CN1621533A - 筛选猪的生长特异性基因的表达模式和以其制备的功能性cDNA芯片 - Google Patents

Abstract

本发明涉及筛选猪的生长特异性基因的表达模式和使用这些基因的功能性cDNA芯片，并提供了猪的肌肉和脂肪组织中与生长相关的新的生长因子的核苷酸序列。同时，本发明提供了一种用于根据猪的品种和组织对生长特异性基因进行筛选和功能性分析的功能性cDNA芯片，所述的cDNA芯片通过仅将由如上所述而得到的特异性基因整合于其中而制备。因此，所述的用于根据猪的品种和组织对生长特异性基因进行筛选和功能性分析的功能性cDNA芯片可用于改良猪的品质并培育新的品种。

Description

筛选猪的生长特异性基因的表达模式和以其制备的功能性cDNA芯片

技术领域

本发明涉及筛选猪的生长特异性基因的表达模式和使用这些基因的功能性cDNA芯片。更为具体的，本发明涉及筛选生长特异性基因的表达模式，这些基因在生长阶段的猪的肌肉和脂肪组织中特异性地表达，本发明同时涉及一种用于根据猪的品种和组织对生长特异性基因进行筛选和功能性分析的功能性cDNA芯片，所述的cDNA芯片通过仅将由所述筛选得到的特异性基因整合于其中而制备。

背景技术

分子生物学的发展对家畜的遗传育种领域产生了巨大的影响，并由此在猪的基因连锁图谱(genetic linkage map)和数量性状基因座图谱(quantitative trait loci(QTL)map)研究上取得了极大的进展。特别是已经发现了与具有经济价值的性状相关的QTL的定位以及一些预期能够影响各种性状的候选基因，并已经将其直接应用于养猪业。目前，国际间正式的合作工作组例如PiGMaP(国际猪基因组图谱计划)协定图谱(Archibald等，1995)和USDA(美国农业部)基因图谱(Rohrer等，1994)已经在进行猪基因组的定位工作，基于1800个结合了基因的标记物，以构建基因连锁图谱(Archibald，1994；Marklund等，1996；Rohrer等，1996)。同时，最近已经开始进行积极的研究以鉴定与具有重要经济学价值的性状有关的DNA标记物(Nielsen等，1996)。

构建猪的基因图谱是鉴定与定量的性状有关的特异性标记物的一个重要过程(Andersson等，1994；Archibald，1994；Schook等，1994)。基于猪的第6号染色体上的标记物与具有重要经济学价值的生长性状或畜体性状之间的关系，构建了一种基因连锁图谱(Clamp等，1992；Louis等，1994；Chevaletn等，1996)。

需要改进的猪的性状包括每窝产子的数目、生长期的猪的生长速度、饲料的效率、畜体率的增加以及与背部脂肪厚度相关的精肉率。通常，每日体重的增加与饲料效率之间的遗传学相关系数很高，猪的生长率的提高可同时引起饲料效率的提高。例如，当饲料供应有限时，每日体重的增加的遗传率(heritability)为0.14至0.76，平均为0.30，而每日体重的增加与饲料效率之间的遗传学相关系数为-1.07至-0.93，平均为-1.0。因此注意到每日体重的增加与饲料效率之间存在很高的相关性。因此，每日体重的增加是反映成品猪(finishing pig)的体重增加性能的一个重要性状。

迄今为止，对猪的遗传差异的检测采用了一些在mRNA水平对基因表达进行分析的技术，例如northern印迹、差异展示、基因表达的序列分析以及斑点杂交分析。不过，这些方法的缺点是不适于同时对多种表达产物进行分析。最近，开发出了能够克服此类缺陷的新技术如cDNA微阵列。cDNA微阵列成为了在各种活体进行基因表达研究的最有效的一种方法。该技术已经用于同时研究众多基因的表达和发现大量的基因，以及用于多态性的筛选和遗传性DNA克隆的定位。其同样是对由已知或未知基因转录产生的RNA进行定量分析的高度完善的RNA表达分析技术。

