CN1652794A - 神经保护性螺甾烯醇药用组合物 - Google Patents

神经保护性螺甾烯醇药用组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及治疗、预防或缓解患者发生与神经毒性相关的、特别是与β－淀粉样蛋白诱发的神经毒性和早老性痴呆相关的障碍或疾病危险、或与之相关的症状的方法、药盒、联合疗法和组合物。本发明化合物为含螺甾－5－烯－3－醇通用结构的生物活性22R－羟基胆甾醇衍生物。本发明还提供通过给予患者治疗有效量的22R－羟基胆甾醇或其治疗活性类似物，治疗患有诸如以下神经疾病或障碍的患者的方法：全脑和局部缺血性中风和出血性中风、头部创伤、脊髓损伤、低氧诱发的神经细胞损伤、心搏停止或新生儿窘迫诱发的神经细胞损伤、癫痫、焦虑、糖尿病、多发性硬化、幻肢痛、灼痛、神经痛、带状疱疹、脊髓损害、痛觉过敏、异常性疼痛、亨廷顿舞蹈病和帕金森病。

Description

神经保护性螺甾烯醇药用组合物
相关申请资料
本申请要求2002年3月15日申请的美国临时专利申请号60/364,140和2003年1月9日申请的美国临时专利申请号60/319,846的优先权，这两个专利申请通过引用结合到本文中。
发明领域
本发明涉及由β-淀粉样蛋白沉积所诱发的细胞毒性疾病的新的预防或治疗方法。更具体地说，本发明涉及包含螺甾烯醇的药用组合物；包括将这种药用组合物给予有需要的患者的治疗方法；制备这种组合物的方法；这种组合物治疗疾病的用途；这种组合物与其它治疗药物的联合疗法；以及包含这种组合物的药盒。
发明背景
神经细胞死亡(变性)可对个体造成潜在不可逆的破坏作用，例如由于中风可导致心脏病发作或脑或脊髓的局部缺血或创伤的其它后果。另外，与神经细胞死亡有关的神经变性性疾病包括早老性痴呆(Alzheimer′s disease)、帕金森病(Parkinson′s disease)、亨廷顿舞蹈病(Huntington′s disease)、肌萎缩性侧索硬化、唐氏综合征(Down′sSyndrome)以及科尔萨科夫精神病(Korsakoff′s disease)。
早老性痴呆(AD)是进行性神经变性性疾病，临床表现为智力功能进行性丧失。AD影响约10％的65岁以上的群体。其在75-85岁的群体中的发生率为19％，在85岁以上群体中的发生率为45％。AD是成人死亡的第四大主要原因，排在心脏病、癌症和中风之后。AD约占老年性痴呆的75％。这种中枢神经系统疾病表现为多种症状，例如神经元变性、淀粉样蛋白斑发生、神经纤维缠结、乙酰胆碱下降以及大脑皮层萎缩。AD患者起初丧失短时记忆，随后认知功能减退，最终丧失照顾自己的能力。包括诊断、护理、家庭护理以及工资损失在内的照顾患者费用估计每年约为$800亿-$900亿。
与AD相关的严重功能损害是由于在新皮质和海马区存在神经炎性病斑并且丧失胆碱能神经元突触前标记物所致。变性轴突和神经末梢组成神经炎性病斑，经常环绕在淀粉样蛋白核心周围，通常含有反应性神经胶质元素。早老性痴呆的另一个病理特征是神经纤维缠结，其为神经元内物质，与异常磷酸化的τ蛋白聚合为被称作成对螺旋丝的原纤维结构的蓄积相同。此外，神经纤维缠结还含有高度磷酸化的神经丝蛋白。
尽管在阐明该疾病的病理生理学机制方面已有显著进展，但发生AD的原因仍不十分清楚。有几个可能的原因，例如遗传素因(PS-1、PS-2、APP、apoE、CO1、CO2基因突变)、神经递质缺损(乙酰胆碱缺乏)、炎症、代谢降低、自由基应激或兴奋性氨基酸毒性。
根据当前对其发病机制的了解，目前正在对几种化合物进行治疗AD的临床研究。在这些药物中，乙酰胆碱酯酶(AchE)抑制剂较为明显。最近，行政当局已批准两种AchE抑制剂他克林及多奈哌齐用于治疗AD。虽然他克林对认知能力的减退提供中等有益作用，但是由于其引起血清肝脏酶升高，因而也带来一些副作用。
因此，非常需要新的神经保护性药物，尤其是限制程度或治疗例如可与中风、心脏病发作或脑或脊髓创伤同时发生的神经细胞死亡(变性)的药物；或治疗神经变性性疾病如早老性痴呆、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化、唐氏综合征以及科尔萨科夫精神病的药物。
早老性痴呆的特征为称为β-淀粉样蛋白或Aβ的39-43氨基酸肽蓄积，呈原纤维形式，作为细胞外淀粉样蛋白斑存在；作为淀粉样蛋白在大脑血管壁存在。据信在早老性痴呆中的原纤维Aβ淀粉样蛋白沉积对患者有害，并且最终导致毒性及神经元细胞死亡，其为AD的典型特点。蓄积证据提示淀粉样蛋白是AD发病机制的主要诱因。
多种其它人类疾病也证明淀粉样蛋白沉积，并且通常涉及全身器官(即中枢神经系统以外的器官或组织)，由于淀粉样蛋白蓄积，导致器官功能障碍或衰竭。对AD和“系统性”淀粉样蛋白疾病，目前尚无治愈或有效的治疗方法，所以患者通常从开始患病起3-10年内死亡。
通过蛋白酶解β-淀粉样蛋白前体蛋白生成的Aβ是老年斑和脑血管病的主要成分。遗传学、生物化学以及组织学研究强有力地提示Aβ在AD的发病机制中，其临床表现为进行性认知缺损及记忆缺失。Selkoe，D.J(1999) Nature 399，A23-31；Yankner，B.A.(1996) Neuron 16，921-932；Selkoe，D.J.(1989) Cell 58，611-612；Kalaria，R.N.(1996)Pharmacol.Ther.72，193-214。
已做了很多有关AD的工作，但是对于治疗方案中抑制淀粉样蛋白形成、沉积、蓄积和/或持续发生在AD及其它淀粉样蛋白病的化合物或药物却知之甚少。
因此，需要治疗方案中抑制或逆转AD及其它淀粉样蛋白病发生的淀粉样蛋白形成、沉积、蓄积和/或持续的新化合物或新药。
因此，如果能在现已发现的化合物、合理修饰的化合物的基础上设计新的疗法和/或重新设计具有Aβ功能抑制剂活性的化合物，将会是非常有益的。
发明概述
本发明涉及治疗、预防或减少患者发生与神经毒性、特别是β-淀粉样蛋白诱发的神经毒性相关的障碍或疾病的危险或与之相关的症状的方法、药盒、联合疗法和组合物。本发明化合物是具有生物活性的22R-羟基胆甾醇衍生物，所述衍生物含有共同的螺甾-5-烯-3-醇结构并且具有下文公开的式(I)结构。
本发明涉及治疗病症或障碍的方法，所述病症或障碍采用式(I)神经毒性抑制剂进行治疗，所述方法包括将本发明的组合物给予有需要的患者。更具体地说，本发明主题是提供一种抑制患者脑β-淀粉样蛋白Aβ形成或持续沉积的神经毒性作用的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的式(I)化合物。
在一方面，本发明提供一种促进、维持或增强患者一种或多种选自以下与β-淀粉样蛋白形成有关的智力或认知质量的方法：记忆力、注意力集中和短时记忆力，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的式(I)化合物。
在另一方面，本发明提供减轻患者一种或多种与β-淀粉样蛋白形成有关的选自以下的智力或认知影响的方法：认知或记忆力减退和智力下降，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的式(I)化合物。
在又一方面，本发明提供治疗患者与β-淀粉样蛋白形成或持续有关的精神状态的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的式(I)化合物。
在再一方面，本发明提供治疗患有选自以下神经疾病或障碍的患者的方法：全脑和局部缺血性中风和出血性中风、头部创伤、脊髓损伤、低氧诱发的神经细胞损伤、心博停止或新生儿窘迫诱发的神经细胞损伤、癫痫、焦虑、糖尿病、多发性硬化、幻肢痛、灼痛、神经痛、带状疱疹、脊髓损害、痛觉过敏、异常性疼痛、AD、亨廷顿舞蹈病以及帕金森病，其中所述治疗包括给予所述患者治疗有效量的式(I)化合物。
在一个进一步的方面，本发明提供治疗特征为β-淀粉样蛋白沉积在患者心脏、脾脏、肾脏、肾上腺皮质或肝脏的疾病的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的式(I)化合物。
在再一个进一步的方面，本发明提供鉴定具有与β-淀粉样蛋白结合亲和性的化合物的方法，所述方法包括根据与22R-羟基胆甾醇的结构同源性筛选已知化合物的数据库；将所述数据库中的化合物根据与22R-羟基胆甾醇的同源程度进行排列，从所述数据库中提取与22R-羟基胆甾醇有最高结构同源性的化合物；将所提取的化合物按与β-淀粉样蛋白的体外结合进行排列；选择出具有最高体外亲和性的化合物。
在再一方面，本发明提供一种设计与β-淀粉样蛋白具有结合亲和性的化合物的方法，所述方法包括将22R-羟基胆甾醇绘制成两个或更多个独立结构单元；通过修饰22R-羟基胆甾醇的一个或多个单元设计新化合物，将所设计的化合物按与β-淀粉样蛋白的体外结合进行排列；选择出具有最高体外结合亲和性的化合物。
在一个进一步的方面，本发明提供一种设计与β-淀粉样蛋白具有结合亲和性的化合物的方法，所述方法包括绘制β-淀粉样蛋白，在计算机屏幕上构建与β-淀粉样蛋白结构或其片段互补的化合物；将所设计的化合物按与β-淀粉样蛋白的体外结合进行排列；选择出具有最高体外结合亲和性的化合物。
在又一方面，本发明提供一种检测并定量生物体液中Aβ的方法，所述方法包括获取样品液；将所述样品液与标记的式(I)化合物一起培养；任选在浓度递增的未标记化合物存在下；从培养液中分离样品并将其转移到硝酸纤维素膜上；将所述膜暴露于氚敏屏；用磷光成像法检测Aβ的存在或定量测定生物体液中存在的Aβ含量，从而分析所述膜的内容物。
在再一方面，本发明提供诊断患者AD的方法，所述方法包括从患者脑中获取样品液；将所述样品液与标记的式(I)化合物一起培养；任选在浓度递增的未标记化合物存在下；从培养液中分离样品并将其转移到硝酸纤维素膜上；将所述膜暴露于氚敏屏；用磷光成像法检测Aβ的存在或定量测定生物体液中存在的Aβ含量，从而分析所述膜的内容物。
因此，本发明的一个主要方面涉及治疗患者的与β-淀粉样蛋白诱发的神经毒性有关的疾病或神经变性性疾病的药用组合物。该组合物包括有效量的式(I)化合物和药学上可接受的载体。式(I)化合物在制备用于治疗这类疾病之一的药物中的用途也在本发明范围内。通过给予患者治疗有效量的本发明化合物或组合物，完成了对这些疾病的治疗。
本发明一个或多个实施方案的细节在下文所附说明中有阐述。根据本发明说明书和权利要求书，本发明的其它特征、目的和优势将会是显而易见的。
附图简述
附图说明了本发明的一些化合物、鉴定这些化合物的方法以及证明本发明说明性化合物活性的体外和体内生物学试验的结果。
图1说明22R-羟基胆甾醇(SP222)和天然存在的衍生物的化学结构中的几种结构。
图2是描述在AD和对照脑样本中22R-羟基胆甾醇水平的图。
图3A是一幅曲线图，描绘在浓度递增的Aβ1-42不存在或存在下，浓度递增的22R-羟基胆甾醇对大鼠PC12神经元细胞活力的影响。
图3B是一幅曲线图，描绘在浓度递增的Aβ1-42不存在或存在下，浓度递增的胆甾醇对大鼠PC12神经元细胞活力的影响。
图3C是一幅曲线图，描绘在浓度递增的Aβ1-42不存在或存在下，浓度递增的孕烯醇酮对大鼠PC12神经元细胞活力的影响。
图3D是一幅曲线图，描绘在浓度递增的Aβ1-42不存在或存在下，浓度递增的17α-羟基孕烯醇酮对大鼠PC12神经元细胞活力的影响。
图3E是一幅曲线图，描绘在浓度递增的Aβ1-42不存在或存在下，浓度递增的DHEA对大鼠PC12神经元细胞活力的影响。
图3F是一幅曲线图，描绘在浓度递增的Aβ1-42不存在或存在下，浓度递增的22S-羟基胆甾醇对大鼠PC12神经元细胞活力的影响。
图4是一幅曲线图，描绘在Aβ1-42不存在或存在下，待测22R-羟基胆甾醇对分化人NT2N神经元活力的影响。
图5A是一幅曲线图，描绘22R-羟基胆甾醇和DHEA对受Aβ1-42诱发的毒性影响的大鼠PC12神经元细胞的影响。
图5B是一幅曲线图，描绘22R-羟基胆甾醇和DHEA对受Aβ25-35诱发的毒性影响的大鼠PC12神经元细胞的影响。
图5C是一幅曲线图，描绘22R-羟基胆甾醇和DHEA对受Aβ1-42诱发的毒性影响的人NT2细胞的影响。
图5D是一幅曲线图，描绘22R-羟基胆甾醇和DHEA对受Aβ25-35诱发的毒性影响的人NT2细胞的影响。
图6A是描绘22R-羟基胆甾醇对Aβ聚集影响的考马斯蓝凝胶。
图6B是图6A的考马斯蓝染色凝胶的免疫印迹分析，描绘22R-羟基胆甾醇对Aβ聚集的影响。
图7A是通过CPBBA鉴定Aβ1-42-22R-羟基胆甾醇结合和结合位点的免疫印迹分析。
图7B是通过在图7A所示印迹上的多克隆兔抗β-淀粉样肽抗血清鉴定Aβ1-42的免疫印迹分析。
图7C是鉴定22R-羟基胆甾醇在Aβ上的结合位点的免疫印迹分析。
图7D是22R-羟基胆甾醇与Aβ1-42的计算对接模拟。
图7E是22R-羟基胆甾醇与Aβ17-40的计算对接模拟。
图7F是22R-羟基胆甾醇与Aβ17-40的计算对接模拟。
图7G是22R-羟基胆甾醇与Aβ1-42的计算对接模拟。
图7H是22R-羟基胆甾醇与Aβ17-40的计算对接模拟。
图7I是定位于Aβ1-42的22R-羟基胆甾醇结合位点的氨基酸序列。
图8是一幅柱状图，说明将PC12细胞在浓度递增的Aβ中暴露3天，导致剂量依赖性细胞死亡。
图9A-9P是一系列柱状图，说明在0.1μM Aβ1-42不存在或存在下，浓度递增的22R-羟基胆甾醇(SP222)及衍生物对大鼠PC12神经元细胞活力的影响。
