pg/mL
		G	20pg/mL
H	10pg/mL

附件#1

      0.6％TX-100

试剂：0.6％TX-100

材料：Milli-Q蒸馏水

      TX-100

制备：1)量取50mL Milli-Q蒸馏水

      2)用positive displacement吸管加入300μL TX-100

      3)混合管

附件#2

      ¹²⁵I-肽PYY示踪剂

试剂：¹²⁵I-肽PYY示踪剂

材料：1×RIA缓冲液

      ¹²⁵I-肽PYY

制备：1)用1mL 1×RIA缓冲液重构示踪剂。

2)在γ计数器上测量示踪剂的量。将10μL重构示踪剂转移到管中。将其置于γ计数器的黑色支架中，该支架附上程序#30。

3)将“停止”置于γ计数器的支架后面。

4)按下“开始”开始计数，然后按下“E”观察CPM结果。

5)如下确定制备示踪剂(XμL)和RIAB(YmL)所需的量：

YmL＝(0.1)(#管+10)

6)将XμL¹²⁵I-肽YY与YmL RIAB合并，充分混合。

实施例28

制备不含作为稳定剂的蛋白质的NPY制剂

制备适于NPY的鼻内施用的PYY制剂，其基本上不含作为稳定剂的蛋白质，该制剂具有下面所列的配方。

12.向烧杯加入约3/4水并在搅拌盘中用搅拌棒搅拌，并加入柠檬酸钠直到其完全溶解。

13.然后加入EDTA并搅拌直到其完全溶解。

14.然后加入柠檬酸并搅拌直到其完全溶解。

15.加入甲基-β-环糊精并搅拌直到其完全溶解。

16.然后加入DDPC并搅拌直到其完全溶解。

17.然后加入乳糖并搅拌直到其完全溶解。

18.然后加入山梨糖醇并搅拌直到其完全溶解。

19.然后加入氯丁醇并搅拌直到其完全溶解。

20.加入NPY(3-36)并轻轻搅拌直到其溶解。

21.检查pH以确定其为5.0±0.25。加入稀HCl或稀NaOH调节pH。

22.加入水定容。

                            表12

试剂	等级	供应商	mg/mL	％
					无水氯丁醇	NF	Spectrum	5.0	0.50
甲基-β-环糊精		Sigma	45	4.5
					二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱		Sigma	1	0.1
EDTA二钠	USP	DowChemicals	1	0.1
					二水合柠檬酸钠	USP	Spectrum	1.62	0.162
柠檬酸，无水	USP	Sigma	0.86	0.086
					一水合α-乳糖		Sigma	9	0.9
山梨糖醇		Sigma	18.2	1.82
					NPY(3-36)	GMP	Bachem	1	0.1
纯化水

制剂pH5+/-0.25

摩尔渗透压浓度～250

实施例29

如上制备另一制剂，只是NPY(3-36)的浓度为15mg/mL，如表13中所示。

                            表13

试剂	等级	供应商	Mg/mL	％
					无水氯丁醇	NF	Spectrum	5.0	0.50
甲基-β-环糊精		Sigma	45	4.5
					二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱		Sigma	1	0.1
EDTA二钠	USP	DowChemicals	1	0.1
					二水合柠檬酸钠	USP	Spectrum	1.62	0.162
柠檬酸，无水	USP	Sigma	0.86	0.086
					一水合α-乳糖		Sigma	9	0.9
山梨糖醇		Sigma	18.2	1.82
					NPY(3-36)	GMP	Bachem	15	0.1
纯化水

制剂pH5+/-0.25

实施例30

制备适于PP的鼻内施用的PYY制剂，其基本上不含作为稳定剂的蛋白质

制备适于PP的鼻内施用的PYY制剂，其基本上不含作为稳定剂的蛋白质，该制剂具有下面所列的配方。

23.向烧杯加入约3/4水并在搅拌盘中用搅拌棒搅拌，并加入柠檬酸钠直到其完全溶解。

24.然后加入EDTA并搅拌直到其完全溶解。

25.然后加入柠檬酸并搅拌直到其完全溶解。

26.加入甲基-β-环糊精并搅拌直到其完全溶解。

27.然后加入DDPC并搅拌直到其完全溶解。

28.然后加入乳糖并搅拌直到其完全溶解。

29.然后加入山梨糖醇并搅拌直到其完全溶解。

30.然后加入氯丁醇并搅拌直到其完全溶解。

31.加入PP(3-36)并轻轻搅拌直到其溶解。

32.检查pH以确定其为5.0±0.25。加入稀HCl或稀NaOH调节pH。

33.加入水定容。

                            表14

试剂	等级	供应商	mg/mL	％
					无水氯丁醇	NF	Spectrum	5.0	0.50
甲基-β-环糊精		Sigma	45	4.5
					二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱		Sigma	1	0.1
EDTA二钠	USP	DowChemicals	1	0.1
					二水合柠檬酸钠	USP	Spectrum	1.62	0.162
柠檬酸，无水	USP	Sigma	0.86	0.086

一水合α-乳糖		Sigma	9	0.9
					山梨糖醇		Sigma	18.2	1.82
PP(3-36)	GMP	Bachem	1	0.1
					纯化水

制剂pH5+/-0.25

摩尔渗透压浓度～250

实施例31

如上制备第二种制剂，只是PP(3-36)的浓度为15mg/mL，如表13中所示。

                            表13

试剂	等级	供应商	mg/mL	％
					无水氯丁醇	NF	Spectrum	5.0	0.50
甲基-β-环糊精		Sigma	45	4.5
					二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱		Sigma	1	0.1
EDTA二钠	USP	DowChemicals	1	0.1
					二水合柠檬酸钠	USP	Spectrum	1.62	0.162
柠檬酸，无水	USP	Sigma	0.86	0.086
					一水合α-乳		Sigma	9	0.9

糖
					山梨糖醇		Sigma	18.2	1.82
PP(3-36)	GMP	Bachem	15	0.1
					纯化水

制剂pH5+/-0.25

尽管通过为了理解的阐明的目的，通过实施例描述了前面的发明，但是对技术人员显而易见的是某些改动和修饰被公开内容所包括并且可以不过多实验而在所附权利要求的范围内实施，这些实施例仅作为举例说明而非限制。

