CN1713823A - 颗粒状组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明想要提供一种高温高湿下稳定的颗粒状组合物，以及提供一种生产这种颗粒状组合物的简单又有效的方法。根据本发明，提供一种含有核心物质以及覆盖核心物质的层的颗粒状组合物，其中核心物质由糖类构成，覆盖核心物质的层含有生物活性成分和硬化油。另外，提供一种生产颗粒状组合物的方法，包括使熔融硬化油和生物活性成分的混合物粘附到糖粒上或在其上面形成膜。

Description

颗粒状组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及颗粒组合物及其生产方法。更特别的，本发明涉及具有增强的湿热稳定性的含有生物活性成分的颗粒状组合物，以及产生这种颗粒状组合物的方法，以致熔融的硬化油和生物活性成分的混合物粘附到粒状糖上或在其上形成膜。
背景技术
生物活性成分，其包括酶、抗生素、疫苗、激素以及维生素，在干燥状态通常为粉末状。在这种条件下，在药物制剂、食品、清洁剂、家畜用饲料等中使用生物活性成分。然而，由于差的流动性以及生尘特性，其通过吸入、皮肤接触等可引起过敏症状等，因此生物活性成分在实践中是不令人满意的。因此，如果需要，这些成分可以在被加工成预定形状之后再进行使用。
另外，当活性成分加入到家畜用饲料中时，高温高湿下生物活性成分的活性通常会降低。此外，在饲料加工厂中，通常能在饲料生产厂的饲料和原料中发现有毒细菌，例如沙门氏菌，要对其进行灭菌。因此为了将饲料制成颗粒状，要用大约80℃的蒸汽对饲料进行热处理。另一方面，夏天，室外饲料储藏容器的温度可能超过50℃，湿度超过80％。
根据以上事实，本领域技术人员需要含有生物活性成分的稳定药物制剂，其中粉状的生物活性成分几乎不被分散，并且其活性在高温及高湿时不会剧烈下降。因此，例如，由于容易处理，本领域比较经常地使用颗粒状酶制剂。通过挤出造粒、滚动造粒(roll granulation)等生产颗粒状酶制剂。
例如，报道了一种生产颗粒状或细粒状酶的方法，其中，在流化条件下，将酶和网孔粒度为20-100(粒度为840-150um)、低熔点的颗粒物的混合物加热至所述低熔点物质的熔点或更高，使混合物成粒(JP04-13019B)。
另外，作为防止酶分散的方法，有几种方法将酶制成颗粒状药物制剂，例如其中一种使用纤维素作为核心物质制粒(JP01-112983A)，一种使用低熔点物质作为核心物质制粒(JP58-214333A)，一种将溶解了粘合剂材料和酶的溶液喷洒到核心上(JP60-37983A和JP60-37984A)，一种由盐和/或糖类构成的核心物质覆盖有溶解的低熔点物质和酶，接着加入具有高熔点的物质(JP03-64108B)。然而，这些方法中的任何一种都有缺点，即生产过程复杂，并且高温高湿时酶的稳定性低。
此外，已提供一种保持高温高湿时酶稳定性的方法，该方法包括将含有酶的核心物质用疏水物质和不溶于水的物质进行包衣(JP11-514240A)。然而，该方法需要复杂的生产过程，生产需要很长的时间，并且制粒机限于一种特定的类型。
本发明试图提供一种颗粒状组合物，对于任何一种生物活性成分例如抗生素、疫苗、激素以及维生素和酶，在高温高湿下都能保持稳定，以及提供一种生产这种颗粒状组合物的简单有效的方法。
发明内容
作为颗粒状组合物的有效成分的生物活性成分通常都采用喷雾干燥法等进行制粒。另一方面，本发明的发明者已经发现：通过利用脂肪具有能在预定温度下融化以及固化的特性，将该生物活性成分的松散粉末(bulk powder)悬浮在脂肪中，使松散粉末粘附到适宜的载体上或在上面形成膜，得到一种湿热压力(load of wet heat)不直接影响生物活性成分的结构。进一步，本发明的发明者通过发展一种简单的产生这种颗粒状组合物的方法实现本发明，并缩减了很多步骤。
根据权利要求1，本发明提供一种颗粒状组合物，包括核心物质和覆盖该核心物质的层，其中核心物质由糖类构成，覆盖核心物质的层由硬化油和生物活性成分构成。
根据权利要求2，本发明提供根据权利要求1的颗粒状组合物，其中糖类是粒状糖或乳糖。
根据权利要求3，本发明提供根据权利要求1的颗粒状组合物，其中硬化油为硬化棕榈油。
根据权利要求4，本发明提供根据权利要求1的颗粒状组合物，其中生物活性成分为酶。
根据权利要求5，本发明提供根据权利要求4的颗粒状组合物，其中酶为选自纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的一种酶或由两种或更多种酶构成的组合。
根据权利要求6，本发明提供根据权利要求5的颗粒状组合物，其中纤维素酶来源于绿色木霉(Trichoderma viride)。
根据权利要求7，本发明提供根据权利要求5的颗粒状组合物，其中淀粉酶来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)。
