CN1654667A - 减毒hsv－1基因治疗载体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新的减毒HSV－1基因治疗载体。本发明还涉及所述新的减毒HSV－1基因治疗载体的制备方法和用途以及一种含有该治疗载体的药物组合物。
Description
技术领域
本发明涉及一种适用于中国(亚洲)人群的基因治疗载体。该载体所用的病毒株是单纯疱疹病毒(HSV-1)I型，即野生型人类HSV-1基因组，或已有的HSV-1型17+株(ECCACC：X14112)中删除了ICP34.5，ICP6及ICP47，经过基因重组技术，构建的减毒HSV-1基因治疗载体。本发明还涉及所述减毒HSV-1基因治疗载体的制备方法和用途。
背景技术
目前世界上常用的HSV-1载体大多是欧美实验室用的野生型HSV-1病毒株(17+株或F株)所构建。这些病毒株已在各实验室经过近二十年的无数次传代。另外，分子生物学研究表明，感染亚洲(包括中国)，欧美，及非洲人种的HSV-1病毒，具有不同的亚型(见J.Gen，Virol.，P513-527，75，1994)。用感染欧美人群的HSV-1病毒所开发的载体对亚洲人群难以产生相同的功效。本载体是用从中国人患者口腔所分离的野生单纯疱疹病毒I型(HSV-1型)，经基因重组技术构建而成。该临床分离的野生型(HSV-1型)与数据库所记载的HSV-1 17+株具有非常类似的限制性内切酶分解模式。HSV-1 17+株的DNA序列在NCBI中的ID：NC_001806。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种新的减毒HSV-1基因治疗载体。
本发明的另一个目的是提供一种减毒HSV-1基因治疗载体的制备方法。
本发明目的还在于提供一种含减毒HSV-1基因治疗载体的药物组合物。
本发明目的还在于提供一种减毒HSV-1基因治疗载体在肿瘤的基因治疗中的应用。
一方面，本发明提供一种新的减毒HSV-1基因治疗载体。该减毒HSV-1基因治疗载体，其序列为在野生型人类HSV-1基因组中删除了ICP34.5，ICP6及ICP47，并在原ICP34.5位置插入人类GMCSF基因，并引入了WPRE片段以增加GMCSF的表达所示。已知的人类HSV-1基因的Genbank登记号GI：9629378。
本发明另一个方面提供一种药物组合物，其含有本发明的减毒HSV-1基因治疗载体和必要时的药物可接受的载体或赋形剂。本发明的减毒HSV-1基因治疗载体可以与药物可接受的赋形剂或载体结合形成药物组合物。药物可接受的载体或赋形剂指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、包囊材料或其他制剂辅料，例如，包括但不限于盐水、缓冲盐液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其混合物。所述药物组合物适于胃肠外、舌下、脑池内、阴道内、腹膜内、直肠内、颊内、肿瘤内或表皮给药。
胃肠外给药包括静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下、关节内注射和输注。适于胃肠外给药的药物组合物包括无菌水溶液或非水溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于在临使用前在无菌可注射溶液或分散液中配制的粉末。适宜的水性或非水性载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、甘油、内二醇、聚乙二醇、羧甲基纤维素、植物油和可注射的有机酯如油酸乙酯。这些组合物还可以含有防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂等佐剂。加入等渗剂如糖类、氯化钠等可能是有利的。
表皮给药包括在皮肤、黏膜上以及在肺和眼表面给药。这样的药物组合物包括粉剂、软膏、滴剂、透皮贴剂、离子电渗疗法装置以及吸入剂等。
