CN1634982A - 由真核细胞分泌性表达人癌胚抗原胞外区部分肽段 - Google Patents

由真核细胞分泌性表达人癌胚抗原胞外区部分肽段 Download PDF

Info

Publication number
CN1634982A
CN1634982A CN 200310115996 CN200310115996A CN1634982A CN 1634982 A CN1634982 A CN 1634982A CN 200310115996 CN200310115996 CN 200310115996 CN 200310115996 A CN200310115996 A CN 200310115996A CN 1634982 A CN1634982 A CN 1634982A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cea
partial peptide
eukaryotic cell
gene
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN 200310115996
Other languages
English (en)
Inventor
谭岩
熊伟
方艳秋
段秀梅
刘力华
姜艳芳
许淑芬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
First Hospital Jinlin University
Original Assignee
First Hospital Jinlin University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by First Hospital Jinlin University filed Critical First Hospital Jinlin University
Priority to CN 200310115996 priority Critical patent/CN1634982A/zh
Publication of CN1634982A publication Critical patent/CN1634982A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明基于对癌胚抗原基因开放读码框架和蛋白质氨基酸构成的分析，应用真核细胞脂质体基因转染法，以CEA基因片段为目的基因、真核质粒pIRESlneo为载体，用人成纤维样骨髓基质细胞为基因转移的细胞，表达出CEA蛋白胞外区部分肽段。该蛋白片段共有285个氨基酸残基，分子量约为70KD，不含CEA的跨膜区和氨基酸组成相似的二个肽段，具有较好的抗原性，可用于制备单克隆抗体以及CEA阳性肿瘤的免疫生物治疗。

