CN110327388A - 一种从黄芩提取液分离制备黄芩苷、总黄酮和黄芩多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从黄芩提取液分离制备黄芩苷、总黄酮和黄芩多糖的方法，具体步骤为：以水为初始溶剂，提取三次，合并提取液，除去不溶物，上清液得到黄芩提取液，加热后，调节pH至1‑3，沉降，分出上浊液，沉淀物过滤，滤液并入上浊液，过滤固体物为黄芩苷粗品；将得到的上浊液调节pH至5‑7，加热后，加入絮凝剂，调节pH至5‑7，除去不溶物；滤液通过大孔树脂吸附，得到过柱液A和大孔负载树脂B，洗涤大孔负载树脂B，得到黄芩总黄酮；过柱液A通过离子交换树脂柱，浓缩液除去沉降物，清液中加入乙醇，过滤，干燥得到黄芩多糖。一次性得到的粗品黄芩苷纯度在83％以上，粗品黄酮在80％以上，黄芩多糖产率达到10％以上。
Description
技术领域
本发明属于中药成分综合提取分离技术领域，具体涉及一种从黄芩提取液分离制备黄芩苷、总黄酮和黄芩多糖的方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
中药黄芩为唇形科植物黄芩(Scutellariabaicalensis Georgi)的根，为中药常用药材，性味苦寒，具有清热燥湿，解毒败火之功效。其有效成分主要包括黄酮类化合物和黄芩多糖，其中黄酮类化合物如：黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、鼠尾草素、千层纸素、7-甲氧基黄芩素,7-甲氧基去甲基汉黄芩素,黄芩黄酮Ⅰ,黄芩黄酮Ⅱ等(温华珍,肖盛元,王义明等黄芩化学成分及炮制学研究,《天然产物研究与开发》2004,16(6)：575),具有抗氧化、抗炎、抗变态、抗菌、抗病毒及抗肿瘤等广泛药理作用；黄芩多糖具有抗氧化和增强免疫力的功能，其对超氧阴离子的清除能力明显高于VC，当质量浓度达到1.4mg/mL时，黄芩多糖的清除率能达89.55％，[金迪，梁英，郑文凤等.黄芩多糖体外抗氧化活性研究[J].中兽医医药杂志，2012，31(3)：33-37.]，和植物活性多糖一样，黄芩多糖保健品和添加剂将成为新型保健食品和饲料添加剂中的重要一员，黄芩多糖的开发利用具有广阔的前景。
黄芩有效成分提取分离的报道有很多，主要集中于某一成分的提取。如：CN201110065938.8，一种从黄芩中提取黄芩苷的方法(四川济生堂药业有限公司任治军)；“超声法提取黄芩多糖的工艺考察”(哈尔学滨商业大药学院，杨波等)；CN201710203101.2，一种黄芩苷的提取方法，(温典明等)；CN 201710137476.3，从黄芩根中提取黄芩多糖的分离纯化方法(崔新爱等)。
天津士兰科技有限公司公开了一种从黄芩中同时分离汉黄芩素与黄芩素单体的方法(CN 103555784 A，201310508967.6)，提供了一种从黄芩中同时分离汉黄芩素与黄芩素单体的方法，通过将黄芩药材粉碎，加入适量水以及食用酶进行酶解，将酶解后的药材进行超临界萃取，使用夹带剂分段收集，进行重结晶后可分别得到黄芩素与汉黄芩素；山东省中医药研究院公开了一种从黄芩中同时提取黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的方法(CN201510086688.4)，是将黄芩水提，再经大孔树脂吸附、沉淀、凝胶柱分离得到黄芩苷、黄芩素、和汉黄芩素。韩桂茹等公开了黄芩中黄芩苷及黄芩总苷元同时提取分离工艺(CN200910075407.X)，用水和无机酸类，先分离脂溶性黄芩总苷元，再酸沉淀、分离水中溶解的黄芩苷的综合提取分离工艺。以上专利尽管考虑到了黄芩有效成分的多样性，但是主要还是关注于黄芩中主要黄酮如黄芩苷以及黄芩素的提取，没有把黄芩有效成分的提取加以综合设计。