图10A-10P是一系列柱状图，说明在1.0μM Aβ1-42不存在或存在下，浓度递增的22R-羟基胆甾醇(SP222)及衍生物对大鼠PC12神经元细胞活力的影响。
图11A-11P是一系列柱状图，说明在10.0μM Aβ1-42不存在或存在下，浓度递增的22R-羟基胆甾醇(SP222)及衍生物对大鼠PC12神经元细胞活力的影响。
图12A是一幅柱状图，显示Aβ暴露诱发膜电位评价发光(potential-assessing luminescence)的剂量相关性减少。
图12B是一幅柱状图，显示22R-羟基胆甾醇(SP222)及衍生物抵抗0.1μM Aβ诱发的神经毒性的效果。
图12C是一幅柱状图，显示22R-羟基胆甾醇(SP222)及衍生物抵抗1.0μM Aβ诱发的神经毒性的效果。
图12D是一幅柱状图，显示22R-羟基胆甾醇(SP222)及衍生物抵抗10.0μM Aβ诱发的神经毒性的效果。
图13A是一幅柱状图，显示在0.1μM、1.0μM和10.0μM Aβ诱发的神经毒性存在下，Aβ以剂量依赖性方式减少PC12细胞产生的ATP。
图13B是一幅柱状图，显示在0.1μM Aβ诱发的神经毒性存在下，22R-羟基胆甾醇(SP222)及衍生物对ATP的影响。
图13C是一幅柱状图，显示在1.0μM Aβ诱发的神经毒性存在下，22R-羟基胆甾醇(SP222)及衍生物对ATP的影响。
图13D是一幅柱状图，显示在10.0μM Aβ诱发的神经毒性存在下，22R-羟基胆甾醇(SP222)及衍生物对ATP的影响。
图14A是一幅曲线图，显示在单独的Aβ存在下，在Aβ+SP233(30μM)存在下，在Aβ+SP233(50μM)存在下，细胞对锥虫蓝的摄取。
图14B是一幅曲线图，显示浓度递增的SP233对受0.1μM、1.0μM和10.0μM Aβ诱发的神经毒性影响的大鼠PC12神经元细胞的影响。
图15是一幅曲线图，说明SP233对MA-10间质细胞类固醇形成的影响。
图16是通过CPBBA鉴定Aβ-SP结合和结合位点的柱状图。
图17A-17Q是表1化合物与Aβ1-42的计算对接模拟。
图18A是描绘22R-羟基胆甾醇(SP222)和SP233与Aβ1-42的结合能频率的计算对接模拟。
图18B是描绘22R-羟基胆甾醇(SP222)和SP233与Aβ1-42结合概率的计算对接模拟。
图19是在神经保护性SP化合物中存在的基本螺甾烯醇结构的计算机模拟。
发明详述
虽然本发明可包括许多不同的形式，但在本发明公开内容仅作为本发明原理的范例前体下，讨论本文的几个具体实施方案，并不意味着所述实施方案构成对本发明的限制。
本文所用的缩写如下：5-胆甾烯-3β，22R-二醇(22R-羟基胆甾醇)；5-胆甾烯-3β，22S-二醇(22S-羟基胆甾醇)；5-胆甾烯-3β-醇(胆甾醇)；5-雄烯-3β-醇-17-酮或脱氢表雄酮(DHEA)；5-孕烯-3β，17α-二醇-20-酮(17α-羟基孕烯醇酮)；5-孕烯-3β-醇-20-酮(孕烯醇酮)；Ntera2/D1畸胎瘤细胞(NT2)；分化人NT2神经元(NT2N)；β-淀粉样肽(Aβ)；早老性痴呆(AD)；胆甾醇-蛋白结合印迹测定(CPBBA)。
本发明基于意想不到的发现：22R-羟基胆甾醇(胆甾醇形成孕烯醇酮途径上的甾类中间体)在AD海马和额皮层组织样本中的水平比相同年龄对照组低。正如以上讨论那样，淀粉样蛋白β(Aβ)肽已证实具有神经毒性，其在脑中的存在已与AD病理相关。
如下所述，本发明人意想不到地发现，22R-羟基胆甾醇具有以剂量依赖性方式防止Aβ诱发的大鼠交感神经嗜铬细胞瘤(PC12)和分化人NT2N神经元细胞死亡。发现22R-羟基胆甾醇的作用是立体特异性的，因为其22S-羟基胆甾醇对映体不能保护神经元抵抗Aβ诱发的细胞死亡。这种大鼠模型通常适用于人。
本发明的一个方面涉及治疗与神经毒性有关的障碍、特别是AD的方法，所述方法包括给予有需要的患者下式(I)化合物：
Figure A0381048800161
式(I)中，每个R1、R2、R4、R5、R6、R7、R11、R12、R15和R16独立为氢、烷基、羟基、氨基、羧基、氧代、磺酸或任选被以下基团取代的烷基：-NH-、-N(烷基)-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-O-SO2-、-SO2-O-、-SO3-O-、-CO-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NR′-或-NR′-CO-；R3为在表1和图1中列出的化合物的R3情况下所公开的取代基；每个R8、R9、R10、R13和R14独立为氢、烷基、羟烷基、烷氧基或羟基；R17为在表1和图1中列出的化合物的R17情况下所公开的取代基。注意到，除非另有说明，式(I)所示的碳原子与氢饱和。
每个术语“烷基”、前缀“烷(alk)”(如在烷氧基中)和后缀“-烷基”(如在羟烷基中)是指C1-8烃链，直链烷基(例如丁基)或支链烷基(例如异丁基)。亚烷基、亚烯基和亚炔基分别指二价的C1-8烷基(例如亚乙基)、烯基和炔基。
除非另有定义，本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义相同。
下表1所示为几个上述的式(I)化合物，其可用来实施本发明：
表1.含22R-羟基胆甾醇先导结构的天然存在的化合物的化学名称、代号及来源。
代号 化学名称 来源
SP222 22R-羟基胆甾醇 哺乳动物
SP223 (20ξ)-26-乙酰氨基-(22ξ)-羟基呋甾-5-烯-3ξ-基醋酸酯 三七草(Gynura sp.)(菊科)
SP224 (20α)-25ξ-甲基-(22R，26)-氮杂环呋甾-5-烯-3ξ-醇 澳洲茄(Solanum asperum)(茄科)
SP225 (20ξ)-26-乙酰氨基-(22ξ)-甲氧基呋甾-5-烯-3α-基醋酸酯 三七草(菊科)
SP226 (20ξ)-25ξ-甲基-N-乙酰基-(22R，26)-氮杂环呋甾-5-烯-3ξ-醇 澳洲茄(茄科)
SP227 (22R，25ξ)-(20α)-螺甾-5-烯-(2α，3ξ)-二醇 菊三七(菊科)
SP228 (20ξ)-26-乙酰氨基-(22ξ)-乙氧基呋甾-5-烯-3ξ-基醋酸酯 三七草(菊科)
SP229 (20α)-25ξ-甲基-N-对甲苯磺酰-(22R，26)-氮杂环呋甾-5-烯-3ξ-基对甲苯磺酸酯 澳洲茄(茄科)
SP230 (22R，25ξ)-(20α)-(14α，20α)-螺甾-5-烯-(3β，12β)-二醇 菊三七(菊科)
SP231 (22R，25S)-(20ξ)-螺甾-5-烯-3ξ-醇 菊三七(菊科)
SP232 (22R，25ξ)-(20α)-螺甾-5-烯-3β-基苯甲酸酯 三七草(菊科)
SP233 (22R，25S)-(20S)-螺甾-5-烯-3β-基己酸酯 三七草(菊科)
SP234 (22R，25S)-(20α)-螺甾-5-烯-(1ξ，3ξ)-二醇 菊三七(菊科)
SP235 (22R，25S)-(20α)-螺甾-5-烯-3β-醇 菊三七(菊科)
SP236 (22R，25S)-(20α)-螺甾-5-烯-3β-基琥珀酸酯 三七草(菊科)
SP237 26-二乙酰氨基-(22ξ)-乙酰氧基-(16ξ)-乙酰氧基-胆甾-5-烯-基醋酸酯 Achlya heterosexualis(水霉科)
SP238 (20α)-25S-甲基-N-乙酰基-(22S，26)-氮杂环呋甾-5-烯-3β-基丙酸酯 澳洲茄(茄科)
其它22R-羟基胆甾醇衍生物可通过搜索基于结构的数据库来鉴定。可遵循两种方法。一种方法基于22R-羟基胆甾醇的结构。可将22R-羟基胆甾醇再分为几个结构单元，在该数据库中搜索包括22R-羟基胆甾醇的一个或多个结构单元的化合物。可形成一种基于本发明的结果而改进的搜索方法，以保留22R-羟基胆甾醇的22R羟基官能团。从数据库中提取具有类似22R-羟基胆甾醇结构的化合物，在体外测试其与Aβ的结合亲和性。选出具有最高结合亲和性的化合物进行进一步体内研究。第二种方法是基于Aβ的结构。简而言之，基于(受体)结构的3D数据库搜索，通过NMR分析确定靶分子Aβ的3D结构，然后在储存有成千上万个结构各异的合成化合物和天然产物3D结构的大型化学数据库中，通过计算机化分子对接寻找并鉴定能与Aβ有效相互作用的小分子。
在形成Aβ的3D结构模板中，按照开始的构象给Aβ骨架上的每个原子指定一个位置，根据每条侧链的内配位价的最小能量给侧链上的原子指定位置。通过使模板的内能最小化，精选由此而获得的模板结构。基于精选的Aβ结构，通过在Aβ附近安排一个选自化合物数据库的化合物形成主宾络合物。在三维参考系中，主宾络合物的结构由该络合物中每个原子所占据的位置确定。
选择可安排在靶结合位点而不与Aβ的原子形成明显不利重叠的化合物，形成几何上合适的基团。对于每一个在几何上合适基团上的化合物，通过使能量作用最小化描述所述化合物原子和Aβ原子之间的相互作用，确定预测的与Aβ受体位点的结合亲和性。能量作用最小化是通过改变化合物的位置来实现，以便获得对应能量作用最小化的主宾络合物结构。为了任选的再处理，鉴定与结合位点上原子具有最佳能量相互作用的化合物，例如通过展示和目测化合物Aβ络合物来鉴定最有希望的候选化合物。
通过目测展示的络合物形成用于体外试验的候选化合物组。例如，为目测化合物与Aβ受体位点对接的质量，检查络合物。目测为鉴定用于体外试验的化合物提供了有效的基础。
当鉴定出假定的结合化合物后，在体外和/或体内证实这种化合物特异性结合Aβ的能力。
在另一方面，本发明提供经合理设计的、抑制与Aβ结合的新化合物。新化合物的合理设计是以与Aβ结合位点有关的信息为基础。分析Aβ和先导化合物的结构，以便确定可能具有与Aβ的结合位点结合活性的化合物结构。
可将该先导化合物结构划分为设计单元，对其进行修饰以了解对先导化合物与Aβ结合位点相互作用的影响。然后合成具有不同设计单元组合的化合物，并对其活性与所鉴定的机制的关系进行试验。这种试验在体外和/或体内按上述方式进行。然后将从这种试验获得信息结合到新一轮的合理药物设计中。重复这种设计-合成-试验循环直至发现具有所需特性的先导化合物。然后将该先导化合物进行临床试验。
本文所用的术语“治疗”是指任何治疗患者的与神经毒性或β-淀粉样蛋白诱发的神经毒性有关的疾病或障碍，并且包括但不限于预防可能易患所述障碍或疾病，但尚未诊断出已患所述障碍或疾病的患者已存在的障碍或疾病；抑制所述障碍或疾病，例如抑制患所述障碍或疾病的发展；缓解所述障碍或疾病，例如促使所述障碍或疾病消退；或缓解由所述障碍或疾病引起的病症，例如使所述障碍或疾病的症状稳定。本文所用的“神经变性性疾病”意指包括所有上述疾病。
对患者神经毒性或与β-淀粉样蛋白诱发的神经毒性相关的疾病或障碍而言，术语“预防”，是指如果未曾发生的话，不会发生疾病或障碍；或如果已发生疾病或障碍的话，疾病或障碍不会进一步发展。
在给药前，可以将有效量的有效化合物与药学上可接受的载体配制成药用组合物，治疗与神经毒性有关的疾病。“有效量”或“药理上的有效量”是指为治疗患者提供治效所需的化合物剂量。Freireich等， Cancer Chemother.Rep.，1966，50，219描述了动物和人的剂量相互关系(以每平方米体表面积毫克计)。体表面积可按患者的身高和体重粗略确定。参见例如Scientific Tables，Geigy Pharmaceuticals，Ardley，New York，1970，537。正如本领域技术人员所认识的，有效剂量也会变化，取决于给药途径、赋形剂的用法和任选的与其它治疗药物联合用药。
活性成分的毒性和疗效可通过标准的药学方法确定。例如测定LD50(使群体的50％致死的剂量)和ED50(有效治疗群体的50％的剂量)。毒性与疗效的剂量比率为治疗指数，其可表示为LD50/ED50的比率。优选具有大治疗指数的化合物。虽然可以使用有毒副作用的化合物，但在设计递药系统时，应该注意将这种化合物靶向受影响的组织部位，以便对未受感染细胞的潜在损害最小，因此降低副作用。
本发明的方法、药盒、联合疗法以及药用组合物包括所述化合物的晶型(例如多晶型)、异构体和互变异构体及其药学上可接受的盐。说明性的药学上可接受的盐可用以下酸制备：甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、羟基乙酸、葡萄糖酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、葡糖醛酸、马来酸、富马酸、丙酮酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸、邻氨基苯甲酸、甲磺酸、硬脂酸、水杨酸、对羟基苯甲酸、苯乙酸、扁桃酸、双羟萘酸(扑姆酸)、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、泛酸、甲苯磺酸、2-羟基乙磺酸、磺胺酸、环己基氨基磺酸、藻酸、b-羟基丁酸、半乳糖二酸以及半乳糖醛酸。