直肠或阴道给药的组合物优选为栓剂，它可以通过将本发明的载体与适宜的非刺激性赋形剂或载体如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡混合制备，所述赋形剂或载体在室温为固态，在体温下为液态，因此在直肠或阴道腔内熔化并释放出活性化合物。
当以上述或其他方式进行治疗时，治疗有效量的本发明减毒HSV-1基因治疗载体可以是本发明减毒HSV-1基因治疗载体的单独形式，使用或不使用药物可接受的赋形剂。治疗有效量指以适宜的治疗方式对治疗肿瘤有效的本发明减毒HSV-1基因治疗载体的量。对任何特定患者的具体治疗有效剂量取决于许多因素，包括所治疗的疾病和气其严重程度；所用减毒HSV-1基因治疗载体的活性；所用的特定组合物；患者的年龄、体重、性别、饮食和一般健康状况；给药时间；给药途径；减毒HSV-1基因治疗载体的排泄速度；治疗的持续时间联合或同时服用的其他药物等。
在本发明的大量实验的基础上，本发明进一步提供了本发明的减毒HSV-1基因治疗载体在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明所构建的基因治疗载体，是从野生型的HSV-1中删除了ICP6，ICP47及r34.5(ICP34.5)基因，然后在载体的基因组中插入人类GMCSF基因(hGMCSF)。在GM-CSF基因后，加上WPRE(Woodchuckhepatitispost-regulationElement).WPRE能提高GM-CSF的表达量。构建后的基因治疗载体HSV-1ΔICP6hGM-CSF-WPREΔICP34.5ΔICP47的基因组，如图1所示。
本发明的减毒HSV-1基因治疗载体，其特征在于，该载体在临床分离的单纯疱疹病毒I型病毒基因组中，删除了ICP34.5，ICP6及ICP47基因，并在原ICP34.5的部位插入了由hCMV的IE(ImmediateEarly，最早期)启动子引导的人类GM-CSF(Graulocyte Macrophage Colony Stimulating Fator粒细胞巨噬细胞刺激因子)基因，并引入了WPRE片段得到。
本发明所采用的病毒株为从中国患者口腔中分离出的单纯疱疹病(HSV-1)I型，它与已有的HSV-1型17+株(ECCACC：X14112)可以通用互换。
本发明的载体的具体构建方法：
HSV-1病毒因其基因组庞大(150kb)，难以用单纯的限制性内切酶分解的方法进行基因组的重组构建，多采用同源重组的技术从基因组中删除某一基因或在特定的部位插入外源性基因。这一技术要求先构建一个质粒，这一质粒中包含有一段特定的HSV-1DNA片段，外源性基因则进HSV-1DNA片段中间，将这一质粒与全长的HSV-1病毒DNA一起转染细胞。全长的HSV-1病毒DNA在细胞中开始增殖，这样质粒DNA与病毒基因组之间发生同源重组，外源基因即重组入HSV-1基因组质粒中包含特定HSV-1DNA片段相同的部位。(见图2)。
如上所述，本发明人从野生型HSV-1病毒基因组中，先后删除ICP34.5，ICP6及ICP47基因，并在原ICP34.5的部位插入由hCMV的IE启动子引导的人类GM-CSF基因，并引入WPRE片段来增强GM-CSF在载体中的表达。
药效学实验
用108pfu(病毒斑形成单位)减毒后的本载体注入小鼠腹腔，对小鼠的生命体征无影响；而103pfu野生型HSV-1注入后则是致命的。
为进一步证明减毒效果，30只Balb/c小鼠被分成两组，实验组与对照组各15只Balb/c小鼠，实验组每天注射100微升1×108pfu/ml减毒后的本载体至小鼠背侧皮下，共注射5天；对照组注射生理盐水。一月内观察小鼠体重(克)变化情况如下：
体重 注射前 注射后1周 2周 3周 4周
对照组 21.1±0.8 21.9±1.0 22.6±0.9 23.3±0.8 24.2±0.7
实验组 21.3±1.1 22.1±0.7 22.9±0.6 23.5±0.7 24.4±0.7
连续5天较大剂量皮下注射本减毒HSV-1载体，对小鼠体重无影响。
用美国CHEMICON公司生产的ELISA Kit(Cat.no.CYT210)进行检测GMCSF的表达发现WPRE的引入能使GMCSF表达量提高2-3倍.