发明人发现，在以黄芩切片为原料工业生产黄芩苷的过程中，主要是采用水提酸沉以及两酸一碱提取黄芩苷的生产工艺，提取黄芩苷后的溶液还含有大量有效成分，常常未加利用直接排放到污水系统。有效成分未加合理利用，是一种资源的浪费，另一方面，大量有机物进入废水系统，徒增污水处理的压力。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的一个目的是提供一种从黄芩提取液分离制备黄芩苷、总黄酮和黄芩多糖的方法。黄芩中的主要有效成分—黄芩苷、总黄酮、黄芩多糖被充分提取，原来的黄芩提取废液被充分利用，极大地减少了废液中的有机物，即增加黄芩提取物的附加值，又减少了废液处理负担；该工艺设备简单、流程短，在原生产工艺的基础上适当延伸即可副产两种新产品。本发明将原来的酸沉废液加以利用，即减少废液排放、降低了污染，又增加了资源的利用率。
为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：
一种从黄芩提取液分离制备黄芩苷、总黄酮和黄芩多糖的方法，具体步骤为：
1)黄芩切片，加入5倍沸水，提取三次，合并提取液，沉降除去不溶物，分出上清液得到黄芩提取液，加热后，调节pH至1-3，沉降，分出上浊液，沉淀物过滤，滤液并入上浊液，过滤后的固体沉淀物即为黄芩苷粗品；
2)将步骤1)得到的上浊液调节pH至5-7，加热后，加入絮凝剂，调节pH至5-7，沉降过滤除去不溶物；
3)将步骤2)得到的滤液通过大孔树脂吸附，得到过柱液A和大孔负载树脂B，洗涤大孔负载树脂B，收集得到黄酮洗脱液，干燥得到黄芩总黄酮；
4)将步骤3)得到的过柱液A通过离子交换树脂柱，浓缩液离心除去沉降物，清液中加入乙醇，沉降后，将沉淀物过滤，干燥得到黄芩多糖。
本发明先是将通常两次8倍水量提取工艺改为三次5倍水提，在减少用水量的同时，提取率明显提高。其次将酸沉后的废液收集，通过调节pH将上浊液中的黄酮类化合物复溶，再通过絮凝除去胶质、蛋白和鞣酸类杂质，通过大孔树脂吸附总黄酮，流出的水溶液通过脱盐、浓缩、醇沉得到粗多糖。大孔树脂吸附物通过乙醇解析，再通过干燥得到总黄酮。该工艺能将黄芩中的有效成分分步分离。整体上提高黄芩苷、黄芩总黄酮、黄芩多糖的产量。一次性得到的粗品黄芩苷纯度在83％以上，粗品黄酮在80％以上，黄芩多糖产率达到10％以上。
本发明依据的原理：
在以水作为溶剂提取黄芩苷的过程中，黄芩苷以天然产物镁盐的状态溶于热水，此时水溶液pH4～5，同时其他黄酮(如汉黄芩苷、野黄芩苷、千层纸素苷、黄芩素、白杨素等)、和多糖成分也一起被浸出到水溶液中。在提取液酸化时(pH＝1～2)，通过控制温度，黄芩苷以一种致密晶型沉于罐底，其他黄酮成分部分溶于水，部分以无定型物悬浮于溶液中。在此过程中，仍有部分的黄芩苷悬浮于水相，也有部分黄芩苷分解成黄芩素。通过倾出上浊液、调至适当pH值(PH＝5.5～6)，这类黄酮成分复溶于水中。然后加入适当的絮凝剂，通过控制pH值，可以有效地除去胶质、蛋白等杂质。通过大孔树脂吸附分离出黄芩黄酮，过柱液通过脱盐处理，再通过浓缩醇沉获得粗多糖。