序列表

<110>纳斯泰克制药公司

S.C.夸伊

G.勃兰特

M.S.克勒佩

C.J马采维利

<120>用于增强Y2受体结合肽的粘膜传递的组合物和方法及治疗

     和预防肥胖症的方法

<130>02-04 PCT

<150>US60/518,812

<151>2003-11-10

<150>US10/322,266

<151>2002-12-17

<150>US60/493,226

<151>2003-08-07

<150>US60/501,170

<151>2003-09-08

<150>US60/510,785

<151>2003-10-10

<150>US60/517,290

<151>2003-11-04

<160>105

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>36

<212>PRT

<213>人类

<400>1

Tyr Pro Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu

 1               5                  10                  15

Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr

            20                  25                  30

Arg Gln Arg Tyr

        35

<210>2

<211>34

<212>PRT

<213>人类

<400>2

Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn

 1               5                  10                  15

Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln

            20                  25                  30

Arg Tyr

<210>3

<211>15

<212>PRT

<213>人类

<400>3

Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr

 1               5                  10                  15

<210>4

<211>33

<212>PRT

<213>人类

<400>4

Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn Arg

 1               5                  10                  15

Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg

            20                  25                  30

Tyr

<210>5

<211>32

<212>PRT

<213>人类

<400>5

Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn Arg Tyr

 1               5                  10                  15

Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr

            20                  25                  30

<210>6

<211>31

<212>PRT

<213>人类

<400>6

Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn Arg Tyr Tyr

 1               5                  10                  15

Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr

            20                  25                  30

<210>7

<211>30

<212>PRT

<213>人类

<400>7

Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala

 1               5                  10                  15

Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr

            20                  25                  30

<210>8

<211>29

<212>PRT

<213>人类

<400>8

Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser

 1               5                  10                  15

Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr

            20                  25

<210>9

<211>28

<212>PRT

<213>人类

<400>9

Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu

 1               5                  10                  15

Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr

            20                  25

<210>10

<211>27

<212>PRT

<213>人类

<400>10

Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg

 1               5                  10                  15

His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr

            20                  25

<210>11

<211>26

<212>PRT

<213>人类

<400>11

Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His

 1               5                  10                  15

Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr

            20                  25

<210>12

<211>25

<212>PRT

<213>人类

<400>12

Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr

 1               5                  10                  15

Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr

            20                  25

<210>13

<211>24

<212>PRT

<213>人类

<400>13

Ser Pro Glu Glu Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu

 1               5                  10                  15

Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr

            20

<210>14

<211>23

<212>PRT

<213>人类

<400>14

Pro Glu Glu Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn

 1               5                  10                  15

Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr

            20

<210>15

<211>22

<212>PRT

<213>人类

<400>15

Glu Glu Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu

 1               5                  10                  15

Val Thr Arg Gln Arg Tyr

            20

<210>16

<211>21

<212>PRT

<213>人类

<400>16

Glu Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val

 1               5                  10                  15

Thr Arg Gln Arg Tyr

            20

<210>17

<211>20

<212>PRT

<213>人类

<400>17

Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr

 1               5                  10                  15

Arg Gln Arg Tyr

            20

<210>18

<211>19

<212>PRT

<213>人类

<400>18

Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg

 1               5                  10                  15

Gln Arg Tyr

<210>19

<211>18

<212>PRT

<213>人类

<400>19

Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln

 1               5                  10                  15

Arg Tyr

<210>20

<211>17

<212>PRT

<213>人类

<400>20

Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg

 1               5                  10                  15

Tyr

<210>21

<211>16

<212>PRT

<213>人类

<400>21

Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr

 1               5                  10                  15

<210>22

<211>36

<212>PRT

<213>人类

<400>22

Tyr Pro Ser Lys Pro Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp

 1               5                  10                  15

Met Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr

            20                  25                  30

Arg Gln Arg Tyr

        35

<210>23

<211>11

<212>PRT

<213>人类

<400>23

His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr Arg Gln Arg Tyr

 1               5                  10

<210>24

<211>34

<212>PRT

<213>人类

<400>24

Ser Lys Pro Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp Met Ala

 1               5                  10                  15

Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr Arg Gln

            20                  25                  30

Arg Tyr

<210>25

<211>33

<212>PRT

<213>人类

<400>25

Lys Pro Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp Met Ala Arg

 1               5                  10                  15

Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr Arg Gln Arg

            20                  25                  30

Tyr

<210>26

<211>32

<212>PRT

<213>人类

<400>26

Pro Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp Met Ala Arg Tyr

 1               5                  10                  15

Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr Arg Gln Arg Tyr

            20                  25                  30

<210>27

<211>31

<212>PRT

<213>人类

<400>27

Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp Met Ala Arg Tyr Tyr

 1               5                  10                  15

Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr Arg Gln Arg Tyr

            20                  25                  30

<210>28

<211>30

<212>PRT

<213>人类

<400>28

Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp Met Ala Arg Tyr Tyr Ser

 1               5                  10                  15

Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr Arg Gln Arg Tyr

            20                  25                  30

<210>29

<211>29

<212>PRT

<213>人类

<400>29

Pro Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp Met Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala

 1               5                  10                  15

Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr Arg Gln Arg Tyr

            20                  25

<210>30

<211>28

<212>PRT

<213>人类

<400>30

Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp Met Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu

 1               5                  10                  15

Arg His TVr Ile Asn Leu Ile Thr Arg Gln Arg Tyr

            20                  25

<210>31

<211>27

<212>PRT

<213>人类

<400>31

Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp Met Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg

 1               5                  10                  15

His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr Arg Gln Arg Tyr

            20                  25

<210>32

<211>26

<212>PRT

<213>人类

<400>32

Asp Ala Pro Ala Glu Asp Met Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His

 1               5                  10                  15

Tyr Ile Asn Leu Ile Thr Arg Gln Arg Tyr

            20                  25

<210>33

<211>25

<212>PRT

<213>人类

<400>33

Ala Pro Ala Glu Asp Met Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr

 1               5                  10                  15

Ile Asn Leu Ile Thr Arg Gln Arg Tyr

            20                  25

<210>34

<211>24

<212>PRT

<213>人类

<400>34

Pro Ala Glu Asp Met Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile

 1               5                  10                  15

Asn Leu Ile Thr Arg Gln Arg Tyr

            20

<210>35

<211>23

<212>PRT

<213>人类

<400>35

Ala Glu Asp Met Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn

 1               5                  10                  15

Leu Ile Thr Arg Gln Arg Tyr

            20

<210>36

<211>22

<212>PRT

<213>人类

<400>36

Glu Asp Met Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu

 1               5                  10                  15

Ile Thr Arg Gln Arg Tyr

<210>37

<211>21

<212>PRT

<213>人类

<400>37

Asp Met Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile

 1               5                  10                  15

Thr Arg Gln Arg Tyr

            20

<210>38

<211>20

<212>PRT

<213>人类

<400>38

Met Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr

 1               5                  10                  15

Arg Gln Arg Tyr

            20

<210>39

<211>19

<212>PRT

<213>人类

<400>39

Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr Arg

 1               5                  10                  15

Gln Arg Tyr

<210>40

<211>18

<212>PRT

<213>人类

<400>40

Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr Arg Gln

 1               5                  10                  15

Arg Tyr

<210>41

<211>17

<212>PRT

<213>人类

<400>41

Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr Arg Gln Arg

 1               5                  10                  15

Tyr

<210>42

<211>16

<212>PRT

<213>人类

<400>42

Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr Arg Gln Arg Tyr

 1               5                  10                  15

<210>43

<211>15

<212>PRT

<213>人类

<400>43

Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr Arg Gln Arg Tyr

 1               5                  10                  15

<210>44

<211>14

<212>PRT

<213>人类

<400>44

Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr Arg Gln Arg Tyr

 1               5                  10

<210>45

<211>13

<212>PRT

<213>人类

<400>45

Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr Arg Gln Arg Tyr

 1               5                  10

<210>46

<211>12

<212>PRT

<213>人类

<400>46

Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr Arg Gln Arg Tyr

 1               5                  10

<210>47

<211>36

<212>PRT

<213>人类

<400>47

Ala Ser Leu Glu Pro Glu Tyr Pro Gly Asp Asn Ala Thr Pro Glu Gln

 1               5                  10                  15

Met Ala Gln Tyr Ala Ala Glu Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Met Leu Thr

            20                  25                  30

Arg Pro Arg Tyr

        35

<210>48

<211>11

<212>PRT

<213>人类

<400>48

Arg Tyr Ile Asn Met Leu Thr Arg Pro Arg Tyr

 1               5                  10

<210>49

<211>34

<212>PRT

<213>人类

<400>49

Leu Glu Pro Glu Tyr Pro Gly Asp Asn Ala Thr Pro Glu Gln Met Ala

 1               5                  10                  15

Gln Tyr Ala Ala Glu Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Met Leu Thr Arg Pro