肿瘤基因治疗动物实验方法及结果：
1.体外培养并收获不同的小鼠肿瘤细胞，如乳腺肿瘤细胞，黑色素瘤细胞，淋巴瘤细胞，肺癌细胞等；
2.将小鼠肿瘤细胞悬浮液注入小鼠左侧后背皮下，注入量为104个细胞，经注射，在注射点部位形成皮下小丘；
3.肿瘤细胞注入2-3周后，小鼠左侧后背可长出0.5厘米左右肿瘤肿块；此时，将小鼠分成2组：对照组与实验组，每组10只动物；
4.在对照组小鼠肿瘤内注射0.5毫升生理盐水；在实验组肿瘤内注射108pfu/0.5毫升HSV-I基因治疗药物，注意应多方向注射，隔天注射一次，共注射三次。
5.每周测量一次肿瘤大小，并记录肿块的平均直径；
6.结果显示，对照组的小鼠，其肿瘤肿块持续生长，四周后可达到1.5厘米以上。而实验组中，肿块则不断缩小，注射4周后，80％小鼠的肿块消失，其余小鼠的肿块均显著缩小。(见动物实验图)
病理检查显示，实验组小鼠肿瘤周围的正常组织细胞不受影响。
实验表明本载体对多种肿瘤有良好效果，见下表。
使用本减毒载体后、肿瘤肿块大小的变化如下：(直径毫米)
1).在BHK(ECACC no.85011433)细胞中生长HSV-1病毒。细胞培养液为在DMEM基础液中加入10％牛胎血清，1％青链霉素。共生长5个175cm2培养瓶，370℃，5％CO2孵化。
2).培养孵化48h后，将细胞及上清液一起收获(含有大量HSV-1病毒)，高速离心12000转/分，2h，40C条件下，用Beckman JA14离心机。
3).去掉上清液，在离心沉积物中加入15毫升蛋白水解酶K缓冲液，摇匀沉积物后，一起转移到一个50毫升的Falcon试管中。
4).加入蛋白水解酶K，使其最终浓度为50微克/毫升，再将该试管置于370C摇床，以200转/分摇12h(过夜)。这时溶液带有轻度粘稠状态，已不可见沉积物。
5).加入10毫升双蒸水，总容量达25毫升。然后加入等容量(25毫升)的Phenol∶Chloroform∶IAA(25∶24∶1)。轻摇混合10分钟。
6).将混合液等分在两个Beckman离心试管中，离心15000转/分，共20分钟。用SW41型号离心盘。
7).这时可见混合液被分成三段，上段为相对清亮含病毒DNA部分，中段为蛋白质部分，下段为Phenol∶Chloroform∶IAA，轻摇混匀10分钟。
8).重复步骤6)-7)直到中段蛋白质层消失。一般需要重复三次。
9).将清亮的上段液层转入到一个新的50毫升Falcon试管中，加入等量的Chloroform∶IAA(24∶1)，轻摇混匀5分钟。
10).用实验台离心机离心，2000转/分，10分钟，将上清液转入一个新的50毫升Falcon试管中。
11).在上述试管中沿试管壁缓缓加入2倍容积的无水乙醇，可见乙醇与原上清液之间的界面。
12).轻轻作圆周运动摇动试管，可见病毒DNA(包括一些细胞DNA)沉淀开始出现在溶液界面。完全混匀后，离心3000转/分，5分钟。
13).倒掉上清液，用70％乙醇清洗离心沉淀(DNA)。倒掉乙醇后，将装有DNA的Falcon试管置于无菌操作箱中过夜，干燥DNA。
14).加入300微升双蒸水，溶解DNA。分装后保存在-200℃备用。
(2)构建含有ICP34.5FlankingRegion的质粒：
图5为如何在ICP34.5FlankingRegion中插入人类GMCSF基因并引入WPRE片段。
图6显示经DNA同源重组从而在HSV-1基因组中插入人类GMCSF基因并引入WPRE片段。
图7为ICP6 Flanking Region克隆入pBlueScript质粒中。
图8为pGEMT-MMLVEGFP质粒片段。
图9为pBSΔICP6EGFP质粒。
图10为删除了ICP34.5和ICP6基因的HSV-1基因组示意图。
图11为ICP47 Flanking Region克隆入pBlueScript质粒中。
图12为最终所得的减毒HSV-1基因治疗载体基因组示意图。
图13为HSV-1不同株的限制性内切酶水解模式，所用的限制性内切酶分别为EcoR1，Nco1，Not1和Xho1。分析的样本有：1.本案所用的临床分离的野生型HSV-1；2.实验室常用的HSV-1 17+株；3.HSV-2型，HG52株；4.HSV-1ΔICP34.5CMVhGMCSF；5.HSV-1ΔICP34.5CMVEGFP；6.17+ΔICP34.5CMVEGFP。请注意比较样本1与样本2。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例：
1.从野生型HSV-1中删除ICP34.5基因，构建HSV-1ΔICP34.5。
(1)在BHK细胞中生长野生型HSV-1单纯疱疹病毒，用苯酚提取法提取全长HSV-1病毒DNA。
苯酚提取法全长HSV-1病毒DNA方法：
所需予准备的溶液：
a.蛋白水解酶K缓冲液：0.01M Tris pH8，0.005M EDTA，0.5％SDS.