根据权利要求8，本发明提供根据权利要求5的颗粒状组合物，其中蛋白酶来源于黑曲霉(Aspergillus niger)。
根据权利要求9，本发明提供根据权利要求5的颗粒状组合物，其中脂肪酶来源于Candida cylindracea。
根据权利要求10，本发明提供根据权利要求1的颗粒状组合物，其中生物活性成分为抗生素。
根据权利要求11，本发明提供根据权利要求10的颗粒状组合物，其中抗生素为粘菌素。
根据权利要求12，本发明提供根据权利要求1和4至11中任何一项权利要求的颗粒状组合物，其中所述生物活性成分的含量为0.1-15％wt。
根据权利要求13，本发明提供一种生产根据权利要求1的颗粒状组合物的方法，包括使含有熔融硬化油和生物活性成分的混合物粘附到粒状糖上或在其上面形成膜。
根据权利要求14，本发明提供根据权利要求13的生产颗粒状组合物的方法，其中糖类为粒状糖或乳糖。
根据权利要求15，本发明提供根据权利要求13的生产颗粒状组合物的方法，其中硬化油为硬化棕榈油。
根据权利要求16，本发明提供根据权利要求13的生产颗粒状组合物的方法，其中生物活性成分为酶。
根据权利要求17，本发明提供根据权利要求16的生产颗粒状组合物的方法，其中酶为选自纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的一种酶或由两种或更多种酶构成的组合。
根据权利要求18，本发明提供根据权利要求13的生产颗粒状组合物的方法，其中生物活性成分为抗生素。
根据权利要求19，本发明提供根据权利要求18的生产颗粒状组合物的方法，其中抗生素为粘菌素。
根据权利要求20，本发明提供根据权利要求13和16至19中任何一项权利要求的生产颗粒状组合物的方法，其中所述生物活性成分的含量为0.1-15％wt。
根据权利要求21，本发明提供一种通过混合权利要求1至12中任何一项权利要求的颗粒状组合物得到的丸形饲料(pellet type feed)。
根据权利要求22，本发明提供一种生产丸形饲料的方法，包括使用根据权利要求1至12中任何一项权利要求的颗粒状组合物。
完成发明的最佳模式
以下将详细描述本发明。
根据权利要求1，本发明提供一种包括核心物质和覆盖该核心物质的层的颗粒状组合物，其中核心物质由糖类构成，覆盖核心物质的层由硬化油和生物活性物质构成。
通过将该生物活性成分悬浮在硬化油中，并使混合物粘附到适宜的载体上或在其上面形成膜，本发明的组合物被构造成使得湿热压力不直接影响作为有效成分的生物活性成分。
因此，颗粒状组合物具有湿热(wet-heat)稳定性。这里使用的术语“湿热稳定性”表示颗粒状组合物的性质，其中即使将生物活性成分受到潮湿和/加热条件的影响，通过减少生物活性成分在这样的条件下活性降低的程度，使组合物中含有的生物活性成分的活性保持原样。更具体的说，以酶为例，术语意味着当在大约80℃蒸汽加热条件下暴露1分钟后，酶能保持75％或更高活性的事实。这一加热条件比其它条件更苛刻，例如通常要进行的饲料蒸汽灭菌过程，以及夏天饲料储藏容器放置在户外的环境条件。
在本发明使用的生物活性成分的实例包括治疗或预防各种疾病的具有有效生物活性的化合物，例如酶、抗生素、疫苗、激素和维生素。
应用于本发明的酶的优选实例包括，但不限于纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶。酶更优选的例子包括来源于绿色木霉的纤维素酶，来源于米曲霉的淀粉酶，来源于黑曲霉的蛋白酶以及来源于Candidacylindracea的脂肪酶。这些酶可以被单独使用或两种或几种结合使用。可选择的，可以结合使用属于同一种类的两种或几种酶。
本发明使用的酶通常是粉末状，也可以通过对采用传统方法分别培养产酶细菌而得到的培养液进行制备而得到。可选择的，酶可以是商业可利用的松散粉末(bulk powder)。例如，对于纤维素酶，从培养液制备的方法包括：培养任何一种能产生酶的微生物，例如黑曲霉，Humicola insolens，绿色木霉，Acremonium cellulolyticus，尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)，以及米根霉(Rhizopus oryaze)；将得到的培养物进行例如离心得到上清液；如果需要，进行超滤浓缩上清液；通过喷雾干燥法等产生感兴趣的纤维素酶松散粉末。另外，相似的，其它酶可以通过各自能产生该酶的生物体的培养液而得到，例如对于淀粉酶来说，生物体有米曲霉，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，以及地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，对于蛋白酶来说，有黑曲霉、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及米曲霉，对于脂肪酶来说，有Candida cylindracea，日本根霉(Rhizopus japonicus)，德列马根霉(Rhizopus delemar)，以及Arthrobacter ureafaciens。