            20                  25                  30

Arg Tyr

<210>50

<211>33

<212>PRT

<213>人类

<400>50

Glu Pro Glu Tyr Pro Gly Asp Asn Ala Thr Pro Glu Gln Met Ala Gln

 1               5                  10                  15

Tyr Ala Ala Glu Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Met Leu Thr Arg Pro Arg

            20                  25                  30

Tyr

<210>51

<211>32

<212>PRT

<213>人类

<400>51

Pro Glu Tyr Pro Gly Asp Asn Ala Thr Pro Glu Gln Met Ala Gln Tyr

 1               5                  10                  15

Ala Ala Glu Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Met Leu Thr Arg Pro Arg Tyr

            20                  25                  30

<210>52

<211>31

<212>PRT

<213>人类

<400>52

Glu Tyr Pro Gly Asp Asn Ala Thr Pro Glu Gln Met Ala Gln Tyr Ala

 1               5                  10                  15

Ala Glu Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Met Leu Thr Arg Pro Arg Tyr

            20                  25                  30

<210>53

<211>30

<212>PRT

<213>人类

<400>53

Tyr Pro Gly Asp Asn Ala Thr Pro Glu Gln Met Ala Gln Tyr Ala Ala

 1               5                  10                  15

Glu Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Met Leu Thr Arg Pro Arg Tyr

            20                  25                  30

<210>54

<211>29

<212>PRT

<213>人类

<400>54

Pro Gly Asp Asn Ala Thr Pro Glu Gln Met Ala Gln Tyr Ala Ala Glu

 1               5                  10                  15

Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Met Leu Thr Arg Pro Arg Tyr

            20                  25

<210>55

<211>28

<212>PRT

<213>人类

<400>55

Gly Asp Asn Ala Thr Pro Glu Gln Met Ala Gln Tyr Ala Ala Glu Leu

 1               5                  10                  15

Arg Arg Tyr Ile Asn Met Leu Thr Arg Pro Arg Tyr

            20                  25

<210>56

<211>27

<212>PRT

<213>人类

<400>56

Asp Asn Ala Thr Pro Glu Gln Met Ala Gln Tyr Ala Ala Glu Leu Arg

 1               5                  10                  15

Arg Tyr Ile Asn Met Leu Thr Arg Pro Arg Tyr

            20                  25

<210>57

<211>26

<212>PRT

<213>人类

<400>57

Asn Ala Thr Pro Glu Gln Met Ala Gln Tyr Ala Ala Glu Leu Arg Arg

 1               5                  10                  15

Tyr Ile Asn Met Leu Thr Arg Pro Arg Tyr

            20                  25

<210>58

<211>25

<212>PRT

<213>人类

<400>58

Ala Thr Pro Glu Gln Met Ala Gln Tyr Ala Ala Glu Leu Arg Arg Tyr

 1               5                  10                  15

Ile Asn Met Leu Thr Arg Pro Arg Tyr

            20                  25

<210>59

<211>24

<212>PRT

<213>人类

<400>59

Thr Pro Glu Gln Met Ala Gln Tyr Ala Ala Glu Leu Arg Arg Tyr Ile

 1               5                  10                  15

Asn Met Leu Thr Arg Pro Arg Tyr

            20

<210>60

<211>23

<212>PRT

<213>人类

<400>60

Pro Glu Gln Met Ala Gln Tyr Ala Ala Glu Leu Arg Arg Tyr Ile Asn

 1               5                  10                  15

Met Leu Thr Arg Pro Arg Tyr

            20

<210>61

<211>22

<212>PRT

<213>人类

<400>61

Glu Gln Met Ala Gln Tyr Ala Ala Glu Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Met

 1               5                  10                  15

Leu Thr Arg Pro Arg Tyr

            20

<210>62

<211>21

<212>PRT

<213>人类

<400>62

Gln Met Ala Gln Tyr Ala Ala Glu Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Met Leu

 1               5                  10                  15

Thr Arg Pro Arg Tyr

            20

<210>63

<211>20

<212>PRT

<213>人类

<400>63

Met Ala Gln Tyr Ala Ala Glu Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Met Leu Thr

 1               5                  10                  15

Arg Pro Arg Tyr

            20

<210>64

<211>19

<212>PRT

<213>人类

<400>64

Ala Gln Tyr Ala Ala Glu Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Met Leu Thr Arg

 1               5                  10                  15

Pro Arg Tyr

<210>65

<211>18

<212>PRT

<213>人类

<400>65

Gln Tyr Ala Ala Glu Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Met Leu Thr Arg Pro

 1               5                  10                  15

Arg Tyr

<210>66

<211>17

<212>PRT

<213>人类

<400>66

Tyr Ala Ala Glu Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Met Leu Thr Arg Pro Arg

 1               5                  10                  15

Tyr

<210>67

<211>16

<212>PRT

<213>人类

<400>67

Ala Ala Glu Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Met Leu Thr Arg Pro Arg Tyr

 1               5                  10                  15

<210>68

<211>15

<212>PRT

<213>人类

<400>68

Ala Glu Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Met Leu Thr Arg Pro Arg Tyr

 1               5                  10                  15

<210>69

<211>14

<212>PRT

<213>人类

<400>69

Glu Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Met Leu Thr Arg Pro Arg Tyr

 1               5                  10

<210>70

<211>13

<212>PRT

<213>人类

<400>70

Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Met Leu Thr Arg Pro Arg Tyr

 1               5                  10

<210>71

<211>12

<212>PRT

<213>人类

<400>71

Arg Arg Tyr Ile Asn Met Leu Thr Arg Pro Arg Tyr

 1               5                  10

<210>72

<211>36

<212>PRT

<213>大鼠

<400>72

Tyr Pro Ala Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu

 1               5                  10                  15

Leu Ser Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr

            20                  25                  30

Arg Gln Arg Tyr

        35

<210>73

<211>36

<212>PRT

<213>猪

<400>73

Tyr Pro Ala Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu

 1               5                  10                  15

Leu Ser Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr

            20                  25                  30

Arg Gln Arg Tyr

        35

<210>74

<211>36

<212>PRT

<213>豚鼠

<400>74

Tyr Pro Ser Lys Pro Glu Ala Pro Gly Ser Asp Ala Ser Pro Glu Glu

 1               5                  10                 15

Leu Ala Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr

            20                  25                  30

Arg Gln Arg Tyr

        35

<210>75

<211>36

<212>PRT

<213>大鼠

<400>75

Tyr Pro Ser Lys Pro Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp

 1               5                  10                  15

Met Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr

            20                  25                  30

Arg Gln Arg Tyr

        35

<210>76

<211>36

<212>PRT

<213>兔

<400>76

Tyr Pro Ser Lys Pro Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp

 1               5                  10                  15

Met Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr

                                       Page 16

            20                  25                  30

Arg Gln Arg Tyr

        35

<210>77

<211>36

<212>PRT

<213>狗

<400>77

Tyr Pro Ser Lys Pro Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp

 1               5                  10                  15

Met Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr

            20                  25                  30

Arg Gln Arg Tyr

        35

<210>78

<211>36

<212>PRT

<213>猪

<400>78

Tyr Pro Ser Lys Pro Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp

 1               5                  10                  15

Leu Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr

            20                  25                  30

Arg Gln Arg Tyr

        35

<210>79

<211>36

<212>PRT

<213>牛

<400>79

Tyr Pro Ser Lys Pro Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp

 1               5                  10                  15

Leu Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr

            20                  25                  30

Arg Gln Arg Tyr

        35

<210>80

<211>36

<212>PRT

<213>绵羊

<400>80

Tyr Pro Ser Lys Pro Asp Asn Pro Gly Asp Asp Ala Pro Ala Glu Asp

 1               5                  10                  15

Leu Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr

            20                  25                  30

Arg Gln Arg Tyr

        35

<210>81

<211>36

<212>PRT

<213>豚鼠

<400>81

Tyr Pro Ser Lys Pro Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp

 1               5                  10                  15

Met Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr

            20                  25                  30

Arg Gln Arg Tyr

        35

<210>82

<211>36

<212>PRT

<213>绵羊

<400>82

Ala Pro Leu Glu Pro Val Tyr Pro Gly Asp Asn Ala Thr Pro Glu Gln

 1               5                  10                  15

Met Ala Gln Tyr Ala Ala Asp Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Met Leu Thr