目前正在使用的DNA芯片的类型包括通过设计基于数据库信息的引物并结合基于数据库信息的cDNA文库中的基因而构建的复合DNA芯片和通过结合基于现有文献的相关基因而构建的功能性DNA芯片。由于非相关基因的作用，当将复合DNA芯片转化为试剂用途时会遇到困难，且需要花费大量的工作才能最终解读基因的生物学作用。同时，由于其是基于数据库信息，其困难还在于缺乏新基因的信息或可能在一定程度上缺乏相关的基因。而功能性DNA芯片很容易转化为实际用途，但其需要收集基因以便鉴定那些在现有文献中尚未被描述或其功能尚未被了解的基因。因此，芯片上的DNA的构建对于其有效的实际应用是非常重要的。

有鉴于此，本发明人将cDNA微阵列技术应用于筛选在猪的特定组织中与生长相关的基因的表达模式，并通过仅将由所述的筛而鉴定的特异性基因整合于其中而制备了一种功能性cDNA芯片，其可用于改良猪的品质，使其具有优良的生长特性，并用于根据猪的品种和组织对生长特异性基因进行筛选和功能性分析。

发明内容

因此，本发明的一个目的是通过将来自猪的肌肉和脂肪组织的靶DNA与一种整合了一种探针的底物进行杂交对生长相关性基因的表达模式进行筛选，所述探针由分离自猪的肌肉和脂肪组织的总RNA制备得到。

本发明的另一个目的是提供一种用于根据猪的品种和组织对生长特异性基因进行筛选和功能性分析的功能性cDNA芯片，该芯片通过仅将由筛选得到的特异性基因整合于其中而制备。

根据本发明，上述目的可以通过以下步骤实现，通过PCR由分离自猪的肌肉和脂肪组织总RNA中制备得到的数千个EST，将其克隆以便在数据库中分析并筛选其核苷酸序列，通过PCR扩增这些EST，继而分离并纯化，用DNA芯片阵列将产物与对照组排列于玻片上，由分离自猪的肌肉和脂肪组织的总RNA中制备靶DNA以便对一种生长相关性基因表达模式进行筛选，将该靶DNA与玻片(探针DNA)继续杂交，对产物进行扫描以得到图象资料，基于该图象资料对猪的生长相关性基因的表达进行研究，并对该基因进行测序以确定该基因的核苷酸序列。并通过仅将猪的生长特异性基因整合于其中而制备一种功能性cDNA芯片。

本发明包括以下步骤：自猪的肌肉和脂肪组织制备EST并鉴定其序列信息；用所述的EST制备探针DNA；将一种荧光标记的、来自猪的肌肉和脂肪组织的靶DNA(EST)与该探针DNA杂交，继而对图象资料进行扫描和分析；研究一种生长相关性基因的表达模式；并通过仅将生长特异性基因整合于其中而制备一种功能性cDNA芯片。

所述的根据猪的品种和组织对生长特异性基因进行筛选和功能性分析的功能性cDNA芯片通过如下步骤而制备：通过PCR由分离自猪的肌肉和脂肪组织的总RNA中制备4434个EST；将这些EST与一种酶对照物排列于DNA芯片阵列的玻片上；由分离自猪的肌肉和脂肪组织的总RNA中制备得到结合了3-dCTP或5-dCTP的靶DNA；将该玻片(探针DNA)与该靶DNA进行杂交，对产物进行扫描并分析图象资料以研究猪的生长相关性基因的表达；并通过仅将筛选得到的猪的生长特异性基因整合于其中而制备一种功能性cDNA芯片。

本发明的根据猪的品种和组织对生长特异性基因进行筛选和功能性分析的功能性cDNA芯片包含一种探针和所述探针固定于其上的基质，所述探针包含特异性表达于猪的肌肉和脂肪组织中的生长特异性基因。

本发明的根据猪的品种和组织对生长特异性基因进行筛选和功能性分析的功能性cDNA芯片的DNA微阵列上所固定的生长特异性基因包含如SEQ ID NO：1至5所示的新的生长因子I、II、III、IV和V的核苷酸序列。

