CN1594547A - Hd34－1菌株的构建及以其为发酵菌株酿造无醇啤酒的方法 - Google Patents

Abstract

HD34－1菌株的构建及以其为发酵菌株酿造无醇啤酒的方法，它涉及一种基因工程菌株的构建及无醇啤酒的酿造方法。HD34－1是这样构建的：a.设计5′端、3′端引物；b.扩增ADH基因；c.与表达载体pYC6/CT连接；d.转化进入Saccharomyces cerevisiae HD34；e.初筛转化子，获得HD34－1菌株，以其为发酵菌株酿造无醇啤酒的方法如下：a.活化菌株；b.将菌种转到培养基中摇瓶培养；c.将扩培菌种接种到含有麦芽汁的发酵罐中；d.充氧、发酵；e.测量糖度，当糖度降到5°BX时停止发酵；f.降温，放置一周后即可出罐。本发明的菌株能催化伯醇和醛的正反应，降低乙醇产量，简化生产工艺。

Description

HD34-1菌株的构建及以其为发酵菌株酿造无醇啤酒的方法

技术领域：

本发明涉及一种基因工程菌株的构建及无醇啤酒的酿造方法，特别涉及一种基因工程菌株的构建方法及以其为发酵菌株酿造无醇啤酒的方法。

背景技术：

乙醇脱氢酶(E.C.1.1.1.1，简称ADH)是一种广泛专一性的含锌金属酶(Drewkw et al.，1988)，它可以NAD为辅酶催化伯醇和醛之间的可逆反应，是啤酒发酵过程中一种重要的发酵酶，它的正反应催化活性对于降低啤酒中的乙醇含量有着重要意义。因此该酶是微生物发酵法生产低醇或无醇啤酒的关键酶。无醇啤酒是指不含酒精或酒精含量甚微的啤酒，它与普通啤酒一样，以大麦为主要原料，经发酵而酿造，并且仍保留着传统啤酒的色、香、味特性。目前，世界上生产无醇啤酒的方法主要有两大类：一类是以限制发酵方法来降低制酒发酵过程中生成乙醇的量，包括特殊酵母控制发酵、中断发酵、低温控制发酵、“冷混合”工艺、Barrell专利和高浓度稀释啤酒；另一类是在后发酵过程中将产生的乙醇除去，包括常压蒸馏、真空蒸馏、蒸发、反渗透和透析。但是现有的这些方法在工艺上或多或少都有相应的问题和弊端：1、特殊酵母控制发酵：由于醪液中含有大量的未发酵麦芽糖而具有很浓的甜味，而且发酵过程中由于低酒精高糖的醪液环境，使发酵醪的微生物控制要求非常严格，必须保证在发酵过程中醪液仅有一种酵母的存在，否则都将导致发酵的失败；2、中断发酵：由于发酵不完全，其稳定性不如传统发酵的啤酒；3、低温控制发酵：除残糖高而有甜味以外，后发酵阶段和冷冻过滤阶段非常容易感染杂菌，工艺控制比较严格；4、“冷混合”工艺、Barrell专利和高浓度稀释啤酒由于工艺的需要对于设备的要求比较严格，因此大范围应用还有困难；5、常压蒸馏：由于使啤酒长时间加热，啤酒中的各种风味物质发生了很大的变化，导致口味不容易被广大消费者接受；6、真空蒸馏、蒸发、反渗透和透析：这些技术虽然解决了啤酒风味问题，但是由于这些技术对仪器设备以及厂房和技术人员都有很高的要求，对于厂家来说并不是最好的选择。