术语“前体药物”是指通过体内代谢过程转化引发药理作用的药物或化合物(活性部分)。通常认为前体药物是在患者用药和随后摄取后，经过某些过程(例如代谢过程)转化为活性或活性更强的种类。该转化过程产生的其它产物易于被机体处理。前体药物通常具有使其活性减弱；和/或将溶解性或一些其它性质赋予药物的化学基团。一旦该化学基团从前体药物切下，就会产生活性更强的药物。前体药物可设计为可逆药物衍生物，用其作为改性剂，促使药物转运至定位组织。目前，前体药物的设计已增加了治疗性化合物的有效水溶性，以便靶向至水为主要溶剂的区域。例如Fedorak等， Am.J. Physiol.269：G210-218(1995)描述了地塞米松-β-D-葡萄糖醛酸苷。McLoed等， Gastroenterol.，106：405-413(1994)描述了地塞米松-丁二酸酯-右旋糖苷。Hochhaus等， Biomed.Chrom.，6：283-286(1992)描述了地塞米松-21-硫苯甲酸钠和地塞米松-21-异烟酸酯。另外，J.Larsen和H.Bundgaard， Int.J.Pharmaceutics，37，87(1987)描述了对N-酰基磺酰胺作为潜在前体药物衍生物的评价。J.Larsen等， Int.J. Pharmaceutics.47，103(1988)描述了对N-甲基磺酰胺作为潜在前体药物衍生物的评价。例如Sinkula等， J.Pharm.Sci.，64：181-210(1975)也描述了前体药物。
术语“衍生物”是指通过用另一个原子、分子或基团置换取代类似结构化合物的一个原子、分子或基团生成的化合物。例如一种化合物的氢原子可被烷基、酰基、氨基等取代，生成该化合物的衍生物。
“血浆浓度”是指药物在血浆或血清中的浓度。
“药物摄取”或“摄取”是指药物从给药部位移动到体循环的过程，例如进入患者的血流。
“生物利用度”是指活性成分(药物或代谢物)被摄取进入大循环并在体内的药物作用部位可利用的程度。“代谢”是指体内药物的化学转化过程。
“药效学”是指确定观察到的、相对应作用部位的药物浓度的生物反应的因素。
“药物动力学”是指确定达到并维持作用部位的合适药物浓度的因素。
“血浆半衰期”是指血浆药物浓度从最高浓度减少50％所需要的时间。
本发明说明书中所用的术语“约”的用途是指“近似”，作为说明，术语“约”的用途表明在所述范围外的剂量也可能是有效和安全的，并且这种剂量也包括在本发明范围之内。
术语“可测血清药物浓度”指给药后，治疗药物被摄取进入血流的血清药物浓度(通常以每ml、dl或l的血清所含mg、μg或ng治疗药物测量)。
本文所用的形容词性术语“药学上可接受的”是指被修饰的名词适合用于药品。药学上可接受的阳离子包括金属离子和有机离子。更优选的金属离子包括但不限于合适的碱金属(Ia组)盐、碱土金属(IIa组)盐和其它生理上可接受的金属离子。示例性的离子包括正常化合价的铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌。优选的有机离子包括质子化叔胺和季铵阳离子，部分包括三甲胺、二乙胺、N，N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普甲胺(N-甲基普糖胺)和普鲁卡因。示例性的药学上可接受的酸包括但不限于盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、甲磺酸、乙酸、甲酸、酒石酸、马来酸、苹果酸、柠檬酸、异柠檬酸、琥珀酸、乳酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、丙酮酸丁酮二酸、富马酸、丙酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸等。
本发明组合物通常以药用组合物的形式给药。这些药用组合物可通过任何合适的途径给药，包括但不限于口服、鼻胃、直肠、经皮、胃肠外(例如皮下、肌内、静脉内、髓内和皮内注射或输注技术给药)、鼻内、经粘膜、植入、阴道、局部、口腔和舌下。这种制剂按常规可含有缓冲剂、防腐剂、渗透促进剂、配伍载体和其它治疗或非治疗性成分。
本发明还包括使用包含本发明的成分和药学上可接受的载体或赋形剂的药用组合物的方法。本文所用的术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣材料、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这种作为可摄取介质和试剂的用途在本领域中众所周知。除了与所述组合物不配伍的任何常规介质或试剂之外，其用途是可设想的。还可将辅助活性成分掺入到所述组合物中。在制备本发明的组合物中，可以将组合物与药学上可接受的赋形剂混合，用赋形剂稀释或用这种载体包裹，其可呈胶囊剂、小药囊剂或其它容器形式。可用于制备本发明组合物的载体材料为那些在药剂学上常用的任何赋形剂，并且应该在与活性药物配伍以及需要的剂型的释放分布特性的基础上进行选择。
选择以下药用赋形剂作为说明性实例：
(a)粘合剂，例如阿拉伯胶、海藻酸及其盐、纤维素衍生物、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、硅酸镁铝、聚乙二醇、树胶、多糖酸、皂土、羟丙基甲基纤维素、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮/醋酸乙烯酯共聚物、交联聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基丙烯酸酯、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、淀粉、预胶化淀粉、乙基纤维素、黄芪胶、糊精、微晶纤维素、蔗糖或葡萄糖等。
(b)崩解剂，例如淀粉、预胶化玉米淀粉、预胶化淀粉、纤维素、交联羧甲基纤维素、淀粉羟乙酸钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、藻酸钙络合物、藻酸钠络合物、粘土、藻酸盐、树胶或淀粉羟乙酸钠以及任何在片剂制剂中使用的崩解剂。
(c)填充剂，例如乳糖、碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、微晶纤维素、纤维素粉、右旋葡萄糖、葡萄糖结合剂、右旋糖苷、淀粉、预胶化淀粉、蔗糖、木糖醇、拉克替醇、甘露醇、山梨醇、氯化钠、聚乙二醇等。
(d)表面活性剂，例如十二烷基硫酸钠、司盘-80、吐温-80、吐温、polaxomers、胆盐、单硬脂酸甘油酯、PluronicTM系列(BASF)等。
(e)增溶剂，例如柠檬酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、马来酸、戊二酸碳酸氢钠和碳酸钠等。
(f)也可使用稳定剂例如抗氧化剂、缓冲剂或酸等。
(g)润滑剂，例如硬脂酸镁、氢氧化钙、滑石粉、硬酯酰富马酸钠、氢化植物油、硬脂酸、甘油二十二烷酸酯、硬脂酸镁、硬脂酸钙和硬脂酸钠、硬脂酸、滑石粉、蜡、Stearowet、硼酸、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、DL-亮氨酸、聚乙二醇、油酸钠或十二烷基硫酸钠等。
(h)湿润剂，例如油酸、单硬脂酸甘油酯、司盘-80、司盘-20、三乙醇胺油酸脂、吐温-80、吐温-20、油酸钠或十二烷基硫酸钠等。
(i)稀释剂，例如乳糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、右旋葡萄糖、微晶纤维素、磷酸氢钙、蔗糖为主的稀释剂、蔗糖玉米淀粉混合物、硫酸钙一水合物、硫酸钙二水合物、乳酸钙三水合物、葡萄糖结合剂、肌醇、水解谷类固体物、直链淀粉、粉状纤维素、碳酸钙、甘氨酸或皂土等。
(J)抗粘着剂或助流剂，例如滑石粉、玉米淀粉、DL-亮氨酸、十二烷基硫酸钠以及硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸钠等。
(K)药学上可配伍的载体包括阿拉伯胶、明胶、胶态二氧化硅、甘油磷酸钙、乳酸钙、麦芽糖糊精合剂、甘油、硅酸镁、酪蛋白酸钠、大豆卵磷脂、氯化钠、磷酸钙、磷酸氢二钾、硬脂酰乳酸钠、卡拉胶、单甘油酯、二甘油酯或预胶化淀粉等。
另外，在例如Remington′s The Science and Practice of Pharmacy(2000)中论述了药物制剂。还可在Liberman，H.A.和Lachman，L.(编著)，Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Decker，New York，N.Y.，1980中查阅药物制剂论述。含本发明组合物的片剂或颗粒可包薄膜衣或肠溶衣。
除了用于治疗人之外，本发明还可用于其它患者，包括宠物、爬行动物、鸟类、外来动物和家畜；包括哺乳动物、啮齿动物等。哺乳动物包括灵长类动物(例如猴或狐猴)、马、犬、猪或猫。啮齿动物包括大鼠、小鼠、松鼠或豚鼠。
本发明药用组合物可用于神经毒性抑制剂的适应症。已发现这些组合物在治疗老年性认知损害和/或痴呆(例如AD)中尤其有效。
为治疗神经变性性疾病，可用本发明组合物提供足够产生治疗反应的量的本发明化合物的剂量，例如为降低Aβ诱发的细胞毒性，提供例如约5ng至约1000mg、或约100ng至约600mg、或约1mg至约500mg、或约20mg至约400mg的量。通常，剂量有效量的范围在约0.0001mg/kg体重至1500mg/kg体重、更优选1-1000mg/kg体重，更优选约1-150mg/kg体重，最优选约50-100mg/kg体重。给药剂量每天可为一个至约四个剂量，或为每天多个剂量，以诱发治疗效果。作为说明，本发明组合物的剂量单位通常含有例如约5ng、50ng、100ng、500ng、1mg、10mg、20mg、40mg、80mg、100mg、125mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、700mg、800mg、900mg或1000mg的本发明化合物。可选择剂型以满足需要的用于达到规定剂量的给药频率。给药的组合物的单位剂型的量和治疗病症或障碍的给药方案取决于多种因素，包括患者的年龄、体重、性别和医学病症、病症或障碍的严重程度、给药途径和频率，众所周知，其变化范围可以很大。
在本发明的一个实施方案中，给予患者治疗有效量的组合物，也就是说，给予患者组合物后，在一段时间内，本发明化合物在患者血清中达到治疗有效剂量而产生所需疗效的量。作为说明，在空腹成年人(通常至少空腹10小时)中，给予受试者组合物后约5分钟，组合物在受试者血清中达到本发明化合物的治疗有效剂量。在本发明的另一实施方案中，给予受试者组合物后约10分钟，在受试者血清中达到本发明化合物的治疗有效剂量。在本发明的另一实施方案中，给予受试者组合物后约20分钟，在受试者血清中达到本发明化合物的治疗有效剂量。在本发明的又一实施方案中，给予受试者组合物后约30分钟，在受试者血清中达到本发明化合物的治疗有效剂量。在本发明的再一实施方案中，给予受试者组合物后约40分钟，在受试者血清中达到本发明化合物的治疗有效剂量。在本发明的一个实施方案中，给予受试者组合物后约20分钟至约12小时，在受试者血清中达到本发明化合物的治疗有效剂量。在本发明的另一个实施方案中，给予受试者组合物后约20分钟至约6小时，在受试者血清中达到本发明化合物的治疗有效剂量。在本发明的又一个实施方案中，给予受试者组合物后约20分钟至约2小时，在受试者血清中达到本发明化合物的治疗有效剂量。在本发明的再一个实施方案中，给予受试者组合物后约40分钟至约2小时，在受试者血清中达到本发明化合物的治疗有效剂量。以及在本发明的又一个实施方案中，给予受试者组合物后约40分钟至约1小时，在受试者血清中达到本发明化合物的治疗有效剂量。
在本发明的一个实施方案中，本发明组合物的给药剂量适合提供具有本发明化合物半数最大剂量的血清药物浓度。作为说明，给予受试者本发明组合物后，在受试者体内达到了约0.01nM至约1000nM、或约0.1nM至约750nM、或约1nM至约500nM、或约20nM至约1000nM、或约100nM至约500nM、或约200nM至约400nM的血清药物浓度。
本发明设计的组合物在给药后约5分钟至约24小时的间隔内，提供本发明药物中化合物的疗效，如果需要，允许一天一次或一天两次给药。在本发明的一个实施方案中，给予受试者组合物后约10分钟、20分钟、30分钟或40分钟，给药组合物的剂量适合提供具有以下本发明化合物的半数最大剂量的平均血清药物浓度：至少约1μg/ml；或至少约5μg/ml；或至少约10μg/ml；或至少约50μg/ml；或至少约100μg/ml；或至少约500μg/ml；或至少约1000μg/ml。
产生疗效所需的治疗药物的量可根据例如药物进入血清的摄取速率、药物的生物利用度和治疗疾病的功效实验来确定。但是，要理解，本发明治疗药物针对任何具体患者的准确剂量水平取决于多种因素，包括使用的具体化合物的活性、患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食(包括例如患者是处于空腹还是饱腹状态)、给药时间、排泄速率、药物组合、接受治疗的具体疾病的严重程度和给药形式。一般可滴定测定治疗剂量以使安全性和功效最优化。通常，在体外和/或体内试验初步得到的量效关系对患者给药的合适剂量可提供有用指导。在动物模型上的研究通常可用于指导治疗与本发明有关的胃肠道障碍或疾病的有效剂量。按照治疗方案，应该认识到给药剂量取决于几个因素，包括具体给药的药物、给药途径、具体患者的状况等。一般而言，需要给予患者化合物的有效量为：在一段时间内，有效达到与在体外发现的有效浓度相对应的血清药物水平而产生疗效的量。因此，例如治疗与高β-淀粉样蛋白诱发的神经毒性有关的障碍，当证实化合物在体外、在例如200nM浓度的半数最大有效量具有活性时，因而需要给予患者药物的量为：在一段时间内，在患者体内有效提供产生需要的疗效的约200nM浓度的半数最大有效剂量，本领域技术人员可选择其它适合测量的指标。本领域技术人员熟悉这些参数的测定。这些需要考虑的事项在本领域众所周知，而且在标准教科书中有描述。