在一些实施例中，步骤1)中加水后在80～100℃下进行提取，黄芩提取液加热的温度为70～100℃；优选的，黄芩提取液加热的温度为80-90℃。在一些实施例中，黄芩提取液酸化后沉降的时间为10-60min；优选为20-40min。在一些实施例中，步骤2)中的絮凝剂为氯化钙、氯化镁、硫酸镁其中的一种或多种。在一些实施例中，上浊液加入絮凝剂之前，加热后的温度为80～90℃。在一些实施例中，步骤2)中的絮凝剂用量为溶液总质量的0.01％～0.8％；优选为0.1％～0.4％，溶液的质量浓度为10～20％。在一些实施例中，加入絮凝剂后调节pH至5.5～6.5。在一些实施例中，大孔树脂为AB-8或D101。在一些实施例中，步骤3)中黄酮洗脱液通过减压浓缩后稠膏比重1.05～1.18，然后经过真空或喷雾干燥后得到黄芩总黄酮。在一些实施例中，步骤4)中通过大孔树脂吸附后的出液电导率≤120μs/cm，所得过柱液减压浓缩至稠膏比重为1.05-1.18。在一些实施例中，步骤4)中加入的乙醇后的混合液中，乙醇的体积浓度为70～80％(V/V)。
黄芩用水提取代替乙醇提取，成本降低、安全性增加，同时，也增大了多糖等有效成分的溶解量。
步骤1)中缩短了沉降时间，有效降低了酸性条件下黄芩苷的水解，黄芩苷纯度提高。
步骤2)中选择氯化钙、氯化镁、硫酸镁作为絮凝剂，由于通过调节pH，使悬浮的黄酮复溶于水中，水中含有黄酮、黄芩多糖和部分黄芩苷，通过加入适当比例的上述絮凝剂，充分去除蛋白质和鞣酸等杂质，使影响后续分离的无效成分分离出来。
本发明的有益效果：
1、本发明的提取方法能将黄芩中的有效成分分步分离，所得产物中，粗品黄芩苷产率10～12％，含量分析按照药典标准(WS-10001-(HD-0989)-2002)方法检测，黄芩苷含量82～85％；
黄芩总黄酮的产率为7～10％，含量参照文献方法(黄芩总黄酮脂质体的制备及其体外抗肿瘤活性，中成药2018年2月第40卷第2期P133)，以紫外分光光度法(UV)检测，总黄酮含量在80％以上；
黄芩多糖产率11～16％，含量参照文献(紫外分光光度法测定黄芩多糖的含量，吉林医药学院学报，2016年10月，第37卷第5期，朱鹤云等)，按照紫外-可见分光光度法(《中国药典》2015年版四部通则0401)检测，含量在60％以上。
2、将提取黄芩苷后的废液进一步综合利用，增大了黄芩提取的附加值，同时也减少了废液排放量，废水中的有机物降低，有效减轻了黄芩提取废液处理的负担。
3、本发明提取的黄芩总黄酮和黄芩多糖，是在原来黄芩苷提取工艺的基础上的延伸，不另外占用药材资源，为临床开发新型的抗菌消炎新药提供了优质、价廉的原料；
4、本发明中将黄芩提取物分离得到黄芩苷、黄芩总黄酮、黄芩多糖，每一种的提取物中，主要成分的含量都比较高，这三种成分具有很好的药用效果，所以为制取相应的药类产品提供了较好的原料。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为提取工艺流程图；
图2为实施例1的黄芩苷的HPLC谱图；
图3为实施例1的黄芩总黄酮的HPLC谱图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下面结合实施例对本发明进一步说明
下述实施例的提取过程如图1所示：
实施例1：
(1)提取分离黄芩苷：取黄芩切片200g投入到2L三口烧瓶中，加入1000ml*3沸水，加热回流提取三次，每次提取1小时。合并提取液，沉降除去不溶物。分出上清液，加热至85℃，以30％的盐酸调pH至1.8，沉降20min，分出上浊液备用。下层黄色沉淀物过滤，滤液并入上浊液，以水洗涤滤饼，得到黄色沉淀物，减压干燥得到黄芩苷粗品22.6g，黄芩苷含量84.5％。得到的黄芩苷的HPLC谱图如图2所示。
(2)絮凝除杂：将上面得到的上浊液2630ml以30％氢氧化钠中和到pH＝5.7，加热到80℃，缓慢搅拌下，加入20％CaCl2溶液13.2g，以氢氧化钠溶液调节pH＝5.9，溶液生成大量矾花絮凝沉淀，静止沉降1小时，过滤除去不溶物。
