CN1666602A

CN1666602A - 建立sars相关冠状病毒小鼠模型的方法

Info

Publication number: CN1666602A
Application number: CN 200410012835
Authority: CN
Inventors: 宁琴; 罗小平; 严伟明; 朱传龙
Original assignee: Tongji Hospital Affiliated To Tongji Medical College Of Huazhong University Of Science & Technology
Current assignee: Tongji Hospital Affiliated To Tongji Medical College Of Huazhong University Of Science & Technology
Priority date: 2004-03-11
Filing date: 2004-03-11
Publication date: 2005-09-14

Abstract

本发明公开了一种建立SARS相关冠状病毒小鼠模型的方法。该方法选择10～1000pFu量的MHV－3病毒或MHV－A59病毒，通过呼吸道途径感染Balb/cJ近交系小鼠，并观察感染后小鼠的存活率、免疫器官脾、肝和肺脏等器官的组织学改变及病毒滴度变化，从而建立了类似人类严重急性呼吸综合征的小鼠模型，即SARS相关冠状病毒的小鼠模型。该模型的建立为系统地研究SARS疾病的病理学改变、分子免疫学发病机理、以及遗传调控因素提供了有力的工具。

Description

建立SARS相关冠状病毒小鼠模型的方法

技术领域

本发明涉及一种建立SARS相关冠状病毒小鼠模型的方法，用于医学科研人员模拟、研究和防治SARS疾病。

背景技术

SARS是近期在我国乃至世界范围内出现的一种新型传染病，我国称之为非典型性肺炎。从最初在广东佛山市第一例病例报道以来，截止2003年6月1日，不包括香港和台湾两个地区，我国共有12个省份报告有SARS病例发生，确诊病例达5328例，死亡332例。在世界范围内，发病地区涉及33个国家和地区，确诊病例为8360例，死亡764例。该疾病的传播速度之快，涉及范围之广，危害程度之大，使世界为之震惊。由于我国疫情尤为严重，SARS现已被列为I类传染病。

目前的病原学研究已初步证实SARS的致病病原体为冠状病毒科家族的新成员，其基因组及氨基酸序列分析都表明这是一种全新的冠状病毒，其编码聚合酶的基因序列与第二组冠状病毒中的牛和鼠冠状病毒最相近，人群因缺乏免疫力而普遍容易感染。

尽管SARS的病原体已经确定，但是有关病原学和发病机制、有效药物的筛选、疫苗的研制以及临床治疗等多个环节还有许多问题尚待阐明。以上大量的工作都依赖于动物模型的建立，因而建立模拟人类SARS病理改变的动物模型是SARS研究中的当务之急。军事科学院等单位已成功建立了SARS冠状病毒感染的细胞模型，但目前国内外尚无稳定、理想的动物模型，动物的选择问题是其瓶颈所在。

目前，研究SARS病毒的最佳模式动物是非人灵掌类动物，它们进化程度高，在分类学中与人类亲缘关系最近，所以在人类疾病研究方面有着不可替代的优越性。最早在2003年4月，荷兰鹿特丹Erasmus大学的学者根据郭霍法则，将分离到的SARS冠状病毒经鼻接种短尾猴，后者出现了典型的SARS症状，发生肺炎，且肺组织病理改变与人类SARS类似。此后在2003年7月，中国医学科学院动物研究所利用SARS冠状病毒经鼻接种15只恒河猴，其感染后出现的病理学改变、体液免疫应答和排毒现象也类似于人类SARS。但非人灵掌类动物来源稀少、价格昂贵、繁殖周期长、饲养管理困难，而且在SARS研究中其生物安全防护要求达到BSL-4级水平，即实验室硬件要求极高，严重限制了该模型的普及和应用。

科学家们仍力图寻找一种更经济、更易获取的模式动物来替代上述模型，但因为冠状病毒具有高度的种属特异性，故动物模型的寻找则更为困难，例如中国疾病预防控制中心的研究人员曾尝试建立乳鼠的SARS模型，但未取得满意的结果。同时科学家发现在香港的一些SARS感染居民家中的宠物猫身上携带有SARS病毒，因此包括美国疾病预防控制中心在内的一些研究单位正在利用猫进行SARS病毒的研究，尽管猫对机械化学刺激的敏感性利于呼吸道疾病模型的建立，但该动物集体饲养繁殖较为困难，且发情期易出现心理变态，可操作性差。另有报道加拿大温尼伯国家微生物实验室的研究人员检测到猪和鸡也会受到SARS病毒的感染，但前者体型较大，不利于实验处理，后者在解剖学上与人类差距甚远，且遗传背景资料的不清晰同样限制了它们在SARS机制方面的研究。