其次，应用于本发明的抗生素的实例包括粘菌素、卡那霉素、链霉素、青霉素以及磷霉素(phosphomycin)。特别的，其中优选粘菌素。可以单独使用这些抗生素或者组合使用其中的两种或几种。
本发明中使用的任何一种抗生素通常是粉末状，可以从能产生该抗生素的生物体制备得到。例如通过培养多粘芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa)得到的培养液制备粘菌素或者是商业上可利用的抗生素松散粉末。
此外，本发明使用的硬化油的实例包括：动物硬化油，例如牛脂硬化油和猪油硬化油；植物硬化油，例如油菜籽硬化油，大豆硬化油，硬化橄榄油，硬化棕榈油，和硬化蓖麻油。其中，优选植物硬化油。特别的是优选硬化棕榈油。顺便说一句，不优选使用干性油、半干性油以及非干性油，由于它们粘度高以及可以渗透核心物质，这些油难以处理。另一方面，硬化油在大约50℃或更高的温度下融化。因此生物活性成分可以悬浮在硬化油中。另外，通过降低温度硬化油容易固化从而覆盖核心物质，而没有发现渗透到核心物质中。
因此，在本发明中使用的适宜的硬化油的例子包括熔点为50℃或更高的硬化油，优选为大约50℃至65℃。另外，本发明使用的硬化油的含量通常在重量百分比1至20％的范围，优选重量百分比在5至10％的范围。
在本发明中，如果需要，除了硬化油和生物活性成分，构成覆盖核心物质的膜层的成分还可以包括赋形剂和粘合剂。
此外，糖类是颗粒状组合物的核心物质的组分。使用于本发明的糖类的例子包括作为蔗糖粒状结晶的粒状糖，乳糖，黄绵白糖(yellow softsugar)和蔗糖。其中优选粒状糖和乳糖。另外，它们可以单独使用或者组合它们中的两种或几种使用。
颗粒状组合物通常含有重量百分比为0.1至15％范围的生物活性成分，优选重量百分比范围在1至10％。如果含有重量百分比小于0.1％的生物活性成分，组合物就会不均匀。如果含有重量百分比超过15％的生物活性成分，随着硬化油体积增加就会变得致密。
其次，将描述在权利要求13中阐明的生产本发明颗粒组合物的方法。
本发明的生产方法包括使含有熔融硬化油和生物活性成分的混合物粘附到粒状糖上或在其上面形成膜。
颗粒状组合物具有比较简单的组成和结构，因此其生产步骤简单，具有少量几步。因此，能显著地减轻含有生物活性成分的药物制剂活性的降低，其中所述药物制剂活性的降低通常与步骤数量增加有关。在本发明，简单但是最重要的控制步骤是温度控制。也就是，保持通过混合以粉末提供的生物活性成分和融化的硬化油而制备的生物活性成分和硬化油混合物时的温度；使混合有生物活性成分的硬化油粘附到作为载体提供的糖类上或在其上面形成涂膜时，糖类的温度；当粘附到糖类上或在上面形成涂膜后，生物活性成分组合物的温度；当冷却得到最终产物颗粒状组合物时的温度。因此得到所关心的对热稳定的均匀结构。
具体来讲，本发明的生产方法中，融化硬化油，接着与生物活性成分混合从而得到生物活性成分和硬化油的混合物。另一方面，糖类的温度保持在大约为硬化油熔点的温度。接着逐渐加入生物活性成分和硬化油的混合物，接着冷却至大约35℃。因此生物活性成分和硬化油的混合物粘附或在糖类的外表面上形成膜。最后，通过筛分等去除不想要的大颗粒，得到想要的颗粒状组合物。
只要本发明的颗粒状组合物具有上面描述的颗粒状组合物的结构，则不限制它的生产方法。另外，用于本发明的机器、设备等没有特别限制。可以选择它们中适合于生产方法的任何一种。
其次，在权利要求21或22中阐明的本发明涉及一种丸形饲料及其生产方法。
可以主要使用传统方法生产丸形饲料。在生产过程中，标准饲料与本发明的颗粒状组合物混合，在湿热条件下消毒和加工。如上所述本发明的颗粒状组合物具有湿热稳定性。即使用于生产的丸形饲料经受湿热过程和蒸汽消毒，生物活性成分表现稳定，显示出原有的对饲料喂养的家畜的作用。
下面将举例说明本发明颗粒状组合物的实施例和试验例。然而本发明不限于这些例子。
进一步，在例子中使用的生物活性成分等包括来源于绿色木霉的纤维素酶松散粉末(Meiji Seika Kaisha，Ltd生产)，来源于米曲霉的淀粉酶松散粉末(Meiji Seika Kaisha，Ltd生产)，来源于黑曲霉的蛋白酶松散粉末(由Meiji Seika Kaisha，Ltd生产)，来源于Candidacylindracea的脂肪酶松散粉末(由Meito Sangyo Co.，Ltd.生产)，来源于多粘芽孢杆菌的粘菌素硫酸盐松散粉末(由Meiji SeikaKaisha，Ltd生产，LOT No.55729，709ug(滴度)/mg)。另外，使用的硬化油是New Japan Chemical Co.，Ltd生产的硬化棕榈油(extreme A)，使用的粒状糖是Nissin Sugar Manufacture Co.，Ltd生产的“粒状糖G”(粒度为0.25至1mm)，使用的乳糖是DMV International Co.，Ltd生产的乳糖#100。