(3)分离制备总黄酮：将上面所得到的滤液通过大孔树脂柱D101吸附，以三氯化铁溶液检测黄酮上样量，得到过柱液A和大孔负载树脂柱B，将负载大孔树脂柱以纯水洗涤，至流出水清澈。以80％的乙醇洗脱负载大孔树脂柱B，收集黄酮洗脱液。洗脱液减压浓缩至溶液比重1.15，真空干燥后得到棕黄色粉末，重量19.7g，产率9.85％。总黄酮含量82.5％。
(4)提取分离黄芩多糖：将步骤(3)中的过柱液A通过离子交换树脂柱脱盐，控制流出液电导率在120μs/cm以下，所得过柱液于65℃/-0.085MPa减压浓缩至稠膏比重1.08，浓缩液冷却至室温，离心除去不容物，上清液加入到醇沉罐，加入乙醇调节至乙醇浓度为80％，生成大量白色沉淀，过滤，60℃真空干燥得到类白色粉末状固体黄芩多糖25.28g，相对于黄芩药材的收率为12.6％，多糖含量为63.6％。得到的黄芩多糖的HPLC谱图如图3所示。
实施例2：
(1)提取分离黄芩苷：取黄芩切片200g投入到2L三口烧瓶中，加入1000ml*3沸水，加热回流提取三次，每次提取1小时。合并提取液，沉降除去不溶物。分出上清液，加热至85℃，以30％的盐酸调pH至1.9，沉降40min，分出上浊液备用。下层黄色沉淀物过滤，滤液并入上浊液，以水洗涤滤饼，得到黄色沉淀物，减压干燥得到黄芩苷粗品23.18g，黄芩苷含量83.4％。
(2)絮凝除杂：将上面得到的上浊液2630ml以30％氢氧化钠中和到pH＝5.7，加热到80℃，缓慢搅拌下，加入20％CaCl2溶液26.3g，以氢氧化钠溶液调节pH＝5.7，溶液生成大量矾花絮凝沉淀，静止沉降1小时，过滤除去不溶物。
(3)分离制备总黄酮：将上面所得到的滤液通过大孔树脂柱AB-8吸附，以三氯化铁溶液检测黄酮上样量，得到过柱0液A和大孔负载树脂柱B，将负载大孔树脂柱以纯水洗涤，至流出水清澈。以80％的乙醇洗脱负载大孔树脂柱B，收集黄酮洗脱液。洗脱液减压浓缩至溶液比重1.13，真空干燥后得到棕黄色粉末，重量18.4g，产率9.85％。总黄酮含量84.3％。
(4)提取分离黄芩多糖：将步骤(3)中的过柱液A通过离子交换树脂柱脱盐，控制流出液电导率在120μs/cm以下，所得过柱液于65℃/-0.085MPa减压浓缩至稠膏比重1.15，浓缩液冷却至室温，离心除去不容物，上清液加入到醇沉罐，加入乙醇调节至乙醇浓度为82％，生成大量白色沉淀，过滤，60℃真空干燥得到类白色粉末状固体黄芩多糖33.16g，相对于黄芩药材的收率为16.6％，多糖含量为62.2％。
实施例3：
(1)提取分离黄芩苷：取黄芩切片200g投入到2L三口烧瓶中，加入1000ml*3沸水，加热回流提取三次，每次提取1小时。合并提取液，沉降除去不溶物。分出上清液，加热至80℃，以30％的盐酸调pH至2.0，沉降30min，分出上浊液备用。下层黄色沉淀物过滤，滤液并入上浊液，以水洗涤滤饼，得到黄色沉淀物，减压干燥得到黄芩苷粗品22.59g，黄芩苷含量82.1％。
(2)絮凝除杂：将上面得到的上浊液2630ml以30％氢氧化钠中和到pH＝5.7，加热到80℃，缓慢搅拌下，加入20％MgCl2溶液13.2g，以氢氧化钠溶液调节pH＝6.1，溶液生成大量矾花絮凝沉淀，静止沉降1小时，过滤除去不溶物。
(3)分离制备总黄酮：将上面所得到的滤液通过大孔树脂柱AB-8吸附，以三氯化铁溶液检测黄酮上样量，得到过柱液A和大孔负载树脂柱B，将负载大孔树脂柱以纯水洗涤，至流出水清澈。以80％的乙醇洗脱负载大孔树脂柱B，收集黄酮洗脱液。洗脱液减压浓缩至溶液比重1.11，真空干燥后得到棕黄色粉末，重量19.2g，产率9.60％。总黄酮含量83.5％。