在SARS动物模型的选择上遭遇了重重困难之后，军事医学科学院微生物流行病研究所准备利用转基因技术将人对SARS病毒敏感的基因转入实验小鼠，这样实验小鼠就会像人一样对SARS病毒具有敏感性，这种思路或许是突破SARS模型瓶颈的一个好办法，但仅仅是敏感基因的寻找可能就是一个漫长的过程。

发明内容

本发明的目的就是要克服现有SARS动物模型的局限性，提供一种建立SARS相关冠状病毒小鼠模型的方法，从而得到类似于人类SARS的病毒性肺炎小鼠模型，用该方法建立的小鼠模型成本低廉、易于复制、重复性好、临床症状明显，可以复制出与人类SARS相似的感染特征，且可以避开大型动物模型研究SARS病毒所面临的危险性高、周期长、对实验条件要求苛刻等缺陷。

为实现此目的，本发明通过深入研究和大量的实验发现，利用单一的鼠肝炎3型病毒(MHV-3病毒)、或鼠肝炎A59型病毒(MHV-A59病毒)，通过呼吸道途径感染近交系Balb/cJ小鼠，可以得到类似于人类SARS感染的模式。由此经过严格的筛选，本发明提出一种建立SARS相关冠状病毒小鼠模型的方法，该方法包括以下步骤：

1)实验动物的准备：选择若干组Balb/cJ近交系小鼠，饲养备用；

2)感染病毒的准备：选择纯化的MHV-3病毒或MHV-A59病毒备用；

3)麻醉剂的准备：选择一种适合于Balb/cJ近交系小鼠的麻醉剂备用；

4)实验动物的感染：用步骤3)所选择的麻醉剂麻醉步骤1)所选择的各组Balb/cJ近交系小鼠，并用步骤2)所选择的MHV-3病毒或MHV-A59病毒对其进行呼吸道感染，继续饲养；

5)感染动物的处理：观察经步骤4)感染后的各组Balb/cJ近交系小鼠的存活率，收集各组Balb/cJ近交系小鼠的脏器，观察其组织学变化，并测定其脏器中MHV-3病毒或MHV-A59病毒的滴度变化。

经本发明方法处理的小鼠在24～48小时开始出现毛发竖直、粘连、行走困难、不食等现象，肺脏病理切片见部分肺泡结构严重破坏，肺泡腔大量红细胞，肺泡间隔水肿，大量炎性细胞浸润，100％小鼠于5天内死亡，并在其肺脏、肝脏、脾脏等多处脏器中发现有MHV-3病毒或MHV-A59病毒复制，由此获得类似于人类SARS相关冠状病毒的小鼠模型。

采用本发明方法所建立的SARS相关冠状病毒小鼠模型具有如下优点：

其一，本发明所建立的小鼠模型重复性好，遗传背景清晰，使系统性、动态性研究病毒性肺炎的遗传控制因素及分子生物学、分子免疫学发病机理成为可能。

其二，所选择的MHV-3病毒或MHV-A59病毒易于体内、体外培养，所建模型的成本相对低廉，且已有序列证实MHV-3病毒或MHV-A59病毒所属的II类冠状病毒与SARS冠状病毒在基因序列上同源性最大，故该模型领域中成功的科研经验将对SARS的基础研究和防治具有更大的借鉴意义。

其三，该小鼠模型从病毒的感染方式到感染后体内组织器官的病理改变都类似于人类SARS，从而可为SARS发病机制、药物、疫苗等研究提供关键性的平台。

附图说明

附图为一组MHV-3病毒呼吸道感染的Balb/cJ小鼠和其生理盐水对照组的Balb/cJ小鼠的生存曲线图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述：

实施例1：本发明所提出的建立SARS相关冠状病毒小鼠模型的方法，包括以下步骤：

1)实验动物的准备：以10只为一组，选择若干组Balb/cJ近交系雌性小鼠，在动物繁育实验室饲养备用。上述各组近交系雌性小鼠的年龄在6～8周龄的范围内较好，因该龄范围的小鼠感染MHV-3病毒后所反映出的症状非常稳定，易于模拟人类的SARS感染情况。上述各组近交系雌性小鼠的动物级别应为清洁级，以防止其他污染对所建模型的干扰和影响，确保模型的准确性。将上述各组近交系雌性小鼠置于无菌过滤空气鼠笼内，控制笼内温度为22℃，12小时光照/黑暗交替进行，供给优质饲料和水，饲养一周，使其适应实验室新的生活环境，即可用于SARS相关冠状病毒小鼠模型的建立。