本发明的功能性cDNA芯片的基质优选地是一种聚合物膜，例如硅氧烷晶片(silicone wafer)、玻璃、聚碳酸酯、膜、聚苯乙烯或聚亚安酯。本发明的DNA微阵列可通过采用制备DNA微阵列的常规方法将探针固定于基质上而制备，所述方法包括照相平版印刷(photolithography)、压电印刷(piezoelectric printing)、微量加样(micro pipetting)、点样等等。本发明采用的是点样方法。

根据猪的品种和组织对生长特异性基因进行筛选和功能性分析的试剂盒包括所述的整合了猪生长特异性基因的功能性cDNA芯片，结合了Cy5-dCTP或Cy3-dCTP的、来自于待筛选的组织的RNA的cDNA，一个荧光扫描系统和一个计算机分析系统。

具体实施方式

现通过以下实施例具体阐述本发明的内容，但本发明并非局限于此。

实施例

实施例1：筛选猪的生长相关特异性基因的表达模式

为筛选与猪的生长相关的特异性基因的表达模式，由分离自鹿儿岛黑猪(Kagoshima Berkshire)的肌肉和脂肪组织的总RNA中制备探针DNA，并对这些组织中的总RNA进行荧光标记以制备一种靶DNA。用这些DNA进行能杂交并对其进行扫描。对得到的图象资料进行分析以筛选猪的生长相关特异性基因，然后将其克隆以确定核苷酸序列。

制备实施例1：探针DNA的制备和排列

首先，制备探针DNA并将其附着于玻片上，该探针DNA为PCR扩增得到的cDNA。以RNA提取试剂盒(Qiagen，Germany)，根据其说明，自鹿儿岛黑猪(体重为30kg及90kg)的背最长肌的肌肉和脂肪组织中提取总RNA，并以寡(dT)柱提取mRNA。将提取的mRNA样品进行RT-PCR以合成cDNA，使用的是SP6，T3正向引物，T7反向引物(Amersham Pharmacia Biotech，England)。每种PCR反应物的总体积为100μl。将100pM的正向引物和反向引物分别转移至96-孔PCR板上(Genetics，England)。每孔含2.5mM dNTP、10×PCR缓冲液、25mM MgCl₂、0.2μg的DNA模板、2.5单位的Taq聚合酶。以GeneAmp PCR系统5700(AB Applied BioSystem，Canada)进行PCR，条件如下：94℃，30秒；58℃，45秒；72℃，1分钟，总共30个循环。

通过琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增的DNA的大小。用乙醇将PCR产物在96-孔板中进行沉淀，干燥并存放于-20℃。

将如上制备的总共4434个cDNA(EST)进行克隆以分析猪的基因的核苷酸序列，并自NCBI的数据库中对其遗传信息进行鉴定。对具有信息的基因以PCR进行分离并纯化。构建此总共4434个cDNA(EST)的基因座的图谱。将此总共4434个cDNA(EST)和300个酵母对照排列于1.7cm²的面积上。然后，将探针DNA点到显微镜的玻片上(Corning产品)，所述的玻片已经用Microgrid II(Biorobotics)在其上覆盖了CMT-GAPSTM氨基硅烷(aminosilane)。用分离针(split pin)将探针DNA印在Microgrid II上。将该针装置接近微孔板的孔以便将溶液注射至玻片(1至2nL)。然后将印有该探针DNA的玻片进行干燥，并用Stratalinker^TM(Stratagene，USA)使点上的DNA与该玻片在90mJ的UV下发生交联，以0.2％SDS在室温下洗涤2次，每次2分钟，并以三蒸水在室温洗涤1次，共2分。洗涤后，将该玻片在95℃的水浴中浸没2分钟，并加入封闭液(1.0g NaBH₄溶解于300mL的pH7.4的磷酸缓冲液中，再与100mL无水乙醇混合)进行封闭15分钟。然后，以0.2％SDS在室温下洗涤该玻片3次，每次1分钟，并以三蒸水在室温洗涤1次2分钟，并在空气中干燥。

制备实施例2：靶DNA的制备与杂交

为制备用于在猪的肌肉和脂肪组织中筛选生长相关性基因的靶DNA，肌肉组织取自体重为30kg和90kg的鹿儿岛黑猪的背最长肌部位，脂肪组织取自体重为30kg的鹿儿岛黑猪。将肌肉和脂肪组织切成5～8mm长，用液氮冷冻存放于-70℃。

按照Trizol^TM试剂盒(Life Technologies，Inc.)的说明，自0.2至1.0g的实验组和对照组的组织分离总RNA以制备靶DNA。将Trizol^TM加至组织上，Trizol^TM的量为每50～100mg组织加1mL的Trizol^TM，用玻璃-Teflon或Polytron匀浆器使得组织碎裂，然后在4℃以12,000g的速度离心10分钟，取1mL的上清液的样品进行测试。在每份样品至加入200μl的氯仿，震荡15秒，置冰上15分钟，然后在4℃以12,000g的速度离心10分钟。再次加入相同量的氯仿，震荡15秒，置冰上15分钟，然后在4℃以12,000g的速度离心10分钟。将上清液移至新的试管中，加入500μl的异丙醇，震荡并置冰上15分钟，然后在4℃以12,000g的速度离心5分钟。弃上清，与1mL的75％冷乙醇混合并在4℃以12,000g的速度离心5分钟。弃上清，在清洁工作台上冻干30分钟，加20μl的无Rnase水或DEPC水以溶解RNA。调整总RNA浓度至40μg/17μl进行电泳。

按照标准的第一链cDNA合成法制备靶DNA。简言之，按照Schuler(1996)的方法，将40μg的总RNA与寡dT-18聚体引物(Invitrogen Life Technologies)混合，在65℃加热10分钟，4℃冷却5分钟。然后在其中加入1μl的25mM dATP、dGTP和dTTP的混合物，1μl的1mM dCTP(Promega)和2μl的1mM花菁3-dCTP或2μl的1mM花菁5-dCTP，20单位的Rnase抑制剂(Invitrogen LifeTechnology)，100单位的M-MLV Rtase，2μl的10×第一链缓冲液，并以加样器混合。将该反应混合物在38℃孵育2小时，通过乙醇沉淀将未结合的核苷酸去除。在此使用经DEPC处理的无菌水。

使用杂交溶液(5×SSC，0.2％SDS，1mg/mL鲱精DNA)在65℃对如上制备的玻片进行预杂交1小时。将花菁3(Cy-3)和花菁5(Cy-5)标记的靶DNA重悬于20μl的所述杂交溶液中，在95℃进行变性2分钟。然后将玻片与该溶液在65℃杂交过夜。杂交在具有玻璃遮盖物(Grace Bio-Lab)的湿盒中进行。

杂交后将玻片以2×SSC、0.1％SDS在室温洗涤4次，每次5分钟，同时在摇床上充分搅动。然后将玻片以0.2×SSC洗涤2次，5分钟，并以0.1×SSC洗涤2次，5分钟，室温进行。

将玻片在ScanArray 5000(GSI Lumonics Version 3.1)上进行扫描，像素尺寸为50μm。以花菁3-dCTP标记的靶DNA在565nm进行扫描，而以花菁5-dCTP标记的靶DNA在670nm进行扫描。通过花菁3-dCTP-和花菁5-dCTP-标记的点的线形扫描对两种荧光的强度进行标准化。将玻片在Scanarray 4000XL上再次扫描，像素尺寸为10μm。得到的TIFF图象资料通过Quantarray software version 2.1进行分析，背景进行自动消减。将各点的强度由Quantarray输入Microsoft Excel。