为了测量并确定给予患者有效量的本发明化合物，本发明化合物的血清药物浓度可用标准测定技术测量。
设计的本发明组合物在给予患者后约30分钟至约24小时间隔内提供疗效。在一个实施方案中，组合物在约30分钟内提供这种疗效。在另一个实施方案中，组合物在约24小时内提供疗效，允许一天一次给药，以改进患者的顺应性。
本发明的方法、药盒和组合物还可与其它治疗或预防神经变性性疾病的药物联合使用(“联合疗法”)，例如乙酰胆碱酯酶抑制剂(即加兰他敏，盐酸多奈哌齐(donezepil)。当与本发明联合使用即联合疗法时，可实现相加或协同作用，可以减少或消除(如果不是所有的)许多数不希望的副作用。这些减少副作用的药物的表现，一般归因于例如用联合给药必须达到疗效的剂量减少。
术语“联合疗法”包括给予患者本本发明组合物和其它治疗或预防神经变性性疾病的药物，作为具体治疗方案的组成部分，从这些治疗神经变性性疾病药物的协同作用中提供有益作用。联合疗法的有益作用包括但不限于由治疗药物组合产生的、药物动力学或药效学的协同作用。这些治疗药物联合用药通常在确定的时间内完成(通常基本上同时、分钟、小时、天、周、月或年，取决于所选择的联合疗法)。“联合疗法”通常不包括作为独立的单一治疗方案的组成部分给予这些治疗药物中的两种或多种(偶然和任意产生本发明的联合作用)。“联合疗法”包括这些治疗药物按序贯方式给药，即每种治疗药物在不同时间使用；以及包括这些药物或至少这些药物的两种以基本上同时的方式用药。可实现基本上同时用药，例如给予患者每种药物具有固定比率的一片片剂或一粒胶囊剂，或含有每种治疗药物的多个、单个胶囊剂或片剂。可通过任何合适的途径，实现每种治疗药物顺序或基本上同时给药。本发明组合物可口服或鼻胃给药，尽管联合疗法中的其它治疗药物可通过任何对具体药物合适的途径给药，包括但不限于口服途径、经皮途径、静脉内途径、肌内途径或通过粘膜组织直接摄取。例如将本发明组合物口服或鼻胃给药，而且联合疗法中的治疗药物可口服或经皮给药。治疗药物给药的顺序不是非常重要。“联合疗法”还包括上述治疗药物再与其它生物活性成分(例如但不限于镇痛药)联合给药；例如与非药物疗法(例如但不限于外科手术)联合。
组成联合疗法的治疗性化合物可以为复合剂型或独立剂型，以便基本同时给药。组成联合疗法的治疗性化合物也可与通过需要两步给药方案给药的任一治疗性化合物序贯给药。因此，可能需要治疗性化合物与分开给药的单独的活性药物序贯给药的方案。多步给药的时间范围可在例如几分钟至几小时至几天，取决于每种治疗性化合物的特性例如效力、溶解度、生物利用度、血浆半衰期和治疗性化合物动力学曲线；以及取决于患者的摄食量、年龄和病症。靶分子浓度的昼夜节律性变化也能决定最佳剂量间隔。无论同时、基本同时还是序贯给药，联合疗法的治疗性化合物可能涉及需要一种经口服途径给药的治疗性化合物和经皮途径、静脉内途径、肌内途径或经粘膜组织直接摄取的另一种治疗性化合物一起给药的方案，例如。无论联合疗法的治疗性化合物是口服、通过吸入喷雾、直肠、局部、口腔、舌下、还是胃肠外(例如皮下、肌内、静脉内和皮内注射)给药；分别或一起给药，每个这种治疗性化合物会包含在药学上可接受的赋形剂、稀释剂或其它制剂成分的合适的药用制剂中。
对于口服给药，药用组合物可含有需要量的式(I)化合物，并且可为以下剂型：例如片剂、硬胶囊剂或软胶囊剂、锭剂、扁囊剂、可调配的散剂、颗粒剂、混悬剂、酏剂、液体制剂或任何其它合理的适用于口服给药的剂型。作为说明，可将这种组合物制成含有预定量的活性化合物的分离的单位剂型，例如片剂或胶囊剂。这种口服剂型还可含有例如缓冲剂。另外，片剂、丸剂等可用肠溶衣制备。
适合口腔或舌下给药的药用组合物包括例如含活性化合物和矫味基质(例如蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)的锭剂；和含活性化合物和惰性基质(例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)的软锭剂。
口服给药的液体剂型可包括药学上可接受的含有本领域常用的惰性稀释剂(例如水)的乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。这种组合物还可包括例如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香精。
合适的液体剂型的实例包括但不限于含活性化合物和β-环糊精或以下β-环糊精的水溶性衍生物的水性溶液剂，例如磺丁基醚β-环糊精；七(2，6-二甲基)-β-环糊精；羟丙基-β-环糊精和二甲基-β-环糊精。
本发明的药用组合物也可(静脉内、肌内、皮下)注射给药。这种注射用组合物可使用例如盐水、葡萄糖或水作为合适的载体材料。如果需要，可用合适的酸、碱或缓冲剂调节组合物的pH值。合适的填充剂、分散剂、湿润剂或悬浮剂，包括甘露醇和聚乙二醇(例如PEG400)也可包括在组合物中。合适的胃肠外用组合物还包括在注射瓶中冻干的活性化合物。注射前，可加入水溶液溶解该组合物。
药用组合物可以栓剂等的剂型给药。这种直肠制剂优选含有占总量例如约0.075w/w至约75％w/w、或约0.2w/w至约40％w/w、或约0.4w/w至约15％w/w的活性化合物。在这种组合物中可使用载体材料例如可可脂、可可油、其它种类的油和聚乙二醇作为栓剂基质。如果需要，也可使用其它载体材料例如包衣材料(例如羟丙基甲基纤维素薄膜包衣材料)和崩解剂(例如交联羧甲基纤维素钠和交联聚乙烯吡咯烷酮)。
主题化合物可以是游离的，或包埋在微囊、胶体药物递药系统(例如脂质体、微乳和粗乳状液)中。
这些药用组合物可通过任何合适的药剂学方法制备，包括将本发明活性化合物和一种或多种载体材料结合到一起的步骤。一般而言，组合物是将活性化合物与液体或微细固体载体、或二者均匀地混合在一起，然后如果需要，将该产物成形。例如通过压制或模制所述化合物的粉末或颗粒和任选的一种或多种补充成分制备片剂。可以将自由流动的化合物例如粉末或颗粒任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂和/或表面活性剂/分散剂可在合适的机器中混合，压缩，制备压制片。可在合适的机器上，通过将润湿的化合物粉末和惰性液体稀释剂一起塑造制备模制片。
本发明化合物的片剂也可用常规的包衣材料例如白色OpadryTMYS-1-18027A(或其它颜色)包衣，包衣粉的重量组分可约为包衣片总重的3％。通过使用在本领域已知的方法，可配制本发明的组合物以便在患者用药后提供快速释放、或缓慢释放或延迟释放的组合物。
当赋形剂作稀释剂时，其可为固体、半固体或液体材料，其担当活性成分的载体或介质。因此，组合物可以为片剂、咀嚼片剂、丸剂、锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气雾剂(作为固体或在液体介质中)、软明胶胶囊剂和硬明胶胶囊剂以及无菌包装的粉针剂。
在本发明的一个实施方案中，制备方法可使用包括以下一种或组合方法：(1)干混；(2)直接压片；(3)粉碎；(4)干法或非水制粒；(5)湿法制粒；或(6)熔融法。Lachman等， The Theory and Practice of Industrial Pharmacy(1986)。
在本发明的另一个实施方案中，通过将本发明的治疗药物与药用赋形剂混合，形成含有治疗药物和赋形剂的均质混合物的固体预制组合物，制备固体组合物例如片剂。当将这些预制组合物称为均质时，意指治疗药物在整个组合物中均匀分散，变得可以容易地将所述组合物再分为同等有效的单位剂型例如片剂、丸剂和胶囊剂。然后将该固体预制组合物再分到本文所述类型的单位剂型中。
压制片为通过压缩含有活性成分和赋形剂的制剂制备的固体剂型，所选的赋形剂应能帮助处理和改善成品的性能。术语“压制片”通常是指口服摄入的普通未包衣片剂，其通过单纯压缩或通过预压缩叩出(pre-compaction tapping)和最后压缩制备。
可以给本发明片剂或丸剂进行包衣或用其它方法配炼，以提供具有长效优点的剂型。例如片剂或丸剂可包含内层剂量和外层剂量成分，后者是前者的保护层。包括许多高分子酸以及高分子酸与紫胶、鲸蜡醇、醋酸纤维素等材料的混合物的多种材料，可用作这种肠溶层或包衣。
长期缓释植入片的应用可适用于治疗需要连续给予神经变性性疾病的患者本发明组合物。本文所用的“长期”释放是指构造和安排所述植入片至少在30天，优选在60天内释放的活性成分能达到治疗水平。长期缓释植入片是本领域普通技术人员众所周知的，长期缓释植入片包括上述的一些释放系统。
在本发明的另一实施方案中，治疗神经变性性疾病的化合物以盛有本发明的一种或多种治疗性化合物的药盒或包装形式出现。本发明这些治疗性化合物可包装在某种形式的药盒或包装物中，在其中安排每小时、每天、每周或每月(或其它周期)的剂量，能够适当地序贯或同时给药。本发明还提供盛有多种剂量单位的药盒或包装，以适合连续每天给药，每个剂量单位包含至少一种本发明的治疗性化合物。可用所述递药系统帮助本发明治疗性化合物的各种实施方案的任何方案给药。在一实施方案中，所述系统包括每天或每周给药的多种剂量。药盒或包装还可装有用于联合疗法的药物，以帮助所述剂型的适当给药。药盒或包装还可装有一套为患者提供的说明书。
相信本领域技术人员按本文提供的说明书，能最大限度地利用本发明。因此，例举以下的具体实施例仅为说明目的，并不意味着以任何方式限制本公开的其它部分。
                        实施例I
材料
Aβ1-42和Aβ肽片段购自American Peptide Co.(Sunnyvale，CA)。多克隆兔抗β-淀粉样蛋白肽(目录号71-5800)得自Zymed Laboratories(San Francisco，CA)。[22-3H]R-羟基胆甾醇(sp.act.20Ci/mmol)由American Radiolabeled Chemical(St Louis，MO)合成。胆甾醇、22R-羟基胆甾醇、22S-羟基胆甾醇、孕烯醇酮、17α-羟基孕烯醇酮和DHEA购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。细胞培养用品购自GIBCO(GrandIsland，NY)，细胞培养塑料制品购自Corning(Corning，NY)。电泳试剂和材料由Bio-Rad(Richmond，CA)提供。其它所有使用的化学品均为分析纯，得自各种商业。
组织样品
所有人组织样品购自Harvard Brain Tissue Resource Center(Belmont，MA)。将用于测定类固醇的样品在液氮中速冻或被动(passively)冷冻。脑海马和额皮层样品取自19名患者，12名AD(6男6女)和7名同年龄对照组患者(4男3女)。AD患者按Harvard TissueResource Center分类为患有“严重AD”。所有AD患者的平均年龄为74.6±7.2岁，对照组患者的平均年龄为73.4±10.5岁。AD患者的尸体解剖平均间隔时间为10.2小时，对照组为14.7小时。由Georgetown University Internal Review Board批准人组织使用规程。
22R-羟基胆甾醇的纯化与测定
样品按前述方法用反相HPLC提取和纯化。Brown，R.C.，Cascio，C.& Papadopoulos，V.(2000) J.Neurochem.74，847-859。收集含22R-羟基胆甾醇的流分(22R-羟基胆甾醇的保留时间＝55分钟)，用胆甾醇氧化酶测定法测定22R-羟基胆甾醇水平。Gamble，W.，Vaughan，M.，Kruth，H.S.& Avigan，J.(1978) J.Lipid Res.19，1068-1070。
细胞培养、细胞毒性和活力测定
按前述方法培养大鼠PC12细胞。Yao，Z.，Drieu K.&Papadopoulos，V.(2001) Brain Res.889，181-190。人NT2前体(Ntera2/D1畸胎瘤)细胞得自Stratagene(La Jolla，CA)，并按供应商的说明培养。分化人NT2神经元(NT2N)取自用视黄酸处理后的NT2前体细胞。Andrews，P.W.(1984) Dev.Biol.103，285-293。将Aβ溶于培养基中，以聚集体(在4℃下放置过夜)或可溶形式(含寡聚体例如二聚体和四聚体)使用，用前述电泳法检查。Yao，Z.等，Brain Res.(2001)。按前述方法 (同上)，用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)试验(Trevigen，Gaithersburg，MD)测定Aβ及Aβ片段的细胞毒性。细胞活力按前述方法 (同上)用锥虫蓝排除法测定。简单地说，对于这些研究，在浓度递增的Aβ存在或不存在下，细胞用类固醇处理72小时。培养结束时，细胞用PBS洗涤三次，与0.1％锥虫蓝染色液在室温下一起培养15分钟。用PBS洗涤三次后，将0.1N NaOH加入到细胞中，用Victor定量检测分光光度计(EGG-Wallac，Gaithersburg，MD)，在450nm处定量测定锥虫蓝染色。在相同样品中，按Bradford方法(Bradford，M.M.(1976) Anal.Biochem.72，248-254)，在590nm处测定考马斯蓝染色以测定细胞蛋白质水平。