b.Tris平衡的phenol(酚)∶Chloroform(氯仿)∶IAA(25∶24∶1)
实验步骤：
1).在BHK(ECACC no.85011433)细胞中生长HSV-1病毒。细胞培养液为在DMEM基础液中加入10％牛胎血清，1％青链霉素。共生长5个175cm2培养瓶，370℃，5％CO2孵化。
2).培养孵化48h后，将细胞及上清液一起收获(含有大量HSV-1病毒)，高速离心12000转/分，2h，40C条件下，用Beckman JA14离心机。
3).去掉上清液，在离心沉积物中加入15毫升蛋白水解酶K缓冲液，摇匀沉积物后，一起转移到一个50毫升的Falcon试管中。
4).加入蛋白水解酶K，使其最终浓度为50微克/毫升，再将该试管置于370C摇床，以200转/分摇12h(过夜)。这时溶液带有轻度粘稠状态，已不可见沉积物。
5).加入10毫升双蒸水，总容量达25毫升。然后加入等容量(25毫升)的Phenol∶Chloroform∶IAA(25∶24∶1)。轻摇混合10分钟。
6).将混合液等分在两个Beckman离心试管中，离心15000转/分，共20分钟。用SW41型号离心盘。
7).这时可见混合液被分成三段，上段为相对清亮含病毒DNA部分，中段为蛋白质部分，下段为Phenol∶Chloroform∶IAA，轻摇混匀10分钟。
8).重复步骤6)-7)直到中段蛋白质层消失。一般需要重复三次。
9).将清亮的上段液层转入到一个新的50毫升Falcon试管中，加入等量的Chloroform∶IAA(24∶1)，轻摇混匀5分钟。
10).用实验台离心机离心，2000转/分，10分钟，将上清液转入一个新的50毫升Falcon试管中。
11).在上述试管中沿试管壁缓缓加入2倍容积的无水乙醇，可见乙醇与原上清液之间的界面。
12).轻轻作圆周运动摇动试管，可见病毒DNA(包括一些细胞DNA)沉淀开始出现在溶液界面。完全混匀后，离心3000转/分，5分钟。
13).倒掉上清液，用70％乙醇清洗离心沉淀(DNA)。倒掉乙醇后，将装有DNA的Falcon试管置于无菌操作箱中过夜，干燥DNA。
14).加入300微升双蒸水，溶解DNA。分装后保存在-200℃备用。
(2)构建含有ICP34.5FlankingRegion的质粒：
将包含有ICP34.5基因(nt123462-126790，NC_001806)的HSV-1DNA片段(Sau3A片段)插入质粒pSP72的BglII位点。编码ICP34.5基因的NotI的片段(nt124948-125713)经由NotI限制内切后删除(psp72ΔICP34.5)。表达绿色荧光蛋白的标记基因EGFP由人类CMV病毒的IE启动子所控制(其polyA信号来自于bGHpolyA)。共同克隆进pSP72ΔICP34.5的NotI位点，得到pSP72ΔICP34.5CMVEGFPpA。(见图3)。
(3)构建删除ICP34.5基因的HSV-1病毒株：HSV-1ΔICP34.5
将纯化提取的全长HSV-1病毒DNA与pSP72ΔICP34.5hCMVEGFP共同转染BHK细胞。
共同转染病毒DNA与质粒DNA
所需予准备的溶液和细胞：
a.2M CaCl2(室温保存)
b.病毒DNA，1毫克/毫升，苯酚提取法所制备(见上)。
a.Hepes转染缓冲液，140mM NaCl，5mM KCl，0.75mM Na2HPO4，5.5mMD-glucose，20mM Hepes，pH 7.05。
b.质粒DNA5毫克/毫升。
c.6孔培养板上有80％密度生长的BHK细胞。
实验步骤：
1).取两个无菌eppendorf试管，在其中一个里加入400微升Hepes转染缓冲液。
2).在另外一个试管中31微升2M CaCl2，20微升病毒DNA，1微升质粒DNA。轻轻混匀后，用移液器将其缓慢加入到400微升Hepes缓冲液中。
3).轻轻混匀后，于室温下静置40分钟。
4).40分钟后在6孔培养板中吸去BHK细胞的培养液，将上述转染混合液缓慢加入培养板中，每一孔对应一个转染混合液，然后在370C孵化箱中放置30分钟。