            20                  25                  30

Arg Pro Arg Tyr

        35

<210>83

<211>36

<212>PRT

<213>猪

<400>83

Ala Pro Leu Glu Pro Val Tyr Pro Gly Asp Asp Ala Thr Pro Glu Gln

 1               5                  10                  15

Met Ala Gln Tyr Ala Ala Glu Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Met Leu Thr

            20                  25                  30

Arg Pro Arg Tyr

        35

<210>84

<211>36

<212>PRT

<213>狗

<400>84

Ala Pro Leu Glu Pro Val Tyr Pro Gly Asp Asp Ala Thr Pro Glu Gln

 1               5                  10                  15

Met Ala Gln Tyr Ala Ala Glu Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Met Leu Thr

            20                  25                  30

Arg Pro Arg Tyr

        35

<210>85

<211>36

<212>PRT

<213>猫

<400>85

Ala Pro Leu Glu Pro Val Tyr Pro Gly Asp Asn Ala Thr Pro Glu Gln

 1               5                  10                  15

Met Ala Gln Tyr Ala Ala Glu Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Met Leu Thr

            20                  25                  30

Arg Pro Arg Tyr

        35

<210>86

<211>36

<212>PRT

<213>牛

<400>86

Ala Pro Leu Glu Pro Glu Tyr Pro Gly Asp Asp Ala Thr Pro Glu Gln

 1               5                  10                  15

Met Ala Gln Tyr Ala Ala Glu Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Met Leu Thr

            20                  25                  30

Arg Pro Arg Tyr

        35

<210>87

<211>36

<212>PRT

<213>大鼠

<400>87

Ala Pro Leu Glu Pro Met Tyr Pro Gly Asp Tyr Ala Thr His Glu Gln

 1               5                  10                  15

Arg Ala Gln Tyr Glu Thr Gln Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Thr Leu Thr

            20                  25                  30

Arg Pro Arg Tyr

        35

<210>88

<211>36

<212>PRT

<213>小鼠

<400>88

Ala Pro Leu Glu Pro Met Tyr Pro Gly Asp Tyr Ala Thr Pro Glu Gln

 1               5                  10                  15

Met Ala Gln Tyr Glu Thr Gln Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Thr Leu Thr

            20                  25                  30

Arg Pro Arg Tyr

        35

<210>89

<211>37

<212>PRT

<213>豚鼠

<400>89

Ala Pro Leu Glu Pro Val Tyr Pro Gly Asp Asn Ala Thr Pro Glu Gln

 1               5                  10                  15

Gln Met Ala Gln Tyr Ala Ala Glu Met Arg Arg Tyr Ile Asn Met Leu

            20                  25                  30

Thr Arg Pro Arg Tyr

        35

<210>90

<211>22

<212>PRT

<213>人类

<400>90

Asp Glu Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu

 1               5                  10                  15

Val Thr Arg Gln Arg Tyr

            20

<210>91

<211>24

<212>PRT

<213>人类

<400>91

Thr Pro Glu Glu Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu

 1               5                  10                  15

Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr

            20

<210>92

<211>25

<212>PRT

<213>人类

<400>92

Val Ser Pro Glu Glu Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr

 1               5                  10                  15

Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr

            20                  25

<210>93

<211>26

<212>PRT

<213>人类

<400>93

Glu Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His

 1               5                  10                  15

Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr

            20                  25

<210>94

<211>27

<212>PRT

<213>人类

<400>94

Asp Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg

 1               5                  10                  15

His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr

            20                  25

<210>95

<211>30

<212>PRT

<213>人类

<400>95

Val Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala

 1               5                  10                  15

Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr

            20                  25                  30

<210>96

<211>31

<212>PRT

<213>人类

<400>96

Asp Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn Arg Tyr Tyr

 1               5                  10                  15

Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr

            20                  25                  30

<210>97

<211>33

<212>PRT

<213>人类

<400>97

Gln Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn Arg

 1               5                  10                  15

Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg

            20                  25                  30

Tyr

<210>98

<211>33

<212>PRT

<213>人类

<400>98

Arg Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn Arg

 1               5                  10                  15

Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg

            20                  25                  30

Tyr

<210>99

<211>33

<212>PRT

<213>人类

<400>99

Asn Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn Arg

 1               5                  10                  15

Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg

            20                  25                  30

Tyr

<210>100

<211>34

<212>PRT

<213>人类

<400>100

Val Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn

 1               5                  10                  15

Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln

            20                  25                  30

Arg Tyr

<210>101

<211>34

<212>PRT

<213>人类

<400>101

Leu Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn

 1               5                  10                  15

Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln

            20                  25                  30

Arg Tyr

<210>102

<211>27

<212>PRT

<213>人类

<400>102

Asp Asp Ala Ser Pro Asp Glu Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg

 1               5                  10                  15

His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr

            20                  25

<210>103

<211>31

<212>PRT

<213>人类

<400>103

Asp Ala Pro Gly Glu Asp Ala Thr Pro Glu Glu Leu Asn Arg Tyr Tyr

 1               5                  10                  15

Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr

            20                  25                  30

<210>104

<211>33

<212>PRT

<213>人类

<400>104

Asn Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Asp Glu Leu Asn Arg

 1               5                  10                  15

Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg

            20                  25                  30

Tyr

<210>105

<211>34

<212>PRT

<213>人类

<400>105

Leu Lys Pro Glu Ala Pro Gly Asp Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn

 1               5                  10                  15

Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln

            20                  25                  30

Arg Tyr

Claims (174)

1.一种透粘膜Y2受体结合肽制剂，当含有至少50μg Y2受体结合激动剂的剂量透粘膜施用于哺乳动物时，该制剂能够使所述哺乳动物血浆中Y2受体结合肽的浓度升高至少5皮摩尔/升血浆或更多。

2.权利要求1的制剂，其中Y2受体结合肽选自肽YY(PYY)、神经肽Y(NPY)和胰腺肽(PP)。

3.权利要求1和2的制剂，其还含有至少一种粘膜传递增强剂，该粘膜传递增强剂选自：

(a)增溶剂；

(b)电荷修饰剂；

(c)pH控制剂；

(d)降解酶抑制剂；

(e)粘液溶解或粘液清除剂；

(f)纤毛抑制剂；

(g)膜渗透增强剂；该膜渗透增强剂选自：(i)表面活性剂，(ii)胆汁盐，(ii)磷脂添加剂、混合微团、脂质体或载体，(iii)醇，(iv)烯胺，(v)NO供体化合物，(vi)长链两亲性分子，(vii)小疏水性渗透增强剂；(viii)钠或水杨酸衍生物；(ix)乙酰乙酸的甘油酯；(x)环糊精或β-环糊精衍生物；(xi)中链脂肪酸；(xii)螯合剂；(xiii)氨基酸或其盐；(xiv)N-乙酰氨基酸或其盐；(xv)对所选择的膜组分降解性的酶；(ix)脂肪酸合成的抑制剂；或(x)胆固醇合成抑制剂；或(xi)(i)-(x)的膜渗透增强剂的任一组合；