2)病毒滴度测定细胞的准备：选择L2细胞，该细胞系购自美国模式培养物保藏所(ATCC)，在含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养至对数生长期备用。

3)感染病毒的准备：选择MHV-3病毒，此病毒也从美国模式培养物保藏所(ATCC)购置。将购置到的MHV-3病毒在DBT细胞系空斑纯化后，于17cL细胞系繁殖培养，L2细胞系滴度定量后，即可用于感染上述Balb/cJ近交系雌性小鼠。本实施例中所用MHV-3病毒的滴度为10⁶pFu/ml。

4)麻醉剂的准备：选择乌拉坦作为Balb/cJ近交系雌性小鼠的麻醉剂，其浓度为0.2g/ml。

5)实验动物的麻醉：按1g麻醉剂/1kg小鼠体重的用量，将上述乌拉坦通过30号针头对上述Balb/cJ近交系雌性小鼠的中下腹壁行腹腔内注射麻醉。

6)实验动物的感染：采用呼吸道注射感染方式，将每只Balb/cJ近交系雌性小鼠的颈部气管钝性分离后，通过微量加样器针头直接将上述MHV-3病毒注入其中，以确保每只小鼠都能更为快捷、有效地感染上MHV-3病毒。每只小鼠体内注入的MHV-3病毒量在10～1000pFu(病毒噬斑形成单位)的范围内都能有效地体现出感染的症状，一般具体操作时注入的MHV-3病毒量在50～100pFu的范围内即可，这样在保证小鼠能有效感染的前提下，可尽量节约病毒用量。本实施例中每只小鼠体内只注入100pFu(2ul体积)的MHV-3病毒。同时设立等体积生理盐水对照组。注射后的Balb/cJ近交系雌性小鼠继续在无菌过滤空气鼠笼内饲养。

7)感染动物的处理：

(1)观察感染后的一组Balb/cJ近交系雌性小鼠的存活率，其结果为：10只Balb/cJ近交系雌性小鼠于病毒感染后24小时开始出现毛发竖直、粘连、行走困难、不食等现象，第5天全部死亡，死亡率达100％；而其生理盐水对照组的Balb/cJ近交系雌性小鼠全部存活。两组Balb/cJ小鼠的生存曲线见附图，图中横坐标为小鼠感染病毒后的天数，纵坐标为小鼠的存活数，生理盐水对照组的生存曲线用含有菱形驻点的直线段表示，100pFu MHV-3病毒量感染组的生存曲线用含有正方形驻点的折线段表示。其它各感染组和生理盐水对照组的情况基本相同。

(2)收集感染后的Balb/cJ近交系雌性小鼠的肺脏、肝脏等组织器官，观察其组织学改变。其方法是在小鼠感染MHV-3病毒后，分别设立1天、2天、3天、4天的时间点，收集小鼠的脏器，同时收集生理盐水组小鼠的脏器作为对照，制作成厚度为4um的组织石蜡切片，苏木素、伊红染色后镜下观察。结果可见：

a)肺脏：大体解剖：感染后24小时肺脏表面可见有出血和萎缩，并随感染时间的延长呈进行性加重。组织病理学：感染后24小时可见部分肺泡结构破坏，肺泡腔大量红细胞、肺泡间隔水肿、大量炎性细胞浸润；至感染后48小时，肺炎更加明显，肺间质毛细血管高度扩张充血，有大量淋巴细胞和巨噬细胞浸润，肺泡间隔增宽，挤压肺泡腔变窄，重度炎症部位见肺泡腔内充满红细胞和少量肺泡上皮细胞脱落，肺组织结构破坏，相邻的肺泡代偿性肺气肿，多个肺泡腔破裂，融合成一个大腔，即Balb/cJ近交系雌性小鼠的肺脏组织病变随着时间的推移进行性加重。

b)肝脏：大体解剖：感染后48～72小时肝脏轻度肿大，表面可见明显出血点。组织病理学：肝小叶结构基本完整，肝组织仅存在轻度炎性细胞浸润，伴有小血管点灶状出血，无明显肝细胞坏死，与Balb/cJ近交系小鼠经腹腔感染MHV-3病毒诱导暴发性肝炎之肝组织病理改变有明显差异，说明MHV-3病毒经呼吸道感染Balb/cJ小鼠后致其死亡的主要病变在肺组织，与SARS感染接近。