5).30分钟后在每孔中直接加入1毫升细胞培养液，然后再将细胞培养板放回370C孵化箱中，孵育7小时。
6).取8毫升Hepes缓冲液，加入2毫升DMSO，将得到的20％DMSO缓冲液置于冰上冷却。
7).7小时后，移去细胞培养板中所有培养液，并用1毫升新鲜培养液清洗细胞两次。
8).每孔中加入1毫升20％DMSO缓冲液，室温下放置90秒。
9).迅速移去20％DMSO缓冲液，用新鲜培养液清洗细胞两次。
10).每孔中加入2毫升新鲜细胞培养液，置于37℃，5％CO2孵化箱。4天后即可收获，这时已可见病毒斑。
11).准备好BHK细胞100％生长的6孔培养板，每孔加入10或100微升收获液。培养2天后，根据需要，在显微镜直视下，用20微升移液器提取带有绿色荧光的或无色的病毒斑。
表达有绿色荧光EGFP的病毒斑，即为删除了ICP34.5基因的HSV-1病毒株(见图4)。分次提取绿色荧光病毒斑，纯化HSV-1ΔICP34.5hCMVEGFP病毒株后，用苯酚提取法，提取该病毒的全长DNA。
2.插入人类GM-CSF基因，构建HSV-1ΔICP34.5/hGMCSFWPRE
(1)首先设计引物，从人类肺cDNA库中PCR扩增hGMCSF基因。
正引物CTGAAGCTTATGTGGCTGCAGAGCCTGCTG
反引物TGGCTCGAGTCACTCCTGGACTGGCTCCCA
将PCR产品克隆入pGEM-T克隆质粒中，得到质粒pGEMT-hGMCSF。该质粒经DNA序列测定确认为hGMCSF基因。
用HindIII和XhoI一起从pGEMT-hGMCSF中分解出hGMCSF，将hGMCSF克隆入pSP72ΔICP34.5CMVEGFP的HindIII/xhoI位点中，以hGMCSF替换EGFP基因，得到新的质粒pSP72ΔICP34.5CMhGMCSF
(2)引入WPRE片段(Woodchuck肝炎病毒转录后调节因子)
WPRE能稳定RNA，并帮助mRNA从胞核进入胞浆，从而提高该基因的表达水平。WPRE片段(GenBankNo.J04514，nt1093-1684)用PCR扩增后，插入pSP72ΔICP34.5CMVhGMCSF的XhoI位点(见图5)，得到质粒pSP72ΔICP34.5CMVhGMCSF/WPRE
(3)将纯化提取的全长HSV-1ΔICP34.5hCMVEGFP病毒DNA(方法同上)与质粒DNApsp72ΔICP34.5hCMVhGMCSFWPRE共同转染BHK细胞(方法同上)，不表达绿色荧光的病毒斑表示原病毒中的EGFP基因由hGMSCF基因经重组而替代，纯化及生长HSV-1ΔICP34.5hCMVhGMCSFWPRE病毒载体，提取该载体全长DNA以备后用(见图6)。
3.删除ICP6基因，构建HSV-1ΔICP34.5GMCSFWPREΔICP6病毒载体
(1)构建pΔICP6质粒。
ICP6基因(UL39)的产品能使HSV-1病毒在非增殖性细胞中繁殖而产生细胞毒性作用。从HSV-1病毒载体中删除ICP6基因，使该载体具有更高的安全性。ICP6基因在HSV-1基因组中位于nt86444-89857。为删除ICP6基因，特设计并经PCR从HSV-1DNA中扩增得到其上游及下游的FlankingRegions：上游(U/S)84859-86119；下游(D/S)90960-92579。将PCR扩增所得的上述两个DNA片段克隆入pBlueScript质粒中，得到pBSΔICP6质粒(见图7)。
(2)在原来已构建的下列质粒中(见图8)，用SalI和XhoI分解出MMLV-EGFP-SPA片段，插入pBSΔICP6的pstI位点，即得到pBSΔICP6EGFP质粒(见图9)。
(3)将前面所纯化的HSV-1ΔICP34.5hGMCSFWPRE全长病毒的DNA与pBSΔICP6EGFP质粒DNA一起共同转染BHK细胞，挑选并纯化表达有绿色荧光的病毒斑，所得到的病毒载体即为HSV-1ΔICP34.5hGMCSFWPREΔICP6EGFP。生长并提取该载体全长DNA。