(4)提取分离黄芩多糖：将步骤(3)中的过柱液A通过离子交换树脂柱脱盐，控制流出液电导率在120μs/cm以下，所得过柱液于65℃/-0.085MPa减压浓缩至稠膏比重1.13，浓缩液冷却至室温，离心除去不容物，上清液加入到醇沉罐，加入乙醇调节至乙醇浓度为81％，生成大量白色沉淀，过滤，60℃真空干燥得到类白色粉末状固体黄芩多糖32.12g，相对于黄芩药材的收率为16.1％，多糖含量为61.3％。
实施例4：
(1)、提取分离黄芩苷：取黄芩切片200g投入到2L三口烧瓶中，加入1000ml*3沸水，加热回流提取三次，每次提取1小时。合并提取液，沉降除去不溶物。分出上清液，加热至80℃，以30％的盐酸调pH至1.8，沉降30min，分出上浊液备用。下层黄色沉淀物过滤，滤液并入上浊液，以水洗涤滤饼，得到黄色沉淀物，减压干燥得到黄芩苷粗品22.87g，黄芩苷含量82.9％。
(2)絮凝除杂：将上面得到的上浊液2630ml以30％氢氧化钠中和到pH＝5.7，加热到80℃，缓慢搅拌下，加入20％MgCl2溶液39.5g，以氢氧化钠溶液调节pH＝6.1，溶液生成大量矾花絮凝沉淀，静止沉降1小时，过滤除去不溶物。
(3)分离制备总黄酮：将上面所得到的滤液通过大孔树脂柱AB-8吸附，以三氯化铁溶液检测黄酮上样量，得到过柱液A和大孔负载树脂柱B，将负载大孔树脂柱以纯水洗涤，至流出水清澈。以80％的乙醇洗脱负载大孔树脂柱B，收集黄酮洗脱液。洗脱液减压浓缩至溶液比重1.15，真空干燥后得到棕黄色粉末，重量17.3g，产率8.65％。总黄酮含量84.6％。
(4)提取分离黄芩多糖：将步骤(3)中的过柱液A通过离子交换树脂柱脱盐，控制流出液电导率在120μs/cm以下，所得过柱液于65℃/-0.085MPa减压浓缩至稠膏比重1.12，浓缩液冷却至室温，离心除去不容物，上清液加入到醇沉罐，加入乙醇调节至乙醇浓度为80％，生成大量白色沉淀，过滤，60℃真空干燥得到类白色粉末状固体黄芩多糖26.32g，相对于黄芩药材的收率为13.2％，多糖含量为65.1％。
实施例5：
(1)提取分离黄芩苷：取黄芩切片200g投入到2L三口烧瓶中，加入1000ml*3沸水，加热回流提取三次，每次提取1小时。合并提取液，沉降除去不溶物。分出上清液，加热至90℃，以30％的盐酸调pH至1.8，沉降30min，分出上浊液备用。下层黄色沉淀物过滤，滤液并入上浊液，以水洗涤滤饼，得到黄色沉淀物，减压干燥得到黄芩苷粗品23.32g，黄芩苷含量83.2％。
(2)絮凝除杂：将上面得到的上浊液2630ml以30％氢氧化钠中和到pH＝5.7，加热到80℃，缓慢搅拌下，加入20％MgSO4溶液26.3g，以氢氧化钠溶液调节pH＝6.1，溶液生成大量矾花絮凝沉淀，静止沉降1小时，过滤除去不溶物。
(3)分离制备总黄酮：将上面所得到的滤液通过大孔树脂柱D101吸附，以三氯化铁溶液检测黄酮上样量，得到过柱液A和大孔负载树脂柱B，将负载大孔树脂柱以纯水洗涤，至流出水清澈。以80％的乙醇洗脱负载大孔树脂柱B，收集黄酮洗脱液。洗脱液减压浓缩至溶液比重1.12，真空干燥后得到棕黄色粉末，重量18.8g，产率9.40％。总黄酮含量82.2％。
(4)提取分离黄芩多糖：将步骤(3)中的过柱液A通过离子交换树脂柱脱盐，控制流出液电导率在120μs/cm以下，所得过柱液于65℃/-0.085MPa减压浓缩至稠膏比重1.12，浓缩液冷却至室温，离心除去不容物，上清液加入到醇沉罐，加入乙醇调节至乙醇浓度为80％，生成大量白色沉淀，过滤，60℃真空干燥得到类白色粉末状固体黄芩多糖27.12g，相对于黄芩药材的收率为13.6％，多糖含量为66.4％。
实施例6：(放大实验)
(1)提取分离黄芩苷：取黄芩切片30Kg投入200L多功能提取罐，加入150Kg*3沸水，加热回流提取三次，每次提取1小时。合并提取液，沉降除去不溶物。分出上清液，加热至90℃，以30％的盐酸调pH至1.8，沉降60min，分出上浊液备用。下层黄色沉淀物过滤，滤液并入上浊液，以水洗涤滤饼，得到黄色沉淀物，减压干燥得到黄芩苷粗品3.41Kg，黄芩苷含量83.3％。
