CN1709503A - 人溶菌酶凝胶剂、制法及应用 - Google Patents

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CN1709503A CN 200510046498 CN200510046498A CN1709503A CN 1709503 A CN1709503 A CN 1709503A CN 200510046498 CN200510046498 CN 200510046498 CN 200510046498 A CN200510046498 A CN 200510046498A CN 1709503 A CN1709503 A CN 1709503A
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Abstract

本发明涉及生物医药领域，人溶菌酶凝胶剂，含有人溶菌酶300U～300万U/mL，另外还提供其制法及应用，本发明基因重组人溶菌酶发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。安全无毒副作用，有很好的药用前景。并且基因重组人溶菌酶来源丰富，制备工艺简单，使用方便。本发明人溶菌酶凝胶剂发掘了人溶菌酶药物的新的剂型，人溶菌酶安全无毒副作用，有很好的药用前景。来源丰富，制备工艺简单，制成凝胶剂使用方便，可直接涂抹于创面并形成一层膜，药物剂量精确，药物在创面保留时间长，作用时间长，效果更佳。

Description

人溶菌酶凝胶剂、制法及应用
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，特别是人溶菌酶药物及其制法、应用。
背景技术：
抗生素创造了许多医学奇迹，使许多疾病消失无踪，如肺炎、脑膜炎、产褥热、败血症、结核等。21世纪的今天，耐药菌的发展令人触目惊心。如耐青霉素的肺炎链球菌，过去对青霉素、红霉素、磺胺等药品都很敏感，现在几乎“刀枪不入”。肺炎克雷伯氏菌对西力欣、复达欣等16种高档抗生素的耐药性高达51.85％-100％。而耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)除万古霉素外已经无药可治。从细菌的耐药发展史可以看出，在某种新的抗生素出现以后，就有一批耐药菌株出现。开发一种新的抗生素一般需要10年左右的时间，而一代耐药菌的产生只要2年的时间，抗生素的研制速度远远赶不上耐药菌的发展速度。目前急需开发一种针对不同耐药菌株均有效的“超级抗生素”用于临床治疗。
发明内容：
本发明的目的是克服上述不足问题，提供一种人溶菌酶凝胶剂，剂型合理，使用方便、作用时间长、疗效更高，另外还提供其制法，制法简单易操作，提供其最适合的应用，以更佳的提高其作用效果。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：人溶菌酶凝胶剂，含有人溶菌酶300U～300万U/mL。
所述凝胶剂中还可以加入杀螨止痒剂SM-650。
所述人溶菌酶为基因工程表达的重组人溶菌酶或基因工程表达人溶菌酶的氨基端带有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的人溶菌酶或基因工程表达或化学合成突变体重组人溶菌酶。
所述人溶菌酶凝胶剂的配方可以是下述两种：
(1)纯度95％的基因重组人溶菌酶300U～300万U/mL/g，聚乙二醇400在60～600，硬脂醇10～30，甘油5～50，吡咯烷铜酸钠5～50，尼泊金甲酯0.15～1.5，蒸馏水18.5～268.5。
(2)纯度95％的基因重组人溶菌酶300U～300万U/mL/g，羧甲基纤维素钠1～10，甘油2～20，吡咯烷铜酸钠5～50，尼泊金甲酯0.15～1.5，蒸馏水91.85～918.5
本发明所述凝胶剂的制法：将纯度95％的基因重组人溶菌酶制得300U～300万U/mL/g，将各原料在常温下混合均质，在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成，制成凝胶剂。
本发明人溶菌酶凝胶剂在治疗由金黄色葡萄球菌、化脓性葡萄球菌、铜绿假单胞菌、表葡菌、丙酸杆菌和耐药菌引起的痤疮、烫伤、烧伤、皮肤疾病中的应用。
在治疗由金黄色葡萄球菌、化脓性葡萄球菌、铜绿假单胞菌、表葡菌、丙酸杆菌和耐药菌引起的皮肤溃疡疾病以及病毒引起的皮肤病中的应用。