(4)将所纯化的HSV-1ΔICP34.5hGMCSFWPREΔICP6EGFP全长病毒DNA与pBSΔICP6质粒DNA一起共同转染BHK细胞，不表达绿色荧光的病毒斑即表示原病毒载体中的EGFP基因经重组后删除，从而得到病毒载体HSV-1ΔICP34.5hGMCSFWPREΔICP6(见图10)，生长并提取该载体全长DNA。
4.删除ICP47基因，构建HSV-1ΔICP34.5GMCSFWPREΔICP6ΔICP47病毒载体。
(1)构建ΔICP47质粒
HSV-1的ICP47基因产物与抗原处理相关的转运子(TAP1和TAP2)相作用，阻断经MHCI分子的抗原处理过程，从病毒载体中删除ICP47基因能提高被载体感染细胞的抗原处理过程，从而增强对被感染细胞的免疫反应。
ICP47基因在HSV-1基因组中位于nt145310-145570。为删除ICP47基因，特设计并经PCR从HSV-1DNA中扩增得到共上游及下游的FlankingRegions，上游(U/S)nt145570-146980DNA片段。
所用正引物为：GCATCGATCTTGTTCTCCGACGCCATC
所用反引物为：GCAAGCTTGCTCCCCCCCGACGAGCAGGAAG
下游(D/S)nt 143675-145290DNA片段。
所用正引物为：TCTAGAGGGTTCGATTGGCAATGTTGTCTCCCG
所用反引物为：TTAACGATCGAGTCCCGGGTACGACCATCACCCG
将ICP47FlankingRegionDNA片段克隆进pBlueScript质粒中，即得到pBSΔICP47质粒。
(2)从前述的pGEMT-MMLVEGFP质粒中，用SalI/xhoI分解出MMLV-EGFP-SpaDNA片段，将其插入pBSΔICP47的BamHI位点中，即得到pBSΔICP47EGFP质粒(见图11)。
(3)将前面所纯化的HSV-1ΔICP34.5hGMCSFWPREΔICP6全长病毒DNA与pBSΔICP47EGFP质粒DNA一起共同转染BHK细胞，挑选并纯化表达有绿色荧光的病毒斑，所得到的病毒载体即为HSV-1ΔICP34.5hGMCSFWPREΔICP6ΔICP47EGFP，生长并提取该载体全长DNA。
(4)将所纯化提取的HSV-1ΔICP34.5hGMCSFWPREΔICP6ΔICP47EGFP全长病毒DNA与pBSΔICP47质粒DNA一起共同转染BHK细胞，不表达绿色荧光的病毒斑即表示原病毒载体中的EGFP基因经重组后删除，最后得到了最终的病毒载体HSV-1ΔICP34.5hGMCSFWPREΔCP6ΔICP47(见图12)。
上述文中记载的ΔICP34.5hGMCSFWPREΔICP6ΔICP47为代号，代表本发明的减毒HSV-1基因治疗载体。
5.用限制性内切酶水解方法分析比较本发明构建载体用的临床分离的野生型HSV-1与实验室用HSV-1 17+株。
1)将BHK21CB细胞在24孔细胞培养板中培养生长。第二天当细胞在培养板上100％密度生长后，在不同的孔中，分别感染临床分离的野生型HSV-1或HSV-1 17+株，或经基因重组后的野生型HSV-1。
2)病毒感染后1小时，移去所用培养液，并用新鲜培养液清洗细胞两次。然后每孔加入500微升含1％牛血清的Eagle氏培养液，37℃孵化箱中放置2小时。2小时后，每孔中加入5微居里P32。再将细胞放回37℃，5％CO2孵化箱中培养48小时。48小时后，收获每孔中的细胞及病毒，提取每孔中的病毒DNA(方法同前)。
3)分别取10微升各病毒DNA，用限制型内切酶水解，水解的方法为：10微升病毒DNA，加入2微升限制性内切酶，5微升与内切酶匹配的缓冲液，再加双蒸水至总容量为50微升。混匀后，置于37℃水浴箱，水浴12小时。所用的限制性内切酶分别有EcoR1，Nco1，Not1和Xho1。
4)12小时水浴后反应产物在1％Agarose胶上，走胶电泳，80伏特，走胶5小时。然后将该胶置于玻璃板上，放置于80℃杂交箱中，烘干5小时。
