CN1683358A - 从黄芩茎叶提取总黄酮的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种从黄芩茎叶中提取总黄酮的方法，其特点是将茎叶粉碎后经杀酶处理，用水提取2－3次，上清液经酸化、分离、吸附、解吸、浓缩、干燥等步骤制得的产品。该产品理化特点为：棕黄色至棕褐色浸膏或粉末，气香，味微苦。其总黄酮含量为56－75％，野黄芩苷含量为6－18％。

Description

从黄芩茎叶提取总黄酮的方法
技术领域
本发明是提取总黄酮物质的方法，更具体地说，是一种从黄芩茎叶提取总黄酮的方法。
背景技术
黄芩为唇形科植物，传统药用部位为黄芩的根，地上茎叶部分被视为非药用部位而被弃去。在专利号为98126822.6、名称为“黄芩茎叶制备镇痛、抗炎或/和解热药物的应用”的专利中，公开黄芩茎叶总黄酮及野黄芩苷的作用。但是对总黄酮以及野黄芩苷的提取只是在该文件的实例中简述提取总黄酮的方法，而且该方法存在一定缺陷，如收率较低，能耗较高，不适合大批量生产。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺点，提出一种从黄芩茎叶提取总黄酮的新的方法。
本发明制取总黄酮的方法包括以下过程：
1、将黄芩茎、叶粉碎成10-60目的粗粉后，经水蒸汽蒸30-60分钟或粗粉浸入沸水中煎煮5-20分钟杀酶处理，加水提取2-3次，每次加入黄芩茎叶重量的5-15倍的水，在50-100℃下提取0.5-10小时，合并上述几次提取液，60-100℃减压或常压浓缩至20℃相对密度为1.02-1.22，离心分离，得上清液备用；
2、在步骤(1)的上清液中加入盐酸酸化至PH为1-4，离心分离，上清液采用大孔吸附树脂吸附后，纯化水洗至中性，用浓度为30-90％的乙醇或浓度为3-5％的氢氧化钠碱液解吸附，收集解液，回收乙醇，并浓缩，最后减压或常下干燥至干即得所需的产品，所述的大孔吸附树脂包括AB-8型、D101型或HP-20型大孔树脂。
步骤(1)所述的提取方法还可采用碱水提取法，即在第一次提取时加入石灰乳或氢氧化钠调至PH值为8-10，在此PH值下提取0.5-5小时，残渣加入水，在50-100℃下再提取1-2次，每次加水的量是残渣量的4-5倍，提取0.5-10小时，合并上述几次提取液，60-100℃下减压或常压浓缩至相对密度为1.02-1.22(20℃测)，备用；
所述的AB-8型树脂和D101型树脂为沧州宝恩化工有限公司生产，所述的HP-20型树脂为日本三菱化学公司生产。
制得的产品可按常规方法制成胶囊、冲剂、片剂、喷雾剂、滴丸口服液等剂型或它们的缓释形式。
本发明的优点和效果
本发明与现有技术(专利号为98123822.6)相比；
①提高收率：黄芩茎叶提取前经杀酶处理，使黄芩茎叶中的有效成份得以保存，从而最终提高了总黄酮及野黄芩苷的含量及收率。总黄酮含量由原来的50-55％提高至56-75％，野黄芩苷含量由原来的2-5％提高至6-18％；收率由原来的2％提高至5-9％。
②降低能耗：原有技术采用聚酰胺柱层析，聚酰胺成本较高，且只能用一次，不能重复利用：采用大孔树脂柱层析，大孔树脂成本较低，且能反复利用，从而降低了能耗。
③按本发明的方法从黄芩茎叶提取的总黄酮的临床试验结论为：治疗急性咽炎风热证是有效、安全的。详见实例5。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明的特点：
实例1
将黄芩茎叶粉碎成20目粗粉，经杀酶处理后，加水提取2次，每次加入生药量的10倍的水，100℃提取1小时。合并2次提取液，70±5℃减压浓缩于相对密度1.02-1.10(20℃测)，离心，得上清液，加盐酸酸化至PH2-3时，离心，上清液采用AB-8型大孔吸附树脂吸附后，用纯化水洗至中性，再采用70％乙醇解吸附，收集解析液，回收乙并浓缩，70+5℃减压干燥至干，即得。产品经检测：总黄酮含量为69％，野黄芩苷为15.5％，收率8.2％。
黄芩茎叶总黄酮的检测方法：采用紫外分光光度法(中国药典2000年版一部附录VI A)，在285nm的波长处测定吸收度，计算，即得。