Description

由真核细胞分泌性表达人癌胚抗原胞外区部分肽段
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种癌胚抗原胞外区部分肽段的构成及在体外由真核细胞分泌性表达的方法。
背景技术：
癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen，CEA)是一种重要的肿瘤相关抗原和国际上公认的肿瘤标志物。CEA属于酸性糖蛋白，主要通过磷脂酰肌醇(GPI)锚固在细胞膜上，分子量约为18-20KD。正常情况下，CEA可存在于8-12周的胚胎胃肠道中，随着胚胎的发育成熟而迅速减少；但当内胚层来源的细胞发生癌变时，CEA又重新开放表达并能够脱落入血而被检测出来。CEA阳性肿瘤包括90％的消化道癌、70％的肺癌和50％的乳腺癌等，高居恶性肿瘤发病率和死亡率之首，严重威胁人类的生命和健康。
尽管CEA被发现已有数十年历史，但对于其在体内的生物学作用，目前还不十分清楚。一些研究显示，CEA及其家族成员与胚胎发育、组织形成、肿瘤发展的关系十分密切。CEA的高表达对癌细胞的转移、扩散具有重要意义。CEA具有免疫原性，用之免疫各种动物都能产生高滴度的抗体，该抗体可用于人血清CEA蛋白含量的检测。临床上已将CEA动态检测作为其阳性肿瘤早期诊断及预后评价的重要监控指标之一。近年来研究发现，CEA也可以为人体内特异性T细胞识别，诱发抗肿瘤免疫反应，因此又被用于CEA阳性肿瘤的免疫生物治疗。
以往要获得CEA蛋白，需要用次氯酸从结肠癌肝转移灶中沉淀肿瘤细胞抽提物，然后经离子交换层析和亲和层析获得。但如此得到的CEA可能是不同特性的数个分子的混合物，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱上呈扩散带，等电点范围较宽。近年来，人们利用基因工程技术，在大肠杆菌中成功地表达出CEA蛋白，产品量大，而且成本低廉。但由于在原核系统表达的真核蛋白折叠效率低下或折叠方式不正确，并缺乏翻译后加工过程，生物学活性较低。
技术内容：
本发明的目的在于提供一种CEA蛋白胞外区部分肽段的构成及在体外由真核细胞分泌性表达的方法。以便获得成分均一、生物学活性较高的CEA蛋白片段。用于单克隆抗体的制备以及CEA阳性肿瘤的免疫生物治疗。
由真核细胞分泌性表达的CEA蛋白胞外区部分肽段，其特征在于：该片段共有285个氨基酸残基，分子量约为70KD，不含CEA的跨膜区和氨基酸组成相似的二个肽段：
KLTIESTPFNVAEGKEVLLLVHNLPQHLFGYSWYKGERVDGNRQIIGYVIGTQQATPGP
AYSGREIIYPNASLLIQNIIQNDTGFYTLHVIKSDLVNEEATGQFRVYPELPKPSISSN
NSKPVEDKDAVAFTCEPETQDATYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDTA
SYKCETQNPVSARRSDSVILNVLYGPDAPTISPLNTSYRSGENLNLSCHAASNPPAQYS
WFVNGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYTCQAHNSDTGLNRTTVTTITVY
本发明由真核细胞分泌性表达的CEA蛋白胞外区部分肽段的制备方法是以大肠癌组织总RNA为模板，应用RT-PCR技术合成CEA基因片段，克隆入真核表达载体pIRES1neo，再通过脂质体法转染体外培养的人成纤维样骨髓基质细胞，用G418筛选出阳性克隆扩大培养，收集含CEA蛋白胞外区部分肽段的细胞培养上消。
本发明的表达CEA蛋白片段的目的基因不含重复编码单位。
本发明具有较好的抗原性，免疫小鼠后能产生高滴度的抗体，并能与CEA多克隆抗体和多种CEA单抗反应。
具体实施方式：
1、外源基因的选择
已知CEA全长cDNA约为3.1Kb，主要由信号肽编码基因和三个结构上相似的重复单位(I、II、III区)构成，编码含有668个氨基酸的CEA蛋白。通过对三个重复编码单位进行的序列分析表明，所编码的三个肽段70％的氨基酸序列是保守的，这就意味着一个或二个重复单位的缺失将不会影响编码蛋白的抗原性。同时，去掉了CEA蛋白的跨膜区编码序列，可以使目的蛋白呈分泌性表达。
2.真核表达载体的选择
本实验选择的真核表达质粒pIRES1neo含有内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)，使目的基因与筛选基因分别位于IRES的上下游，同处于能在真核细胞中高效表达的人巨细胞病毒启动子CMV的调控下，在转染靶细胞后，能从一条mRNA上转录并翻译CEA蛋白片段和新霉素磷酸转移酶，使转染后经新霉素类似物G418筛选获得的抗性克隆都是高表达CEA基因的细胞株，提高了工作效率。
3、转基因细胞的选择
人成纤维样骨髓基质细胞(HFCL)的增殖能力强、生存期较长，易于在体外培养和大量扩增；同时，HFCL接受外源基因转移的效率高并能以分泌形式高效稳定地表达目的蛋白，不产生有害性物质，是基因转染和表达的理想靶细胞。
本发明的实施方法如下：
一、CEA基因片段的重组
1、提取大肠癌组织总RNA：
(1)取新鲜大肠癌组织，剪成小块后每0.1克组织加入1.2ml预冷的变性裂解液(4.0M硫氰酸胍、25mM柠檬酸钠pH7.0、0.5％十二烷基肌酸钠、0.72％β-巯基乙醇)，在匀浆器中粉碎，裂解细胞。