本发明人溶菌酶凝胶剂发掘了人溶菌酶药物的新的剂型，人溶菌酶安全无毒副作用，有很好的药用前景。来源丰富，制备工艺简单，并可做成凝胶剂使用方便，而且针对某些疾病有其特殊的效果，水凝胶含20％-40的固体物，水性凝胶基质大多在水中溶胀成水性凝胶而不溶解。凝胶在释药系统周围形成一层稠厚的凝胶屏障，药物可以通过扩散作用通过凝胶屏障而释放，释放速度因凝胶屏障的作用而被延缓。本类基质一般易涂展和洗除，由于粘滞度较小而利于药物释放，特别是水溶性药物的释放，具有释药快、对皮肤无刺激性、无油腻感、能吸收组织渗出液不防碍皮肤正常功能。其他剂型与凝胶剂相比有不足，如喷雾剂、滴剂使用不如凝胶剂方便，药物剂量不如其精确，药物在创面保留时间短；膏剂由于粘滞度较大，容易黏附其它物质，或者被其它物质黏附掉，药物剂量不如其精确，药物在创面保留时间短。而本发明凝胶剂使用方便，可直接涂抹于创面并形成一层膜，药物剂量精确，药物在创面保留时间长，作用时间长，效果更佳。
为了更好地理解本发明的实质，下面将用基因重组人溶菌酶的药理试验及结果来说明其在制药领域中的新用途。
基因重组人溶菌酶以配制200毫升培养基为基准，用H3PO44-8毫升、MgSO41-5克，K2SO42-6克，KOH1-3克，CaSO42H2O1-3.5克，加蒸馏水至200毫升，高压灭菌后接种甘油管种子，摇床转数为每分钟250转，培养温度为20-35℃，在恒温床上培养36-48小时。进行种子罐培养后进行生产罐培养。将发酵表达完成的培养液进行提取纯化，对提取纯化的蛋白浓缩液冰冻干燥，测定蛋白量、纯度和溶菌酶活性保存。将制备好的纯度95％～99％活性30000U/mL/g基因重组人溶菌酶备用。
一、基因重组人溶菌酶(HLZ)体内外抗菌作用评价
1体外抗菌作用
药品及试剂
1、人溶菌酶(Human Lysozyme HLZ)：活性单位：30000单位/mL，由大连奇龙生物技术研究所提供。
2、对照溶菌酶(contral Lysozyme，CLZ)：白色粉未，活性单位：50000单位/mg，美国SIGMA公司产品，批号：L6876。
3、克拉霉素：效价948μ/mg，中国药品生物制品检定所标准品，批号：
4、罗红霉素：效价878μ/mg，中国药品生物制品检定所标准品，批号：
5、注射用阿莫西林：哈尔滨制药厂产品，批号：010504。
6、琼脂糖(B10WEST AGAROSE)：
7、三羟甲基氨基甲烷(Tris)：成都化学试验厂，批号010211
试验菌株：所用菌株均为2001.4-2002.4月于四川、北京地区收集的临床分离致病菌。经本室用API方法重新鉴定后用于试验。
质控菌株：金黄色葡萄球菌ATCC25923
          大肠埃希菌ATCC25922
          铜绿假单孢菌ATCC27853
培养基：1、Tris-HCl缓冲液：0.1M Tris 100ml，0.1M HCl70ml，High Water 800ml，测PH值，用HCl溶液调至PH7.2，加High Water至1000ml。
2、Tris-HCl脂琼养基：在Tris-Cl缓冲液中加入脂琼糖116℃天菌后使用。
3、M-H培养基：中国药品生物制品检定所产品，M-H肉汤培养基：称取25g加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，高压灭菌，116℃ 20分钟。M-H固体培养基：称取36g，加1000ml蒸馏水，高压灭菌，116℃ 20分钟，用于革兰阳性、阴性需氧菌的药敏试验。
4、血培养基，即在M-H培养基中加5-10％脱纤维兔血配制而成，用于肠球菌、链球菌的药敏试验。
试验方法：体外抗菌活性(MIC)测定：采用琼脂二倍稀释法测定受试药物对试验菌株的最低抑菌浓度(MIC)。将受试药物用灭菌蒸馏水溶解，适当稀释。分别取1ml药液加9ml融化的Tris-HCl琼脂糖固体培养基混匀，以二倍稀释，制备系列含药平皿。每皿所含药物终浓度分别为4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03……0.001mg/ml；用多点接种仪将稀释至105CFU/ml的试验菌液接种于各含药平皿表面，置于37℃培养8-10小时，取出分别吸取6ml融化的M-H培养基(50℃)覆盖上述系列平皿表面，再置于37℃培养10小时取出，观察结果，以无细菌生长平皿内所含最低药物浓度为该菌的最低抑菌浓度(MIC)。
2、体内抗菌作用评价
药品：人溶性酶来源同前。
      克拉霉素来源同前。
      罗红霉素来源同前。
      阿莫西林来源同前。
细菌：金黄色葡球菌01193，金黄色葡球菌MRSA021923均为临床分离致病菌。
动物：昆明种小鼠，体重18-22克，由本所动物室提供。
试验方法：
1、体内保护试验：挑取一定量的菌苔接种于2ml M-H液体培养基中，37℃培养6小时后，取出用灭菌干酵母液进行适当稀释(10-1，10-2，10-3，10-4)，再取昆明种小鼠，随机分组，每组5只鼠，分别腹腔感染不同菌量的受试菌液，测定引起小鼠100％死亡的最小致死菌量(MLD)。再按1∶0.5剂间距设置5个剂量组，每组10只鼠，每只小鼠腹腔感染1MLD菌量的菌液0.5ml，感染后即刻静脉注射受试药0.5ml，设感染对照组(不给药)，观察1周，记录小鼠死亡数。按Bliss法计算半数有效剂量ED50及95％可信限。
2、小鼠皮肤烧伤感染模型的疗效评价：昆明种小鼠26-30g，随机分组，每组5只鼠，分别皮肤烧伤感染模型喷涂金黄色葡萄球菌菌液100ml，菌量为108CFU/ml，连续喷5次(间隔10分钟喷一次)，末次喷菌后6小时，分别用无菌棉签挑取皮肤烧伤感染模型涂于无药琼脂平板表面，37℃培养18小时，皮肤烧伤感染模型感染细菌数在＞103CFU/ml，且经革兰氏染色、光镜检测为金黄色葡萄球菌的小鼠为感染模型成功。选取皮肤烧伤感染模型感染成功小鼠随机分组，每组10只鼠，分别用喷雾器喷涂受试药物100μl/次，4次/日，连续5日，每日采用咽试子涂片法，于琼脂平板表面进行活菌计数，作统计学处理，与感染对照组和克拉霉素组、罗红霉素给药组作比较。
                   表1人溶菌酶、鸡溶菌酶、克拉霉素和罗红霉素体内外抗菌活性
  细菌                                 MIC
  HLZmg/ml(万μ/ml)   CLZmg/ml(万μ/ml) CLAmg/ml ROXmg/ml
  金葡MRSA 02-22金葡MRSA 02-23金葡MRSA 02-26金葡MRSA 02-28金葡02-19-5表葡MssE25表葡MRSE 02-29表葡MRSE 02-5表葡MRSE 02-6表葡MRSE 02-20-2表葡MRSE 02-20-3表葡MRSE 02-20-4表葡MRSE 02-20-5表葡MRSE 02-20-6表葡MRSE 02-20-7表葡MRSE 02-20-8表葡MRSE 02-20-9表葡MRSE 02-20-1表葡MRSE 02-3表葡MRSE 02-4   0.025(0.03)0.025(0.03)0.025(0.03)0.5(1.5)0.03(0.1)0.016(0.05)0.063(0.2)＜0.001(0.003)＜0.001(0.005)＜0.001(0.003)＜0.001(0.003)＜0.001(0.003)0.004(0.012)0.004(0.012)＜0.001(0.003)＜0.001(0.003)＜0.001(0.003)＜0.001(0.003)1(3)0.004(0.012)   0.008(0.04)0.008(0.04)0.004(0.02)0.016(0.08)＜0.002(0.001)0.004(0.02)0.5(2.5)＜0.001(0.003)＜0.001(0.005)＜0.001(0.005)0.004(0.02)＜0.001(0.005)＜0.001(0.005)＜0.001(0.005)＜0.001(0.005)＜0.001(0.005)＜0.001(0.005)＜0.001(0.005)0.015(0.08)0.008(0.04)   ＞1＞1＞1＞1＞1＜0.0010.03＜0.001＜0.001＞1＞1＞1＞1＞11＜0.001＜0.001＜0.001＞10.5   ＞1＞1＞1＞1＞1＜0.0010.5＜0.001＜0.00111＞1＞1＞11＜0.001＜0.001＜0.001＞1＞1
续表2
细菌                               MIC
  HLZmg/ml(万μ/ml)   CLZmg/ml(万μ/ml)   CLAmg/ml   ROXmg/ml
  表葡MRSE 02-10表葡MRSE 02-12表葡MRSE 02-11表葡MRSE 02-15表葡MRSE 02-17表葡MRSE 02-18表葡MRSE 02-20表葡MRSE 02-21表葡MRSE 02-22丙酸杆菌02-7-4丙酸杆菌02-7-5丙酸杆菌02-7-6丙酸杆菌02-7-9丙酸杆菌02-7-7丙酸杆菌03-2-22丙酸杆菌03-2-30丙酸杆菌03-2-32丙酸杆菌03-2-33丙酸杆菌03-2-36丙酸杆菌03-2-37丙酸杆菌03-2-39   0.004(0.012)＜0.001(0.003)＜0.001(0.003)0.008(0.024)0.004(0.012)＜0.001(0.003)0.008(0.024)0.016(0.05)0.004(0.012)0.008(0.02)0.008(0.02)0.008(0.02)0.063(0.2)0.125(0.4)0.032(0.1)0.063(0.2)0.016(0.05)0.032(0.1)0.063(0.2)0.032(0.1)0.032(0.1)   0.25(1.25)＜0.001(0.005)＜0.001(0.005)0.002(0.01)＜0.001(0.005)＜0.001(0.005)＜0.001(0.005)0.25(1.25)＜0.001(0.005)4(20)0.25(0.63)0.063(0.31)0.125(0.63)0.016(0.08)0.5(2.5)4(10)0.25(1.25)2(10)4(20)＞4(20)0.5(2.5)   10.008＜0.00110.25＜0.001＞1＜0.001＜0.0010.002＜0.0010.0080.0080.0321＞10.008＞10.25＞10.5   10.125＜0.001＞1＞1＜0.001＞1＜0.001＜0.0010.002＜0.0010.250.0160.251＞10.5＞10.511
续表3
  细菌                                  MIC
  HLZmg/ml(万μ/ml)   CLZmg/ml(万μ/ml)   CLAmg/ml   ROXmg/ml
  大肠埃希菌03-2-41大肠埃希菌03-2-42大肠埃希菌03-2-43大肠埃希菌03-2-45大肠埃希菌03-2-51大肠埃希菌03-2-52大肠埃希菌03-2-53大肠埃希菌032-54大肠埃希菌03-2-56大肠埃希菌03-2-57大肠埃希菌03-2-58大肠埃希菌03-2-59沙雷氏菌2-31-8沙雷氏菌2-31-8沙雷氏菌2-31-8肺炎克雷伯菌02-6-14肺炎克雷伯菌02-6-18   0.032(0.1)0.016(0.05)＜0.001(0.003)0.032(0.1)0.032(0.1)0.032(0.1)0.008(0.024)0.032(0.1)0.032(0.1)＜0.001(0.003)＜0.001(0.003)0.032(0.1)0.008(0.02)0.008(0.02)0.008(0.02)0.25(0.8)0.5(1.5)   0.5(2.5)0.5(2.5)＞4(20)2(10)＞4(20)＞4(20)4(20)1(5)＞4(20)2(10)4(20)4(20)0.5(0.25)1(5)0.125(0.63)1(5)＞4(20)   ＞10.0630.0160.25＞1＞10.03＞10.0160.032＞10.1250.0080.0080.0160.0630.5   ＞1＞10.250.5＞10.250.2510.250.250.50.250.0160.0160.016＞11
试验结果(1)人溶菌酶对临床分离菌株的体外抗菌活性见表1。(2)克拉霉素、罗红霉素、阿莫西林与人溶菌酶以1∶1联合用药的体外抗菌作用结果见续表2。(3)人溶菌酶对379株临床分离致病菌的MIC50、MIC90见续表3。
以上试验结果表明：人溶菌酶体外具有一定抗菌作用，体内对伤口感染溃烂的疗效较确切。
二、动物模型试验：
A、人溶菌酶对大鼠的镇痛作用(大鼠甩尾法)
选用120-150克SD健康大鼠50只，雌雄各半，动物自由饮水。试验室温度控制在22-28℃左右，动物喂饲大鼠标准饲料。在TF-光热测痛仪(光源为12V，50W)热照射下10秒钟内反应的大鼠，随机分为5组，每组10只，雌雄各半。设空白对照组、人溶菌酶三个剂量组(120、60、30IU/只)、鸡溶菌酶(阳性对照)30IU/，均尾部涂药。涂药前和涂药后0.5-4小时测每只大鼠的疼痛反应(甩尾)时间，若痛阈升高到照射30秒钟不甩尾时即中断照射，以免损伤皮肤与起泡，并以30秒计算。试验重复一次。
试验结果见表17-21，结果表明，涂抹人溶菌酶30、60、120IU/只三小时内，其痛阈明显升高，具有镇痛作用。
表17-21(A)人溶菌酶外涂对大鼠的镇痛作用(甩尾法)
                           (第一次试验结果)
组别 剂量(IU/只) 动物数(只)   疼痛反应时间(秒，X±SD)
  0   0.5   1   2   3   4(h)
  空白对照鸡溶菌酶人溶菌酶人溶菌酶人溶菌酶  -301206030   1010101010   5.2±1.695.5±1.725.3±1.775.3±1.895.2±1.93   5.7±2.1611.4**±4.513.6**±6.989.8*±4.058.6*+2.67   6.4±2.4614.0**±6.9315.2**±7.4212.9**±6.6912.4*±7.49   6.4±3.3414.7**±7.6713.4**±6.3812.7*±6.910.9±7.09   6.8±3.9115.2**±7.4515.4**±6.6213.5*±6.7211.7±6.89   10.3±5.3312.7**±6.9914.9±6.5412.4±6.6510.1±7.5
注：经统计学处理，与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
表17-21(B)人溶菌酶外涂对大鼠的镇痛作用(甩尾法)
  组别  剂量(IU/只)   动物数(只)   疼痛反应时间(秒，X±SD)
0 0.5 1 2 3 4(h)
  空白对照鸡溶菌酶人溶菌酶人溶菌酶人溶菌酶  -301206030   1010101010   5.5±1.585.7±1.645.8±1.235.6±1.895.7±1.34   5.9±1.6612.3**±4.614.2**±6.5412.6**±4.0510.0*±4.47   6.5±1.7815.0**±7.9915.7**±6.7814.3**±6.6912.0*±7.85   6.6±4.9513.8*±7.9914.5**±7.1114.0*±6.910.7±4.27   5.9±6.3513.6*±7.614.3*±7.4413.8*±6.7210.1±3.84   9.8±6.7311.7±6.913.5±7.6912.5±6.6511.2±4.5
注：经统计学处理，与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
B、人溶菌酶对巴豆油诱发小鼠耳廓肿胀的影响
选用体重27-30克的健康雄性昆明小鼠50只，随机分成5组，每组10只。动物自由饮水。试验室温度控制在22-28℃左右。动物喂饲大鼠标准饲料。第一组为空白对照组；第二、三、四组为人溶菌酶，剂量分别为120、60、30IU/只；第五组为鸡溶菌酶(阳性对照)，30IU/只。首先，各组小鼠全部右耳内侧涂1％巴豆油30μL致炎，(巴豆油，浅棕色油状液体，药用级，批号000309，由江西吉水县华宝天然药用厂生产。临用前用乙醇∶水∶乙醚25∶5∶70混合溶媒配制成1％浓度备用。)半小时后分别用双蒸水20μl、人溶菌酶(6000IU/ML)20μl、入溶菌酶(3000IU/ML)20μl、人溶菌酶(1500IU/ML)20μl、鸡溶菌酶(1500IU/ML)20μl涂抹各组小鼠右耳内侧。致炎后4小时将小鼠脱颈椎致死，沿耳廓基线剪下左右两耳片，用8mm打孔器冲下两耳片，精确称重，左右耳片重量之差为肿胀度。经T检验，比较药物组与空白对照组的差异，并求出抑制率。试验重复一次。试验结果见表17-22。小鼠经外涂人溶菌酶120、60、30IU/只，使小鼠由巴豆油诱发耳廓肿胀度明显减轻，经T检验，药物组与空白对照组比较，有显著性差异(P＜0.05)。结果表明人溶菌酶具有抗炎作用。
表17-22人溶菌酶对巴豆油诱发小鼠耳廓肿胀的影响
组别 剂量(IU/只)          第1次试验           第2次试验
  肿胀度(mg，X±SD)   抑制率(％)   肿胀度(mg，X±SD)   抑制率(％)
  空白对照人溶菌酶人溶菌酶人溶菌酶鸡溶菌酶  -120603030   20.3±3.4012.5±5.56**13.5±4.67**14.2±3.77**14.6±2.12** 38.4233.5030.0528.08   20.1±4.0113.6±3.78**15.1±2.42**15.4±4.22*15.1±2.51** 32.3424.8823.3824.88
注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
C重组人溶菌酶对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的影响
(1)受试药物
重组人溶菌酶：白色粉末，批号020110，3万单位/毫克，由大连奇龙生物技术研究所提供。临用时用无菌双蒸水配成所需浓度。
(2)对照品
鸡溶菌酶：白色粉末，2万单位/毫克，Lysozyine Sigma L6878.临用时用无菌双蒸水配制。
(3)试剂
角叉菜胶，浅黄白色粉末，批号21H0340，Sigam Chemical CO生产。临用时用无菌生理盐水配成1％的浓度。
实验方法：选用体重130-150克的健康雄性SD大鼠50只，由四川抗菌素工业研究所动物中心提供。合格证：川实动管第99-32号。每笼5只。动物自由饮水，试验室温度控制在22~28℃左右，动物喂饲大鼠标准饲料。随机分成5组，每组10只。测量各鼠正常左后足跖容积。第1组为空白对照组，外涂等容积无菌双蒸水；第2、3、4组为人溶菌酶，剂量分别为120、60、30IU/只；第5组为鸡溶菌酶，剂量为30IU/只。每鼠外涂各组药物(20μl/只)一次后1小时，给大鼠左后足跖皮下注射1％的角叉菜胶0.1ml。致炎后半小时再涂一次药。致炎前和致炎后1、2、4、6小时按微量吸管测量法测定致炎前后大鼠左后足容积。致炎前后足容积差为肿胀度。试验重复一次。
数据处理和统计分析：对计量资料，把原始数据按组分别输入Microsoft Excel中，各组结果以算术平均数±标准差表示。根据《新药西药临床前研究指导原则汇编》中的有关新药药效研究中统计处理的指导原则，选择Student t检验进行各用药组均数与模型对照组均数、相同剂量的受试药组与对照品组的差异显著性检验。
试验结果见表4，大鼠外涂人溶菌酶30、60、120IU/只，在致炎后1-4小时内，使由1％角叉菜胶诱发的左后足跖肿胀度明显减轻。说明人溶菌酶具有抗炎作用，重组人溶菌酶不但有杀菌作用，而且有很好的抗炎作用。
表4(1)人溶菌酶对大鼠由角叉菜胶所致足跖肿胀的影响
                             (第一次试验结果)
组别 剂量(IU/只) 左后足跖正常体积   致炎后不同时间足跖肿胀度(X±SD，ml)
  1hr   2hr   4hr   6hr
  空白对照人溶菌酶人溶菌酶人溶菌酶鸡溶菌酶   -120603030   0.86±0.060.84±0.070.87±0.090.87±0.080.86±0.08   0.35±0.060.24**±0.060.30*±0.040.29*±0.050.29*±0.06   0.49±0.050.35**±0.050.41**±0.050.41*±0.080.40**±0.05   0.42±0.080.34*±0.060.35*±0.060.34*±0.070.34*±0.07   0.29±0.130.22±0.070.24±0.080.26±0.080.25±0.10
注：经统计学处理，与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
表4(2)人溶菌酶对大鼠由角叉菜胶所致足跖肿胀的影响
                         (第二次试验结果)
组别 剂量(IU/只) 左后足跖正常体积   致炎后不同时间足跖肿胀度(X±SD，ml)
  1hr   2hr   4hr   6hr
  空白对照人溶菌酶人溶菌酶人溶菌酶鸡溶菌酶   -120603030   0.92±0.100.90±0.100.92±0.110.92±0.090.89±0.10   0.30±0.080.22*±0.060.23*±0.040.25±0.070.22*±0.05   0.40±0.100.31*±0.080.31*±0.060.32*±0.060.32*±0.07   0.35±0.050.30*±0.050.29*±0.050.29*±0.050.30*±0.04   0.29±0.150.25±0.070.24±0.070.25±0.070.26±0.12
注：经统计学处理，与空白对照组比较，*P＜0.05。
D重组人溶菌酶(HLZ)加杀螨止痒剂SM-650体外杀螨作用评价
1、基因重组人溶菌酶浓缩液活性单位：300单位/mL试验
药品及试剂
1、基因重组人溶菌酶浓缩液(Human Lysozyme HLZ)活性单位：300单位/mL，由大连奇龙生物技术研究所提供，
2、杀螨止痒剂SM-650：白色粉未，纯度为≥99％，ph：6～8，生产
单位：北京耐特生化技术研究所
试验螨虫
所用螨虫标本为第四军医大学临床门诊痤疮病人。
试验方法：
体外杀螨虫活性测定：采用图片法测定了人溶菌酶(HLZ)加杀螨止痒剂SM-650最低杀螨浓度(MIC)。将螨虫标本分离到玻片上，用人溶菌酶(HLZ)300单位/mL，杀螨止痒剂SM-650 1％/Ml。滴到玻片螨虫标本上，观察结果，以最低杀螨浓度(MIC)。
试验结果见表5，结果表明人溶菌酶加杀螨止痒剂SM-650体外杀螨有杀灭作用。
表5
  螨虫标本   对照组   杀螨止痒剂SM-650   人溶菌酶加杀螨止痒剂SM-650
  1号12个螨虫   0   51％   62％
  2号18个螨虫   0   48％   59％
  3号16个螨虫   0   49％   61％
  4号11个螨虫   0   50％   65％
  5号19个螨虫   0   53％   66％
2、基因重组人溶菌酶浓缩液活性单位：3000单位/mL试验药品及试剂
1、基因重组人溶菌酶浓缩液(Human Lysozyme HLZ)活性单位：3000单位/mL，由大连奇龙生物技术研究所提供，
2、杀螨止痒剂SM-650：白色粉未，纯度为≥99％，ph：6～8，生产单位：北京耐特生化技术研究所
试验螨虫
所用螨虫标本为第四军医大学临床门诊痤疮病人。
试验方法：
体外杀螨虫活性测定：采用图片法测定了人溶菌酶(HLZ)加杀螨止痒剂SM-650最低杀螨浓度(MIC)。将螨虫标本分离到玻片上，用人溶菌酶(HLZ)3000单位/mL，杀螨止痒剂SM-650 1％/Ml。滴到玻片螨虫标本上，观察结果，以半数杀螨浓度(MBC)。
试验结果见表6，结果表明人溶菌酶加杀螨止痒剂SM-650体外杀螨有杀灭作用。
表6
  螨虫标本   对照组   杀螨止痒剂SM-650   人溶菌酶加杀螨止痒剂SM-650
  1号12个螨虫   0   730％   85％
  2号18个螨虫   0   82％   91％
  3号16个螨虫   0   80％   94％
  4号11个螨虫   0   76％   88％
  5号19个螨虫   0   79％   90％
3、基因重组人溶菌酶浓缩液活性单位：30000单位/mL试验药品及试剂
1、基因重组人溶菌酶浓缩液(Human Lysozyme HLZ)活性单位：30000单位/mL，由大连奇龙生物技术研究所提供，
2、杀螨止痒剂SM-650：白色粉未，纯度为≥99％，ph：6～8，生产单位：北京耐特生化技术研究所
试验螨虫
所用螨虫标本为第四军医大学临床门诊痤疮病人。
试验方法：
体外杀螨虫活性测定：采用图片法测定了人溶菌酶(HLZ)加杀螨止痒剂SM-650最低杀螨浓度(MIC)。将螨虫标本分离到玻片上，用人溶菌酶(HLZ)30000单位/mL，杀螨止痒剂SM-650 1％/Ml。滴到玻片螨虫标本上，观察结果，以无活螨虫为杀螨浓度。
试验结果见表7，结果表明人溶菌酶加杀螨止痒剂SM-650体外杀螨有杀灭作用。
表7
  螨虫标本   对照组   杀螨止痒剂SM-650   人溶菌酶加杀螨止痒剂SM-650
  1号12个螨虫   0   100％   100％
  2号18个螨虫   0   100％   100％
  3号16个螨虫   0   100％   100％
  4号11个螨虫   0   100％   100％
  5号19个螨虫   0   100％   100％
采用图片法测定了人溶菌酶(HLZ)加杀螨止痒剂SM-650对临床分离五人份的螨虫标本体外杀螨作用，结果表明：人溶菌酶加杀螨止痒剂SM-650对螨虫有杀灭作用。杀螨止痒剂SM-650最低杀螨浓度MICRange为0.2％-2％。
E重组人溶菌酶抑制豚鼠牛血清白蛋白过敏反应试验模型
选用体重250克左右的健康豚鼠20只，雄性，随机均分四组，每组5只，进行静脉注射牛血清白蛋白造模。将造模后的20只小鼠重新合并后再随机分成四组，分别设立三个给药组和一模型组。重组人溶菌酶临床气雾剂治疗时药液的浓度为15000u/ml，初步拟定剂量为15000u/次，每日3～5次，即0.5mg/次/日。(按体表面积推算至豚鼠剂量为1.3×10-3mg/只(250g体重计)，由于人通气量9000ml/分相当于豚鼠通气量31ml/分的290倍，人用单次剂量0.5mg/70kg相当于小鼠剂量1.3×10-3mg/250g的280倍，以上二者较为接近)。所以设定用临床人用浓度0.5mg/ml对小鼠进行雾化治疗，另考虑到临床人用气雾吸入重组人溶菌酶气体利用率较高，而小鼠在雾化缸内只能靠自身呼吸吸入含药气体，故只有延长吸入时间才能确保吸入药量，设定为一小时。在15000u/ml为低剂量浓度基础上再配制30000u/ml、60000u/ml二浓度作为中、高剂量组治疗时的药液浓度。在第二十一天给每只豚鼠静脉注射牛血清白蛋白前一个小时，将豚鼠置于玻璃干燥器后，用PAR1.BOY压缩喷雾器雾化不同浓度的重组人溶菌酶液对豚鼠进行雾化预防。然后给每只豚鼠静脉注射牛血清白蛋白1mg，肉眼观察豚鼠形态变化情况和死亡数量及时间。
实验结果豚鼠静脉注射牛血清白蛋白后10秒钟模型组出现咳嗽、气促和挠唇现象。30秒钟后模型组豚鼠全部死亡。给药重组人溶菌酶组30小时豚鼠仍然全部存活。给药重组人溶菌酶组和一模型组有明显区别。见表8、见表9。
表8
组别   动物数(只) 用药后10秒 用药后30秒 用药后60秒
  模型对照组模型高剂量组模型中剂量组模型低剂量组   5只5只5只5只   4只5只5只5只   0只5只5只5只   0只5只5只5只
表9
组别   动物数(只) 用药后10小时 用药后20小时 用药后30小时
  模型对照组模型高剂量组模型中剂量组模型低剂量组   0只5只5只5只   0只5只5只5只   0只5只5只5只   0只5只5只5只
综合以上实验结果表明，对豚鼠静脉注射牛血清白蛋白进行过敏反应试验重组人溶菌酶雾化保护，有很好的保护预防效果。其保护预防效果与使用剂量无明显量效关系。
F、重组人溶菌酶抗疱疹病毒抑制豚鼠角膜炎试验模型
选用体重250克左右健康豚鼠20只，雄性，将20只豚鼠随机均分四组，每组5只，进行滴眼液造模。首先用细针在豚鼠的眼角膜上轻微划出三道痕迹，然后用四川抗菌素工业研究所实验动物中心提供I型疱疹病毒100～1000TCID50感染豚鼠的眼角膜，每天三次。第三天豚鼠眼角膜出现轻微角膜炎，第四天豚鼠眼角膜出现红肿，角膜炎加重。将造模后的20只豚鼠重新合并后再随机分成四组，分别设立三个给药组和一模型组。
重组人溶菌酶滴眼液以15000u/ml(每滴1500U)为低剂量浓度基础上再配制30000u/ml(每滴3000U)、60000u/ml(每滴6000U)二浓度作为中、高剂量组治疗时的药液浓度。在第五天开始给豚鼠眼角膜用重组人溶菌酶滴眼液，每天三次，每次每只眼一滴，肉眼观察豚鼠形态变化情况及时间。
实验结果给药重组人溶菌酶滴眼液第二天，给药重组人溶菌酶滴眼液中、高剂量组治疗效果凸现，豚鼠角膜红肿减轻。给药重组人溶菌酶滴眼液第三天，给药重组人溶菌酶滴眼液低剂量组也出现好转治疗效果。给药重组人溶菌酶滴眼液第六天，给药模型低、中、高组豚鼠角膜炎和红肿全部消退好转。模型对照组豚鼠角膜红肿，角膜炎症加重并出现溃疡。给药重组人溶菌酶组和一模型组有明显区别。见表10、见表11。
表10
组别   动物数(只) 用药第一天 用药第二天 用药第三天
模型组对照模型高剂量组模型中剂量组模型低剂量组 5只5只5只5只   角膜红肿角膜炎角膜红肿角膜炎角膜红肿角膜炎角膜红肿角膜炎 角膜红肿角膜炎红肿减轻红肿减轻角膜红肿角膜炎 角膜红肿角膜炎红肿减轻红肿减轻红肿减轻
表11
组别   动物数(只) 用药第四天 用药第五天 用药第六天
模型组对照模型高剂量组模型中剂量组模型低剂量组 5只5只5只5只 角膜红肿角膜炎角膜炎症减轻角膜炎症减轻角膜炎症减轻   角膜红肿、角膜炎角膜溃疡角膜红肿角膜炎消退角膜红肿角膜炎消退角膜红肿角膜炎消退   角膜红肿、角膜炎角膜溃疡恢复正常恢复正常恢复正常
综合以上实验结果表明，试验重组人溶菌酶对抗I型疱疹病毒100～1000TCID50感染豚鼠，有很好的治疗效果。其治疗效果与使用剂量有明显量效关系。
用法与用量：
直接作用于病灶局部给药1500u～30000u/g外用，每日2～3次，每次按病灶部位大小给药。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明做进一步的描述，但不限于实施例。
实施例1：
基因重组人溶菌酶的制备：基因重组人溶菌酶经高压灭菌后接种甘油管种子，摇床转数为每分钟250转，培养温度为20℃，在恒温床上培养36小时。进行种子罐培养后进行生产罐培养。将发酵表达完成的培养液进行提取纯化，对提取纯化的蛋白浓缩液冰冻干燥，测定蛋白量、纯度和溶菌酶活性保存备用。
人溶菌酶凝胶剂的制备：将纯度95％的基因重组人溶菌酶制得3万U/mL/g，聚乙二醇400在100，硬脂醇12，甘油10，吡咯烷铜酸钠15，尼泊金甲酯0.16，蒸馏水26在常温下混合均质，在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成，制成凝胶剂。
实施例2：
根据实施例1相同的制法制备重组人溶菌酶，然后将纯度95％的基因重组人溶菌酶制得30万U/mL/g，羧甲基纤维素钠5，甘油15，吡咯烷铜酸钠22，尼泊金甲酯0.35～1.5，蒸馏水118在常温下混合均质，在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成，制成凝胶剂。
实施例3：
根据实施例1相同的制法制备重组人溶菌酶，然后将纯度95％的基因重组人溶菌酶制得100U万U/mL，聚乙二醇400在300，硬脂醇23，甘油30，吡咯烷铜酸钠33，尼泊金甲酯1.0，蒸馏水258，杀螨止痒剂SM-650纯度为≥99％ph：6～8(商品)1，在常温下混合均质，制成凝胶剂。
实施例4
根据实施例1相同的制法制备重组人溶菌酶，然后将纯度95％的基因重组人溶菌酶制得260万U/mL/g，羧甲基纤维素钠8，甘油8，吡咯烷铜酸钠30，尼泊金甲酯0.85，蒸馏水800在常温下混合均质，在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成，制成凝胶剂。

Claims (7)

1、人溶菌酶凝胶剂，其特征是：含有人溶菌酶300U～300万U/mL。
2、根据权利要求1所述的人溶菌酶凝胶剂，其特征是：含有杀螨止痒剂SM-650。
3、根据权利要求1所述人溶菌酶凝胶剂，其特征是：人溶菌酶为基因工程表达的重组人溶菌酶或基因工程表达人溶菌酶的氨基端带有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的人溶菌酶或基因工程表达或化学合成突变体重组人溶菌酶。
4、根据权利要求1所述的人溶菌酶凝胶剂，其特征是：由以下原料制成，纯度95％的基因重组人溶菌酶300U～300万U/mL/g，聚乙二醇400在60～600，硬脂醇10～30，甘油5～50，吡咯烷铜酸钠5～50，尼泊金甲酯0.15～1.5，蒸馏水18.5～268.5。
5、根据权利要求1所述的人溶菌酶凝胶剂，其特征是：由以下原料制成，纯度95％的基因重组人溶菌酶300U～300万U/mL/g，羧甲基纤维素钠1～10，甘油2～20，吡咯烷铜酸钠5～50，尼泊金甲酯0.15～1.5，蒸馏水91.85～918.5。
6、根据权利要求1-5任一所述的人溶菌酶凝胶剂在治疗由金黄色葡萄球菌、化脓性葡萄球菌、铜绿假单胞菌、表葡菌、丙酸杆菌和耐药菌引起的痤疮、烫伤、烧伤和皮肤病中的应用。
7、根据权利要求1-5任一所述的人溶菌酶凝胶剂在治疗由金黄色葡萄球菌、化脓性葡萄球菌、铜绿假单胞菌、表葡菌、丙酸杆菌和耐药菌引起的皮肤溃疡疾病及由病毒引起的皮肤病中的应用。
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