CN1614002A - 烟草疫霉的产孢培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种烟草疫霉的产孢培养方法，其特征在于：分离烟草疫霉，选择芝麻培养基或黑麦培养基为烟草疫霉的孢子囊培养基，在芝麻培养基、黑麦培养基平板上接种活化的烟草疫霉，重复数次，28℃温箱中培养14天后，刮取菌丝，用0.1％KNO3浸润，5－8天后测孢子囊数量、孢子囊大小，孢子囊在6－11℃下处理15－25min释放游动孢子，测孢子囊的释放率。本发明在芝麻培养基上培养烟草疫霉，产孢子囊能力强，孢子囊大，释放率高，游动孢子活动时间长。在盆栽试验以及大田试验中，培养病原菌烟草疫霉采用芝麻培养基培养产孢较好。
Description
技术领域
本发明特别涉及一种烟草疫霉在培养基上培养、产孢以及孢子囊释放的方法。
背景技术
烟草疫霉是重要的病原菌，烟草黑胫病是毁灭性病害之一，寄主范围广泛，在我国寄生于烟草、大葱、颠茄、辣椒、柚、甜橙、黄瓜、海岛棉、番茄、苹果、芝麻等中，使作物在其根茎部产生病害。
烟草黑胫病(tobacco black shank)是由烟草疫霉引起的，烟草疫霉以菌丝体与厚壁孢子随病株残体在土壤或堆肥中越冬，成为次年的初浸染源。病株上产生的孢子囊或释放出来的游动孢子通过地面流水或风雨吹溅进行再侵染，侵染主要部位是土表及土面以下5cm深的茎基部。
病原菌是研究其引起的病害、生理小种和生物防治的重要内容。而国内外对烟草疫霉病原菌的产孢方法众多，标准不一。在人工培养条件下，烟草疫霉在相当长时间内不产生孢子囊或很少产生，即使产生孢子囊，一般也不集中释放游动孢子。而游动孢子又是重要的侵染形式，因此就影响该病原菌的生理专化型、生防测定以及病害等研究工作。
对于烟草疫霉孢子囊的形成和游动孢子的释放研究，目前采用在燕麦培养基上培养菌丝，再加入0.1％KNO3溶液浸润产孢的方法。Gooding虽然从燕麦培养基上刮取菌丝加0.1％KNO3浸润能产生大量孢子囊，其游动孢子的浓度越大，游动的时间越长，但产孢方法并不稳定，重复性低。刘延荣等在1987年《山东农业科学》中的关于“烟草黑胫病菌孢子囊形成和游动孢子释放条件的研究”报道了在人工培养条件下，用低浓度的无机盐溶液，如33％Hoagland’s营养液、0.1％KNO3或蒸馏水浸泡生长旺盛的菌丝，可促使较快形成孢子囊，游动孢子的浓度对游动孢子的游动性影响不大；杨建卿等在2001年《植物保护》第27(4)期中关于“烟草疫霉菌的培养及大量产生游动孢子方法的研究”报道了在燕麦培养基上培养菌丝，再用加土壤浸出液，可在3天内产生大量游动孢子囊，低温处理后再培养24小时，可产生大量游动孢子，但这些方法产孢不稳定，而且孢子囊较小，释放率不高。
发明内容
本发明的目的，是提供一种烟草疫霉的培养和产孢方法。它具有产孢稳定，孢子囊较大，释放率高的优点。
本发明的目的是这样实现的：
分离烟草疫霉，选择芝麻培养基或黑麦培养基为烟草疫霉的孢子囊培养基，在芝麻培养基、黑麦培养基平板上接种活化的烟草疫霉，重复数次，28℃温箱中培养14天后，刮取菌丝，用0.1％KNO3浸润，5-8天后测孢子囊数量、孢子囊大小，孢子囊在6-11℃下处理15-25min释放游动孢子，测孢子囊的释放率。
由于烟草疫霉的致病力强弱与产孢能力，孢子囊大小，释放率等三种因素紧密相关，芝麻是烟草疫霉的自然寄主，芝麻做成的培养基中含有烟草疫霉生长、产孢的物质，有利于其生长、产孢，而且芝麻还广泛用于低等真菌孢子的诱集研究中。因此芝麻培养基上培养烟草疫霉，产孢子囊能力强，孢子囊大，释放率高，游动孢子活动时间长。在盆栽试验以及大田试验中，培养病原菌烟草疫霉采用芝麻培养基培养产孢较好。