野黄芩苷的检测方法按高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定。检测波长为335nm；理论板数按野黄芩苷峰计算，不低于1500。
测定法分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。
实例2
将黄芩叶粉碎成20目粗粉，经杀酶处理后，加水提取2次，每次加入生药量的10倍的水，100℃提取1小时。合并2次提取液，70±5℃减压浓缩于相对密度1.02-1.10(20℃测)，离心，得上清液，加盐酸酸化至pH2-3时，离心，上清液采用D101型大孔吸附树脂吸附后，采用5％碱液解吸附，收集解析液，70±5℃减压浓缩，70±5℃减压干燥至干，即得。产品经检测：总黄酮含量为58％，野黄芩苷为5.5％，收率9.8％。
实例3
将黄芩茎叶粉碎成20目粗粉，经杀酶处理后，加水提取2次，每次加入生药量的14倍的水，60℃下浸9小时。合并2次浸液，60℃减压浓缩于相对密度1.02-1.10(20℃测)，离心，得上清液，加盐酸酸化至PH2-3时，离心，上清液采用AB-8型大孔树脂吸附后，采用70％乙醇解吸附，收集解析液，回收乙醇并浓缩，60℃减压干燥至干，即得。产品经检测：总黄酮含量为57％，野黄芩苷为6.2％，收率5.8％。
实例4
本实例为对比实例，即不经酶化处理，采用聚酰胺树脂吸附。具体过程：
将黄芩茎叶粉碎成粗粉，加水提取2次，分别加入生药量的8倍、6倍的水，100℃提取1小时。合并2次提取液，70±5℃减压浓缩于相对密度1.02-1.10(20℃测)，加盐酸酸化至PH2时，离心，上清液采用聚酰胺树脂吸附后，用纯化水洗至中性，再采用70％乙醇解吸附，收集解析液，回收乙醇并浓缩，70±5℃减压干燥至干，即得。产品经检测：总黄酮含量为51％，野黄芩苷为3.3％，收率4.2％。
由于用聚酰胺树脂吸附药液后，聚酰胺不能被重复利用而被弃去，因此成本较高，而用大孔树脂吸附药液后，大孔树脂可经酸、碱处理后，被重复利用至少6次，因此，成本低。聚酰胺树脂与大孔树脂市售价格基本接近。
另外，以聚酰胺来吸附药液时，聚酰胺会吸附一些黄酮类化合物，较难被洗脱下来，因此经该方法所得的总黄酮及野黄芩苷含量较低，收率也不高。
实例5
本实例为黄芩茎叶总黄酮胶囊临床试验情况。
根据国家药品监督管理局2003L04245号批文，由南京中医药大学附属医院、江西中医学院附属医院、吉林省中医中药研究院、辽宁中医学院附属医院、天津中医学院第一附属医院等5家国家药品临床研究基地协同完成。
一、治疗方案
1.试验用药名称和规格
试验用药：黄芩茎叶总黄酮胶囊。处方组分为从黄芩茎叶提取的有效部位为总黄酮。规格：0.36g/粒。
对照药品：银黄胶囊。由金银花提取物100g，黄芩提取物40g组成。规格：0.3g/粒。
2.服药方法
试验组：黄芩茎叶总黄酮般囊，口服，一次3粒，一日4次(其中1次服用黄芩茎叶总黄酮胶囊安慰剂3粒)。
对照组：银黄胶囊，口服，一次3粒，一日4次。
连续服药5天为1个疗程。观察时间为1个疗程。
3.合并用药
除试验用药外，观察期间禁止使用其它治疗急性咽炎的中药和西药及与本病治疗相关的其他治疗。
二、结果
(一)实际各组受试者入选数量
试验入组240例，脱落4例，剔除12例，脱落、剔除率6.67％。符合方案集224例，全分析集239例，安全集239例。见表1。
(二)综合疗效分析
符合方案集两组总有效率的差别有统计学意义。总有效率相差的95％CI(0.22，32.74)。见表2。
全分析集两组总有效率的差别有高度统计学意义。总有效率相差的95％CI(0.34，32.46)。见表3。
为排除中心效应，以中心分层，两组综合疗效的差别有统计学意义。中心间差别无统计学意义。见表4。
为排除中心效应，以中心分层，两组总有效率的差别有统计学意义。各中心间差别无统计学意义。见表5。
三、试验小结
1.有效性小结：
治疗第5天咽痛、咽粘膜、悬雍垂红肿、咽后壁淋巴滤泡的疗效试验组优于对照组。第2天咽侧索红肿消失率对照组优于试验组。
符合方案集试验组总有效率68.47％，对照组总有效率52.21％，总有效率相差95％CI；全分析集试验组总有效率68.07％，对照组总有效率51.67％，总有效率相差的95％CI。两组综合疗效的差别试验组优于对照组。