发明内容：

本发明的目的是提供一种HD34-1菌株的构建及以其为发酵菌株酿造无醇啤酒的方法，它从无醇啤酒酵母基因工程菌株HD34-1出发，酿造无醇啤酒，可以简化生产工艺，降低成本，克服现有无醇啤酒生产工艺的诸多弊端，满足市场需要。本发明的基因工程菌株HD34-1是这样构建的：a、依据GenBank上登录的ADH基因序列设计5′端、3′端引物，在5′端引物和3′端引物分别加上Sac I和BamH I的识别位点 GAGCTC和 GGATCC；b、采用PCR方法以Bacillus subtilis的基因组DNA作为模板扩增ADH基因；c、将得到的产物与表达载体pYC6/CT连接；d、将构建的重组DNA采用LiAc转化法转化进入Saccharomyces cerevisiae HD34；e、用同工酶方法对所得转化子进行初筛，对初筛后的菌株进行ADH定性检测，获得HD34-1菌株。以HD34-1菌株为发酵菌株酿造无醇啤酒的方法是这样实现的：a、采用麦芽汁培养基固体斜面活化HD34-1；b、在20～40℃的温度下将活化好的菌种转到500ml麦芽汁液体培养基中，摇瓶培养46～50小时，控制温度为20～40℃，转速为120转/分钟；c、将扩培好的菌悬液冷却至3～5℃，按2～4％的接种量将扩培菌种接种到含有麦芽汁的发酵罐中；d、然后向发酵罐中充氧2～3分钟，在10～14℃进行发酵；e、以天为单位测量糖度，当糖度降到5°BX时停止发酵；f、降温至3～5℃，放置一周后即可出罐，得到无醇啤酒。本发明依据GenBank上登录的Bacillus subtilis ADH(Alcohol Dehydrogenase)基因序列 NC 000964.设计5′端、3′端引物，采用PCR方法从公认的安全菌株Bacillus subtilis中克隆到ADH基因，并与表达载体pYC6/CT连接，转化进入Saccharomyces cerevisiae HD34中，从得到的转化子中筛选出ADH活性明显高于原始菌株的菌株，从而获得菌株HD34-1，因为这样的菌株能够改变菌株本身代谢调控，使得ADH的正反应活性增强，催化伯醇和醛的正反应，降低乙醇产量。基因工程菌株HD34-1在啤酒酿造中的应用，能够简化生产工艺，使得无醇啤酒与普通啤酒的生产工艺一致；仍保留传统啤酒的色、香、味特性；对于设备的要求不高，可以大范围应用；啤酒的最终酒精度＜1％(v/v)；发酵周期缩短为12天；双乙酰含量0.106ppm；总酸、高级醇等各项指标合格。

附图说明：

图1为表达载体pYC6/CT的图谱。

具体实施方式：

具体实施方式一：本实施方式的基因工程菌株HD34-1是这样构建的：a、依据GenBank上登录的ADH基因序列设计5′端、3′端引物，在5′端引物和3′端引物分别加上Sac I和BamH I的识别位点 GAGCTC和 GGATCC；b、采用PCR方法以Bacillus subtilis的基因组DNA作为模板扩增ADH基因；c、将得到的产物与表达载体pYC6/CT连接；d、将构建的重组DNA采用LiAc转化法转化进入Saccharomyces cerevisiae HD34；e、用同工酶方法对所得转化子进行初筛，对初筛后的菌株进行ADH定性检测，获得高ADH活性的菌株HD34-1。

具体实施方式二：本实施方式的基因工程菌株HD34-1是这样构建的：

a、依据GenBank上登录的ADH基因序列设计5′端、3′端引物，在5′端引物和3′端引物分别加上Sac I和BamH I的识别位点 GAGCTC和 GGATCC：