实施例1制备颗粒状组合物A
将20克硬化棕榈油放于100ml玻璃烧杯中，接着将其浸没在80+1℃的恒温容器中，随后用刮铲搅拌溶解硬化棕榈油。接着，搅拌混合6g绿色木霉纤维素酶松散粉末，制备与酶混合的硬化油。
另一方面，将174g粒状糖(granulated sugar)放于500ml塑料烧杯中，保存在温度为50℃±1℃的恒温容器中，随后逐步向内加入26g上述的酶和硬化油的混合物。随后，当硬化油冷却到35℃并固化后，用网格大小为1.4mm的筛子去除不想要的大颗粒，得到想要的颗粒状组合物A，其中含有重量比为3％的绿色木霉的纤维素酶。
实施例2制备颗粒状组合物B
将20克硬化棕榈油放于100ml玻璃烧杯中，接着将其浸没在80±1℃的恒温容器中，随后用刮铲搅拌溶解硬化棕榈油。接着，搅拌混合6g绿色木霉纤维素酶松散粉末，制备与酶混合的硬化油。
另一方面，将174g乳糖放于500ml塑料烧杯中，保存在温度为50℃±1℃的恒温容器中，随后逐步向内加入26g上述的酶和硬化油的混合物。随后，当硬化油冷却到35℃并固化后，用网格大小为1.4mm的筛子去除不想要的大颗粒，得到想要的颗粒状组合物B，其中含有重量比为3％的绿色木霉的纤维素酶。
实施例3制备颗粒状组合物C
使用振动流化床干燥器(VDF-6000；Fuji Paudal制造)增加130.5kg粒状糖的温度，调整到55℃后，使用带式进料器(KYC Machine Industry制造)在Mazelar搅拌器(PM-200VP；Mazelar制造)中加入以及混合总量，使用电热加热器保持其温度。
另一方面，将总量为15kg的硬化棕榈油装入硬化油溶解容器中(T.K.UNI-MIXER，TOKUSHU KIKA KOGYO制造)，进行溶解，液体温度控制在80℃±3℃。接着将4.5kg绿色木霉的纤维素酶松散粉末加入到容器中，混合以制备与酶混合的硬化油。
接着，当Mazelar搅拌器中粒状糖的温度稳定在55℃±1℃后，将与酶混合的硬化油装入喷嘴中，当混合粒状糖时，该喷嘴进行保温。大约用15分钟的时间倒入全部混合物(19.5kg)。接着，混合内容物大约10分钟，使其均匀分散。同时，内容物的温度达到大约60℃。
接着，使用现场空气调节器(Hitachi Air Conditioning System制造)供入冷空气以混合内容物，温度冷却到56℃±1℃。接着，将混合物迅速从Mazelar搅拌器转移到另一搅拌器中(PT-200；Mazelar制造)，在混合下用现场空气调节器进行冷却，直到温度达到35℃或更低。
其次，用圆筛(筒形，DALTON制造)筛分混合物，除去不想要的大颗粒，得到想要的颗粒状组合物C，其中含有重量百分比为3％的绿色木霉的纤维素酶。
实施例4制备颗粒状组合物D
当123kg粒状糖的温度调节到57℃后，使用带式进料器在Mazelar搅拌器中加入以及混合总量，使用电热加热器保温。在该步骤中内容物的温度控制在55℃。
另一方面，将总量为18kg的硬化棕榈油装入硬化油溶解容器中，进行溶解，液体温度控制在81℃±2℃。接着将9kg绿色木霉的纤维素酶松散粉末加入到容器中，混合以制备酶和硬化油的混合物。
接着上面的步骤，当Mazelar搅拌器中粒状糖的温度稳定在57℃±1℃后，将与酶混合的硬化油装入喷嘴中，当混合粒状糖时，所述喷嘴进行保温。用大约20分钟的时间倒入全部混合物(27kg)。接着，混合内容物大约10分钟，用于均匀分散。同时，内容物的温度达到大约58℃。
接着，使用现场空气调节器供入冷空气以混合内容物，其温度冷却到56℃±1℃。接着，将含有酶的混合物迅速从Mazelar搅拌器转移到另一搅拌器中，仔细混合，以使没有留下堆积物。使用现场空气调节器使混合物的温度冷却至35℃或更低，使用DALTON筛分机去除不想要的大颗粒，得到想要的颗粒状组合物D，其中含有重量百分比为6％的绿色木霉的纤维素酶。
实施例5制备颗粒状组合物E
将20克硬化棕榈油放于100ml玻璃烧杯中，将其浸没在80±1℃的恒温容器中，随后用刮铲搅拌溶解硬化棕榈油。接着，搅拌混合6g米曲霉的淀粉酶松散粉末，制备与酶混合的硬化油。
另一方面，将174g粒状糖放于500ml塑料烧杯中，保存在温度为50℃±1℃的恒温容器中，随后逐步向内加入26g上述的与酶混合的硬化油。随后，当硬化油冷却到35℃并固化后，用网格大小为1.4mm的筛子去除不想要的大颗粒，得到想要的颗粒状组合物E，其中含有重量比为3％的米曲霉的淀粉酶。
实施例6制备颗粒状组合物F
将20克硬化棕榈油放于100ml玻璃烧杯中，将其浸没在80±1℃的恒温容器中，随后用刮铲搅拌溶解硬化棕榈油。接着，搅拌混合6g黑曲霉的蛋白酶松散粉末，制备与酶混合的硬化油。
另一方面，将174g粒状糖放于500ml塑料烧杯中，保存在温度为50℃±1℃的恒温容器中，随后逐步向内加入26g上述与酶混合的硬化油。随后，当硬化油冷却到35℃并固化后，用网格大小为1.4mm的筛子去除不想要的大颗粒，得到想要的颗粒状组合物F，其中含有重量比为3％的黑曲霉的蛋白酶。