(2)加2M乙酸纳(pH4.0)0.12ml，混合。
(3)加酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)1.2ml，用力混合后，置冰上15min。
(4)4℃、12000rpm离心20min。
(5)小心转移上层水相，加等体积异丙醇，-20℃沉淀30min以上。
(6)4℃、12000rpm离心20min。
(7)弃掉上清，再加变性液1ml重悬RNA沉淀物。
(8)加等体积异丙醇，-20℃沉淀30min以上。
(9)4℃、12000rpm离心20min。
(10)弃净上清，用预冷的75％乙醇洗涤离心2次。
(11)沉淀晾干后，用50lDEPC水溶解。
(12)紫外分光光度计定量后，-20℃保存备用。
2、PCR引物设计与合成：PCR引物用计算机引物设计程序设计并由DNA合成仪合成。序列如下。
引物1  5’CAGAGGAATTCAGAGCAGACAGCAGAGACCATGGA  3’
(含EcoRI酶切位点及起始密码子)
引物2  5’CAGCCTAGGCATATAGACTGTGATCGTCGTGACTG 3’
(含BamHI酶切位点及终止密码子)
3、cDNA合成
在反应体系中依次加入RNA模板1-2g、oligo(dT)121l(100g/ml)、dNTP(各10mmol/L)2l、RNA酶抑制剂20U、AMV反转录酶20U、10×AMV反应缓冲液2l、加DEPC水至20l，42℃水浴30min，95℃5min。
4、PCR扩增和产物回收：
上述反应体系中再加入特异性引物(1+2)4l(20pmol)、dNTP 8l、Tag(Ex)聚合酶2.5U、10×Tag酶反应缓冲液10l、加双蒸水至100l。循环扩增程序为：预变性95℃5min，然后变性95℃1min、复性58℃1min、延伸72℃1.5min，共30个循环，充分延伸72℃10min。琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物后用DNA纯化试剂盒回收。
二、构建真核表达质粒pIRES-CEA
1、双酶切反应：
用EcoRI和BamHI双酶切反应分别制备有粘性末端的CEA基因片段和线性载体pIRES1neo。
           DNA                       15l(2g/l)
           10×buffer                10l
           EcoRI/BamHI               5l(10U/l)
           双蒸水                    加至100l
           置37℃水浴1.5-2小时。
琼脂糖凝胶电泳后，用DNA纯化试剂盒回收酶切产物。
2、DNA片段的连接：
连接有共同粘性末端的CEA基因片段和线性载体pIRES1neo
           DNA片段                0.1g
           线性pIRES1neo质粒      0.4g
           10×buffer             2l
           T4DNA连接酶            1l
           双蒸水                  加至20l
           25℃，连接1-2小时。
三、重组质粒pIRES-CEA的生产
1、制备感受态大肠杆菌(氯化钙法)：
(1)用无菌接种环刮取冻存于液氮中的大肠杆菌菌种，划线接种于LB琼脂平皿，37℃培养12-16h。
(2)挑取单菌落，接种于5ml LB液体培养基中，37℃、200rpm/min振摇培养12h。
(3)取1％培养液，接种于50ml LB液体培养基中，37℃、250rpm/min振摇培养2-3h，至OD600＝0.4-0.6。
(4)取出后立即冰浴10min。
以下均需无菌操作。
(5)将培养液转移到用冰预冷的50ml离心管中，4℃、4000rpm离心10min。
(6)弃净上清液，用冰预冷的0.1mol CaCl210ml重悬菌体，冰水浴30min。
(7)4℃、4000rpm离心10min，弃净上清液。
(8)用冰预冷的0.1mol CaCl22ml重悬菌体，4℃放置12-24h，即成感受态细菌。可分装为200l/份，加30％甘油，-70℃保存备用。
2、细菌转化
(1)取50ng质粒加入含0.2ml感受态细菌的无菌玻璃试管中，轻轻混匀，冰水浴30min。
(2)42℃热休克90s。
(3)加0.8l LB液体培养基，37℃、120rpm/min温和振摇45mi。(4)用玻璃弯头铺菌器将200l菌液涂于含氨苄青霉素50g/ml的琼脂培养皿中，37℃平放吸附20min后，倒置培养10-14h。
3、重组质粒的快速鉴定
(1)将转化菌落依次转移到含Amp的琼脂培养皿中，编号后，37℃过夜培养。
(2)挑取适量菌落，加入25l溶液A，混匀。
(3)加入25l溶液B，混匀，70℃保温5min后，4℃、12000rpm离心10min。
(4)取上清，行琼脂糖凝胶电泳(同时用空质粒作对照)，根据分子量大小确定是否为重组质粒。
4、质粒的大量提取(碱裂解法)：
(1)将1％转化菌接种于100ml LB培养基(含Amp50g/ml)中，37℃、250rpm/min振摇培养12-16h，至OD600＝0.6-0.8。
(2)取出后立即冰浴10min，转移到用冰预冷的50ml离心管中，4℃、4000rpm离心10min。