胆甾醇-蛋白结合印迹测定(CPBBA)
将纯化的Aβ1-42蛋白(50μM)或各种Aβ片段(50μM)和3H-22R-羟基胆甾醇单独、或者在20μl体积的浓度递增的未标记22R-羟基胆甾醇存在下，于37℃培养24小时。培养结束时，在10XSSC缓冲液中，用1.5％琼脂糖(Type I-B)凝胶电泳分离样品，然后转移到硝酸纤维素膜(Schleicher & Schuell，Keene，NH)上。将膜暴露于氚敏屏，用CycloneStorage phosphor system(Packard BioScience，Meridien，CT)通过磷光成像分析膜，用OptiQuant软件(Packard)进行图像光密度分析。该方法适用于分离、显现和鉴定Aβ络合物，其在非变性条件下掺入了放射性标记的胆甾醇(Yao，Z.& Papadopoulos，V.，提交的手稿)和22R-羟基胆甾醇。用电泳分离和排除低分子量的未掺入的22R-羟基胆甾醇。
Aβ聚集测定
将纯化的Aβ1-42蛋白(50mM)的细胞培养基单独、或在浓度递增的22R-羟基胆甾醇存在下，于37℃培养24h。培养结束时，在125V电压下，在4％-20％梯度丙烯酰胺-双丙烯酰胺凝胶上，用SDS-PAGE分离蛋白2小时。蛋白质用考马斯蓝染色显现。通过免疫印迹分析鉴定各种Aβ种。Yao，Z.等， Brain Res.(2001)。
免疫印迹分析
然后用含有22R-羟基胆甾醇-Aβ肽络合物的膜检测Aβ水平。通过在5％牛奶中培养硝酸纤维素封闭所述膜，然后用ECL试剂处理以便进行Aβ免疫检测(Amersham-Pharmacia，Piscataway，NJ)。Li，H.，Yao，Z.，Degenhardt，B.，Teper，G.& Papadopoulos，V.(2001) Proc.Natl. Acad.Sci.USA 98，1267-1272。抗Aβ抗体和第二抗体分别按0.2μg/ml和1∶5000稀释度使用。
肽建膜和22R-羟基胆甾醇对接
用在Aβ1-40Met(O)(MMDB同上：7993PDB同上：1BA)(由CD和NMR光谱产生的数据)的溶液结构中生成的Aβ结构，完成22R-羟基胆甾醇与Aβ17-40和Aβ25-35的计算机对接。Watson，A.A.，Fairlie，D.P.，& Craik，D.J.(1998) Biochemistry 37，12700。Met(O)SME35残基被保留相邻的骨架双面夹角和提取的残基17-40的配位价的Met置换。运用Alchemy 2000程序(Tripos，St.Louis，MO)开发出22R-羟基胆甾醇结构。用Monte Carlo模拟退火(Li，H.等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2001))完成对接，并且按修订版的Autogrid/Autodock.Morris，G.M.，Goodsell，D.S.，Halliday，R.S.，Huey，R.，Hart，W.E.，Belew，R.K.，&Olson，A.J.(1998)； J.Comput.Chem.19，1639-1662方法完善对接。在约109的构象中评价最小能量的构象。执行5轮组成100次运行，每轮在配体与靶标的随机初始相对位置和取向开始。每次运行由用约2×104改进步骤的100个退火循环组成。用1.7GHz、1GB RAM个人电脑和改进的程序计算，总的计算时间约为15分钟。
统计
用INSTAT 3.00程序包(GraphPad，San Diego，CA)，按照单向方差分析(ANOVA)和非配对学生氏t检验进行统计学分析。
结果
如图2所示，人脑内源性22R-羟基胆甾醇水平经HPLC纯化，用胆甾醇氧化酶测定法测定。报告的数据为两次测定的12名AD和7名相同年龄对照组样品的平均值±SEM。图2显示，AD患者脑海马标本中的22R-羟基胆甾醇水平与相同年龄组对照组相比减少60％(p＝0.04)。尽管没有显著意义，AD患者脑额皮层标本中的22R-羟基胆甾醇水平与相同年龄组相比也减少50％。
在浓度递增的22R-羟基胆甾醇(图3A)、胆甾醇(图3B)、孕烯醇酮(图3C)或17α-羟基孕烯醇酮(图3D)、DHEA(图3E)或22S-羟基胆甾醇(图3F)不存在或存在下，用指定浓度的Aβ1-42处理PC12细胞24小时。所示结果为平均值±SD(n＝6-12)。用线粒体黄递酶测定MTT法测定22R-羟基胆甾醇拯救大鼠PC12神经元细胞抵抗Aβ诱发的细胞毒性的能力。
分别在5.0μM和50μM Aβ存在下，Aβ1-42诱发的分别达到26％(p＜0.001)和40％(P＜0.001)细胞死亡的剂量依赖性神经毒性(图3A)。尽管在10μM和100μM的22R-羟基胆甾醇存在下出现非显著性提高，但浓度递增的22R-羟基胆甾醇不影响PC12细胞活力(图3A)。22R-羟基胆甾醇能够拯救所有细胞抵抗25μM Aβ诱发的细胞毒性(P＜0.001)；和在50μM Aβ存在下，拯救50％(p＜0.01)的即将死亡的细胞(图3A)。有趣的是，22R-羟基胆甾醇只与Aβ同时存在时才有效。用22R-羟基胆甾醇预处理PC12细胞后，随后用Aβ处理无法对细胞提供任何的保护(数据未显示)。
用其前体胆甾醇(图3B)或其代谢物孕烯醇酮(图3C)重复不出22R-羟基胆甾醇的神经保护性作用。相反，单独的胆甾醇和孕烯醇酮都对细胞有毒性。而且，胆甾醇的存在加大低浓度Aβ的毒性作用。单独的17α-羟基孕烯醇酮也对细胞有毒性(图3D)。100μM DHEA对细胞活力有积极作用。相同浓度的DHEA防止5μM(p＜0.001)Aβ诱发的神经毒性，但对50μM无效(图3E)。22R-羟基胆甾醇的作用为立体专一性的，因为22S-羟基胆甾醇不仅没有防止Aβ诱发的神经毒性，而且在100μM浓度下还有神经毒性(图3F)。
应该注意，在例举的这些研究中，使用的是聚集的Aβ(放置过夜，4℃)。在另外的试验中，将可溶性Aβ(含寡聚体)直接加入到PC12细胞中，发现其有毒性(数据未显示)。22R-羟基胆甾醇还有防止Aβ寡聚体诱发的毒性(未显示)。
22R-羟基胆甾醇的神经保护性作用并不限于PC12细胞，而在分化人NT2N神经元中也可以重现(图4)。在22R-羟基胆甾醇存在或不存在下，用25μM Aβ1-42处理分化人NT2N神经元72h。尽管1μM和10μM的22R-羟基胆甾醇分别保护50％(p＜0.01)和100％(p＜0.001)人神经元抵抗Aβ诱发的毒性，但25μM Aβ抑制50％(p＜0.001)的人神经元活力(图4)。为评价22R-羟基胆甾醇是否拯救人NT2细胞抵抗其它毒性损害，在1-50μM 22R-羟基胆甾醇存在或不存在下，用5mM谷氨酸盐处理NT2细胞3天。用MTT测定法测定，谷氨酸盐引起细胞活力下降30％，而22R-羟基胆甾醇不能保护细胞(数据未显示)。
MTT测定获得的结果用锥虫蓝染料排除测定法进一步证实。在100μM 22R-羟基胆甾醇或DHEA存在或不存在下，PC12细胞用浓度递增的Aβ1-42(图5A)或Aβ25-35(图5B)处理72小时。在25μM 22R-羟基胆甾醇或DHEA存在或不存在下，NT2细胞用浓度递增的Aβ1-42(图5C)或Aβ25-35(图5D)处理72小时。活力水平用材料和方法中描述的锥虫蓝测定法测定。结果以每总细胞蛋白的锥虫蓝染色细胞相对于未处理对照细胞的倍数表示。所示结果为平均值±SD(n＝6-12)。图5A和图5C显示22R-羟基胆甾醇既拯救大鼠PC12细胞(图5A)又拯救人NT2细胞(图5C)抵抗Aβ1-42诱发的细胞死亡。相反，DHEA只保护大鼠PC12细胞抵抗Aβ1-42诱发的细胞死亡，而不保护NT2细胞(图5A和图5C)。22R-羟基胆甾醇和DHEA都不能拯救PC12和NT2细胞抵抗Aβ25-35诱发的细胞死亡(图5B和图5D)。
还检测了22R-羟基胆甾醇改变Aβ聚集的能力。将纯化的Aβ1-42蛋白(50μM)在细胞培养基中单独、或在浓度递增的22R-羟基胆甾醇存在下，于37℃培养24小时。培养结束时，用SDS-PAGE分离蛋白，并用考马斯蓝显现(图6A)。形成的各种Aβ用抗Aβ多克隆抗血清免疫印迹鉴定(图6B)。在凝胶的顶部可观察到Aβ聚集，在对照培养基泳道不存在聚集。图6A和6B显示22R-羟基胆甾醇不影响Aβ聚集，该聚集用考马斯蓝染色凝胶(图6A)的免疫印迹分析(图6B)鉴定。在包括在对照培养基中使用的所有样品中，经Aβ多克隆抗血清识别的100kDa条带可能反映出抗血清的非特异结合。
然后检测22R-羟基胆甾醇的作用机制。鉴于22R-羟基胆甾醇只在Aβ存在下有神经保护性(作用)，用新方法(CPBBA法)探索了22R-羟基胆甾醇与Aβ的直接相互作用。将放射性标记的22R-羟基胆甾醇与Aβ1-42在37℃下一起培养24小时，证明存在可被Aβ的特异性抗体(图7B)所识别的高分子量放射性标记条带(图7A)。用未标记的22R-羟基胆甾醇进行的竞争性研究证明，22R-羟基胆甾醇与放射性标记的Aβ1-42的特异性(图7A)。在这些研究中，50μM和200μM 22R-羟基胆甾醇分别抑制50％和90％的放射性标记的22R-羟基胆甾醇与50μMAβ1-42的结合，如放射性标记的Aβ1-42图像分析所示(图7A)。用放射性标记的Aβ1-42免疫印迹分析，评价Aβ1-42在培养反应和CPBBA中的等量加样(图7B)。应该注意，尽管在50-200μM 22R-羟基胆甾醇存在下观察到放射性标记的Aβ1-42减少，但在各泳道存在的Aβ1-42的量没有差异。这些数据表明，在非变性条件下，22R-羟基胆甾醇与Aβ结合。用CPBBA和各种Aβ合成肽，测得22R-羟基胆甾醇在Aβ结合位点是在Aβ的氨基酸17-40位(图7C和图7E)。有趣的是，在22R-羟基胆甾醇(图7B和图7D)存在下，保持其神经毒性的肽Aβ25-35不结合22R-羟基胆甾醇(图7C)。用计算对接模拟进一步证实了这些数据。对接结果显示Aβ17-40形成一个口袋，22R-羟基胆甾醇在该处可对接(图7D)。通过氨基酸G29A30I31形成的该口袋捕获到22R-羟基胆甾醇的C27-29原子。R与S的相对定位允许22R-羟基胆甾醇对接。用Aβ25-35进行的类似研究表明，尽管在19-36区域存在一些氨基酸，但Aβ25-35与22R-羟基胆甾醇的对接能(-6.0510kcal/mol)比Aβ17-40(-8.6939Kcal/mol)和Aβ1-42(-9.6960Kcal/mol)高，提示该类固醇不与Aβ25-35结合，与CPBBA数据相符。
讨论
在脑中，神经类固醇(孕烯醇酮和DHEA)蓄积不依靠外周内分泌器官供应(Baulieu，E.E.& Robel，P.(1990) J.Steroid Biochem.Mol. Biol.37，395-403)，充当神经调节剂(Paul，M.P.& Purdy，R.H.(1992)FASEB J.6，2311-2322)，并且可作为各种神经病理学的药理学工具(Costa，E.，Cheney，D.L.，Grayson，D.R.，Korneyev，A.，Longone，P.，Pani，L.，Romeo，E.，Zivkovich，E.& Guidotti，A.(1994) Ann.N.Y.Acad. Sci.746，223-242)。神经胶质细胞可将胆甾醇转换为孕烯醇酮。体外研究表明，少突胶质细胞、神经胶质瘤细胞株和神经膜细胞表达的细胞色素P450负责胆甾醇侧链切割，因此形成孕烯醇酮。Jung-Testas，I.，Hu，Z.，Baulieu，E.E.& Robel，P.(1989) Endocrinology 125，2083-2091；Papadopoulos，V.，Guarneri，P.，Krueger，K.E.，Guidotti，A.&Costa，E.(1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，5113-5117；Akwa，Y.，Schumacher，M.，Jung-Testas，I.& Baulieu，E.E(1993) C.R.Acad.Sci III(France)316，410-414。P450侧链切割酶也存在于啮齿动物脑中(Stromstedt，M.& Waterman，M.R.(1995) Mol.Brain Res.34，75-88)，并存在于AD和相同年龄对照组脑标本中(Brown，R.C.，Han，J.Cascio，C.& Papadopoulos，V.(2002) Neurobiol.Aging，即将出版)。已有文章详细记述了在该酶反应中形成的三个羟基化中间体中的一个为22R-羟基胆甾醇。Dixon，R.等， Biochem.Biophys.Res.Commun.(1970)；Hall，P.F.(1985) Vitamins & Hormones 42，315-368。22R-羟基胆甾醇比胆甾醇极性更强，容易转运穿过细胞膜。在本研究中，发现在AD患者脑标本中的22R-羟基胆甾醇的水平比相同年龄对照组低。22R-羟基胆甾醇的水平在海马(对学习和记忆等认知功能至关重要的脑边缘系统结构)中显著降低，其在AD中受到影响。Aβ的生理功能是调节胆甾醇的转运(Yao，Z.& Papadopoulos，V.，FASEB Journal，16：1677-1679)。根据这项发现，22R-羟基胆甾醇的减少可能是因为Aβ在AD患者脑中过量生成(Roher，A.E.，Lowenson，J.D.，Clark，S.，Wolkow，C.，Wang，R.，Cotter，R.J.，Reardon，I.M.，Zurcher-Neely，H.A.，Heinrikson，R.L.，Ball，M.J.& Greenberg，B.D.(1993) J.Biol.Chem.286，3072-3083；Younkin，S.G.(1998) J.Physiol.92，289-292)阻断了细胞对胆甾醇的交换或减少了细胞对胆甾醇的摄取，因此影响神经类固醇形成对底物胆甾醇的利用率，导致AD患者脑中的22R-羟基胆甾醇合成减少。另外，将AD脑标本的胆甾醇用于增加孕烯醇酮和DHEA的从头合成，也会耗竭AD中可利用的22R-羟基胆甾醇中间体。在AD海马中出现孕烯醇酮和DHEA水平增加(Brown，R.C.，Han，Z.，Cascio，C.& Papadopoulos，V.(2003)Neurobiology of Aging，24：57-65))，是由Aβ诱发的(Brown，R.C.，Cascio，C.& Papadopoulos，V.(2000)J.Neurochem.74：847-859)。Aβ诱发的胆甾醇交换减少和胆甾醇代谢增加，这两个事件可能在AD中发生，导致22R-羟基胆甾醇水平降低也是可能的。