实施例7制备颗粒状组合物G
将50克硬化棕榈油放于100ml玻璃烧杯中，将其浸没在80±1℃的恒温容器中，随后用Three-One Motor(600G型；HEIDON)搅拌溶解硬化棕榈油。接着，搅拌混合15g Candida cylindracea的脂肪酶松散粉末，制备与酶混合的硬化油。
另一方面，将435g粒状糖放于高速搅拌器(LFS-GS-2J型；FUKAEPOWTEC)中，其保存在温度为55℃±1℃的热水回流套中，随后逐步向内加入65g上述与酶混合的硬化油。随后，当硬化油冷却到35℃并固化后，用网格大小为1.4mm的筛子去除不想要的大颗粒，得到想要的颗粒状组合物G，其中含有重量比为3％的Candida cylindracea的脂肪酶。
实施例8制备颗粒状组合物H
将30克硬化棕榈油放于100ml玻璃烧杯中，将其浸没在80±1℃的恒温容器中，随后用Three-One Motor(600G型；HEIDON)搅拌并溶解硬化棕榈油。接着，搅拌混合8.5g粘菌素硫酸盐松散粉末，制备与粘菌素硫酸盐混合的硬化油。
另一方面，将在60℃的热风干燥器中保温的261.5g粒状糖转移到高速搅拌器(LFS-GS-2J型；FUKAE POWTEC)中，并保存在温度为50℃至60℃的热水回流套中，随后逐步向内加入38.5g与粘菌素硫酸盐混合的硬化油。随后，当硬化油冷却到35℃并固化后，用网格大小为1.4mm的筛子去除不想要的大颗粒，得到想要的颗粒状组合物H，其中含有重量比为2.8％的粘菌素硫酸盐。
对照实施例1制备粉状组合物a
将471.8g米糠油饼，28.2g粘菌素硫酸盐松散粉末，以及500g米糠油饼按所述顺序加入高速搅拌器(SEGV-200)中，30rpm搅拌10分钟，得到想要的粉状组合物a，其中粘菌素硫酸盐的重量百分比含量为2.8％。
试验实施例1
在本实施例中，制备了多种酶的颗粒状组合物，以评价组合物中酶的稳定性。
[测定酶活性的方法和制备样品的方法]
1-1.纤维素酶活性的测定
纤维素酶用pH4.5的醋酸缓冲液提取后，作为样品溶液与偶联了兰色染料的CM-CELLULOSE(Megazyme生产)反应。这种有色CM-CELLULOSE可为粉末状。在pH4.5，40℃条件下，有色CM-CELLULOSE用酶处理10分钟后，用酸性醇(acidic alcohol)终止反应。
然后，将反应溶液离心得到的上清液中兰色染料的量根据吸光度(620nm)除以空白溶液的吸光度得到的值进行确定。同样，根据纤维素标准溶液与酶反应的校准曲线，测定样品中纤维素酶的活性(单位：u/mL)。
1-2.测定范围
将样品溶液稀释，从而调节纤维素糖基化活性为0.05至0.3u/mL。该纤维素糖基化活性的测量范围相应于酶组合物中10到10000u/g的酶。
1-3.制备样品溶液的方法
将大约1g的纤维素酶样品加到100mL锥形瓶中。再加入50mL pH4.5的醋酸缓冲液后将瓶密封。混合液在室温下用磁力搅拌器搅拌60分钟，然后用0.45μm的膜过滤器(Maillex-HV，孔径：25mm，MILLIPORE生产)过滤。过滤后的混合液作为样品溶液。
1-4.纤维素酶标准溶液
标准溶液由具有已知的纤维素糖基化活性的绿色木霉纤维素酶制备而得，使用pH4.5的醋酸缓冲液可以精确指示其活性范围为0.05至0.3u/mL。
2-1.淀粉酶活性的测定
淀粉酶活性(淀粉糖基化能力)的测定方法与MinisterialOrdinance(Ministry of Agriculture and Forestry’s Ordinance No.35of 1976)中关于饲料成分和饲料添加剂的有关章节中的通用方法即“关于酶能力的测定方法”相一致。但本测试中pH值为5.0。样品溶液用0.1mol/L的乳酸盐缓冲液制备而得。一单位淀粉糖基化能力相当于当淀粉酶在37℃作用于马铃薯淀粉时在反应初始阶段1分钟内生成1mg葡萄糖的酶量(该酶能实现还原能力的增加)。
2-2.测定范围
将样品溶液稀释成每毫升溶液浓度相当于0.4到0.8单位的淀粉糖基化能力。
2-3.底物溶液的制备
事先精确称量大约1克的马铃薯淀粉，然后在105℃干燥2小时，称量其重量损失。精确称量相当于1克干品的马铃薯淀粉于锥形瓶中。向瓶中加入20毫升水，并逐渐加入5毫升2mol/L的氢氧化钠试液，同时充分振摇，使混合液成糊状。在水浴中搅拌加热3分钟后，加入25毫升水。冷却后，用2mol/L盐酸试液精确中和混合液，再补加10毫升0.1mol/L的醋酸/醋酸钠缓冲液(pH5.0)，随后加水至混合液体积刚好为100毫升。
2-4.步骤
精确称量适量的样品，并加入pH值为5.0的0.1mol/L乳酸盐缓冲液，使每毫升浓度相当于0.4至0.8个单位的淀粉糖基化能力。用所得混合液作为样品溶液。必要时可以过滤或离心。然后，精确称量10毫升底物溶液，加入直径为30毫米的试管中。在37±0.5℃放置10分钟后，向试管内精确加入1毫升样品溶液，立即振摇混合，在37±0.5℃放置10分钟。