GenBank上登录的Bacillus subtilis ADH(Alcohol Dehydrogenase)基因序列 NC 000964.为：

                                                                              ttat

3182941 accgttttag gcgtaaggtt aaagcagcgt ttgtagatcc agttgtatgc tttttcattt

3183001 aaatctctag ggtttccgaa ggtttgcgga tctttcattg cttctttaga caagcgttcg

3183061 atcatatcag gtgatactcc ctgctcttct aaagtcggca cttctaaatc ttcgaccaga

3183121 tcatacatcc aattgacaga tgctttcgca gcttcttctg ttgtcatctt gcttgtatca

3183181 ataccgaacg ctttcgcaat acgcgcaaac ttctcaggat agcccttcca gttgtattcc

3183241 atgacagggc ccatcatcgc cgctacacat tggccgtgag cgactgggat aataccgcca

3183301 agcgtttggc tcatcgcatg agcagcgccc gctgattcac ttccgtaaga aagaccggca

3183361 agcatcgcag cctgcgccat tccgtacctt gcttccagat cctctccatc agcaaatgcc

3183421 ctcttgatgt aatgagcggc atactcaatc gccattaagg caaccgcatc cgtgattggc

3183481 tgtgcaaatt tcattgtata gcactcaatg gcatgggcga gcgcatcaat tcccgtcata

3183541 gctgttacat gcggaggcat tgaaacatga agctcaggat caatgattgt caagtgcgct

3183601 gcaatcagcg gaccgcccgt gttgaatttg aattctcttt cttcatctgt gataaccgcc

3183661 cattgggtta cttctgatcc ggttccagct gtagtgggaa ttgtcgtcag cggaggaatg

3183721 cggttttcca gcggtttttt cccatctgcc gcttcataat caagcacgct tccttcgtga

3183781 gtcgcttcta ctccgattgc ttttgctgta tccatggagc ttccgcctcc gactgccacc

3183841 aaaccattac agttctcttt tttgtaaagc tcagatcctt cattcaccag acggacaggc

3183901 gggtttggct caactttatt aaagagtacc acttcaatgc ctgcttcttt aagtgattcg

3183961 attacgggat cagcaacacc ggctttataa atcccagggt ctgtgacaag gagcgctttt

3184021 gaaacgccca gtgcagctac ttcctcaccc gtatgcttga tggctccgat tccatgctta

3184081 atcacagtcg gaatttcaaa tgtgtggaat ttctgcatgc tttctacctt catatttaat

3184141 gtcatcat，

5′端：AGT  GAGCTC TCTAGGGTTTCCGAAGGTTTGCG，3′端：GTGGGATCC AATCGGAGCCATCAAGCATACGG；

b、采用PCR方法以Bacillus subtilis的基因组DNA作为模板扩增ADH基因：

94℃ 1min、67℃ 1min、72℃ 3min，在50μl反应体积中含有Bacillussubtilis的基因组DNA模板0.5μg、引物各20pmol、dNTP名50μmol、2单位Tag酶、30个循环，扩增ADH基因片段，得到PCR产物；

c、将得到的产物与表达载体pYC6/CT连接：

i、PCR产物经乙醇沉淀，溶解于TE溶液中(10×TE：12.1g Tris Base+3.7gEDTA+900ml H₂O(去离子)，用HCl调pH至7.5，定容至1000ml)，用质量体积浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段的长度，如与GenBank上登录的一致即1.2kb，则可进行测序；

ii.将PCR产物与pBlue载体连接，pBlue载体是克隆载体，其中

酶切反应液：pBlue(1μg/μl)          5μl

            10×缓冲液               2μl

            Sac I(5U/μl)            1μl

            BamH I(5U/μl)           1μl

            ddH₂O                   11μl

反应条件：37℃，2小时；

连接反应液：PCR产物(0.1μg/μl)      1μl

            pBlue载体(50ng/μl)      1μl

            10×T₄DNA连接酶Buffer   1μl

            T₄DNA连接酶(1U/μl)     1μl

            ddH₂O                   6μl

反应条件：16℃，过夜；

将上述连接产物转化E.coli感受态细胞JM109；

iii.将含有ADH基因的E.coli JM109用100ml LB液体培养基在37℃、200转/分的条件下培养过夜；

iv.使用Sangon MNIQ-200质粒大量抽提试剂盒(SK241)提取pBlue-adh重组质粒DNA，其提取步骤如下：

(1)将RNase A Solution加入Solution I中，混合备用，Wash Solution瓶中加入4倍体积的无水乙醇，Solution II用37℃水浴促溶；

(2)加Solution I 2ml于保存有E.coli的离心管，冰上操作，放置2min；加Solution II 2ml于离心管中，上下颠倒5-10次，裂解细菌，冰上操作，放置2min；