对于这些研究，均采用公认的大鼠PC12神经元细胞模型。然而，22R-羟基胆甾醇的神经保护性作用并不限于啮齿动物神经元，在人NT2和NT2N神经元细胞也发现该作用。NT2细胞是人畸胎瘤细胞的克隆系，源自NT2细胞的NT2N是有丝分裂期后的、具有与中枢神经系统神经元一致的细胞表面标记的终末分化的神经元。Andrews，P.W.， Dev.Biol.(1984)。发现22R-羟基胆甾醇以剂量依赖性方式保护大鼠和人神经元抵抗Aβ诱发的毒性，其对PC12和NT2T细胞的IC50分别为10μM和3μM。用22R-羟基胆甾醇处理的细胞可给细胞提供完全保护25μM浓度的Aβ，提供50％的神经防止50μM Aβ肽。
在B12大鼠神经细胞中，用淀粉样蛋白原纤维诱发的MTT甲胞吐测定法，对多种公认的类固醇抗Aβ的神经保护特性进行了测试。Liu Y.& Schubert，D.(1998) J.Neurochem.71，2322-2329。在这些研究中，Liu和Schubert认为阻断淀粉样蛋白原纤维诱发的MTT甲胞吐的化合物(不影响对照细胞的胞吐作用)，应该作用于上游靶，因而具有神经保护性作用。 同上。除22R-羟基胆甾醇作用外，还用检测蓝甲形成的MTT测定法，检测参与胆甾醇代谢的各种类固醇的神经保护特性。在这些经Aβ诱发的PC12神经毒性测试的类固醇中，除了22R-羟基胆甾醇和DHEA，其它所有都有毒性。DHEA对啮齿动物神经元的神经保护性作用与先前的研究一致。Kimonides，VG，Khatibi，NH，Svendsen，CN，Sofroniew，MV，& Hervert，J(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，1852-1857；Cardounel，A，Regelson，W，&Kalimi，M(2000) Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，222，145-149。但是，与22R-羟基胆甾醇相反，DHEA对Aβ诱发的人NT2细胞死亡不起作用，提示22R-羟基胆甾醇的作用不是种特异性，可能因为该类固醇与Aβ直接相互作用。发现胆甾醇(22R-羟基胆甾醇的前体)具有神经毒性。但是，在碳22(R)位存在羟基不仅降低胆甾醇的毒性作用，而且防止Aβ诱发的神经毒性。通过观察，发现其对映体22S-羟基胆甾醇无活性，而且在高浓度时具有神经毒性，进一步证实22R-羟基胆甾醇作用的特异性。
用新的测定法(CPBBA)显示22R-羟基胆甾醇与Aβ直接相互作用。在非变性条件下，该测定法适用于放射性标记的类固醇与Aβ、或Aβ肽片段直接互相作用的研究和显现。放射性标记的22R-羟基胆甾醇与Aβ结合，而未标记的22R-羟基胆甾醇取代该结合的类固醇。CPBBA表明22R-羟基胆甾醇结合Aβ1-42和Aβ17-40，但几乎不与Aβ1-40相互作用。纯化的淀粉样蛋白斑质谱分析表明，Aβ1-42是淀粉样蛋白沉淀的主要成分，因此，据信Aβ1-42是AD发病机制的主要元凶。Roher，A.E.等， J.Biol.Chem.(1993)；Younkin，S.G.，J.Physiol.(1998)。据信40个氨基酸的较短型Aβ没有病理作用(Brown，R.C.等，J.Neurochem.(2000))，并且在AD脑中较少(Roher，A.E.等， J.Biol.Chem.(1993)；Younkin，S.G.，J.Physiol.(1998))。根据报道的Aβ结构的计算模型化模拟表明，当羟基具有R定位时，氨基酸 19-36捕获捕获22-R羟基胆甾醇的侧链。有趣的是，已知具有毒性作用的 肽Aβ25-35 (Schubert，D.，Behl，C.，Lesley，R.，Brack，A.，Dargusch，R.，Sagara，Y.& Kimura H.(1995) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，1989-1993)即使在22R-羟基胆甾醇存在下，仍保留其神经毒性特性。计算模型化模拟和CPBBA无法显示22R-羟基胆甾醇和肽Aβ25-35的相互作用，提示是Aβ1-42和Aβ17-40的三维构象而非一级氨基酸序列，提供氨基酸19-36与22R-羟基胆甾醇相互作用的能力。
22R-羟基胆甾醇与Aβ1-42的氨基酸17-40结合导致保护/拯救啮齿动物和人神经元细胞抵抗Aβ1-42诱发的细胞毒性和细胞死亡。22R-羟基胆甾醇阻断Aβ的神经毒性作用的确切机制尚不得而知。但是，本文出具的数据表明其不影响Aβ的聚合。22R-羟基胆甾醇与Aβ1-42结合可能改变Aβ单体或多聚体的构象，因此致使其无活性，或阻止Aβ与细胞相互作用或激活介导其毒性作用的胞内机制。因此，除了在AD脑中Aβ1-42生成增加外，AD患者脑中22R-羟基胆甾醇水平比相同年龄对照组低，导致脑降低/失去抵抗A1-42诱发的神经毒性的能力。这一点可能对与早老蛋白1样家族性早老性痴呆(FAD)患者尤其正确，这类患者的Aβ1-42水平最高。Borchelt，D.R.，Thinakaran，G.，Eckman，C.B.，Lee，M.K.，Davenport F.，Ratovitsky，T.，Prada，C-M.，Kim，G.，Seekins，S.，Yager，D.，Slunt，H.H.，Wang，R.，Seeger M.，LeveyA.I.，Gandy S.E.，Copeland N.G.，Jenkins N.A.，Price DL，Younkin S.G.& Sisodia S.S.(1996)， Neuron 17，1005-1013。
                            实施例II
材料
Aβ1-42肽购自American Peptide Co.(Sunnyvale，CA)。22R-羟基胆甾醇(SP222)购自Sigma(St.Louis，MO)。[22-3H]R-羟基胆甾醇(sp.act.20Ci/mmol)由American Radiolabeled Chemical(St Louis，MO)合成。22R-羟基胆甾醇衍生物(SP223-238)购自Interbioscreen(Moscow，Russia)。细胞培养用品购自GIBCO(Grand Island，NY)，细胞培养塑料制品得自Corning(Corning，NY)和Packard BioSciences Co.(Meriden，CT)。
22R-羟基胆甾醇衍生物的计算机筛选
运用ISIS软件(Information Systems，Inc.，San Leandro，CA)，在天然存在的实体的Interbioscreen数据库中筛选含22R-羟基胆甾醇结构的化合物。选择和测试的22R-羟基胆甾醇(SP222)及衍生物(SP223-238)的结构示于图1，而每个化合物的代号、化学名称和来源示于表1。细胞培养和处理
在37℃和5％CO2下，将得自ATCC(Manassas，VA)的PC12细胞(大鼠嗜铬细胞瘤神经元)在不含谷氨酰胺、补充10％胎牛血清和5％马血清的RPMI 1640培养基中进行培养。Yao Z，Drieu K和Papadopoulos V.，The Gingko biloba extract EGb 761 rescues PC12neuronal cells from β-amyloid-induced cell death by inhibiting theformation of β-amyloid-derived diffusible neurotoxic ligands(通过抑制β-淀粉样蛋白衍生的弥散性神经毒性配体形成，银杏叶提取物EGb761拯救PC12神经元细胞抵抗β-淀粉样蛋白诱发的细胞死亡)，BrainRes2001，889：181-190。将细胞接种到96孔板(8×104细胞/孔)上。经一夜培养后，在指定浓度的待测SP化合物存在或不存在下，将浓度递增的聚集Aβ(0.1μM、1μM和10μM)加入到所述细胞中。经过72小时培养后，检测各种参数和细胞活力的标记物。将小鼠MA-10肿瘤间质细胞在补充热灭活的5％胎牛血清和2.5％马血清的DMEM/Ham’s F12(Biofluids，Rockville，MD)培养基中，在5％CO2下，于37℃进行培养。将细胞按2.5×104细胞/孔的密度接种到96孔板上过夜。在0.2ml/孔的无血清培养基中，细胞用指定浓度的各种SP化合物刺激2小时。收集培养基，通过放射免疫测定法测定其对孕酮生成的影响。
MTT细胞毒性测定
用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)测定法(Trevigen，Gaithersburg，MD)评价Aβ的细胞毒性。简单地说，将10μl的MTT溶液加入到在100μl培养基中培养的细胞。经过4小时培养后，加入100μl去垢剂，将细胞在37℃下培养过夜。用Victor定量检测分光光度计(EGG-Wallac，Gaithersburg，MD)，在600nm和690nm处定量检测甲蓝形成，结果以(DO600-DO690)表示。尽管MTT测定法广泛用于评价用Aβ处理的神经元细胞的细胞毒性，但已提示，在各种类固醇存在下得到的结果可反映出Aβ依赖的小泡再循环，导致MTT甲胞吐增加和损失。Liu Y和Schubert D，Steroid hormonesblock amyloid fibril-induced 3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)formazan exocytosis：relationship toneurotoxicity(类固醇激素阻断淀粉样蛋白原纤维诱发的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)甲胞吐：与神经毒性的关系)，JNeurochem 1998，19：1639-1662。为此，使用其它的细胞毒性和细胞活力的测定法。
锥虫蓝细胞活力测定
用前述的锥虫蓝排除法测定细胞活力。Yao Z，Drieu K和Papadopoulos V，The Gingko biloba extract EGb 761 rescues PC12neuronal cells from β-amyloid-induced cell death by inhibiting theformation of β-amyloid-derived diffusible neurotoxic ligands(通过抑制β-淀粉样蛋白衍生的弥散性神经毒性配体形成，银杏叶提取物EGb761拯救PC12神经元细胞抵抗β-淀粉样蛋白诱发的细胞死亡)，BrainRes 2001，889：181-190。简单地说，在浓度递增的Aβ存在或不存在下，用SP化合物处理细胞72小时。培养结束时，细胞用PBS洗涤三次，然后用0.1％锥虫蓝染色液在室温下培养15分钟。用PBS洗涤三次后，将0.1N NaOH加入到细胞，然后在450nm处，用Victor定量检测分光光度计定量检测锥虫蓝。
膜电位的测定
还用发光试剂盒CytoLiteTM(Packard BioScience Co.)，按照生产商的建议，评价细胞活力。简单地说，培养细胞，然后在96孔板中处理细胞，经过72小时培养后，将25μl激活剂溶液加入细胞中，随后加入150μl Amplifier溶液。计数前待机5分钟，然后用TopCountNXTTM计数器(Packard BioSciences Co.)检测发光。
细胞ATP水平测定
用ATPLite-MTM发光测定法(Packard BioSciences Co.)测定细胞ATP浓度。对于这种测定法，在黑色96孔ViewPlateTM上培养细胞，按照生产商的建议，用TopCount NXTTM计数器(Packard BiosciencesCo.)测定ATP浓度。
放射免疫测定法
用抗孕酮抗血清(ICN，Costa Mesa，CA)，按照生产商推荐的条件，通过放射免疫测定法测定MA-10细胞产生的孕酮。调整各孔中的蛋白量使孕酮的产生标准化。运用MultiCalc软件(EG&G Wallac，Gaithersburg，MD)，分析放射免疫测定数据。