下一步，加入2毫升费林溶液中的碱性酒石酸盐溶液并立即搅拌。再精确加入2毫升费林溶液中的铜溶液并轻微振摇，将一漏斗置于试管口，将试管在水浴中准确加热15分钟。之后立刻用流水将试管冷却至25℃或以下。然后加入2毫升浓缩的碘化钾试液和2毫升稀释的3mol/L硫酸，用0.05mol/L的硫代硫酸钠溶液滴定释放出来的碘(指示剂：1到2滴可溶性的淀粉试液)。在这种情况下，溶液中的兰色消失的点作为滴定终点，其滴定度为A毫升。或者，用10毫升水代替10毫升底物溶液，按上述方法操作，其滴定度为B毫升。按照下面的公式计算1克样品的淀粉糖基化能力单位(U)。这里，式中的w表示1毫升样品溶液中的样品重量(克)。
U＝(B-A)×1.6×1/10×1/w
3-1.蛋白酶活性的测定
蛋白酶活性(消化蛋白的能力)的测定方法与MinisterialOrdinance(Ministry of Agriculture and Forestry’s Ordinance No.35of 1976)中关于饲料成分和饲料添加剂的有关章节中的通用方法“关于酶能力的测定方法(关于消化蛋白能力的测定方法，第二方法)”相一致。但本测试中pH值为2.6。样品溶液用0.1mol/L的醋酸盐缓冲液制备而得。一个单位的消化蛋白质的能力相应于当蛋白酶在37℃作用于乳清酪蛋白时在反应的初始阶段1分钟内释放1μg酪氨酸的酶量(该酶能实现费林试剂中非蛋白显色底物的增加)。
3-2.测定范围
将样品溶液稀释成每毫升浓度相当于10到30单位的消化蛋白能力。
3-3.底物溶液的制备
事先精确称量大约1克的乳清酪蛋白，然后在105℃干燥2小时，称量其重量损失。精确称量相当于1.20克干品的乳清酪蛋白，加入16毫升1mol/L乳酸试液和146毫升水。混合物在水浴中加热并使之溶解。然后用流水冷却，补加1mol/L的盐酸试液或1mol/L的氢氧化钠试液，调节pH值至2.6，随后加水至溶液体积刚好为200毫升。
3-4.校正曲线的绘制
将酪氨酸标准品在105℃干燥3小时，从其中精确称量0.500克干品，溶于2mol/L盐酸试液并精确配制成500毫升溶液。精密量取1毫升、2毫升、3毫升和4毫升上述溶液，分别加入0.2mol/L的盐酸试液并精确配制成100毫升溶液。
随后，每种溶液精确量取2毫升，分别加入5毫升0.55mol/L的碳酸钠试液和1毫升三倍水稀释的费林试剂。将溶液于37±0.5℃放置30分钟后，在660nm波长下分别测定每个溶液的吸光度，得到溶液中费林试剂的显色物质的量(A1，A2，A3和A4)。另外，精密量取2毫升0.2mol/L盐酸试液，按上述方法操作测得吸收值A0。
以吸光度A1-A0，A2-A0，A3-A0和A4-A0的差值作为纵坐标，酪氨酸的量(微克)作为横坐标，绘制校正曲线。
3-5.步骤
精确称量适量的样品并溶解于水，0.1mol/L乳酸盐缓冲液，醋酸缓冲液或0.01mol/L醋酸/醋酸钠缓冲液，使每毫升浓度相当于10至30个单位的消化蛋白能力。所得混合液作为样品溶液。必要时可以过滤或离心。随后，精确称量5毫升底物溶液，在37±0.5℃放置30分钟。另外，该溶液经过滤完全除掉沉淀后，精密量取2毫升滤液，加入5毫升0.55mol/L碳酸钠试液和1毫升三倍水稀释的费林试剂。所得溶液充分搅拌并于37±0.5℃放置30分钟，然后在660nm波长下测定溶液的吸收值AT。此外，精密量取1毫升样品溶液，并加入5毫升三氯乙酸试液A。溶液经过充分振荡后，加入5毫升底物溶液，在37±0.5℃放置30分钟。然后，按上述操作测定溶液的吸收值AT’。按照下面的公式计算1克样品的消化蛋白能力单位(U)。这里，式中F表示由校正曲线得到的吸收度差值为1时的酪氨酸量(微克)，w表示1毫升样品溶液中的样品重量(克)。
U＝(AT-AT’)×F×11/2×1/10×1/w
4-1.脂肪酶活性的测定
脂肪酶活性(消化脂肪的能力)的测定方法与MinisterialOrdinance(Ministry of Agriculture and Forestry’s Ordinance No.35of 1976)中关于饲料成分和饲料添加剂的有关章节中的通用方法“关于酶能力的测定方法”相一致。但本测试中pH值为7.0。一个单位的消化脂肪的能力相应于当脂肪酶在37℃作用于橄榄油时在反应初始阶段1分钟内释放1μmol脂肪酸的酶量(该酶能实现消化能力的增加)。
4-2.测定范围
将样品溶液稀释成每毫升浓度相当于1.0到5.0单位的消化脂肪能力。
4-3.底物溶液的制备
在盛放乳化剂的500ml容器中，加入200到300毫升的聚乙烯醇试液/橄榄油(3∶1)混合液，降温至10℃，以12000到16000rpm速度旋转，乳化10分钟。将所得溶液置于暗处1小时，在确定油层没有分离后使用。
4-4步骤