c)其余脏器：大体未见明显变化。

(3)收集感染后的Balb/cJ近交系雌性小鼠的肺脏、肝脏等组织器官，观察其中MHV-3病毒的滴度变化。其方法是：

a)在小鼠感染MHV-3病毒后，分别设立1天、2天、3天、4天的时间点，收集小鼠的脏器，包括肺脏、肝脏、心脏、脾脏、肾脏、小肠、脑，保存于-80℃的环境中备用。

b)L2细胞培养：从T75培养瓶内收集细胞，按约2×10⁵个/ml浓度悬浮于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，转移至6孔培养板(每孔含2ml)，置温度为37℃、5％CO₂的培养箱中培养2～3天，至汇合率达90％。

c)将纯化的病毒在含4％胎牛血清的DMEM培养基中进行梯度稀释。

d)弃去L2细胞陈旧培养基，用0.1mol/L、pH值7.0的PBS清洗两遍后，将稀释好的病毒悬液(200ul)均匀铺于细胞层上。于室温下无菌操作台内每10～15分钟水平向混合，共3次，使病毒与细胞充分接触。每一稀释度做3个复孔。

e)将预热至64℃、浓度为0.04g/ml的琼脂糖凝胶(液体状)置37℃的水浴箱半小时，使其温度回复到37℃，取出后迅速与含4％胎牛血清的DMEM按1∶1比例混合，按每孔2ml量均匀铺盖于被病毒感染的细胞层上，37℃、5％CO₂的培养箱中继续培养。

f)24小时后取出细胞，可见透明空斑，挑出上层琼脂糖-培养基后，用结晶紫染色后即可计数病毒空斑数，折合稀释比例，三孔均数即得出病毒滴度。

结果可见：感染后收集的各脏器中均发现有MHV-3病毒复制，其中肺脏、脾脏、肝脏、小肠中的MHV-3病毒复制出现早(＜24小时)，且病毒滴度高(至96小时均可达到10⁵～10⁷pFu/ml)，心脏、肾脏、脑组织中病毒复制较晚(24以后)，病毒滴度较低(96小时约达到10³pFu/ml)。

由上可知：利用单一的MHV-3病毒通过呼吸道感染近交系Balb/cJ小鼠，可以得到类似于人类SARS感染的模式，从而可建立类似人类严重急性呼吸综合征SARS的小鼠模型。

实施例2：仅用MHV-A59病毒取代实施例1中的MHV-3病毒，其它操作过程完全与实施例1中一样，最终所得到的结果也基本相同，与此不再赘述。

Claims

1.一种建立SARS相关冠状病毒小鼠模型的方法，包括以下步骤：

2)感染病毒的准备：选择纯化的MHV-3病毒或MHV-A59病毒备用；

5)感染动物的处理：观察经步骤4)感染后的各组Balb/cJ近交系小鼠的存活率，收集各组Balb/cJ近交系小鼠的脏器，观察其组织学变化，并测定其脏器中MHV-3病毒或MHV-A59病毒的滴度变化，即可获得类似于人类SARS相关冠状病毒的小鼠模型。

2.根据权利要求1所述的建立SARS相关冠状病毒小鼠模型的方法，其特征在于：所说的步骤1)中选择的各组近交系小鼠的年龄为6～8周龄，动物级别为清洁级，在无菌过滤空气鼠笼内饲养。

3.根据权利要求1或2所述的建立SARS相关冠状病毒小鼠模型的方法，其特征在于：所说的步骤4)中每只Balb/cJ近交系小鼠感染的MHV-3病毒或MHV-A59病毒量为10～1000pFu。

4.根据权利要求1或2所述的建立SARS相关冠状病毒小鼠模型的方法，其特征在于：所说的步骤4)中每只Balb/cJ近交系小鼠感染的MHV-3病毒或MHV-A59病毒量为50～100pFu。

5.根据权利要求1或2所述的建立SARS相关冠状病毒小鼠模型的方法，其特征在于：所说的步骤4)中采用呼吸道注射感染方式，将每只Balb/cJ近交系小鼠的颈部气管钝性分离后，通过微量加样器针头直接将MHV-3病毒或MHV-A59病毒注入其中。

6.根据权利要求3所述的建立SARS相关冠状病毒小鼠模型的方法，其特征在于：所说的步骤4)中采用呼吸道注射感染方式，将每只Balb/cJ近交系小鼠的颈部气管钝性分离后，通过微量加样器针头直接将MHV-3病毒或MHV-A59病毒注入其中。

7.根据权利要求4所述的建立SARS相关冠状病毒小鼠模型的方法，其特征在于：所说的步骤4)中采用呼吸道注射感染方式，将每只Balb/cJ近交系小鼠的颈部气管钝性分离后，通过微量加样器针头直接将MHV-3病毒或MHV-A59病毒注入其中。