(3)弃净上清液，加入冰预冷的溶液I(40mmol/L葡萄糖、2540mmol/L Tris-CI pH8.0、10mmol/L EDTA pH8.0)4ml，剧烈震荡混匀。
(4)加新鲜配制的溶液II(0.2mol/L NaCI、1％SDS)8ml，缓慢颠倒混匀，放置5-10min。
(5)加用冰预冷的溶液III(5mol/L乙酸钾3.6ml、3mol/L冰乙酸0.69ml、双蒸水1.71ml)6ml，颠倒混匀，冰水浴10min。4℃、8000rpm离心10min。
(6)取上清液，加0.6体积异戊醇，混匀，-20℃沉淀20min。4℃、12000rpm离心10min。
(7)弃净上清液，用70％乙醇洗沉淀，晾干，溶于1.2mlTE(pH8.0)溶液中。
(8)加Rnase A 30l，37℃水浴30min。
(9)加等体积平衡酚，混合。5000rpm离心10min。
(10)小心吸取上层水相，平衡酚抽提及氯仿-异戊醇(24∶1)抽提。
(11)5000rpm离心10min，小心吸取上层水相。
(12)加1/10体积NaAc(pH5.3)，2.5倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃沉淀20min。
(13)12000rpm离心10min，弃净上清，70％洗2次。
(14)沉淀晾干，溶于200l TE(pH8.0)溶液中。
(15)取10l按1∶100稀释后测量OD260，计算质粒DNA浓度。-20℃保存备用。
四、脂质体介导真核细胞转染
1、真核细胞转染
(1)HFCL细胞及Smmc-7721细胞常规贴壁培养于含10％小牛血清(FCS)的IMDM培养液中。转染前一天将细胞用胰蛋白酶消化，取1-2×105个细胞重悬于2ml培养液，接种于35mm培养皿中。
(2)37℃、5％CO2孵育箱培养18-24h，使细胞达到50-80％融合。
(3)在无菌玻璃试管中制备下列溶液：
溶液A：将2-20g质粒溶于100l无血清培养液中。
溶液B：将20l脂质体稀释于80l无血清培养液中。
(4)合并溶液A、B，轻轻混合，置室温15min。
(5)弃去细胞培养液，用无血清培养液洗涤细胞一次。
(6)加0.8ml无血清培养液于Lipofectamine-DNA混合物中，混匀后，小心滴加到细胞上，轻轻混匀。
(7)37℃、5％CO2孵育箱培养5-24h。
(8)弃去无血清培养液，加2ml完全培养液继续培养。
2、转染细胞的筛选
(1)转染后48-72h，待细胞生长接近融合时按1∶4密度传代。
(2)继续培养，使细胞达到50-80％融合。
(3)弃去培养液，更换含200-1200g/ml G418的培养液
(4)加0.8ml无血清培养液于Lipofectamine-DNA混合物中，混匀后，小心滴加到细胞上，轻轻混匀。
(5)未转染的对照组细胞大部分死亡时(约5d)，更换培养液，G418浓度降至200g/ml，维持筛选。
(6)2w后，显微镜下可见有抗性克隆形成。
3、克隆细胞株的转移与扩增
(1)显微镜下观察已形成克隆的位置，并用记号笔标记准确。
(2)弃去培养液，用镊子夹取灭菌的5mm大小滤纸块，用胰蛋白酶消化液浸湿，置于标记位置处，10-20s。
(3)24孔培养板每孔加G418培养液1ml，用镊子取出已粘附克隆细胞的滤纸块，分别置于培养孔中，漂洗数次，使细胞脱下，显微镜下确认细胞已脱落后，弃去滤纸块。
(4)将转移有克隆细胞的24孔板，37℃、5％CO2孵育箱继续培养3-5d。
(5)待细胞长满后，用胰蛋白酶消化，分别转移到6孔板或培养瓶中扩大培养。
五、CEA蛋白片段的鉴定
1、收集并用聚乙二醇浓缩(25×)细胞培养上清
2、CEA蛋白片段聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)
(1)清洁玻璃板，固定于电泳装置上。
(2)配制8％分离胶(20ml)
30％丙烯酰氨         5.3ml
5×TBE               4ml
10％过硫酸铵         0.14ml
双蒸水               10.6ml
加TEMED 10l混匀后，迅速注入胶床2/5体积，再加双蒸水覆盖。
配制5％积层胶(10ml)
30％丙烯酰氨         1.66ml
5×TBE               2ml
10％过硫酸铵         0.05ml
双蒸水               6.29ml
待分离胶聚合完全后，吸出双蒸水，将上述溶液加入TEMED 10l混匀后，迅速注入胶床。插上加样梳。
(3)在电泳槽内加入Tris-甘氨酸缓冲液，盖过加样孔。
(4)样品与1×SDS加样缓冲液混合，100℃加热3min变性后，注入加样孔中电泳，另孔加标准分子量对照，电压2-5V/cm。
3、免疫印迹
(1)电泳结束后，将蛋白质在2V/cm电压下转移到标记的醋酸纤维素膜上。
(2)将膜放入塑料袋中，加入溶有CEA抗体(一抗)的封闭液(0.1ml/cm2)，封好，室温孵育2h或4℃孵育过夜。
(3)用PBS溶液充分漂洗。
(4)将膜放入另一塑料袋中，加入溶有二抗的封闭液(0.1ml/cm2)，封好，室温孵育2h或4℃孵育过夜。
(5)用PBS溶液充分漂洗。
(6)加入封闭液，室温下轻轻摇动温育10min。重复三次。
(7)在10ml碱性磷酸酶缓冲液中分别加入66l NBT及33l BCIP溶液。
(8)按膜面积加入生色底物(0.1ml/cm2)，室温下轻轻摇动温育至蛋白带显色。