(h)上皮连接生理的调节剂；

(i)血管舒张剂；

(j)选择性转运增强剂；和

(k)稳定传递赋形剂、载体、支持体或复合体形成种类。

4.权利要求1的制剂，其中该制剂是鼻内制剂。

5.权利要求4的制剂，其中该制剂是含有水和Y2受体结合肽的水性制剂。

6.权利要求5的制剂，其中Y2受体结合肽选自PYY肽、NPY肽，和PP肽。

7.权利要求6的制剂，其中Y2受体结合肽是PYY肽，其中PYY肽含有选自SEQ ID NOs：1-21的氨基酸序列。

8.权利要求4、5、6和7的制剂，其中该制剂还含有至少一种透粘膜传递剂。

9.权利要求8的制剂，其中透粘膜传递剂选自：

(a)增溶剂；

(b)电荷修饰剂；

(c)pH控制剂；

(d)降解酶抑制剂；

(e)粘液溶解或粘液清除剂；

(f)纤毛抑制剂；

(g)膜渗透增强剂；该膜渗透增强剂选自：(i)表面活性剂，(ii)胆汁盐，(ii)磷脂添加剂、混合微团、脂质体或载体，(iii)醇，(iv)烯胺，(v)NO供体化合物，(vi)长链两亲性分子，(vii)小疏水性渗透增强剂；(viii)钠或水杨酸衍生物；(ix)乙酰乙酸的甘油酯；(x)环糊精或β-环糊精衍生物；(xi)中链脂肪酸；(xii)螯合剂；(xiii)氨基酸或其盐；(xiv)N-乙酰氨基酸或其盐；(xv)对所选择的膜组分降解性的酶；(ix)脂肪酸合成的抑制剂；或(x)胆固醇合成抑制剂；或(xi)(i)-(x)的膜渗透增强剂的任一组合；

(h)上皮连接生理的调节剂；

(i)血管舒张剂；

(j)选择性转运增强剂；和

(k)稳定传递赋形剂、载体、支持体或复合体形成种类。

10.权利要求1-9的制剂，其中该制剂还含有至少两种多元醇。

11.权利要求10的制剂，其中多元醇是乳糖和山梨糖醇。

12.权利要求1-11的制剂，其还含有螯合剂。

13.权利要求12的制剂，其中螯合剂是乙二胺四乙酸(EDTA)。

14.权利要求1-13的制剂，其还含有增溶剂。

15.权利要求14的制剂，其中增溶剂是环糊精。

16.权利要求1-15的制剂，其还含有表面活性剂。

17.权利要求16的制剂，其中表面活性剂是二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱(DDPC)。

18.权利要求1-17的制剂，其中Y2受体激动剂是PYY肽。

19.权利要求18的制剂，其中PYY肽含有选自SEQ ID NOs：1-21的氨基酸序列。

20.权利要求18的制剂，其中PYY肽是PYY3-36。

21.权利要求20的制剂，其还含有增溶剂。

22.权利要求21的制剂，其中增溶剂是环糊精。

23.权利要求22的制剂，其中环糊精是甲基-β-环糊精。

24.权利要求20-23的制剂，其中该制剂还含有水。

25.权利要求24的制剂，其中该制剂的pH为约3-6。

26.权利要求25的制剂，其中pH为5.0±0.3。

27.一种含有PYY肽的鼻内制剂，当含有至少50μg PYY的剂量鼻内施用于个体时，该制剂能够使所述个体血浆中PYY的浓度升高至少5皮摩尔/升血浆或更多。

28.权利要求27的鼻内制剂，其还含有粘膜增强剂。

29.权利要求28的鼻内制剂，其中粘膜增强剂选自：

(a)增溶剂；

(b)电荷修饰剂；

(c)pH控制剂；

(d)降解酶抑制剂；

(e)粘液溶解或粘液清除剂；

(f)纤毛抑制剂；

(g)膜渗透增强剂；该膜渗透增强剂选自：(i)表面活性剂，(ii)胆汁盐，(ii)磷脂添加剂、混合微团、脂质体或载体，(iii)醇，(iv)烯胺，(v)NO供体化合物，(vi)长链两亲性分子，(vii)小疏水性渗透增强剂；(viii)钠或水杨酸衍生物；(ix)乙酰乙酸的甘油酯；(x)环糊精或β-环糊精衍生物；(xi)中链脂肪酸；(xii)螯合剂；(xiii)氨基酸或其盐；(xiv)N-乙酰氨基酸或其盐；(xv)对所选择的膜组分降解性的酶；(ix)脂肪酸合成的抑制剂；或(x)胆固醇合成抑制剂；或(xi)(i)-(x)的膜渗透增强剂的任一组合；

(h)上皮连接生理的调节剂；

(i)血管舒张剂；

(j)选择性转运增强剂；和

(k)稳定传递赋形剂、载体、支持体或复合体形成种类。

30.权利要求27-29的鼻内制剂，其还含有至少两种多元醇。

31.权利要求30的鼻内制剂，其中两种多元醇是乳糖和山梨糖醇。

32.权利要求27-31的鼻内制剂，其还含有增溶剂。

33.权利要求32的鼻内制剂，其中增溶剂是环糊精。

34.权利要求33的鼻内制剂，其中增溶剂是甲基-β-环糊精。

35.权利要求27-34的鼻内制剂，其还含有螯合剂。

36.权利要求35的鼻内制剂，其中螯合剂是EDTA。

37.权利要求27-36的鼻内制剂，其还含有表面活性剂。

38.权利要求37的鼻内PYY制剂，其中表面活性剂是DDPC。

39.权利要求27-38的鼻内PYY制剂，其中该制剂是水性制剂。

40.权利要求39的鼻内PYY制剂，其中水性制剂的pH为3-6。

41.权利要求40的鼻内制剂，其中pH为5.0±0.3。

42.权利要求27-41的鼻内PYY制剂，其中PYY是PYY3-36(SEQ IDNO：2)。

43.权利要求27-42的PYY鼻内制剂，其中该制剂基本上不含作为稳定剂的多肽或蛋白质。

44.Y2受体结合肽在生产鼻内药物中的应用，该药物用于治疗哺乳动物中的肥胖症或诱导体重减轻，其中该药物当以含有至少50μg Y2受体结合激动剂的剂量鼻内施用于哺乳动物时，该制剂能够使所述哺乳动物血浆中Y2受体结合肽的浓度升高至少5皮摩尔/升血浆或更多。

45.权利要求44的应用，其中Y2受体结合肽选自肽YY(PYY)、神经肽Y(NPY)和胰腺肽(PP)。

46.权利要求45的应用，其中Y2受体结合肽选自PYY肽、NPY肽，和PP肽。

47.权利要求46的应用，其中Y2受体结合肽是PYY肽，其中PYY肽含有选自SEQ ID NOs：1-21的氨基酸序列。

48.权利要求44、45、46和47的应用，其中该药物还含有至少一种透粘膜传递剂。

49.权利要求48的应用，其中透粘膜传递剂选自：

(a)增溶剂；

(b)电荷修饰剂；

(c)pH控制剂；

(d)降解酶抑制剂；

(e)粘液溶解或粘液清除剂；

(f)纤毛抑制剂；

(g)膜渗透增强剂；该膜渗透增强剂选自：(i)表面活性剂，(ii)胆汁盐，(ii)磷脂添加剂、混合微团、脂质体或载体，(iii)醇，(iv)烯胺，(v)NO供体化合物，(vi)长链两亲性分子，(vii)小疏水性渗透增强剂；(viii)钠或水杨酸衍生物；(ix)乙酰乙酸的甘油酯；(x)环糊精或β-环糊精衍生物；(xi)中链脂肪酸；(xii)螯合剂；(xiii)氨基酸或其盐；(xiv)N-乙酰氨基酸或其盐；(xv)对所选择的膜组分降解性的酶；(ix)脂肪酸合成的抑制剂；或(x)胆固醇合成抑制剂；或(xi)(i)-(x)的膜渗透增强剂的任一组合；

(h)上皮连接生理的调节剂；

(i)血管舒张剂；

(j)选择性转运增强剂；和

(k)稳定传递赋形剂、载体、支持体或复合体形成种类。

50.权利要求44-49的应用，其中该药物还含有至少两种多元醇。

51.权利要求50的应用，其中多元醇是乳糖和山梨糖醇。

52.权利要求44-49的应用，其中药物还含有螯合剂。

53.权利要求22的应用，其中该螯合剂是乙二胺四乙酸(EDTA)。

54.权利要求44-53的应用，其还含有增溶剂。

55.权利要求54的应用，其中增溶剂是环糊精。

56.权利要求44-55的应用，其中药物还含有表面活性剂。

57.权利要求56的应用，其中表面活性剂是二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱(DDPC)。

58.权利要求44-57的应用，其中药物中Y2受体激动剂是PYY肽。

59.权利要求58的应用，其中PYY肽含有选自SEQ ID NOs：1-21的氨基酸序列。

60.权利要求58的应用，其中PYY肽是PYY3-36(SEQ ID NO：2)。

61.权利要求60的应用，其中药物还含有增溶剂。

62.权利要求61的应用，其中增溶剂是环糊精。

63.权利要求62的应用，其中环糊精是甲基-β-环糊精。

64.权利要求44-64的应用，其中药物还含有水。

65.权利要求64的应用，其中药物的pH为约3-6。

66.权利要求65的应用，其中pH为5.0±0.3。

67.权利要求44-66的应用，其中对哺乳动物施用50μg到800μg Y2受体结合肽以治疗该哺乳动物的肥胖症或诱导体重减轻或者诱导饱满感。

68.权利要求67的应用，其中对该哺乳动物施用75μg到约400μg Y2受体结合肽以治疗该哺乳动物的肥胖症或诱导体重减轻或者诱导饱满感。

69.权利要求68的应用，其中对该哺乳动物施用100μg到约300μg Y2受体结合肽以治疗该哺乳动物的肥胖症或诱导体重减轻或者诱导饱满感。

70.权利要求69的应用，其中对该哺乳动物施用150μg到约200μg Y2受体结合肽以治疗该哺乳动物的肥胖症或诱导体重减轻或者诱导饱满感。

71.权利要求44-70的应用，其中Y2受体结合肽是PYY肽、NPY肽或PP肽。

72.权利要求71的应用，其中Y2受体结合肽是PYY肽。

73.权利要求72的应用，其中PYY肽含有选自SEQ ID NOs：1-21的氨基酸序列。

74.权利要求73的应用，其中PYY肽是PYY3-36(SEQ ID NO：2)。

75.权利要求1-75的制剂和应用，其中Y2受体激动剂是人序列并且哺乳动物是人。

76.含有Y2受体结合肽、水和增溶剂的水性Y2受体结合肽制剂，其中该制剂基本上不含作为稳定剂的多肽或蛋白质。

77.权利要求76的制剂，其中所述稳定剂选自羟丙基-β-环葡聚糖、硫丁醚-β-环葡聚糖、和甲基-β-环糊精。

80.权利要求76的水性制剂，其还含有一种或多种多元醇。

81.权利要求80的水性制剂，其中多元醇选自乳糖、山梨糖醇、海藻糖、蔗糖、甘露糖和麦芽糖和它们的衍生物或同系物。

82.权利要求76-81的水性Y2受体结合肽制剂，其还含有表面活性剂和螯合剂。

83.权利要求82的水性制剂，其中表面活性剂选自聚山梨酯20、聚山梨酯80、PEG、十六醇、PVP、PVA、羊毛脂醇、二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱(DDPC)和失水山梨糖醇单月桂酸酯。

84.含有水、Y2受体结合肽、螯合剂和一种或多种多元醇的水性Y2受体结合肽制剂，其中该制剂的pH为约3到约6.5，并且该制剂基本上不含作为稳定剂的多肽或蛋白质。

85.权利要求84的水性Y2受体结合肽制剂，其中多元醇选自乳糖、山梨糖醇、海藻糖、蔗糖、甘露糖和麦芽糖和它们的衍生物或同系物。

86.权利要求84和85的水性Y2受体结合肽制剂，其还含有增溶剂。

87.权利要求86的水性Y2受体结合肽制剂，其中增溶剂选自羟丙基-β-环葡聚糖、硫丁醚-β-环葡聚糖、和甲基-β-环糊精。

88.权利要求84-87的水性Y2受体结合肽制剂，其还含有表面活性剂。

89.权利要求88的水性Y2受体结合肽制剂，其中表面活性剂选自聚山梨酯20、聚山梨酯80、PEG、十六醇、PVP、PVA、羊毛脂醇、二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱(DDPC)和失水山梨糖醇单月桂酸酯。

90.含有Y2受体结合肽、水、螯合剂和增溶剂的水性Y2受体结合肽制剂，其中该制剂的pH为约3.0到约6.5，并且该制剂基本上不含作为稳定剂的多肽或蛋白质。

91.权利要求90的水性Y2受体结合肽制剂，其中增溶剂选自羟丙基-β-环葡聚糖、硫丁醚-β-环葡聚糖、和甲基-β-环糊精。

92.权利要求90和91的水性制剂，其还含有一种或多种多元醇。

93.权利要求92的水性制剂，其中多元醇选自乳糖、山梨糖醇、海藻糖、蔗糖、甘露糖和麦芽糖和它们的衍生物或同系物。

94.含有Y2受体结合肽、水、螯合剂和表面活性剂的Y2受体结合肽的水性制剂，其中该制剂的pH为约3.0到约6.5，并且该制剂基本上不含作为稳定剂的多肽或蛋白质。

95.权利要求94的水性制剂，其中表面活性剂选自聚山梨酯20、聚山梨酯80、PEG、十六醇、PVP、PVA、二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱(DDPC)、羊毛脂醇和失水山梨糖醇单月桂酸酯。

96.权利要求94和95的水性Y2受体结合肽制剂，其还含有增溶剂。

97.权利要求96的水性Y2受体结合肽制剂，其中增溶剂选自羟丙基-β-环葡聚糖、硫丁醚-β-环葡聚糖、和甲基-β-环糊精。

98.含有水、Y2受体结合肽、一种或多种多元醇和表面活性剂的水性Y2受体结合肽制剂，其中该制剂的pH为约3.0到约6.5，并且该制剂基本上不含作为稳定剂的多肽或蛋白质。

99.权利要求98的水性制剂，其中多元醇选自乳糖、山梨糖醇、海藻糖、蔗糖、甘露糖和麦芽糖和它们的衍生物或同系物。

100.权利要求98和99的水性Y2受体结合肽制剂，其中表面活性剂选自聚山梨酯20、吐温80、PEG、十六醇、PVP、PVA、二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱(DDPC)、羊毛脂醇和失水山梨糖醇单月桂酸酯。

101.权利要求98-101的水性Y2受体结合肽制剂，其还含有增溶剂和螯合剂。

102.权利要求101的水性Y2受体结合肽制剂，其中增溶剂选自羟丙基-β-环葡聚糖、硫丁醚-β-环葡聚糖、和甲基-β-环糊精。

103.含有水、Y2受体结合肽、一种或多种多元醇和增溶剂的水性Y2受体结合肽制剂，其中该制剂的pH为约3.0到约6.5，并且该制剂基本上不含作为稳定剂的多肽或蛋白质。

104.权利要求103的水性Y2受体结合肽制剂，其中多元醇选自乳糖、山梨糖醇、海藻糖、蔗糖、甘露糖和麦芽糖和它们的衍生物或同系物。

105.权利要求103和104的水性Y2受体结合肽制剂，其还含有表面活性剂和螯合剂。

106.权利要求105的水性Y2受体结合肽制剂，其中表面活性剂选自聚山梨酯20、聚山梨酯80、PEG、十六醇、PVP、PVA、羊毛脂醇、二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱(DDPC)和失水山梨糖醇单月桂酸酯。

107.权利要求103-106的水性Y2受体结合肽制剂，其中稳定剂选自羟丙基-β-环葡聚糖、硫丁醚-β-环葡聚糖、和甲基-β-环糊精。

108.含有水、Y2受体结合肽、增溶剂和表面活性剂的水性Y2受体结合肽制剂，其中该制剂的pH为约3.0到约6.5，并且该制剂基本上不含作为稳定剂的多肽或蛋白质。

109.权利要求108的水性Y2受体结合肽制剂，其中增溶剂选自羟丙基-β-环葡聚糖、硫丁醚-β-环葡聚糖、和甲基-β-环糊精。

110.权利要求108和109的水性Y2受体结合肽制剂，其中表面活性剂选自聚山梨酯20、聚山梨酯80、PEG、十六醇、PVP、PVA、羊毛脂醇、二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱(DDPC)和失水山梨糖醇单月桂酸酯。

111.权利要求108-110的水性Y2受体结合肽制剂，其还含有一种或多种多元醇和螯合剂。

112.权利要求111的水性Y2受体结合肽制剂，其中多元醇选自乳糖、山梨糖醇、海藻糖、蔗糖、甘露糖和麦芽糖和它们的衍生物或同系物。

113.含有水、Y2受体结合肽、增溶剂、一种或多种多元醇和表面活性剂的水性Y2受体结合肽制剂，其中该制剂的pH为约3.0到约6.5。

114.权利要求113的水性Y2受体结合肽制剂，其中该制剂还含有两种多元醇和一种螯合剂。

115.权利要求113和114的水性Y2受体结合肽制剂，其中多元醇选自乳糖、山梨糖醇、海藻糖、蔗糖、甘露糖和麦芽糖和它们的衍生物或同系物。

116.权利要求115的水性Y2受体结合肽制剂，其中多元醇是山梨糖醇和乳糖。

117.权利要求113-116的水性Y2受体结合肽制剂，其中增溶剂选自羟丙基-β-环葡聚糖、硫丁醚-β-环葡聚糖、和甲基-β-环糊精。

118.权利要求117的水性Y2受体结合肽制剂，其中增溶剂是甲基-β-环糊精。

119.权利要求113-118的水性Y2受体结合肽制剂，其中表面活性剂选自聚山梨酯20、聚山梨酯80、PEG、十六醇、PVP、PVA、羊毛脂醇、二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱(DDPC)和失水山梨糖醇单月桂酸酯。

120.权利要求119的水性Y2受体结合肽制剂，其中表面活性剂是L-二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱(DDPC)。

121.含有水、Y2受体结合肽和螯合剂的水性Y2受体结合肽制剂，其中该制剂的pH为约3.0到约6.5，并且该制剂基本上不含作为稳定剂的多肽或蛋白质。

122.权利要求121的水性Y2受体结合肽制剂，其还含有增溶剂。

123.权利要求122的水性Y2受体结合肽制剂，其中增溶剂选自羟丙基-β-环葡聚糖、硫丁醚-β-环葡聚糖、和甲基-β-环糊精。

124.权利要求121-123的水性Y2受体结合肽制剂，其还含有表面活性剂。

125.权利要求124的水性Y2受体结合肽制剂，其中表面活性剂选自聚山梨酯20、聚山梨酯80、PEG、十六醇、PVP、PVA、羊毛脂醇、二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱(DDPC)和失水山梨糖醇单月桂酸酯。

126.权利要求121-125的水性Y2受体结合肽制剂，其还含有一种或多种多元醇。

127.权利要求126的水性Y2受体结合肽制剂，其中多元醇选自乳糖、山梨糖醇、海藻糖、蔗糖、甘露糖和麦芽糖和它们的衍生物或同系物。

128.权利要求121-127的水性Y2受体结合肽制剂，其中螯合剂是乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇四乙酸(EGTA)。

129.权利要求76-128的水性Y2受体结合肽制剂，其中Y2受体结合肽是PYY肽、NPY肽或PP肽。

130.权利要求129的水性Y2受体结合肽制剂，其中Y2受体结合肽是PYY肽，其含有选自SEQ ID NOs：1-21、SEQ ID NOs：72、73和74，和SEQ ID NOs：90-104的氨基酸序列。

132.权利要求129和130的水性Y2受体结合肽制剂，其中PYY肽是PYY(3-36)肽。

133.权利要求129-132的水性Y2受体结合肽制剂，其中Y2受体结合肽是PYY(3-36)肽，其含有选自SEQ ID NOs：2、3和SEQ ID NOs：90-105的氨基酸序列。

134.含有适于非输注施用的不含内毒素的Y2受体结合肽的药物制剂。

135.权利要求134的制剂，其还含有非输注施用的粘膜传递增强赋形剂。

136.权利要求76的制剂，其中所述Y2受体结合肽选自NPY、PP和PYY。

137.权利要求78的制剂，其中所述肽是PYY(3-36)。

138.权利要求77的制剂，其中所述非输注施用是经鼻、口、肠、口腔、支气管肺、阴道，和/或直肠粘膜表面施用。

139.权利要求76的制剂，其还含有约0.5mg/kg不含内毒素的PYY和用于口服给药的100到约200mg/kg一种或多种粘膜传递增强赋形剂。

140.权利要求76的制剂，其中所述非输注施用是皮下注射、肌内注射和/或腹膜内注射。

141.权利要求80的制剂，其中所述施用是经鼻。

142.权利要求80的制剂，其中所述施用是经口。

143.权利要求80的制剂，其中所述施用是经肺。

144.含有不含内毒素的Y2受体结合肽的药物制剂，所含的不含内毒素的Y2受体结合肽的量在每天施用持续至少10天后足够产生体重减轻多达2.5磅。

145.权利要求85的制剂，其中所述制剂含有每次施用浓度约为50到250微克的PYY3-36。

146.权利要求85的制剂，其中所述施用是经鼻。

147.含有Y2受体结合肽和药学上可接受的载体的Y2受体结合肽制剂，其中在体外组织渗透测定中该Y2受体结合肽制剂的渗透比由水、氯化钠、缓冲剂和Y2受体结合肽组成的对照制剂的渗透高至少1％。