22R-羟基胆甾醇-蛋白结合印迹测定(CPBBA)
将纯化的Aβ(50μM)和3H-22R-羟基胆甾醇单独、或者在100μM的未标记22R-羟基胆甾醇(SP-222)、或在各种20μl体积的22R-羟基胆甾醇衍生物存在下，于37℃培养8小时或24小时。培养结束时，在非变性条件下，在10XSSC缓冲液中用1.5％琼脂糖(Type I-B)凝胶电泳分离样品，然后将其转移到硝酸纤维素膜(Schleicher & Schuell，Keene，NH)。将所述膜暴露于氚敏屏，并用Cyclone Storage phosphorsystem(Packard BioScience，Meridien，CT)通过磷光成像进行分析，用OptiQuant软件(Packard BioScience)进行图像光密度分析。所述方法适用于Aβ络合物的分离、显色和鉴定，其已在非变性条件下掺入放射性标记的胆甾醇(Yao Z.和Papadopoulos V.，Function of β-amyloidin cholesterol transport：a lead to neurotoxicity(β-淀粉样蛋白在胆甾醇转运中的功能：神经毒性的先导)， FASEB J 2002，16：1677-1679)和22R-羟基胆甾醇(Yao Z.X.等， J Neurochem 2002，83：1110-1119)或22R-羟基胆甾醇衍生物。在电泳期间，分离并排除低分子量未结合的22R-羟基胆甾醇及衍生物。
肽建模与对接模拟
用在Aβ1-40Met(O)(MMDB同上：7993PDB同上：1BA)(由CD和NMR光谱测得的数据)溶液结构初始化的Aβ结构，完成22R-羟基胆甾醇及其16种衍生物与Aβ1-42的计算机对接。Watson，A.A.，Fairlie，D.P.和Craik，D.J.Solution structure of methionine-oxidized amyloidbeta-peptid(1-40)(甲硫氨酸氧化的淀粉样β-肽溶液结构(1-40))。Doesoxidation affect conformational switching？(氧化影响构象转换吗？)，Biochem.(1998)，37，12700-12706。Met(O)SME 35残基被保留相邻骨架双面夹角和附带的I41和A42残基的Met置换。然后用Alchemy 2000程序(Tripos，St.Louis，MO)使该结构的能量最小化。22R-羟基胆甾醇衍生物结构也用Alchemy 2000生成。用前述Monte Carlo模拟退火完成分子对接。Li，H.，Yao Z.，Degenhardt B.，Teper G.和PapadopoulosV.，Cholesterol binding at the cholesterol recognition/interaction aminoacid consensus(CRAC)of the peripheral-type benzodiazepine receptorand inhibition of steroidogenesis by an HIV TAT-CRAC peptide(在外周型苯并二氮杂受体的胆甾醇-氨基酸识别/相互作用的共同区域结合的胆甾醇，和HIV TAT-CRAC肽抑制类固醇生成)， Proc Natl Acad Sci USA 2001，98：1267-1272，按修订版的Autogrid/Autodock实施。MorrisG.M.，Goodsell D.S.，Halliday R.S.，Huey R.，Hart W.E.，Belew R.K.和Olson A.J.，Distributed automated docking of flexible ligands toproteins：parallel applications of AutoDock 2.4(柔性配体与蛋白指定的自动对接：AutoDock 2.4的平行应用)， J Comput Chem 1998，19：1639-1662。对于每一对化合物/Aβ，约需评价108个构象以选择一种最小能量。执行3轮组成的100次运行，每轮在配体相对于靶标的随机初始位置和定位开始。每次运行由使用约2×104改进步骤的100个退火循环组成。用1.7GHz、1GB RAM个人电脑，每对配体/靶标的平均计算时间约为2小时。
统计学分析
用INSTAT 3.00(GraphPad，San Diego，CA)，按照单向方差分析(ANOVA)和非配对学生氏t检验进行统计学分析。
结果
将PC12细胞在浓度递增的Aβ中暴露3天，产生剂量依赖性细胞死亡(图8)，达到最大细胞浓度的50％，与本文先前的数据相符。Yao Z.X.等， J Neurochem 2002，83：1110-1119；和Yao Z.，Drieu K.和Papadopoulos V.，The Gingko biloba extract EGb 761 rescues PC12neuronal cells from β-amyloid-induced cell death by inhibiting theformation of β-amyloid-derived diffusible neurotoxic ligands(通过抑制β-淀粉样蛋白衍生的弥散性神经毒性配体形成，银杏叶提取物EGb761拯救PC12神经元细胞抵抗β-淀粉样蛋白诱发的细胞死亡)，BrainRes 2001，889：181-190。为与AD脑中Aβ浓度相近，使用0.1-10μM Aβ浓度。在浓度30μM和50μM(图9-15)，测试试验化合物的神经保护特性。
图9-11显示用MTT测定即测定NADPH黄递酶活性，先导化合物22R-羟基胆甾醇(SP222)和含22R-羟基胆甾醇结构的化合物(SP223-238)对Aβ诱发的神经毒性的影响。图9-11显示这些化合物分别对0.1μM、1.0μM和10.0μM Aβ诱发的神经毒性的作用，用NADPH黄递酶活性的抑制百分率表示。100％抑制水平对应于单独给予Aβ所诱发的蓝甲形成减少。
SP222保护PC12细胞抵抗0.1μM和1μM Aβ，但在10μM Aβ下，只提供有限的神经保护。应该注意到，根据所用细胞的传代数，观察到SP-222对高浓度的Aβ作用的差异很大。SP228、SP229、SP233、SP235、SP236、SP237和SP238显示有抵抗0.1μM Aβ的神经保护性活性，但只有SP233、SP235、SP236和SP238明显比SP222有更强的显著性作用(图9A-9P)。SP233、SP236和SP238保持其抵抗1μM Aβ诱发的毒性的神经保护特性(图10A-10P)，但只有SP233和SP238在10μM Aβ存在下仍保持这种特性(图11A-11P)。
用评价膜电位的Cytolite测定法测定SP222、SP233、SP235、SP236和SP238，结果证实了用MTT测定获得的结果。图12A显示Aβ暴露诱发剂量相关的评价膜电位的发光减少。尽管SP222抵抗0.1μMAβ(图12B)，但其未能抵抗两个最高浓度的Aβ(图12C和图12D)。如测得的发光增强所示，使用的各种SP化合物证实明显比SP222的神经保护性作用强。通过在相同条件下(图12D)提高信号，可重复在MTT测定(图11)中观察到的SP233和SP238对10μM Aβ的神经保护性作用。
在SP222-SP238化合物(图13A-13D)存在或不存在下，测定用浓度递增的Aβ处理的PC12细胞ATP水平(一种线粒体功能的指数)。Aβ以剂量依赖性方式减少PC12细胞产生ATP；在0.1μM、1.0μM和10μM Aβ存在下，测得ATP水平分别下降18％、22％和25％(p＜0.001，ANOVA法；图13A)。在测试的化合物中，只有SP233和SP236能够逆转0.1μM和1.0μM Aβ诱发的ATP水平降低(图13B和图13C)。在10μM Aβ存在下，没有发现SP化合物对ATP合成的有益作用。
细胞摄取锥虫蓝是第四个试验，用于评价有希望的SP233化合物对Aβ诱发的毒性的影响(图14A)。正如所料，0.1μM、1μM和10μMAβ诱发的剂量依赖性(分别为33％、36％和97％；p＜0.001，ANOVA法)增加PC12细胞摄取锥虫蓝。30μM和50μM SP233抑制Aβ诱发的细胞死亡(p＜0.001 ANOVA法)。图14B显示尽管在高、超病理生理Aβ浓度存在下其功效下降，SP233的神经保护性作用为剂量依赖性，并且在所有这三个Aβ浓度存在下保持其原有特性。
鉴定22R-羟基胆甾醇衍生物的一个原因是需要生物活性(神经保护性)化合物，所述化合物不能被P450scc代谢为孕烯醇酮，然后代谢为组织特异性的最终类固醇产物。为评价类固醇生成细胞对这些化合物的代谢，本发明人检测了这些化合物在MA-10小鼠肿瘤间质细胞形成类固醇的能力，所述细胞为一种充分表征的类固醇生成细胞模型，其中22R-羟基胆甾醇为良好的P450scc底物，并且能够产生大量的类固醇。Li H.，Yao Z.，Degenhardt B.，Teper G.和Papadopoulos V.，Cholesterol binding at the cholesterolrecognition/interaction acid consensus(CRAC)of the peripheral-typebenzodiazepine receptor and inhibition of steroidogenesis by an HIVTAT-CRAC peptide(在外周型苯并二氮杂受体的胆甾醇-氨基酸识别/相互作用的共同区域结合的胆甾醇，和HIV TAT-CRAC肽抑制类固醇生成)， Proc Natl Acad Sci USA 2001，98：1267-1272。图15显示：与SP222相反，SP233不能被代谢为最终类固醇产物。
鉴于先前对基于22R-羟基胆甾醇(SP222)神经保护性作用机制的研究，其中用实施例1的CPBBA方法显示了22R-羟基胆甾醇和Aβ的直接相互作用，进行类似的实验以了解22R-羟基胆甾醇衍生物是否与Aβ结合。这些化合物与Aβ的直接相互作用在抗放射性标记的22R-羟基胆甾醇/Aβ络合物(图16)的替代研究中出现。将放射性标记的22R-羟基胆甾醇与Aβ在37℃一起培养24小时，证明存在高分子量的放射性标记条带(图16)，其可被Aβ的特异性抗体所识别(Yao等，2002，数据未显示)。通过用未标记的22R-羟基胆甾醇(图16)进行的竞争性研究证实，22R-羟基胆甾醇对放射性标记的Aβ的特异性，其中100μM SP222置换了80％放射性标记的与Aβ结合的SP222化合物。在测试的SP化合物中，SP237、SP238、SP226、SP227和SP233分别置换了与Aβ结合的46％、44％、65％、38％和35％的放射性标记的22R-羟基胆甾醇(图16)。
用与Aβ计算对接模拟进一步证实了这些数据。对接结果表明，Aβ1-42在19-36氨基酸区域形成一个与22R-羟基胆甾醇结合的口袋(图17)，与本文先前的数据一致。Yao Z.X.等 J Neurochem 2002，83：1110-1119。各种被测化合物的对接能按与Aβ结合所需的最小能量的次序排列：(-10.34kcal/mol)SP229＜SP232＜SP224＜SP237＜SP222＜SP233＜SP228＜SP223＜SP230＜SP234＜SP225＜SP238＜SP236＜SP226＜SP235＜SP231＜SP227(-8.35kcal/mol)。图18A和18B比较了SP222、SP233的结合特性。这是每个化合物运行100次的对接分析。数据显示在约23％的时间内，SP233对接能为-7.0至-7.5Kcal/mol；而SP222在约25％时间内，对接能只为5.5-6.0kcal/mol。SP233具有更高对接能的概率(负数更大)明显比SP222大。在几乎100％的时间内，SP233的结合能小于-6.0kcal/mol，而在相同时间内SP222的结合能只约为-4.0kcal/mol。对结合能频率分布的分析表明，双峰分布提示在Aβ中存在两个结合位点。对于SP233，峰可能出现在-7至-7.5以及-8至-8.5kcal/mol；而对于SP222，峰位于-5.5至-6.0以及-4.0至-4.5kcal/mol。
讨论
本专利申请人发现与相同年龄对照组标本相比，AD脑海马和额皮层中的22R-羟基胆甾醇在下降，促使对该类固醇在脑中的功能进行研究，导致发现22R-羟基胆甾醇保护大鼠PC12和人分化NT2N细胞抵抗Aβ毒性。
本申请人最初使用的是MTT测定法(一种广泛使用的细胞活力和细胞毒性的标记物)。即使当PC12细胞暴露在高达10μM的Aβ浓度下，使用这种测定法，一些称为SP233、SP235、SP236和SP238的被测化合物还显示出神经保护性活性。有趣的是，这些化合物比22R-羟基胆甾醇(SP222)参比分子更有效。
Aβ作用机制的一个最新事件是，直接或间接的破坏线粒体呼吸链，导致ATP生成减少，仅此即可导致细胞死亡。SP222、SP235和SP238化合物能够拯救PC12细胞抵抗Aβ诱发的毒性，但不能阻断Aβ诱发的ATP合成的改变。尽管这种明显的矛盾有待于解释，但MTT测定法(线粒体黄递酶活性)和ATP合成不反映呼吸链相同部分的状况是可能的。相反，SP233和SP236部分阻断Aβ诱发的ATP生成减少。SP233保存ATP储存的能力只能解释该化合物有效的神经保护性作用，其被锥虫蓝摄取细胞活力测定法进一步证实。应该注意到，发现SP233不仅在所有的测定中是最灵验的，而且是效力最强的，在体外提供神经保护，以抵抗低至10μM浓度Aβ。