2.安全性小结：
试验组147号病例服药后出现胃部轻度发胀，对照组162号病例服药后出现心慌胸闷，心电图ST段下移，但两组安全性评价的差别无统计学意义。
四、结论
黄芩茎叶总黄酮胶囊治疗急性咽炎风热证是有效、安全的。
表1：试验病例情况
    中心           入组例数              脱落例数              剔除例数
    试验组 对照组   合计     试验组 对照组 合计     试验组 对照组   合计
 01020304O5合计     2424242424120     2424242424120     4848484848240     030003     010001     040004     114006     204006     31800l2
注：天津中医学院第一附属医院为01、江西中医学院附属医院为02、辽宁中医学院附属医院为03、南京中医药大学附属医院为04、吉林省中医中药研究院为05.下同.
表2：两组综合疗效(PPS)
指标项     试验组     对照组     统计量     P值
综合疗效例数(缺失)痊愈(例，％)显效(例，％)进步(例，％)无效(例，％)痊愈率例数(缺失)痊愈(例，％)其它(例，％)总有效率例数(缺失)有效(例，％)其它(例，％) 111(0)24(21 62)52(46.85)30(27.03)5(4.50)111(0)24(21.62)87(78.38)111(0)76(68.47)35(31.53) 113(0)22(19.47)37(32.74)43(38.05)11(9.73)113(0)22(19.47)91(80.53)113(0)59(52.21)54(47.79)     CMHX2＝7.13chisq＝-0.16chisq＝6.18   P＝0.0678P＝-0.6901P＝0.0129
  两组总有效率相差的95％CI(试验组-对照组)非劣性检验比较(试验组-对照组)非劣性的95％CI(对照组-试验组)非劣性检验比较(对照组-试验组)非劣性的95％CI     下限-0.22u＝3.12CL＝2.42u＝-0.74CL＝-30.09 上限32.74P＝0.0009delta＝-10P＝0.7716delta＝-10
表3：两组综合疗效(FAS)
  指标项     试验组     对照组     统计量     P值
综合疗效例数(缺失)痊愈(例，％)显效(例，％)进步(例，％)无效(例，％)痊愈率例数(缺失)痊愈(例，％)其它(例，％)总有效率例数(缺失)有效(例，％)其它(例，％) 119(0)26(21.85)55(46.22)32(26.89)6(5.04)119(0)26(21.85)93(78.15)119(0)81(68.07)38(31.93) 120(0)22(18.33)40(33.33)45(37.50)l3(10.83)120(0)22(18.33)98(81.67)120(0)62(51.67)58(48.33)     CMHX2＝7.44chisq＝0.46chisq＝6.69   P＝0.0591P＝0.4976P＝0.0097
  两组总有效率相差的95％CI(试验组-对照组)非劣性检验比较(试验组-对照组)非劣性的95％CI(对照组-试验组)非劣性检验比较(对照组-试验组)非劣性的95％CI     下限0.34u＝3.22CL＝2.92u＝-0.78CL＝-29.88   上限32.46P＝0.0006delta＝-10P＝0.7827delta＝-10
表4：按医院分层两组综合疗效比较(PPS)
指标项     试验组     对照组     统计量   P值