Claims (3)

1、一种由真核细胞分泌性表达的CEA蛋白胞外区部分肽段，其特征在于：该片段共有285个氨基酸残基，分子量约为70KD，不含CEA的跨膜区和氨基酸组成相似的二个肽段：
KLTIESTPFNVAEGKEVLLLVHNLPQHLFGYSWYKGERVDGNRQIIGYVIGTQQATPGP
AYSGREIIYPNASLLIQNIIQNDTGFYTLHVIKSDLVNEEATGQFRVYPELPKPSISSN
NSKPVEDKDAVAFTCEPETQDATYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDTA
SYKCETQNPVSARRSDSVILNVLYGPDAPTISPLNTSYRSGENLNLSCHAASNPPAQYS
WFVNGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYTCQAHNSDTGLNRTTVTTITVY
2、一种由真核细胞分泌性表达的CEA蛋白胞外区部分肽段的制备方法，其特征在于：以大肠癌组织总RNA为模板，应用RT-PCR技术合成CEA基因片段，克隆入真核表达载体pIRES1neo，再通过脂质体法转染体外培养的人成纤维样骨髓基质细胞，用G418筛选出阳性克隆扩大培养，收集含CEA蛋白胞外区部分肽段的细胞培养上清。
3、根据权利要求2所述的由真核细胞分泌性表达的CEA蛋白胞外区部分肽段的制备方法，其特征在于：表达CEA蛋白片段的目的基因不含重复编码单位。
CN 200310115996 2003-12-29 2003-12-29 由真核细胞分泌性表达人癌胚抗原胞外区部分肽段 Pending CN1634982A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 200310115996 CN1634982A (zh) 2003-12-29 2003-12-29 由真核细胞分泌性表达人癌胚抗原胞外区部分肽段