148.权利要求147的Y2受体结合肽制剂，其中在体外组织渗透测定中该制剂的渗透比对照制剂的渗透高至少2％，其中对照制剂由水、氯化钠、缓冲剂和Y2受体结合肽组成。

149.权利要求147的Y2受体结合肽制剂，其中在体外组织渗透测定中该制剂的渗透比对照制剂的渗透高至少3％，其中对照制剂由水、氯化钠、缓冲剂和Y2受体结合肽组成。

150.权利要求147的Y2受体结合肽制剂，其中在体外组织渗透测定中该制剂的渗透比对照制剂的渗透高至少6％，其中对照制剂由水、氯化钠、缓冲剂和Y2受体结合肽组成。

151.权利要求147-150的Y2受体结合肽制剂，其中该Y2受体结合肽制剂还含有选自表面活性剂、增溶剂、多元醇，和螯合剂的至少一种赋形剂。

152.权利要求151的制剂，其中表面活性剂选自二癸酰基磷脂酰胆碱(DDPC)、聚山梨酯、十二醚、聚山梨酯20、聚山梨酯80、PEG、十六醇、PVP、PVA、羊毛脂醇、二癸酰基L-α-磷脂酰胆碱(DDPC)和失水山梨糖醇单月桂酸酯和胆酸钠。

153.权利要求147-152的Y2受体结合肽制剂，其中该制剂含有Y2受体结合肽、水和至少两种多元醇。

154.权利要求153的Y2受体结合肽制剂，其中多元醇是糖和糖醇。

155.权利要求154的Y2受体结合肽制剂，其中糖是乳糖并且糖醇是山梨糖醇。

156.权利要求151-155的Y2受体结合肽制剂，其中螯合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)和乙二醇四乙酸(EGTA)。

157.权利要求151-155的Y2受体结合肽制剂，其中增溶剂选自羟丙基-β-环葡聚糖、硫丁醚-β-环葡聚糖、和甲基-β-环糊精。

158.权利要求151-155的Y2受体结合肽制剂，其中该制剂的pH范围为3.0到约6.5。

159.权利要求147-158的Y2受体结合肽制剂，其中Y2受体结合肽选自PYY肽、NPY肽或PP肽。

160.权利要求147-159的Y2受体结合肽制剂，其中Y2受体结合肽是PYY肽，其含有选自SEQ ID NOs：1-21、SEQ ID NOs：72、73和74，和SEQID NOs：90-105的氨基酸序列。

161.权利要求159和160的Y2受体结合肽制剂，其中PYY肽是PYY(3-36)肽。

162.权利要求161的Y2受体结合肽制剂，其中Y2受体结合肽是PYY(3-36)肽，其含有选自SEQ ID NOs：2、3和SEQ ID NOs：90-105的氨基酸序列。

163.含有Y2受体结合肽的透粘膜Y2受体结合肽制剂，当100μL该制剂鼻内施用于哺乳动物时，该制剂能够使该哺乳动物血浆中Y2受体结合肽的浓度升高至少5皮摩尔/升血浆或更多。

164.权利要求163的Y2受体结合肽制剂，当100μL该制剂经鼻内施用于哺乳动物时，该制剂能够使该哺乳动物血浆中Y2受体结合肽的浓度升高至少10皮摩尔/升血浆或更多。

165.权利要求163的Y2受体结合肽制剂，当100μL该制剂经鼻内施用于哺乳动物时，该制剂能够使该哺乳动物血浆中Y2受体结合肽的浓度升高至少20皮摩尔/升血浆或更多。

166.权利要求163的Y2受体结合肽制剂，当100μL该制剂经鼻内施用于哺乳动物时，该制剂能够使该哺乳动物血浆中Y2受体结合肽的浓度升高至少40皮摩尔/升血浆或更多。

167.权利要求163的Y2受体结合肽制剂，当100μL该制剂经鼻内施用于哺乳动物时，该制剂能够使该哺乳动物血浆中Y2受体结合肽的浓度升高至少60皮摩尔/升血浆或更多。

168.权利要求163的Y2受体结合肽制剂，当100μL该制剂经鼻内施用于哺乳动物时，该制剂能够使该哺乳动物血浆中Y2受体结合肽的浓度升高至少80皮摩尔/升血浆或更多。

169.权利要求163的Y2受体结合肽制剂，当100μL该制剂经鼻内施用于哺乳动物时，该制剂能够使该哺乳动物血浆中Y2受体结合肽的浓度升高至少100皮摩尔/升血浆或更多。

170.权利要求163的Y2受体结合肽制剂，当100μL该制剂经鼻内施用于哺乳动物时，该制剂能够使该哺乳动物血浆中Y2受体结合肽的浓度升高至少120皮摩尔/升血浆或更多。

171.权利要求163的Y2受体结合肽制剂，当100μL该制剂经鼻内施用于哺乳动物时，该制剂能够使该哺乳动物血浆中Y2受体结合肽的浓度升高至少140皮摩尔/升血浆或更多。

172.权利要求163-172的Y2受体结合肽，其中哺乳动物是人。

173.Y2受体结合肽在生产含有Y2受体结合肽的药物中的应用，其中Y2受体结合肽作为喷雾剂施用，其中所述喷雾剂的小滴大小为10-100μm，并且其中当100μL喷雾剂经鼻内施用于人时，该喷雾剂能够使该哺乳动物的血浆中Y2受体结合肽的的浓度升高至少5皮摩尔/升。

174.Y2受体结合肽在生产含有Y2受体结合肽的药物中的应用，其中Y2受体结合肽作为喷雾剂施用，其中所述喷雾剂的小滴大小为10-100μm，并且其中当100μL喷雾剂经鼻内施用于人时，该喷雾剂能够使该哺乳动物的血浆中Y2受体结合肽的的浓度升高至少10皮摩尔/升。

175.Y2受体结合肽在生产含有Y2受体结合肽的药物中的应用，其中Y2受体结合肽作为喷雾剂施用，其中所述喷雾剂的小滴大小为10-100μm，并且其中当100μL喷雾剂经鼻内施用于人时，该喷雾剂能够使该哺乳动物的血浆中Y2受体结合肽的的浓度升高至少20皮摩尔/升。

176.Y2受体结合肽在生产含有Y2受体结合肽的药物中的应用，其中Y2受体结合肽作为喷雾剂施用，其中所述喷雾剂的小滴大小为10-100μm，并且其中当100μL喷雾剂经鼻内施用于人时，该喷雾剂能够使该哺乳动物的血浆中Y2受体结合肽的的浓度升高至少30皮摩尔/升。

177.Y2受体结合肽在生产含有Y2受体结合肽的药物中的应用，其中Y2受体结合肽作为喷雾剂施用，其中所述喷雾剂的小滴大小为10-100μm，并且其中当100μL喷雾剂经鼻内施用于人时，该喷雾剂能够使该哺乳动物的血浆中Y2受体结合肽的的浓度升高至少40皮摩尔/升。

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