(3)加8.6ml Solution III，上下颠倒5-10次，室温放置2min；

(4)10,000转/分，4℃，高速离心10min；

(5)取上述部分上清液于50ml收集管中(装有UNIQ-200柱)(6ml)，静置5min，4000转/分，4℃，离心2-5min；

(6)弃废液，加剩余上清液(4ml)于收集管中(有柱)，4000转/分，4℃，离心2-5min；

(7)加5ml Wash Solution于柱内4000转/分室温离心2min；

(8)重复离心一次；

(9)弃废液，4000转/分室温离心10min；

(10)另取一支新离心管，加500μl Elution Buffer，室温放置2min，4000转/分室温离心2min；

(11)将500μl Elution Buffer转入Eppendorf管中，加入50μl 3M NaAc、500μl异丙醇，4℃静置20min；

(12)14,000转/分、4℃离心10min；

(13)弃上清液，加1ml 70％的乙醇洗涤；

弃上清液，加20μl 1×TE，取5μl混合1μl loading buffer，用体积质量浓度为0.8％的琼脂糖电泳检测结果；

(14)提取的质粒DNA浓度用RNA/DNA Calculator检测；

v.重组质粒DNA pYC6/CT-ADH的构建：酵母表达载体pYC6/CT是Invitrogen公司的产品，是低拷贝的表达载体，因而在生产菌株中进行表达时具有稳定和尽可能减少对受体细胞的影响等特点，表达载体pYC6/CT的图谱见图1，将pBlue-adh和pYC6/CT(4.5Kb)分别用Sac I和BamH I双酶切，

酶切反应液A：重组质粒pBlue-adh(1μg/μl)       5μl

          10×缓冲液                           2μl

          Sac I(5U/μl)                        1μl

          BamH I(5U/μl)                       1μl

          ddH₂O                               11μl

酶切反应液B：pYC6/CT(1μg/μl)                 5μl

          10×缓冲液                           2μl

          Sac I(5U/μl)                        1μl

          BamH I(5U/μl)                   1μl

          ddH₂O                           11μl

反应条件：37℃，2小时；

用质量体积浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA胶回收试剂盒(购自上海华舜生物工程有限公司)从凝胶中回收基因片段和pYC6/CT片段，用T₄DNA连接酶连接这两个片段，其中

连接反应液：基因片段(0.1μg/μl)           1μl

            载体片段(50ng/μl)             1μl

            T₄DNA连接酶(1U/μl)           1μl

            ddH₂O                         7μl

反应条件：16℃，过夜；

将上述连接产物转化E.coli感受态细胞JM109。

vi.将含有ADH基因的E.coli用100ml LB液体培养基，37℃，200转/分培养过夜；

d、将构建的重组DNA采用LiAc转化法转化进入Saccharomycescerevisiae HD34：

LiAc转化方法如下：(1)将培养2～4h的1500g HD34菌液离心(＜3000转/分)5min，弃上清液；(2)加40ml 1×TE，离心(＜3000转/分)5min，弃上清液；(3)加2ml 1×LiAc/0.5×TE，室温放置10min，加入1μg plasmid DNA、100μg denatured sheared salmon sperm DNA和100μl yeast suspension；(4)加700μl1×LiAc/40％PEG-4000/1×TE混合，30℃反应30min；(5)加88μlDMSO原液，混合均匀，40℃水浴加热7min；(6)13,000转/分离心10秒，弃上清液，用1×TE洗涤沉淀两次；(7)加1ml 1×TE洗涤，14000转/分离心10秒，吸取上清液，加入50-100μl 1×TE，涂布于含有Blasticidin的平板上，30℃培养过夜，同时将空质粒(保存于E.coli)转化作为阳性对照，以及空白作为负对照(只涂布菌种)；

e、用同工酶方法对所得转化子进行初筛，对初筛后的菌株进行ADH定性检测，获得高ADH活性的菌株HD34-1：

初筛方法如下：

A、酶蛋白的提取：将经过培养(30℃，350转/分钟)的HD34转化菌悬液离心(3000转/分钟)5min，弃上清液，菌体沉淀移入装有液氮研钵，并迅速研磨成冻干粉，装入离心管中，加入1ml蛋白贮液(Tris-HCl(pH7.5)20mM、EDTA 0.1mM、Glycerol 10％、KCl 100mM、DTT 1mM、PMSF 1mM，煮沸5分钟，4℃保存)离心(1000转/分钟)2min；

B、不连续聚丙酰胺凝胶电泳检测：

PAGE配方：贮液           配制方法(100ml)

          1              1mol/L HCl 48ml+36.6gTris+52ml H₂O

          2              28.0gArc+0.74gBis+100ml H₂O

          3              0.28g过硫酸铵+50ml H₂O(可用一周)

          4              1mol/LHCl 48ml+5.98gTris+52ml H₂O

          5              10.0gArc+2.5gBis+100ml H₂O

          6              40.0g蔗糖+100ml H₂O

          7              TEMED原液

          8              Tris 0.60g+甘氨酸2.88g+100ml H₂O

分离胶(7.0％)32ml：

标号(加样顺序)            毫升数            比例

1                         4                 1

2                         8                 2

H₂O                      16                4

3                         4                 1

7                         19.2μl           4.8μl

浓缩胶(2.5％)16ml：

标号(加样顺序)            毫升数            比例

4                         2                 1

5                         4                 2

6                         8                 4

3                         2                 1

7                         24μl             12μl

按上述比例配制好PAGE，点样电泳，加入20μl样品上清液、10μl 40％蔗糖、20μl 0.1％溴酚蓝、浓缩胶15mA和分离胶30mA，1小时左右停止电泳，取出胶，将浓缩胶去除，对分离胶进行染色，作好位置标记，其中染色方法如下：

①50ml Tris-HCl(0.05mol/L，pH8.0)6.06g Tris+1000mlH₂O+1mol/LHCl调至pH8.0；

②4滴酒精95％(ethanol)；

③16滴辅酶I(1％NAD)0.5gNAD+50ml H₂O；

④16滴氮蓝四唑(1％NBT或用1％MTT)0.1gNBT+10ml H₂O；

⑤4滴吩嗪甲硫酸(1％PMS)0.2gPMS+20ml H₂O；

30℃培养箱中，暗处染色30min，观察条带，取出现特异性蓝色条带的菌株做ADH活性定量检测，其方法如下：

A、蛋白质浓度测定：取14只试管，分两组按表1平行操作(考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250100mg溶于50ml 95％乙醇中，加入100ml 85％磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01％(W/V)考马斯亮蓝G-250，4.7％(W/V)乙醇，8.5％(W/V)磷酸；标准蛋白质溶液：BSA(预先测定蛋白氮含量)，根据其纯度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml，0.1mg/ml蛋白溶液)，然后绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线，取合适的样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准曲线蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白浓度；

表1

试管编号	0	1	2	3	4	5	6
								1mg/ml标准蛋白溶液/ml	0	0.01	0.02	0.03	0.04	0.05	0.06
0.15mol/LnaCl/ml	0.10	0.09	0..08	0.07	0.06	0.05	0.04
								考马斯亮蓝试剂/ml	5ml
摇匀，1h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色
								A595nm

B.ADH活性定量测定：重新培养菌株，如同上述方法提取酶蛋白溶于蛋白贮液中，取200μl上清液，加入200μl 1％的BSA、600μl pH7.5、0.1M的磷酸缓冲液混合均匀，从中取出100μl混合液，加入1.5ml 0.1mol/L的焦磷酸缓冲液、0.5ml 2.0mol/L的乙醇和1.0ml 0.025mol/L的NAD，在30℃下温浴3～4min，测定340nm下OD值，计算ADH活性。

具体实施方式三：本实施方式的无醇啤酒是这样实现的：a、采用麦芽汁培养基固体斜面活化HD34-1；b、在20～40℃的温度下将活化好的菌种转到500ml麦芽汁液体培养基中，摇瓶培养46～50小时，其中温度为20～40℃，转速为120转/分钟；c、将扩培好的菌悬液冷却至3～5℃，按2～4％接种量将扩培菌种接种到含有麦芽汁的发酵罐中；d、然后向发酵罐中充氧2～3分钟，在10～14℃进行发酵；e、以天为单位测量糖度，当糖度降到5°BX时停止发酵；f、降温至3～5℃，放置一周后即可出罐，得到无醇啤酒。

具体实施方式四：本实施方式的无醇啤酒是这样实现的：a、采用麦芽汁培养基固体斜面活化HD34-1；b、在30℃的温度下将活化好的菌种转到500ml麦芽汁液体培养基中，摇瓶培养48小时，其中温度为30℃，转速为120转/分钟；c、将扩培好的菌悬液冷却至4℃，按2％接种量将扩培菌种接种到含有麦芽汁(10～11°P)的发酵罐中；d、然后向发酵罐中充氧2～3分钟，在12℃进行发酵；e、以天为单位测量糖度，当糖度降到5°BX时停止发酵；f、降温至4℃，放置一周后即可出罐，得到无醇啤酒。利用无醇啤酒酵母基因工程菌株HD34-1进行啤酒发酵，其工艺指标的测试方法如下：

I、发酵度测定：取发酵液，滤去酵母，微火加热蒸发至原容积的1/3以除去乙醇，添加水恢复原容积后测定20℃的比重，按下式计算发酵度：

$w_r(\%)=\frac{w\·w_1}{w}\×100\%$

式中：w表示发酵前麦芽汁浓度(％)，w₁表示发酵后排除酒精后的发酵液浓度(％)，w_r表示真正发酵度(％)。

II、酒精度测定：在平底烧瓶中加入10.00ml重铬酸钾标准溶液及5ml浓硫酸，冷却，在蒸馏烧瓶中加入12ml蒸馏水和1.00ml除CO₂后的啤酒样品，连接蒸馏装置，在电炉上加热至沸腾，继续沸腾4分钟，将平底烧瓶冷却，加入10mlKI溶液，置暗处放置5分钟，加水至300ml，用Na₂S₂O₃标准溶液滴定，接近终点时加1ml淀粉指示剂，用Na₂S₂O₃溶液继续滴定至终点，根据消耗的Na₂S₂O₃，计算样品中酒精含量，酒精含量g/100ml＝12～0.4A，A表示消耗的标准Na₂S₂O₃毫升数，其中30ml标准Na₂S₂O₃溶液相当120g/L酒精。

III、悬浮酵母数测定：以无菌生理盐水将酵母制成适当浓度的菌悬液，在加样前，先对计数室进行镜检，若有污物则需清洗，吹干后才能进行计数，将清洁干净的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室；加样后静止五分钟，然后将血球计数板置于显微镜载物台上；先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。

IV、总酸测定：利用酸碱中和原理，以氢氧化钠标准溶液直接滴定啤酒样品的总酸，用pH计测量滴定终点，最后由消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，计算出啤酒中总酸的含量，计算公式如下：

X＝2·C·V

其中：X表示总酸含量，即100ml酒样的总酸含量(ml/100ml)；C表示NaOH标准溶液(C＝0.1002mol/L)；V表示50ml酒样消耗的NaOH的ml数；2表示换算成100ml酒样的系数。

V、高级醇测定：采用气相色谱法测定高级醇的变化。

VI、双乙酰含量测定：装好双乙酰蒸馏器，将100ml酒样迅速加入已预热的蒸馏器内，加热蒸馏，直至馏出液接近25ml时，取10ml馏出液加入0.5ml 1％邻苯二胺，充分摇匀放置暗处反应20～30min，加入2ml 4NHCl，混匀后用335nm测其吸收度，计算双乙酰含量。

VII、酵母凝聚力测定：采用细胞数比较法测定酵母凝聚力，在相同条件下将酵母悬浮液在25℃静置30min，取样计数悬浮酵母数S，再将沉淀酵母摇匀，测酵母数T，为提高精确度，如上述操作重复5次，分别取平均值得到S、T，则凝聚酵母数F＝T-S，F′＝F/T，比值愈大，凝聚力愈强。

VIII、糖度测定：用糖度计(WYT-10-32％)测定发酵液的含糖量(％)。

按照上述方法检测经本方法酿造的无醇啤酒，其啤酒的最终酒精度＜1％(v/v)；双乙酰含量0.106ppm；总酸、高级醇等各项指标合格。

Claims (2)

1、HD34-1菌株的构建，其特征在于它是这样构建的：a、依据GenBank上登录的ADH基因序列设计5′端、3′端引物，在5′端引物和3′端引物分别加上SacI和BamHI的识别位点 GAGCTC和 GGATCC；b、采用PCR方法以Bacillus subtilis的基因组DNA作为模板扩增ADH基因；c、将得到的产物与表达载体pYC6/CT连接；d、将构建的重组DNA采用LiAc转化法转化进入Saccharomyces cerevisiae HD34；e、用同工酶方法对所得转化子进行初筛，对初筛后的菌株进行ADH定性检测，获得HD34-1菌株。

2、以HD34-1菌株为发酵菌株酿造无醇啤酒的方法，其特征在于它是这样实现的：a、采用麦芽汁培养基固体斜面活化HD34-1；b、在20～40℃的温度下将活化好的菌种转到500ml麦芽汁液体培养基中，摇瓶培养46～50小时，其中温度为20～40℃，转速为120转/分钟；c、将扩培好的菌悬液冷却至3～5℃，按2～4％接种量将扩培菌种接种到含有麦芽汁的发酵罐中；d、然后向发酵罐中充氧2～3分钟，在10～14℃进行发酵；e、以天为单位测量糖度，当糖度降到5°BX时停止发酵；f、降温至3～5℃，放置一周后即可出罐，得到无醇啤酒。

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