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明不仅限于这些例子。
1.分离烟草疫霉
将烟草种子于28℃下浸泡1天，再铺在湿润滤纸上28℃下催芽，3天后播于装有湿润土的瓷盘里，上面再覆一层细沙，20-26℃温室中光照培养，20天后移栽子装有沙壤土的塑料钵中，每钵1株，塑料钵的体积为0.21dm3，每10天施一次Hoaland’s全营养液，10ml/钵。
烟草疫霉的分离采用髓部碟片分离法，取典型烟草黑胫病病株茎杆，洗净拭干，醮95％的酒精，烧干，重复3次，用灭菌解剖刀剖开，再用灭菌的镊子夹取碟片置于燕麦培养基平板上28℃培养。3后纯化，保存于燕麦培养基斜面上。
调整孢子囊浓度为1×104个/ml，8℃下处理20min，稀释10倍后加入1％的葡萄糖，注射8-10叶期烟苗茎基部以上1cm处髓部，每株0.1ml接种菌液，对照注射无菌水。再从接种发病的植株上分离烟草疫霉，4℃冰箱中保存待用，以后每6个月回接一次烟草，以恢复致病力。
2.选择生长培养基
选择生长培养基：取燕麦培养基平板上培养3d的烟草疫霉边缘菌丝块，菌块直径0.4cm，分别接种于直径为9cm的PDA、PSA、燕麦培养基、芝麻培养基、黑麦培养基平板中心上，每皿培养基量为15ml，28℃温箱中培养，3次重复。记录菌丝在平板上生长的时间和测菌落生长量，菌落生长量的测定方法为，采用垂直十字交叉法测量菌落直径，以测得两值的平均值减去菌块直径0.4cm，所得差值除以2即为菌落生长量。计算平均每天生长量。烟草疫霉在不同培养基上的生长情况，见表1。
表1 烟草疫霉在不同培养基上的生长情况
Table 1 The growth speeds of Phytophthora parasitica var.nicotianae on thedifferent culture medium
培养基种类 平均每天菌落生长量(cm) 差异显著性 菌丝
Significant difference
Culture Average growth speeds/d(cm) 0.05 0.01 Hypha
PDA 0.46 e D 稀薄rarity
PSA 0.52 d D 稀薄rarity
燕麦培养基 0.86 b B 丰厚thick
Oats culture mediums
芝麻培养基 1.10 a A 丰厚thick
Sesame culture medium
黑麦培养基 0.78 c C 丰厚thick
Rye culture medium
从表1可以看出，烟草疫霉在芝麻培养基上生长最快，平均每天菌落生长量达1.10cm，而且菌丝丰厚。PDA、PSA上生长最差，平均每天菌落生长量仅为0.46、0.52cm，而且菌丝稀薄，这两种培养基不适于培养烟草疫霉，在α＝0.05和α＝0.01水平上，芝麻培养基上菌落生长量和燕麦培养基、黑麦培养基等相比，都呈显著差异。
因此，选择芝麻培养基和黑麦培养基为烟草疫霉的产孢培养基。
3.选择烟草疫霉的产孢方法
烟草疫霉产孢方法：
(1)直接培养产孢：分别在等量15ml的芝麻培养基、黑麦培养基平板以及含有烟茎皮汁液的燕麦培养基、含有0.1％KNO3的燕麦培养基、含有0.1％Ca(NO3)2的燕麦培养基平板上接种活化的烟草疫霉，3次重复，28℃温箱中培养，21天后检测产孢情况。加入烟汁、Ca(NO3)2的燕麦培养基、芝麻培养基、黑麦培养基上菌丝生长良好。
(2).培养后诱导处理产孢：分别在等量15ml的芝麻培养基、黑麦培养基平板上接种活化的烟草疫霉，28℃温箱中培养14天后，①在芝麻培养基、黑麦培养基平板上加入灭菌水，培养基平板培养；②在燕麦培养基平板上加入0.1％KNO3、0.05％KNO3、0.1％Ca(NO3)2溶液、蒸馏水、烟根际土壤浸出过滤液、灭菌水，燕麦培养基平板光照2小时后继续培养，4℃处理8h后继续培养，划破燕麦培养基平板后继续培养；③在芝麻培养基、黑麦培养基平板上分别加入0.1％KNO3、灭菌水，分别刮取燕麦培养基、芝麻培养基、黑麦培养基平板上的菌丝加入0.1％KNO3浸润，培养基平板培养。3次重复，6天后检测产孢情况。
在培养基上培养烟草疫霉14天后，在芝麻培养基、黑麦培养基平板上加入灭菌水，都未产生孢子囊。燕麦培养基平板加入烟根际土壤浸出过滤液的培养基上，产生了孢子囊，但燕麦培养基平板加入烟根际土壤浸出过滤液产孢后污染严重，不能采用。芝麻培养基平板和黑麦培养基平板上加入0.1％的KNO3溶液后，都产生了孢子囊。
(3)不同培养基产孢量及孢子囊释放率比较：
分别在15ml燕麦培养基、芝麻培养基和黑麦培养基平板上接种活化的烟草疫霉，重复数次，28℃温箱中培养14天后，刮取菌丝，用0.1％KNO3浸润，5-8天后测孢子囊数量、孢子囊大小及释放率。三种培养基产孢量、孢子囊大小及释放率比较，见表2。
表2三种培养基产孢量、孢子囊大小及释放率比较
Table 2 Comparing the producing zoosporangia quantity，size and release rate ofzoosporangia
培养基种类 平均产孢量(×104个/cm2)差异显著性 孢子囊大小(μm) 释放率％
Medium Average producing Significant difference Size of zoosporangia Release rate
zoosporangia quantity 0.05 0.01
燕麦培养基 2.15 b B 26.84×23.66 28.0
Oats eulture mediums
芝麻培养基 2.52 a A 8.98×30.19 43.0
Sesame culture medium
黑麦培养基 2.07 b B 29.07×25.01 32.1
Rye culture medium
从三种培养基产孢囊量比较可以看出，在芝麻培养基上产孢能力最强，平均为2.52×104个孢子囊/cm2，而在燕麦培养基和黑麦培养基上分别为2.15×104个孢子囊/cm2和2.07×104个孢子囊/cm2，在α＝0.05和α＝0.01水平上，芝麻培养基上平均产孢量和燕麦培养基、黑麦培养基相比，都呈显著差异。从孢子囊大小来看，芝麻培养基上所产孢子囊最大，为38.98×30.19μm，而燕麦培养基和黑麦培养基上所产孢子囊较小，大小为26.84×23.66μm和29.07×25.01μm。从释放率来看，芝麻培养基上所产孢子囊释放率最高，为43.0％，而其他两种分别为28.0％和32.1％。
结论：芝麻培养基的产孢能力、释放率都比燕麦培养基高，释放率高出15.0个百分点，而且孢子囊较大。虽然芝麻培养基和黑麦培养基都可用来培养烟草疫霉产孢，但芝麻培养基产孢能力强，所产孢子囊较大，释放率也较高。
Claims (1)
- 一种烟草疫霉的产孢培养方法，其特征在于：分离烟草疫霉，选择芝麻培养基或黑麦培养基为烟草疫霉的孢子囊培养基，在芝麻培养基、黑麦培养基平板上接种活化的烟草疫霉，重复数次，28℃温箱中培养14天后，刮取菌丝，用0.1％KNO3浸润，5-8天后测孢子囊数量、孢子囊大小，孢子囊在6-11℃下处理15-25min释放游动孢子，测孢子囊的释放率。
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