(2)絮凝除杂：将上面得到的上浊液401Kg以30％氢氧化钠中和到pH＝5.7，加热到80℃，缓慢搅拌下，加入20％CaCl2溶液6.0Kg，以氢氧化钠溶液调节pH＝6.0，溶液生成大量矾花絮凝沉淀，静止沉降1小时，过滤除去不溶物。
(3)分离制备总黄酮：将上面所得到的滤液通过大孔树脂柱AB-8吸附，以三氯化铁溶液检测黄酮上样量，得到过柱液A和大孔负载树脂柱B，将负载大孔树脂柱以纯水洗涤，至流出水清澈。以80％的乙醇洗脱负载大孔树脂柱B，收集黄酮洗脱液。洗脱液减压浓缩至溶液比重1.10，喷雾干燥后得到棕黄色粉末，重量2.37Kg，产率7.92％。总黄酮含量83.1％。
(4)提取分离黄芩多糖：将步骤(3)中的过柱液A通过离子交换树脂柱脱盐，控制流出液电导率在120μs/cm以下，所得过柱液于65℃/-0.085MPa减压浓缩至稠膏比重1.12，浓缩液冷却至室温，离心除去不容物，上清液加入到醇沉罐，加入乙醇调节至乙醇浓度为80％，生成大量白色沉淀，过滤，60℃真空干燥得到类白色粉末状固体黄芩多糖3.52Kg，相对于黄芩药材的收率为11.7％，多糖含量为64.0％。
对比例1：(常规水提工艺)
(1)提取分离黄芩苷：取黄芩切片200g投入到2L三口烧瓶中，加入1600ml*2沸水，加热回流提取两次，每次提取1.5小时。合并提取液，沉降除去不溶物。分出上清液，加热至85℃，以30％的盐酸调pH至1.8，沉降240min，分出上浊液备用。下层黄色沉淀物过滤，滤液并入上浊液，以水洗涤滤饼，得到黄色沉淀物，减压干燥得到黄芩苷粗品20.18g，黄芩苷含量80.2％。
(2)中和过滤：将上面得到的上浊液2600ml以30％氢氧化钠中和到pH＝5.7，悬浊物大部分溶解，过滤除去不溶物。
(3)分离制备总黄酮：将上面所得到的滤液通过大孔树脂柱D101吸附，以三氯化铁溶液检测黄酮上样量，得到过柱液A和大孔负载树脂柱B，将负载大孔树脂柱以纯水洗涤，至流出水清澈。以80％的乙醇洗脱负载大孔树脂柱B，收集黄酮洗脱液。洗脱液减压浓缩至溶液比重1.15，真空干燥后得到棕黄色粉末，重量20.89g，产率10.48％，总黄酮含量76.5％。
(4)提取分离黄芩多糖：将步骤(3)中的过柱液A通过离子交换树脂柱脱盐，控制流出液电导率在120μs/cm以下，所得过柱液于65℃/-0.085MPa减压浓缩至稠膏比重1.15，浓缩液冷却至室温，离心除去不容物，上清液加入到醇沉罐，加入乙醇调节至乙醇浓度为80％，生成大量白色沉淀，过滤，60℃真空干燥得到灰色粉末状固体黄芩多糖40.2g，相对于黄芩药材的收率为20.1％，多糖含量为47.7％。
对比例2：(无絮凝剂)
(1)提取分离黄芩苷：取黄芩切片200g投入到2L三口烧瓶中，加入1000ml*3沸水，加热回流提取三次，每次提取1小时。合并提取液，沉降除去不溶物。分出上清液，加热至85℃，以30％的盐酸调pH至1.8，沉降40min，分出上浊液备用。下层黄色沉淀物过滤，滤液并入上浊液，以水洗涤滤饼，得到黄色沉淀物，减压干燥得到黄芩苷粗品22.4g，黄芩苷含量82.7％。
(2)中和过滤：将上面得到的上浊液2630ml以30％氢氧化钠中和到pH＝5.7，悬浊物大部分溶解，过滤除去不溶物。
(3)分离制备总黄酮：将上面所得到的滤液通过大孔树脂柱D101吸附，以三氯化铁溶液检测黄酮上样量，得到过柱液A和大孔负载树脂柱B，将负载大孔树脂柱以纯水洗涤，至流出水清澈。以80％的乙醇洗脱负载大孔树脂柱B，收集黄酮洗脱液。洗脱液减压浓缩至溶液比重1.15，真空干燥后得到棕黄色粉末，重量21.8g，产率10.9％。总黄酮含量75.2％。