5)将烘干的胶用塑料薄膜包裹后，在暗房中贴上X光胶片，放置30秒至1分钟后，冲洗胶片，即得图13。在图13中，特别注意第一和第二条走胶样本，可见本载体构建用的野生型HSV-1与实验室常用的HSV-1 17+株有极类似的分解模式。
本申请中所有正，反引物的设计均按相关基因的DNA序列来确定。为方便将PCR产物克隆到质粒中，某些引物加有限制性内切酶所辨认的核酸序列为前缀。
Claims (6)
1、一种减毒HSV-1基因治疗载体，该载体由人类HSV-1病毒基因编码；该载体是用新近从中国人患者口腔所分离的野生单纯疱疹病毒I型(HSV-1型)，经基因重组技术构建而成；该临床分离的野生型(HSV-1型)与数据库所记载的HSV-1 17+株具有非常类似的限制性内切酶分解模式；HSV-1 17+株的DNA序列在NCBI中的ID：NC_001806。
2、一种减毒HSV-1基因治疗载体，其特征在于，该载体在单纯疱疹病毒I型病毒基因组中，删除了ICP34.5，ICP6及ICP47基因，并在原ICP34.5的部位插入了由hCMV的IE启动子引导的人类GM-CSF基因，并引入了WPRE片段得到。
3、如权利要求1项所述的减毒HSV-1基因治疗载体的制备方法，所述制备方法包括：从野生型HSV-1病毒基因组中，先后删除ICP34.5，ICP6及ICP47基因，并在原ICP34.5的部位插入由hCMV的IE启动子引导的人类GM-CSF基因，并引入WPRE片段来增强GM-CSF在载体中的表达。
4、如权利要求3项所述的减毒HSV-1基因治疗载体的制备方法，其中包括：
(1)从上述野生型HSV-1中删除ICP34.5基因，构建HSV-1ΔICP34.5；
a.在BHK细胞中生长野生型HSV-1单纯疱疹病毒，用苯酚提取法提取全长HSV-1病毒DNA；
b.构建含有ICP34.5FlankingRegion的质粒：
将包含有ICP34.5基因的HSV-1DNA片段插入质粒pSP72的BglII位点；编码ICP34.5基因的NotI的片段经由NotI限制内切后删除后，得到pSP72ΔICP34.5质粒；表达绿色荧光蛋白的标记基因EGFP由人类CMV病毒的IE启动子所控制；共同克隆进pSP72ΔICP34.5的NotI位点，得到pSP72ΔICP34.5CMVEGFP质粒；
c.构建删除ICP34.5基因的HSV-1病毒株：
将纯化提取的全长HSV-1病毒DNA与pSP72ΔICP34.5hCMVEGFP共同转染BHK细胞；
表达有绿色荧光EGFP的病毒斑，即为删除了ICP34.5基因的HSV-1病毒株；分次提取绿色荧光病毒斑，纯化HSV-1ΔICP34.5hCMVEGFP病毒株后，用苯酚提取法，提取该病毒的全长DNA；
(2)插入人类GM-CSF基因，构建HSV-1ΔICP34.5/hGMCSFWPRE
a.首先设计引物，从人类肺cDNA库中PCR扩增hGMCSF基因；
正引物CTGAAGCTTATGTGGCTGCAGAATTTA
反引物TGGCTCGAGTCATTTTTGGACTGGTTT
将PCR产品克隆入pGEM-T克隆质粒中，得到质粒pGEMT-hGMCSF；用两个限制性内切酶HindIII和XhoI一起，从pGEMT-hGMCSF中分解出hGMCSF，将hGMCSF克隆入pSP72ΔICP34.5CMVEGFP的HindIII/XhoI位点中，以hGMCSF替换EGFP基因，得到新的质粒pSP72ΔICP34.5CMhGMCSF；
b.引入WPRE片段，WPRE片段用PCR扩增后，插入pSP72ΔICP34.5CMVhGMCSF的XhoI位点，得到质粒pSP72ΔICP34.5CMVhGMCSF/WPRE；
c.将纯化提取的全长HSV-1ΔICP34.5hCMVEGFP病毒DNA与质粒DNApSP72ΔICP34.5hCMVhGMCSFWPRE共同转染BHK细胞，不表达绿色荧光的病毒斑表示原病毒中的EGFP基因由hGMSCF基因经重组而替代，纯化及生长HSV-1ΔICP34.5hCMVhGMCSFWPRE病毒载体，提取该载体全长DNA以备后用；