准确称取适当量的样品，加入冷水进行溶解，使得每毫升浓度相当于1.0至5.0单位的消化脂肪的能力。得到的混合物作为样品溶液。如果需要，进行超滤或离心。精确称取5ml底物溶液和4ml pH调节为7.0的0.1ml/l的磷酸缓冲液，将其充分混合，混合物在37℃±0.5℃放置10分钟，接着补充1ml样品溶液。之后立刻搅拌混合物，在37℃±0.5℃放置正好20分钟。
其次，加入10ml丙酮/乙醇(1∶1)的混合溶液，振荡混合全部溶液。用0.05ml/l盐酸对溶液进行滴定(指示剂：几滴酚酞试液)。在这种情况下，溶液中红色消失时的点被指定为滴定的终点，滴定度记为Aml。分别精确称取5ml底物溶液和4ml pH调节为7.0的0.1ml/l的磷酸缓冲液，将其充分混合，接着在37℃±0.5℃放置30分钟。
其次，精确加入10ml丙酮/乙醇(1∶1)的混合溶液，搅拌混合全部溶液。进一步，准确加入1ml样品溶液，振荡混合溶液。接着将得到的溶液以和上述相同的方法进行操作，滴定度记为Bml。根据下面的公式，确定1g中消化脂肪能力的单位(U)。这里，公式中的w指的是1ml样品溶液中的样品量(g)。
U＝50×(B-A)×1/20×1/w
[评价颗粒状组合物中酶的稳定性]
采用下面描述的方法评价上面制备的颗粒状组合物中酶的稳定性。
生产动物(家畜和鱼)饲料中采用的在成丸阶段中进行的湿热处理步骤如下所述在实验室中重现，以用于评价酶组合物中酶的稳定性。也就是，将每个大约0.5g的样品放在玻璃容器中，补加混合1g预先含有水的米糠油饼。接着将得到的混合物放在100℃干加热器的架子上(暖气循环型)，湿热处理8分钟，接着根据上述每种酶能力测定方法对于每个酶组合物的酶稳定性确定酶活性的存活率。
此外，作为对照，将纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的每种酶松散粉末与米糠油饼混合，接着如上所述进行湿热处理，由此得到粉状组合物，用相同的方法确定酶活性的存活率。结果在表1中显示。
表1
  酶名称   酶活性的存活率(％)
  实施例编号 颗粒状组合物   粉状组合物
  纤维素酶   实施例1    84.5   10.3
  淀粉酶   实施例5    63.4   0.0
  蛋白酶   实施例6    43.8   0.0
  脂肪酶   实施例7    51.0   0.6
结果显示根据本发明的纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的颗粒状组合物，在湿热处理后，酶活性的存活率很高。
试验实施例2
在该实施例中，比较商业可获得的酶标准产品和根据本发明的颗粒状组合物之间的酶稳定性。也就是，使用试验实施例1中描述的分析方法，对商业可获得的纤维素酶(RONOZYME VP，Roche生产，Lot No.KT902015)和根据本发明的颗粒状组合物进行酶稳定性的比较。结果在表2中显示。
表2
  样品名称   纤维素酶残留率(％)
  实施例3  颗粒状组合物C   76
  商业可得的纤维素酶  RONOZYME   7
表2的结果显示本发明的颗粒状组合物比作为对照进行比较的商业可得的酶标准产品具有显著更高的稳定性。
试验实施例3
在该实施例中，通过混合本发明的颗粒状组合物制备丸形饲料，接着研究丸形饲料中颗粒状组合物的湿热稳定性。
采用丸形饲料制造机(1100系列，California Pellet Mill Co.，Ltd制造)，在74至86℃的蒸汽温度下，将实施例3中制备的重量比为1.4％或2.8％的颗粒状组合物C加入到100kg Piggy Standard Feed(NipponFormula Feed Manufacturing Co.，Ltd生产)中，从而制备丸形饲料。
当确定丸形饲料达到78至80℃的温度后，回收饲料。收集饲料后，考虑到湿热的滞后性，用来自现场空气调节器的冷空气立刻将饲料进行冷却，从而提供分析样品。
除了使用商业纤维素酶(RONOZYME VP，Roche Co.Ltd.生产，LotNo.KT902015)，将用上述相同的方法生产的丸形饲料作为对照。接着，使用试验实施例1中描述的方法，基于纤维素酶活性残留率，对湿热稳定性进行比较。结果在表3中显示。
表3
  样品名称   纤维素酶活性残留率(％)
  含有重量百分比为1.4％的颗粒状组合物C的丸形饲料   12
  含有重量百分比为2.8％的颗粒状组合物C的丸形饲料   23
  含有重量百分比为1.4％的商业纤维素酶的丸形饲料   2
  含有重量百分比为2.8％的商业纤维素酶的丸形饲料   11
表3的结果显示在生产丸形饲料中本发明的颗粒状组合物比商业产品更稳定。
试验实施例4
在本实施例中，对使用抗生素制备的颗粒状组合物的稳定性进行评价。[滴定度测量方法(高效液相色谱法)
1.样品制备方法
在每个体积为200ml的螺帽锥形瓶中，精确收集大约1g样品。向每个瓶中准确加入2ml内部标准溶液，接着加入98ml 10g/dl的磷酸盐缓冲液(pH6.0)，接着进行密封。随后，振荡瓶子30分钟，接着使其静置获得上清液。使用0.45um膜过滤器(孔径大小为25mm，Maillex-HV，MILLIPORE Co.，Ltd生产)过滤上清液，从而提供滤液作为样品溶液。
精确称量大约20mg(滴定度)的粘菌素硫酸盐通用标准产品，溶解在大约50ml 10g/dl的磷酸盐缓冲液中(pH6.0)。接着，准确加入2ml内部标准溶液。之后，加入10g/dl的磷酸盐缓冲液(pH6.0)使总量达到100ml。将得到的生成物用0.45um膜过滤器过滤，滤液作为标准溶液。
2.分析方法
在下面描述的条件下、用液相色谱法对每10ul的样品溶液和标准溶液进行检测。确定每种溶液中粘菌素硫酸盐的总峰面积A和B与内标溶液的峰面积之比QT和QS，从而根据下式计算样品溶液[ug(滴定度)/ml]中粘菌素硫酸盐的量。
样品溶液中粘菌素硫酸盐的量[ug(滴定度)/ml]＝标准溶液中粘菌素硫酸盐的量[ug(滴定度)/ml]×QT/QS
(步骤条件)
使用的仪器：通用液相色谱和自动积分仪。
检测器：紫外吸收光度计(检测波长：215nm)。
柱：使用柱(Inertsil ODS-3，GL Sciences生产)，其中将用于液相色谱的5um的18烷基甲硅烷基化的硅胶填入内径为4.6mm、长度大约为250mm的不锈钢柱。
柱温：恒温，大约25℃。
流动相：用于HPLC的0.05ml/L硫酸钠溶液和乙腈以76∶24的比例进行混合，用1mol/L的硫酸将pH调节到2.3。
流速：将粘菌素硫酸盐B的保留时间设定为7到8分钟。
以基本上和上述试验实施例1相同的方法评价颗粒状组合物的稳定性，除了下列不同：使用1g本发明颗粒状组合物H(实施例8)和对照实施例1中的粉状组合物a作为样品，并且将样品放在100℃干加热器(暖气循环型)的架子上60分钟，进行湿热处理。结果在表4中显示。
表4
  样品名称   粘菌素滴定度的存活率(％)
  颗粒状组合物H(实施例8)   81.5
  粉状组合物a(对照实施例1)   65.5
结果显示根据本发明的颗粒状组合物在进行湿热处理后，比作为对照的粉状组合物具有更高的粘菌素滴定度存活率。
工业实用性
本发明的颗粒状组合物具有生物活性成分，例如酶和抗生素，作为活性成分，在高温高湿下该组合物具有极好的稳定性。因此颗粒状组合物在例如医药、食品、清洁剂领域非常实用，进一步希望在饲料领域中用于生产丸形饲料等。
此外，根据本发明的生产方法，能以简便的步骤有效地生产上述颗粒状组合物。

Claims (22)

1.一种颗粒状组合物，包含核心物质以及覆盖该核心物质的层，其中核心物质由糖类构成，覆盖核心物质的层由硬化油和生物活性成分构成。
2，根据权利要求1的颗粒状组合物，其中所述糖类包括粒状糖或乳糖。
3.根据权利要求1的颗粒状组合物，其中所述硬化油包括硬化棕榈油。
4.根据权利要求1的颗粒状组合物，其中所述生物活性成分包括酶。
5.根据权利要求4的颗粒状组合物，其中所述酶包括选自纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的一种酶或由两种或更多种酶构成的组合。
6.根据权利要求5的颗粒状组合物，其中所述纤维素酶来源于绿色木霉。
7.根据权利要求5的颗粒状组合物，其中所述淀粉酶来源于米曲霉。
8.根据权利要求5的颗粒状组合物，其中所述蛋白酶来源于黑曲霉。
9.根据权利要求5的颗粒状组合物，其中所述脂肪酶来源于Candida cylindracea。
10.根据权利要求1的颗粒状组合物，其中所述生物活性成分包括抗生素。
11.根据权利要求10的颗粒状组合物，其中所述抗生素包括粘菌素。
12.根据权利要求1和4至11中任何一项权利要求的颗粒状组合物，其中所述生物活性成分的含量为0.1-15％wt。
13.一种生产根据权利要求1的颗粒状组合物的方法，包括使含有熔融硬化油和生物活性成分的混合物粘附到粒状糖上或在其上面形成膜。
14.根据权利要求13的生产颗粒状组合物的方法，其中所述糖类包括粒状糖或乳糖。
15.根据权利要求13的生产颗粒状组合物的方法，其中所述硬化油包括硬化棕榈油。
16.根据权利要求13的生产颗粒状组合物的方法，其中所述生物活性成分包括酶。
17.根据权利要求16的生产颗粒状组合物的方法，其中所述酶包括选自纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的一种酶或由两种或更多种酶构成的组合。
18.根据权利要求13的生产颗粒状组合物的方法，其中所述生物活性成分包括抗生素。
19.根据权利要求18的生产颗粒状组合物的方法，其中所述抗生素包括粘菌素。
20.根据权利要求13和16至19中任何一项权利要求的生产颗粒状组合物的方法，其中所述生物活性成分的含量为0.1-15％wt。
21.一种通过混合权利要求1至12中任何一项权利要求的颗粒状组合物得到的丸形饲料。
22.一种生产丸形饲料的方法，包括使用根据权利要求1至12中任何一项权利要求的颗粒状组合物。
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