(4)提取分离黄芩多糖：将步骤(3)中的过柱液A通过离子交换树脂柱脱盐，控制流出液电导率在120μs/cm以下，所得过柱液于65℃/-0.085MPa减压浓缩至稠膏比重1.12，浓缩液冷却至室温，离心除去不容物，上清液加入到醇沉罐，加入乙醇调节至乙醇浓度为80％，生成大量白色沉淀，过滤，60℃真空干燥得到灰色粉末状固体黄芩多糖42.5g，相对于黄芩药材的收率为21.3％，多糖含量为49.5％。
对比例3：(絮凝pH大于7)
(1)提取分离黄芩苷：取黄芩切片200g投入到2L三口烧瓶中，加入1000ml*3沸水，加热回流提取三次，每次提取1小时。合并提取液，沉降除去不溶物。分出上清液，加热至85℃，以30％的盐酸调pH至1.8，沉降40min，分出上浊液备用。下层黄色沉淀物过滤，滤液并入上浊液，以水洗涤滤饼，得到黄色沉淀物，减压干燥得到黄芩苷粗品23.1g，黄芩苷含量83.2％。
(2)絮凝除杂：将上面得到的上浊液2630ml以30％氢氧化钠中和到pH＝5.7，加热到80℃，缓慢搅拌下，加入20％CaCl2溶液26.3g，以氢氧化钠溶液调节pH＝7.2，溶液生成大量矾花絮凝沉淀，静止沉降1小时，过滤除去不溶物。
(3)分离制备总黄酮：将上面所得到的滤液通过大孔树脂柱D101吸附，以三氯化铁溶液检测黄酮上样量，得到过柱液A和大孔负载树脂柱B，将负载大孔树脂柱以纯水洗涤，至流出水清澈。以80％的乙醇洗脱负载大孔树脂柱B，收集黄酮洗脱液。洗脱液减压浓缩至溶液比重1.15，真空干燥后得到棕黄色粉末，重量10.8g，产率5.40％。总黄酮含量84.5％。
(4)提取分离黄芩多糖：将步骤(3)中的过柱液A通过离子交换树脂柱脱盐，控制流出液电导率在120μs/cm以下，所得过柱液于65℃/-0.085MPa减压浓缩至稠膏比重1.12，浓缩液冷却至室温，离心除去不容物，上清液加入到醇沉罐，加入乙醇调节至乙醇浓度为80％，生成大量白色沉淀，过滤，60℃真空干燥得到类白色粉末状固体黄芩多糖21.20g，相对于黄芩药材的收率为10.6％，多糖含量为66.8％。
对比例4：(絮凝pH小于5)
(1)提取分离黄芩苷：取黄芩切片200g投入到2L三口烧瓶中，加入1000ml*3沸水，加热回流提取三次，每次提取1小时。合并提取液，沉降除去不溶物。分出上清液，加热至85℃，以30％的盐酸调pH至1.8，沉降40min，分出上浊液备用。下层黄色沉淀物过滤，滤液并入上浊液，以水洗涤滤饼，得到黄色沉淀物，减压干燥得到黄芩苷粗品22.5g，黄芩苷含量83.0％。
(2)絮凝除杂：将上面得到的上浊液2630ml以30％氢氧化钠中和到pH＝5.7，加热到80℃，缓慢搅拌下，加入20％CaCl2溶液26.3g，以氢氧化钠溶液调节pH＝4.8，溶液生成很少量的矾花絮凝沉淀，静止沉降1小时，过滤除去不溶物。
(3)分离制备总黄酮：将上面所得到的滤液通过大孔树脂柱D101吸附，以三氯化铁溶液检测黄酮上样量，得到过柱液A和大孔负载树脂柱B，将负载大孔树脂柱以纯水洗涤，至流出水清澈。以80％的乙醇洗脱负载大孔树脂柱B，收集黄酮洗脱液。洗脱液减压浓缩至溶液比重1.15，真空干燥后得到棕黄色粉末，重量20.89g，产率10.45％。总黄酮含量73.2％。
(4)提取分离黄芩多糖：将步骤(3)中的过柱液A通过离子交换树脂柱脱盐，控制流出液电导率在120μs/cm以下，所得过柱液于65℃/-0.085MPa减压浓缩至稠膏比重1.15，浓缩液冷却至室温，离心除去不容物，上清液加入到醇沉罐，加入乙醇调节至乙醇浓度为80％，生成大量白色沉淀，过滤，60℃真空干燥得到灰色粉末状固体黄芩多糖46.10g，相对于黄芩药材的收率为23.1％，多糖含量为41.0％。