(3)删除ICP6基因，构建HSV-1ΔICP34.5GMCSFWPREΔICP6病毒载体
a.构建pΔICP6质粒：
从HSV-1病毒载体中删除ICP6基因，ICP6基因在HSV-1基因组中位于nt86444-89857；
经PCR从HSV-1DNA中扩增得到上游及下游的FlankingRegions：上游(U/S)84859-86119；下游(D/S)90960-92579；
将PCR扩增所得的上述两个DNA片段克隆入pBlueScript质粒中，得到pBSΔICP6质粒；
b.在原来已构建的质粒PGEMT-MMLVEGFP中：
用两个限制性内切酶SalI和XhoI分解出MMLV-EGFP-SPA片段，插入pBSΔICP6的PstI位点，即得到pBSΔICP6EGFP质粒；
c.将前面所纯化的HSV-1ΔICP34.5hGMCSFWPRE全长病毒的DNA与pBSΔICP6EGFP质粒DNA一起共同转染BHK细胞，挑选并纯化表达有绿色荧光的病毒斑，所得到的病毒载体即为HSV-1ΔICP34.5hGMCSFWPREΔICP6EGFP；生长并提取该载体全长DNA；
d.将所纯化的HSV-1ΔICP34.5hGMCSFWPREΔICP6EGFP全长病毒DNA与pBSΔICP6质粒DNA一起共同转染BHK细胞，不表达绿色荧光的病毒斑即表示原病毒载体中的EGFP基因经重组后删除，从而得到病毒载体HSV-1ΔICP34.5hGMCSFWPREΔICP6，生长并提取该载体全长DNA；
(4)删除ICP47基因，构建HSV-1ΔICP34.5GMCSFWPREΔICP6ΔICP47病毒载体
a.构建ΔICP47质粒：
经PCR从HSV-1DNA中扩增得到其上游及下游的FlankingRegions，
上游(U/S)nt145570-146980DNA片段；
所用正引物为：GCATCGATCTTGTTCTCCGACGCCATC
所用反引物为：GCAAGCTTGCTCCCCCCCGACGAGCAGGAAG
下游(D/S)nt143675-145290DNA片段；
所用正引物为：TCTAGAGGGTTCGATTGGCAATGTTGTCTCCCG
所用反引物为：TTAACGATCGAGTCCCGGGTACGACCATCACCCG
将上述PCR所得ICP47FlankingRegionDNA片段克隆进pBlueScript质粒中：先将上游DNA片段，经HindIII和Sal1水解后，连接到pBlueScript质粒的HindIII和Sal1位点，得pBS47US；
将下游DNA片段克隆进pGEMT质粒，用EcoRI从其中切下下游DNA，将其插入pBS47US的Spel位点，即得到pBSΔICP47质粒；
b.从前述的pGEMT-MMLVEGFP质粒中，用SalI/xhoI分解出MMLV-EGFP-SpaDNA片段，将其插入pBSΔICP47的BamHI位点中，即得到pBSΔICP47EGFP质粒；
℃.将前面所纯化的HSV-1ΔICP34.5hGMCSFWPREΔICP6全长病毒DNA与pBSΔICP47EGFP质粒DNA一起共同转染BHK细胞，挑选并纯化表达有绿色荧光的病毒斑，所得到的病毒载体即为HSV-1ΔICP34.5hGMCSFWPREΔICP6ΔICP47EGFP，生长并提取该载体全长DNA；
d.将所纯化提取的HSV-1ΔICP34.5hGMCSFWPREΔICP6ΔICP47EGFP全长病毒DNA与pBSΔICP47质粒DNA一起共同转染BHK细胞，不表达绿色荧光的病毒斑即表示原病毒载体中的EGFP基因经重组后删除，最后得到了最终的病毒载体HSV-1ΔICP34.5hGMCSFWPREΔICP6ΔICP47，该载体即是减毒HSV-I基因治疗载体。
5、一种药物组合物，其包含如权利要求1或2项的减毒HSV-1基因治疗载体和必要时药物可接受的载体或赋形剂。
6、如权利要求1所述的减毒HSV-1基因治疗载体在制备基因治疗肿瘤的药物中的应用。
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