结果，鉴定出以下5种新的生长相关性基因。

1.GF(生长因子)I基因：SEQ ID NO：1

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2.GF(生长因子)II基因：SEQ ID NO：2

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3.GF(生长因子)III基因：SEQ ID NO：3

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4.GF(生长因子)IV基因：SEQ ID NO：4

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5.GF(生长因子)V基因：SEQ ID NO：5

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实施例2：制备用于根据猪的品种和组织对生长特异性基因进行筛选和功能性分析的本发明的功能性cDNA芯片

采用制备实施例1的方法，将如SEQ ID NO：1至5所示的生长因子I、II、III、IV和V(即实施例1筛选得到的猪的生长阶段的生长特异性基因)的核苷酸序列固定于DNA微阵列上，并制备用于根据猪的品种和组织对生长特异性基因进行筛选和功能性分析的功能性cDNA芯片。

实施例3：制备用于根据猪的品种和组织对生长特异性基因进行筛选和功能性分析的本发明的试剂盒

制备了一种用于根据猪的品种和组织对生长特异性基因进行筛选和功能性分析的试剂盒，其包括实施例2制备的功能性cDNA芯片，结合了Cy5-dCTP或Cy3-dCTP的、来自于待筛选的组织的RNA的cDNA，一个荧光扫描系统和一个计算机分析系统。

工业实用性

如以上实施例所述，本发明涉及筛选猪的生长特异性基因的表达模式和使用这些基因的功能性cDNA芯片，并提供了猪的肌肉和脂肪组织中与生长相关的新的生长因子的核苷酸序列。同时，本发明提供了一种用于根据猪的品种和组织对生长特异性基因进行筛选和功能性分析的功能性cDNA芯片，所述的cDNA芯片通过仅将由如上所述而得到的特异性基因整合于其中而制备。因此，所述的用于根据猪的品种和组织对生长特异性基因进行筛选和功能性分析的功能性cDNA芯片可用于改良猪的品质并培育新的品种，因此对于养猪业具有十分重要的用途。

                              序列表

<110>庆尚南道

<120>筛选猪的生长特异性基因的表达模式和以其制备的功能性cDNA芯片

<130>YLOP040111CN

<150>KR 2003-83653

<151>2003-11-24

<160>5

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>660

<212>DNA

<213>鹿儿岛黑猪

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<210>2

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<212>DNA

<213>鹿儿岛黑猪

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<210>3

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<213>鹿儿岛黑猪

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<210>5

<211>507

<212>DNA

<213>鹿儿岛黑猪

<400>5

tatatagaac cgaatcacgt acactgggcc tgaccaagca gggccaaaac aaggcaacct         60

aggaggttat aaaataggta tacgcgcgct gacacataca tactcactac ccgaacgcgg        120

ggacaactag ggctccgcca taagccatcc tttcctggtc gtcgatgttg cgggctgcag        180

ttatagggct gccaaccgcc atacacacct taccagccac ttattaagtt acatccacga        240

gggctctgta ccacccctaa gcagtggcag tggtagccgc tgcccgctta ccctgcgcag        300

tgttggtgct agctccgtcc taagcttccc cgatagccgc cgctttttac acaccatcgg        360

cggactagac accgttggtt gcagcgtaag cgtctatggt agcagctgcg gcgaccgccg       420

tgtagccagc ttactacatg ttagtttcag caaccaccct gccaataccc gtgttcccta       480

ctccaactct gtcggtttca gccgcag                                           507

Claims (3)

1、一种用于根据猪的品种和组织对生长特异性基因进行筛选和功能性分析的功能性cDNA芯片，其包括一种探针和所述探针固定于其上的基质，所述探针包含猪的肌肉和脂肪组织中的生长特异性基因。

2、权利要求1的功能性cDNA芯片，其中所述的探针DNA包含如SEQ ID NO：1至5所示的核苷酸序列。

3、一种用于根据猪的品种和组织对生长特异性基因进行筛选和功能性分析的试剂盒，其包括权利要求1的、其上整合了猪的生长特异性基因的功能性cDNA芯片，结合了Cy5-dCTP或Cy3-dCTP的、来自于待筛选的组织的RNA的cDNA，一个荧光扫描系统和一个计算机分析系统。