01中心例数(缺失)痊愈(例，％)显效(例，％)进步(例，％)无效(例，％)02中心例数(缺失)痊愈(例，％)显效(例，％)进步(例，％)无效(例，％)03中心例数(缺失)痊愈(例，％)显效(例，％)进步(例，％)无效(例，％)04中心例数(缺失)痊愈(例，％)显效(例，％)进步(例，％)无效(例，％)05中心例数(缺失)痊愈(例，％)显效(例，％)进步(例，％)无效(例，％) 23(0)5(21.74)14(60.87)4(17.39)0(0.00)20(0)4(20.00)9(45.00)6(30.00)1(5.00)20(0)5(25.00)9(45.00)6(30.00)0(0.00)24(0)4(16.67)11(45.83)6(25.00)3(12.50)24(0)6(25.00)9(37.50)8(33.33)1(4.17) 22(0)2(9.09)6(27.27)13(59.09)1(4.55)23(0)3(13.04)9(39.13)9(39.13)2(8.70)20(0)6(30.00)5(25.00)7(35.00)2(10.00)24(0)8(33.33)10(41.67)4(16.67)2(8.33)24(0)3(12.50)7(29.17)10(41.67)4(16.67)     CMHX2＝10.01CMHX2＝0.85CMHX2＝3.23CMHX2＝1.94CMHX2＝3.20  P＝0.0185P＝0.8373P＝0.3578P＝0.5850P＝0.3612
两组综合疗效    以中心分层CMHX2＝4.09    P＝0.0432中心效应似然比检验X2＝2.87   P＝0.4204
表5：按医院分层两组综合总有效率比较(PPS)
指标项     试验组     对照组     统计量   P值
01中心例数(缺失)有效(例，％)其它(例，％)O2中心例数(缺失)有效(例，％)其它(例，％)03中心例数(缺失)有效(例，％)其它(例，％)04中心例数(缺失)有效(例，％)其它(例，％)O5中心例数(缺失)有效(例，％)其它(例，％) 23(0)19(82.61)4(17.39)20(0)13(65.00)7(35.00)20(0)14(70.00)6(30.00)24(0)15(62.50)9(37.50)24(0)15(62.50)9(37.50) 22(0)8(36.36)14(63.64)23(0)12(52.17)11(47.83)20(0)11(55.00)9(45.00)24(0)18(75.00)6(25.00)24(0)10(41.67)14(58.33)     chisq＝10.02chisq＝0.72chisq＝0.96chisq＝0.87chisq＝2.09  P＝0.0015P＝0.3951P＝0.3272P＝0.3502P＝0.1486
两组总有效率  以中心分层CMHX2＝6.09      P＝0.0136中心间齐性检验X2＝6.71       P＝0.0687

Claims (2)

1、一种从黄芩茎叶中提取总黄酮的方法，其特征在于制备过程如下：
(1)将黄芩茎叶粉碎成10-60目粗粉后，经水蒸汽蒸30-60分钟或粗粉浸没水中煎煮5-20分钟，进行杀酶处理，再加水提取2-3次，每次加入黄芩茎叶重量的5-15倍的水，在50-100℃下提取0.5-10小时，合并上述几次提取液，60-100℃减压或常压浓缩至20℃相对密度为1.02-1.22，离心分离，得上清液备用；
(2)在步骤(1)的上清液中加入盐酸至PH为1-4，离心分离，上清液用大孔吸附树脂吸附后，用纯化水洗至中性，再用浓度为30-90％的乙醇或浓度为3-5％的氢氧化钠碱液解吸附，收集解液，回收乙醇并浓缩，最后减压或常下干燥至干，即得所需的产品，所述的大孔吸附树脂包括AB-8型大孔树脂、D101型大孔树脂或HP-20型大孔树脂。
2、按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤(1)采用下述过程：第1次提取时加入石灰乳或氢氧化钠碱液，调至PH值为8-10，在此PH值下提取0.5-5小时，取出残渣并加入水，在50-100℃下再提取1-2次，每次加水的量是残渣重量的5-15倍，提取0.5-10小时，合并上述几次提取液，浓缩至20℃相对密度为1.02-1.22，备用。
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