总结：
以上实施例表明，黄芩提取液在权力请求范围内的技术条件下的实施，可以分步获得具有工业价值的黄芩苷粗品、黄芩总黄酮、黄芩多糖。对比例1表明，按照常规方法提取，黄芩苷的提取率、纯度都有所降低。对比例1和对比例2结果表明，不加絮凝剂，则蛋白及胶质等杂质得不到有效分离，尽管所得黄芩多糖产率增加，但是纯度降低；实验情况也发现，这两例的大孔树脂前部颜色加深，再吸附能力下降。对比例3和对比例4表明，絮凝沉降的pH范围非常关键，pH大于7，絮凝沉淀量大，尽管后面所得产物的纯度提高，但是总黄酮和多糖都损失严重，导致其产率降低。pH小于5，则难以形成矾花絮凝沉淀，杂质不能除去，后续产品纯度降低。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种从黄芩提取液分离制备黄芩苷、总黄酮和黄芩多糖的方法，其特征在于：具体步骤为：
1)黄芩切片，加入5倍沸水，提取三次，合并提取液，沉降除去不溶物，分出上清液得到黄芩提取液，加热后，调节pH至1-3，沉降，分出上浊液，沉淀物过滤，滤液并入上浊液，过滤后的固体沉淀物即为黄芩苷粗品；
2)将步骤1)得到的上浊液调节pH至5-7，加热后，加入絮凝剂，调节pH至5-7，沉降过滤除去不溶物；
3)将步骤2)得到的滤液通过大孔树脂吸附，得到过柱液A和大孔负载树脂B，洗涤大孔负载树脂B，收集得到黄酮洗脱液，干燥得到黄芩总黄酮；
4)将步骤3)得到的过柱液A通过离子交换树脂柱，浓缩液离心除去沉降物，清液中加入乙醇，沉降后，将沉淀物过滤，干燥得到黄芩多糖。
2.根据权利要求1所述的从黄芩提取液分离制备黄芩苷、总黄酮和黄芩多糖的方法，其特征在于：步骤1)中加水后在80～100℃下进行提取，黄芩提取液加热的温度为70～100℃；
优选的，黄芩提取液加热的温度为80-90℃。
3.根据权利要求1所述的从黄芩提取液分离制备黄芩苷、总黄酮和黄芩多糖的方法，其特征在于：黄芩提取液酸化后沉降的时间为10-60min；
优选的，沉降的时间为20-40min。
4.根据权利要求3所述的从黄芩提取液分离制备黄芩苷、总黄酮和黄芩多糖的方法，其特征在于：步骤2)中的絮凝剂为氯化钙、氯化镁、硫酸镁其中的一种或多种；
或，加入絮凝剂之前，加热后的温度为80～90℃。
5.根据权利要求1所述的从黄芩提取液分离制备黄芩苷、总黄酮和黄芩多糖的方法，其特征在于：步骤2)中的絮凝剂用量为溶液总质量的0.01％～0.8％，溶液的质量浓度为10～20％；
优选的，絮凝剂用量为溶液总质量的0.1％～0.4％。
6.根据权利要求1所述的从黄芩提取液分离制备黄芩苷、总黄酮和黄芩多糖的方法，其特征在于：加入絮凝剂后调节pH至5.5～6.5。
7.根据权利要求1所述的从黄芩提取液分离制备黄芩苷、总黄酮和黄芩多糖的方法，其特征在于：大孔树脂为AB-8或D101。
8.根据权利要求1所述的从黄芩提取液分离制备黄芩苷、总黄酮和黄芩多糖的方法，其特征在于：步骤3)中黄酮洗脱液通过减压浓缩后稠膏比重1.05～1.18，然后经过真空或喷雾干燥后得到黄芩总黄酮。
9.根据权利要求1述的从黄芩提取液分离制备黄芩苷、总黄酮和黄芩多糖的方法，其特征在于：步骤4)中通过大孔树脂吸附后的出液电导率≤120μs/cm，所得过柱液减压浓缩至稠膏比重为1.05-1.18。
10.根据权利要求1述的从黄芩提取液分离制备黄芩苷、总黄酮和黄芩多糖的方法，其特征在于：步骤4)中加入的乙醇后的混合液中，乙醇的体积浓度为70～80％。
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