用0.1μM、1.0μM和10μM Aβ1-42进行本文报道的研究。这些浓度都是超病理生理的，因为在AD患者脑脊髓液中存在这些Aβ1-42浓度，对照组范围为500 1000ng/l(0.1-0.2nM)。即使Aβ1-42可能在AD脑中的浓度高10倍，估计Aβ1-42的病理生理浓度在1-2nM，其比本申请人实验的浓度低100-10,000倍。将这些因素都考虑在内，很明显SP233提供75％的抵抗0.1μM Aβ的保护作用是有重大药理学意义的。
用公认的MA-10小鼠间质细胞模型，本申请人证实与22R-羟基胆甾醇不同，其生物活性衍生物SP233不能诱发类固醇形成。
SP化合物的神经保护特性似乎遵从结构/活性关系(SAR)。SP231和SP235是薯蓣皂甙元的立体异构体(图1)，但只有SP235是抗Aβ诱发的神经毒性的保护剂。SP235的立体化学为C3R、C10R、C13S、C20S、C22S、C25S，SP233和SP236也具有这种基序(图1和图19)。显示高神经保护性活性并且在高浓度Aβ的存在下具有活性的SP化合物C3位成酯，优选与脂肪酸或脂肪酸类结构成酯。事实上，在C3位上具有未取代羟基的SP235提供有限的神经保护性作用，只抵抗0.1μM Aβ。相反，SP236是SP235的C3位的琥珀酸酯，其具有抗更高Aβ浓度的活性，而SP233是效力最强的化合物，其为SP235的C3位的己酸酯。发现尽管SP238对维持ATP水平没有影响，但其能保护PC12细胞抵抗Aβ诱发的毒性，进一步支持这个假设，因为其在C3位没有任何侧链的衍生物(SP226)不提供神经保护性作用。苯甲酸取代的SP232对于神经保护无效的发现，提示在该水平上存在的脂族链比芳族结构更有意义。尽管这些数据是SAR的说明，并突出了在C3存在脂肪酸链的重要性，但需要进行进一步的建模和SAR研究以优化神经保护性的SP233结构。
Yao等最近证实，22R-羟基胆甾醇的神经保护性作用在于与Aβ1-42结合和使Aβ1-42失活的能力。基于这个观察，本申请人检测了SP222衍生物通过相同作用方式提供神经保护的能力。本申请人的发现表明，显示抗Aβ诱发的细胞死亡的神经保护特性的SP化合物置换了与淀粉样肽结合的放射性标记的22R-羟基胆甾醇。
用计算对接模拟进一步表征SP-Aβ的相互作用。研究表明在Aβ上可能存在与生物活性SP化合物结合的两个位点。一个结合位点似乎对22R-羟基胆甾醇(SP222)更专一，而第二个结合位点显示对化合物如SP233和SP236有更强的亲和性。尽管SP226显示也与第二个结合位点结合，但该化合物计算的结合能比神经保护性SP分子显示的能量低得多。其后的计算对接模拟研究表明SP222和SP233的结合能遵循双峰分布，该发现强有力地支持在Aβ上存在两个结合位点。进一步的结合能计算表明SP222对第二个结合位点的亲和性小于SP233，提示酯链的存在可能是造成SP233与Aβ上这两个位点结合的原因。基于这些观察，本申请人假设使淀粉样肽持续失活可能需要占据Aβ的第二个结合位点。本申请人现正对该假设进行体外和计算机试验。
与Aβ直接失活无关的其它机制也与SP233的神经保护活性有关。尽管对螺甾烯醇与核受体的结合知之甚少，但不排除对类固醇受体家族可能的调节。已证实，Aβ抑制含GLUT3小泡的融合，导致破坏线粒体稳态并导致因此神经元死亡。另一方面，从黄精(Polygonatirhizome)提取的螺甾烯醇衍生物提高了正常小鼠和链脲佐菌素诱发的糖尿病小鼠的葡萄糖摄取。合起来看，这些结果提示，细胞内葡萄糖转运的恢复可能是螺甾烯醇SP233在本文所述模型中激活保护机制。还已证实，天然和合成的薯蓣皂甙元衍生物减少细胞摄取胆甾醇，并通过抑制关键酶3-羟基-3-甲基戊二酰基辅酶A还原酶减少胆甾醇的合成。增加细胞胆甾醇浓度诱发激活β-和γ-分泌酶，导致产生Aβ也是众所周知的。此外，还证实薯蓣皂甙元衍生物通过抑制胆固醇酯转移蛋白修饰细胞内胆甾醇库，胆固醇酯转移蛋白据报道为一种正调节Aβ生成的酶。尽管这些保护性机制不可能在本申请人的模型中发生，因为它们在培养基中加入Aβ，但它们在体外可对SP233产生部分应答。
尽管在过去几年中作出了极大努力，以期发现新的治疗模式用于治愈和/或减缓AD的进程，但自从引入乙酰胆碱酯酶抑制剂以来尚未取得较大的临床进展，所述抑制剂能够减缓10-15％患者的疾病进程，但维持的时间有限。尽管许多化合物实际上已进入试图治疗AD的临床试验，对其中的大多数而言，AD病理学是仅次于其主要作用的目标。这类药物包括抗氧化剂、COX-1和COX-2抑制剂、抑制素和脑血管扩张药。本申请人的结果表明，天然存在的螺甾烯醇化合物能保护神经元细胞抵抗Aβ。
已描述了本发明的多个实施方案。然而，不用说，在不偏离本发明实质和范围的前体下，可以进行各种修改。因此，其它实施方案在所附权利要求书的范围内；并且在不偏离本发明范围的前体下，可以对上述组合物、制剂、联合疗法和方法进行变化，这意味着包括在上面说明书中所包括的所有内容都可认为是说明性的而不是限制性的。本文列举的所有专利文献和参考文献全都通过引用结合到本文中。

Claims (27)

1.一种治疗有需要的患者的神经变性性疾病的方法，所述方法包括给予所述患者下式(I)化合物：
其中每个R1、R2、R4、R5、R6、R7、R11、R12、R15和R16独立为氢、烷基、羟基、氨基、羧基、氧代、磺酸或任选被以下基团取代的烷基：-NH-、-N(烷基)-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-O-SO2-、-SO2-O-、-SO3-O-、-CO-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NR′-或-NR′-CO-；R3为在表1和图1中列出的化合物的R3情况下所公开的取代基；每个R8、R9、R10、R13和R14独立为氢、烷基、羟烷基、烷氧基或羟基；R17为在表1和图1中列出的化合物的R17情况下所公开的取代基。
2.权利要求1的方法，其中所述化合物选自表1中列出的化合物。
3.权利要求1的方法，其中所述化合物是在包含治疗有效量的所述化合物的剂型之中。
4.权利要求3的方法，其中所述剂型选自片剂、软明胶胶囊剂、硬明胶胶囊剂、混悬型片剂、泡腾片剂、散剂、泡腾散剂、咀嚼片剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、乳膏剂、凝胶剂、贴剂和栓剂。
5.权利要求3的方法，其中所述剂型还包含药学上可接受的赋形剂。
6.权利要求5的方法，其中所述药学上可接受的赋形剂包括粘合剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、润滑剂、湿润剂、稀释剂、抗粘着剂、助流剂或药学上可配伍的载体。
7.权利要求1的方法，所述方法还包括给予至少一种乙酰胆碱酯酶抑制剂。
8.权利要求1的方法，其中所述神经变性性疾病选自全脑和局部缺血性中风和出血性中风、头部创伤、脊髓损伤、低氧诱发的神经细胞损伤、心博停止或新生儿窘迫诱发的神经细胞损伤、癫痫、焦虑、糖尿病、多发性硬化、幻肢痛、灼痛、神经痛、带状疱疹、脊髓损害、痛觉过敏、异常性疼痛、早老性痴呆、亨廷顿舞蹈病和帕金森病。
9.权利要求8的方法，其中所述神经变性性疾病是早老性痴呆。
10.一种药用组合物，所述组合物包含治疗有效量的下式(I)化合物和药学上可接受的赋形剂，
其中每个R1、R2、R4、R5、R6、R7、R11、R12、R15和R16独立为氢、烷基、羟基、氨基、羧基、氧代、磺酸或任选被以下基团取代的烷基：-NH-、-N(烷基)-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-O-SO2-、-SO2-O-、-SO3-O-、-CO-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NR′-或-NR′-CO-；R3为在表1和图1中列出的化合物的R3情况下所公开的取代基；每个R8、R9、R10、R13和R14独立为氢、烷基、羟烷基、烷氧基或羟基；R17为在表1和图1中列出的化合物的R17情况下所公开的取代基。
11.权利要求10的药用组合物，其中所述化合物选自表1中列出的化合物。
12.权利要求10的药用组合物，其中所述药用组合物是在选自以下的剂型之中：片剂、软明胶胶囊剂、硬明胶胶囊剂、混悬型片剂、泡腾片剂、散剂、泡腾散剂、咀嚼片剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、乳膏剂、凝胶剂、贴剂和栓剂。
13.权利要求10的药用组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂包括粘合剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、润滑剂、湿润剂、稀释剂、抗粘着剂、助流剂或药学上可配伍的载体。
14.权利要求10的药用组合物，所述组合物还包含至少一种乙酰胆碱酯酶抑制剂。
15.一种鉴定与β-淀粉样蛋白具有结合亲和性的化合物的方法，所述方法包括：
根据与22R-羟基胆甾醇的结构同源性，筛选已知化合物的数据库；
将所述数据库中的化合物根据与22R-羟基胆甾醇的同源程度进行排列；
从所述数据库中提取与22R-羟基胆甾醇有最高结构同源性的化合物；
将所提取的化合物按与β-淀粉样蛋白的体外结合进行排列；和
选择出具有最高体外亲和性的化合物。
16.一种设计与β-淀粉样蛋白具有结合亲和性的化合物的方法，所述方法包括：
将22R-羟基胆甾醇绘制成两个或更多个独立结构单元；
通过修饰22R-羟基胆甾醇的一个或多个单元，设计新化合物；
将所设计的化合物按与β-淀粉样蛋白的体外结合进行排列；和
选择出具有最高体外结合亲和性的化合物。
17.一种设计与β-淀粉样蛋白具有结合亲和性的化合物的方法，所述方法包括：
绘制β-淀粉样蛋白；
在计算机屏幕上构建与β-淀粉样蛋白结构或其片段互补的化合物；
将所构建的化合物按与β-淀粉样蛋白的体外结合进行排列；和
选择出具有最高体外结合亲和性的化合物。
18.权利要求17的方法，其中所述片段由β-淀粉样蛋白的氨基酸17-40组成。
19.权利要求17的方法，其中所述片段由β-淀粉样蛋白的氨基酸15-40组成。
20.权利要求17的方法，其中所述片段由β-淀粉样蛋白的氨基酸17-38组成。
21.权利要求17的方法，其中所述片段由β-淀粉样蛋白的氨基酸16-39组成。
22.一种检测并定量生物体液中Aβ的方法，所述方法包括：
获取样品液；
将所述样品液与标记的下式(I)化合物一起培养：
其中每个R1、R2、R4、R5、R6、R7、R11、R12、R15和R16独立为氢、烷基、羟基、氨基、羧基、氧代、磺酸或任选被以下基团取代的烷基：-NH-、-N(烷基)-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-O-SO2-、-SO2-O-、-SO3-O-、-CO-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NR′-或-NR′-CO-；R3为在表1和图1中列出的化合物的R3情况下所公开的取代基；每个R8、R9、R10、R13和R14独立为氢、烷基、羟烷基、烷氧基或羟基；R17为在表1和图1中列出的化合物的R17情况下所公开的取代基；
从所述培养液中分离出样品并将所述样品转移到硝酸纤维素膜上；
将所述膜暴露于氚敏屏；和
分析所述膜的内容物。
23.权利要求22的方法，其中所述样品液与标记的式(I)化合物一起培养是在浓度递增的未标记式(I)化合物存在下进行。
24.权利要求22的方法，其中分析所述膜内容物的步骤包括用至少一种磷光成像检测Aβ的存在并定量测定生物体液中存在的Aβ含量，从而分析所述膜的内容物。
25.一种诊断患者的早老性痴呆的方法，所述方法包括：
从患者脑中获取样品液；
将所述样品液与下式(I)标记化合物一起培养：
Figure A038104880006C1
其中每个R1、R2、R4、R5、R6、R7、R11、R12、R15和R16独立为氢、烷基、羟基、氨基、羧基、氧代、磺酸或任选被以下基团取代的烷基：-NH-、-N(烷基)-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-O-SO2-、-SO2-O-、-SO3-O-、-CO-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NR′-或-NR′-CO-；R3为在表1和图1中列出的化合物的R3情况下所公开的取代基；每个R8、R9、R10、R13和R14独立为氢、烷基、羟烷基、烷氧基或羟基；R17为在表1和图1中列出的化合物的R17情况下所公开的取代基；
从所述培养液中分离出样品并将所述样品转移到硝酸纤维素膜上；
将所述膜暴露于氚敏屏；和
分析所述膜的内容物。
26.权利要求25的方法，其中所述样品液与标记的式(I)化合物一起培养是在浓度递增的未标记式(I)化合物存在下进行。
27.权利要求25的方法，其中分析膜内容物的步骤包括用至少一种磷光成像检测Aβ的存在并定量测定生物体液中存在的Aβ含量，从而分析所述膜的内容物。
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