CN1682742A - 23－羟基白桦酸在抑制血管生成中的应用 - Google Patents

Abstract

23－羟基白桦酸在抑制血管生成中的应用，涉及中药应用技术领域。本发明公开了23－羟基白桦酸在抑制血管生成中的新用途，研究表明，23－羟基白桦酸具有抑制血管生成的作用。23－羟基白桦酸在制备抑制血管生成的治疗和/或预防药物中应用的有效剂量为3～50mg/kg体重/天。本发明巧妙地以血管生成作为治疗疾病的靶点，具有以下优点：1.治疗针对已经启动的新生血管进行，具有特异性；2.由于血管内皮细胞暴露于血流中，药物直接发挥作用，故剂量小，疗效高，副作用小；3.由于内皮细胞基因表达相对稳定，故不易产生耐药性。

Description

23-羟基白桦酸在抑制血管生成中的应用

技术领域

23-羟基白桦酸在抑制血管生成中的应用，涉及中药应用技术领域，特别是涉及23-羟基白桦酸的新用途。

背景技术

原发肿瘤的生长和转移依赖于源自既存血管的新生血管的生成，这个过程叫做血管生成(angiogenesis)。肿瘤既可通过肿瘤血管从宿主获取营养和氧气，又可通过肿瘤血管源源不断地向宿主输送转移细胞，并在机体的其他部位继续生长和诱导血管形成，导致肿瘤转移。如果没有血管生成，原发肿瘤的生长不会超过1～2mm，也不会出现浸润和转移。抑制肿瘤血管生成与阻断肿瘤的发生、发展、浸润和转移密切相关，并可阻止癌前病变向癌的恶性转变。不仅实体肿瘤的生长、浸润和转移依赖新生血管生成，血液系统恶性肿瘤(如恶性淋巴瘤、淋巴细胞白血病等)的生长和转移也与血管生成密切相关。肿瘤的生长、转移、复发、预后与血管生成密切相关，以肿瘤的血管生成为靶点，开发血管生成抑制剂，不但可用于大多数实体肿瘤的治疗，还可用于癌的预防和血液系统恶性肿瘤的治疗，同时对其他与血管生成有关的疾病如：糖尿病视网膜病变、风湿性关节炎、银屑病、血管瘤、动脉粥样硬化等的预防与治疗，都具有重要的理论及现实意义。因此，肿瘤的血管系统已成为一个崭新的、有希望的抗肿瘤治疗靶点。

开发和研究能破坏或抑制血管生成，有效地阻止肿瘤生长和转移的药物(肿瘤血管生成抑制剂，tumor angiogenesis inhibitor，TAI)是目前的研究热点。TAI通过切断肿瘤赖以生长和转移的营养来源和迁移通道，具有许多优势：①治疗发生时，血管生成已被启动，故TAI治疗具有良好的特异性。②血管内皮细胞暴露于血流中，药物能直接发挥作用，故剂量小、疗效高。③内皮细胞基因表达相对稳定，不易产生耐药性。④肿瘤血管内皮细胞的增殖速度较正常血管内皮细胞快许多倍，故TAI对正常组织毒性极小。近年来，这类抑制剂的研究已取得进展，可望在21世纪初成为一类崭新的、有希望的抗肿瘤治疗药物，其中天然药物的开发备受关注。

白头翁是一传统中药，具清热解毒、活血化瘀功效，中医临床主要用于结肠癌、直肠癌等肠道肿瘤及子宫颈癌、脑垂体瘤、甲状腺瘤、肺癌的治疗。23-羟基白桦酸是从传统中药白头翁(Pulsatilla Chinensis)根部分离出的一种五环三萜类皂苷，是中药白头翁的特征性成分，其结构式为：

分子式为C₃₀H₄₈O₄，类白色粉状物，分子量为472，易溶于二甲亚砜、氯仿、乙酸乙酯、乙醇等有机溶剂，不溶于水。它可通过采取“23-羟基白桦酸在制备治疗或预防肿瘤和艾滋病药物中的应用”(申请号为03152904.6的中国发明专利申请文件中作了详细的叙述)而获得，但这不是获得23-羟基白桦酸的唯一方法和唯一来源。

23-羟基白桦酸具有广泛的抗肿瘤活性。体内外抑瘤实验表明，它较白头翁中提取的其它衍生物抗黑色素瘤作用更强，低剂量时(10-20ug/mL)对黑色素瘤B16细胞即有明显的分化诱导作用，高剂量时(小鼠灌胃300-600mg/kg)诱导肿瘤细胞凋亡，对体内外黑色素瘤增殖有明显的抑制作用。此外，它不同于Pisha等报道的在桦树皮中提取的成分白桦酸，后者只对黑色素瘤有抑制作用而对其它肿瘤细胞没有作用。它对多种肿瘤细胞系如人胃癌SGC-7901细胞系、人卵巢癌A0细胞系、人白血病HL-60细胞系、人白血病K562细胞系、人宫颈癌Hela细胞系及小鼠腹水瘤S180细胞系等均有抑制作用。中国专利(申请号为03152904.6)还报道，它对肺癌、肝癌、脑神经胶质瘤、肠道肿瘤、艾滋病毒等均有抑制作用。但由于其抗癌作用机制还不明确，限制了其抗癌作用的发挥。

发明内容

本发明的目的是提供23-羟基白桦酸的一种新用途，23-羟基白桦酸在制备抑制血管生成的治疗和/或预防药物中的应用。

本发明发明人的研究表明，23-羟基白桦酸具有抑制血管生成的作用。因此本发明的技术方案是：23-羟基白桦酸在制备抑制血管生成的治疗和/或预防药物中的应用时，其有效剂量为3～50mg/kg体重/天。

需要的时候，在23-羟基白桦酸制备抑制血管生成的治疗和/或预防药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、乳化剂、渗透压调节剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。

本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂、乳剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明的研究表明，除了治疗和/或预防癌症，以23-羟基白桦酸为活性成分的抑制血管生成的治疗和/或预防药物，对于与血管生成有关的疾病如糖尿病、视网膜病变、早熟视网膜病、视网膜静脉闭塞、老年盘状斑变性、风湿性关节炎、银屑病、血管瘤、动脉粥样硬化等疾病具有确切的治疗和预防作用，同时对伤口愈合中的斑痕形成也有显著的抑制作用。

本发明的有益效果：本发明巧妙地以血管生成作为治疗疾病的靶点，具有以下优点：1、治疗针对已经启动的新生血管进行，具有特异性；2、由于血管内皮细胞暴露于血流中，药物直接发挥作用，故剂量小，疗效高，副作用小；3、由于内皮细胞基因表达相对稳定，故不易产生耐药性。

附图说明

图1 23-HBA对HMEC细胞体外增殖的抑制作用。

图2 23-HBA对HMEC细胞的形态学影响。

图3 23-HBA对HMEC细胞Matrigel体外小管形成的影响。

具体实施方式

实施例1：23-羟基白桦酸对人血管内皮细胞增殖的抑制作用。

1.1 23-羟基白桦酸(23-HBA)对人血管内皮细胞(HMEC)的体外增殖试验

将人血管内皮细胞(HMEC，法国国家卫生医学研究院惠赠)置于含1mmol-谷氨酰胺，1μg/mL氢化可的松，10ng/mL表皮生长因子(EGF)和15％小牛血清的MCDB-131培养液中培养(37℃、5％CO₂、95％湿度)。取对数生长期细胞，以10⁵cell/mL细胞接种于96孔板，100μL/孔，每组设4个平行孔，放置于37℃、5％湿化CO₂的培养箱过夜。加不同浓度(10～100μg/mL)的23-HBA，以溶媒二甲亚砜(DMSO)为阴性对照，培养48小时后，去掉上清液，每孔轻轻地加入10％三氯醋酸100μL固定，静置5min后移到4℃放置1h后倒掉固定液，用去离子水洗5次，空气干燥。每孔加入0.4％磺酰罗丹明B(SRB)100μL室温放置30min，用1％醋酸液洗5饮，加150μL 10mM Tris碱液(pH10.5)溶解，自动分光光度仪在531nm波长处测定每个小孔的吸光度值(A)。上述实验重复3次。抑制率(％)计算公式如下：

结果如图1所示，23-羟基白桦酸对人血管内皮细胞的增殖呈剂量依赖性抑制作用，其半数抑制量为40.44ug/mL。

1.2 23-HBA对HMEC细胞的形态学影响

24孔板中先加入玻璃片，再加对数生长期HMEC细胞，每孔2×10⁵个细胞，37℃、5％湿化CO₂培养24h。加入不同浓度(1～60μg/mL)的23-HBA处理72h，取出玻璃片，0.001M磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.4)洗涤，冷丙酮固定，HE染色，观察细胞的形态学改变并拍照。结果如图2所示：正常的细胞经染色仍然保持原有的生长形状，细胞核完整，染成均一蓝色或略带一点红色。加1μg/mL 23-HBA后，部分细胞开始凋亡，贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落，细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞核呈蓝黑色，胞浆呈淡红色或深红色，染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状。当23-HBA浓度提高到10μg/mL以上，HMEC细胞的凋亡现象更加明显。

实施例2：23-羟基白桦酸对人血管内皮细胞管形成能力的抑制作用。

2.1体外小管形成试验

4℃下于96孔培养板底部加入50μL生长减少型Matrigel，铺平后培养箱内37℃孵育4h，将23-HBA与15％小牛血清MCDB-131培养液和HMEC细胞(4×10⁴细胞/孔，每孔体积为0.25ml)混匀后加入培养板，23-HBA终浓度为1～60μg/mL，以溶媒为阴性对照。37℃、5％湿化CO₂培养24h后，应用倒置显微镜，观察23-HBA对内皮细胞体外构建血管的影响。结果可见23-HBA对HMEC细胞体外Matrigel小管形成有显著的抑制作用。23-HBA浓度为1μg/mL时，对HMEC细胞小管形成即有明显影响，不仅小管数目减少，而且管腔不完整；浓度为10μg/ml时，HMEC细胞贴壁后几乎无移动，根本无小管形成；在60μg/ml浓度下，细胞贴壁困难。23-HBA浓度为10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml和60μg/ml时4个实验组形成管腔的面积与对照组相比有明显差异(图3)。

2.2体内Matrigel plug法血管抑制试验

4℃下取液态Matrigel与不同浓度(1～200μg/mL)的23-HBA分别混合，取0.4mL注射入BALB/c小鼠的腋部皮下，4只小鼠为一组。7d后处死小鼠，取出Matrigel小包，10％中性福尔马林固定，包埋，切片，HE染色，显微镜下摄片，放大200倍，随机选取5个视野内迁移入Matrigel小包内皮细胞的数量。结果见表1。镜下观察23-HBA浓度高于1μg/mL时，可明显减少侵入Matrigel小包的内皮细胞数量，且随浓度的升高，细胞侵入的数目下降，与对照组相比，差异有显著性(P＜0.001)。

      表1  23-HBA对Matrigel小包内皮细胞数量的影响

药物浓度(μg/mL)	n	迁移细胞数
			正常对照组	5	502.98±31.93
1	5	350.00±32.00
			5	5	207.50±22.73
10	5	134.46±15.97
			50	5	80.02±14.72
100	5	18.20±4.71
			200	5	9.4±1.95

与对照组比较：P＜0.001

实施例3：23-羟基白桦酸对人血管内皮细胞迁移能力的抑制作用。

3.1抑制血管内皮细胞迁移试验

将24孔板呈60°倾斜，在每孔底部的1/2处加1％的琼脂糖，待凝固后用培养基洗涤，没有琼脂糖的一侧加HMEC细胞，每孔10⁵个细胞。细胞贴壁后分别加阴性对照和不同浓度(1～60μg/ml)的23-HBA，72h后用倒置显微镜记录每一组内皮细胞向另一半迁移的数量。结果显示，没有23-HBA干预组细胞的迁移数量较高，细胞迁移抑制率呈浓度依赖性，23-HBA可能通过抑制血管内皮细胞的迁移而抑制新生血管的生成(表2)。

表2  23-羟基白桦酸对血管内皮细胞迁移数的影响

药物浓度(μg/mL)	n	HMEC细胞迁移数
			正常对照组	4	289.8±25.4
1	4	61.5±12.9
			5	4	47.4±12.5
10	4	32.1±11.7
			20	4	26.6±9.2
40	4	12.3±5.6
			60	4	6.2±1.4

与对照组比较：P＜0.001

实施例4：荷瘤裸鼠体内试验。

人类结肠癌细胞系LoVo细胞，用PBS制成细胞悬液，以200万cell/200ul接种至8周大的BALB/cAnN-nu/nu裸鼠的右股部皮下。待瘤体生长至5mm×5mm大小时，随机分成两组，每组5只。23-羟基白桦酸用药组给药剂量为25mg/kg(药物以含10％DMSO的PBS溶液溶解)，对照组给含10％DMSO的PBS溶液200ul，连续给药60天，每天记录瘤体的长径和短径。用药期间，小鼠未出现不良反应。处死小鼠后，取出肿瘤，检测肿瘤的微血管密度。结果显示，用药组瘤体较对照组缩小，生长明显减慢，微血管密度明显低于对照组。说明该药具有体内抑制肿瘤的作用，而且副作用小。

实施例5：荷瘤裸鼠体内试验。

操作方法同实施例4。23-羟基白桦酸用药组给药剂量为3mg/kg，结果显示，用药组瘤体较对照组缩小，生长减慢，微血管密度低于对照组。说明该药具有体内抑制肿瘤的作用，而且副作用小。

实施例6：荷瘤裸鼠体内试验。

操作方法同实施例4。23-羟基白桦酸用药组给药剂量为50mg/kg，结果显示，用药组瘤体较对照组缩小，生长显著减慢，微血管密度显著低于对照组。说明该药具有体内抑制肿瘤的作用，而且副作用小。

Claims (10)

1、23-羟基白桦酸在制备抑制血管生成的治疗和/或预防药物中的应用，其特征在于：所述23-羟基白桦酸在抑制血管生成的药物中的有效剂量为3～50mg/Kg体重/天。

2、根据权利要求1所述的应用，其特征在于：在制备该抑制血管生成的药物中还可加入一种或多种药学上能接受的载体，此类载体为：包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、乳化剂、渗透压调节剂。

3、根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物能制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂或乳剂。

4、根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物为治疗和/或预防癌症的药物。

5、根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物为伤口愈合中抑制斑痕形成的药物。

6、根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物为治疗和/或预防糖尿病视网膜病、早熟视网膜病及视网膜静脉闭塞的药物。

7、根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物为治疗和/或预防老年盘状斑变性及风湿性关节炎的药物。

8、根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物为治疗和/或预防银屑病的药物。

9、根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物为治疗和/或预防血管瘤的药物。

10、根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物为治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物。

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