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 200310115996 CN1634982A (zh) 2003-12-29 2003-12-29 由真核细胞分泌性表达人癌胚抗原胞外区部分肽段

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1634982A true CN1634982A (zh) 2005-07-06

Family

ID=34843519

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 200310115996 Pending CN1634982A (zh) 2003-12-29 2003-12-29 由真核细胞分泌性表达人癌胚抗原胞外区部分肽段

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN1634982A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011140634A3 (en) * 2010-05-11 2012-01-05 Governing Council Of The University Of Toronto The n-domain of carcinoembryonic antigen and compositions, methods and uses thereof

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011140634A3 (en) * 2010-05-11 2012-01-05 Governing Council Of The University Of Toronto The n-domain of carcinoembryonic antigen and compositions, methods and uses thereof
CN103037896A (zh) * 2010-05-11 2013-04-10 多伦多大学理事会 癌胚抗原的n-结构域及其组合物、方法和用途
US8846050B2 (en) 2010-05-11 2014-09-30 Governing Council Of The University Of Toronto N-domain of carcinoembryonic antigen and compositions, methods and uses thereof
AU2011252699B2 (en) * 2010-05-11 2015-09-17 Governing Council Of The University Of Toronto The N-domain of carcinoembryonic antigen and compositions, methods and uses thereof
US9636387B2 (en) 2010-05-11 2017-05-02 Governing Council Of The University Of Toronto N-domain of carcinoembryonic antigen and compositions, methods and uses thereof
CN103037896B (zh) * 2010-05-11 2017-06-13 多伦多大学理事会 癌胚抗原的n‑结构域及其组合物、方法和用途

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105296433B (zh) 一种ctla4抗体、其药物组合物及其用途
CN1142188A (zh) 人生长激素
CN102146135A (zh) 一种重组类人胶原蛋白及其生产方法
CN113512096A (zh) 一种鲈鱼弹状病毒重组g2蛋白及其应用
CN1974601A (zh) 一种新型Fc融合蛋白及其生产方法
CN111217903A (zh) 一种重组人纤连蛋白ⅲ1-c及其制备方法和应用
CN101063142A (zh) 人乳头瘤病毒16型dna疫苗和基因佐剂及其应用
CN1634982A (zh) 由真核细胞分泌性表达人癌胚抗原胞外区部分肽段
CN1865286A (zh) 双功能表皮生长因子及其制备方法和用途
CN1296385C (zh) 抗猪生长激素单克隆抗体及制备方法及应用
CN113940993B (zh) 一种鲈鱼弹状病毒g2-2m亚单位疫苗及其制备方法
CN1911963A (zh) Sars中和性抗体及应用
CN1172956C (zh) 一种突变的人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体多肽及其用途
CN109400690A (zh) 促进米虾抗菌肽增多的重组bursicon蛋白及其应用
CN1844390A (zh) 鸭B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重组应用
CN1164753C (zh) 抗iv型胶原酶单链抗体与力达霉素辅基蛋白的融合蛋白
CN1532281A (zh) 癌胚抗原基因片段的重组及基因疫苗
CN1974767A (zh) 猪表皮生长因子基因及其应用
CN1279058C (zh) 用于诱导白血病细胞分化及凋亡的抗cd44的工程抗体及其载体和用途
CN101067138A (zh) 基因工程制备人毛乳头细胞hspc016蛋白质的方法、表达载体和工程菌
CN105112382B (zh) 一种基于家蚕-杆状病毒系统制备人髓过氧化物酶的方法
CN1289527C (zh) 一种高生物活性的角质细胞生长因子突变体，其制备方法及用途
CN113943355B (zh) 一种鲈鱼弹状病毒g2-2m重组蛋白及其应用
CN110734492B (zh) 抗f4/80的多克隆抗体及制备方法
CN1721446A (zh) 融合蛋白及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication