CN1594354A - 齐墩果酸偶联衍生物及其药物用途 - Google Patents
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Abstract
本发明齐墩果酸偶联衍生物为不同类型的NO供体通过连接基团，以酯键或酰胺键分别与肝病治疗药物齐墩果酸(OLA)相偶联而成的一氧化氮供体型OLA衍生物，其中有的化合物抑制细胞凋亡作用明显强于OLA和正在美国进行I期临床研究的细胞凋亡抑制剂NCX－1000，有可能用于肝炎、肝硬化的治疗；有的化合物具有选择性地诱导肝肿瘤细胞凋亡的作用，具有治疗肝癌的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及齐墩果酸偶联衍合物及其药物用途，具体为不同类型的一氧化氮(简称NO，下同)供体通过酯键或酰胺键与具有保肝等作用的齐墩果酸偶联的化合物，及其在制备抑制细胞凋亡或选择性地诱导肝肿瘤细胞凋亡药物中的应用。
背景技术
齐墩果酸(简称OLA，下同)广泛存在于植物界，临床上用于治疗慢性肝炎、肝硬化及恶性肿瘤等，但尚存在生物利用度较低、疗效不十分理想等问题(参见：王立新，韩广轩，刘文庸，等.齐墩果酸的化学及药理研究[J].药学实践杂志，2001，19(2)：104-107；齐墩果酸防治实验性肝损伤作用的研究[J].药学学报，1982，17(2)：93-97)。
病毒性肝炎分布于世界各地，由于难以根治和危害面广，与癌症、艾滋病并称为“世界三大顽症”。病毒感染的持续存在常可造成肝炎的慢性化，进而发生肝纤维化，严重者发展为肝硬化，甚至肝癌。近年来，大量研究表明，细胞凋亡是引起各种肝细胞损伤的重要原因。而NO在细胞凋亡过程中具有双向调节作用：体内持续低浓度的NO(无论是内源性的还是外源性的)可抑制细胞凋亡，对细胞具有保护和促其生长的作用；体内高浓度的NO可产生细胞毒性，诱导肿瘤细胞凋亡，阻止肿瘤细胞的扩散和转移。NO供体是一类在体内经酶和非酶作用释放一定量NO的化合物，已有报道一些NO供体选择性地在肝脏内释放少量NO，可用于治疗肝炎、肝硬化等肝脏疾病。另有报道一些NO供体可经酶的活化特异性地在肝肿瘤部位释放NO，杀灭癌细胞。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：基于NO的双向调节作用，如何应用药物设计的基本理论，设计、合成结构类型新颖、释放NO机制多样化的NO供体型OLA衍生物，并对它们进行生物活性筛选，以获得具有抑制细胞凋亡或选择性地诱导肝肿瘤细胞凋亡作用，尤其是具有保肝作用或特异性抗肿瘤效应的新型肝病治疗药物。本发明还用于提供一种新型肝病治疗药物的可工业化生产的制备方法。
为解决上述问题本发明提供如下技术方案。
通式I化合物
其中，R1代表H，CF3CO-；R2代表-(CH2)n-，n＝2～8，-CH2CH＝CHCH2-，-CH2C≡CCH2-，-CH2-吡啶(2，6)-CH2-，-苯基(CH2)n-(邻，间，对)，n＝1～4。
通式II化合物
其中，R1代表H，CF3CO-；R2代表H，HO-，CH3O-；R3代表-CO-，-CH＝CHCO-；R4代表-(CH2)n-，n＝2～8，-CH2CH＝CHCH2-，-CH2C≡CCH2-，-CH2-吡啶(2，6)-CH2-，-苯基(CH2)n-(邻，间，对)，n＝1～4。
通式III化合物
其中，R1代表H，CF3CO-；R2代表-(CH2)nO-，n＝1～6，-CH(CH3)CH2CH2O-或-(CH2)n苯基OCH2-(间，对)，-(CH2)n苯基O-(间，对)，n＝0～4；R3代表苯基，苯磺酰基；X代表-O-，-NH-。
通式IV化合物
其中，R1代表H，CF3CO-；R2代表H，HO，CH3O-；R3代表-CO-，-CH＝CHCO-；R4代表-(CH2)nO-，n＝1～6，-CH(CH3)CH2CH2O-或-(CH2)n苯基OCH2-(间，对)，-(CH2)n苯基O-(间，对)，n＝0～4；R5代表苯基，苯磺酰基；X代表-O-，-NH-。
通式V化合物
其中，R1代表H，C2H5-，苄基，Na；R2代表-(CH2)2-，-CH＝CH-，-苯基-(邻)；R3代表H，HO-，CH3O-；R4代表-CO-，-CH＝CHCO-；R5代表-(CH2)n-，n＝2～8，-CH2CH＝CHCH2-，-CH2C≡CCH2-，-CH2-吡啶(2，6)-CH2-，-苯基(CH2)n-(邻、间、对)，n＝1～4。
通式VI化合物
其中，R1代表H，C2H5-，苄基，Na；R2代表-(CH2)2-，-CH＝CH-，-苯基-(邻)；R3代表-O(CH2)n-，n＝1～6，-OCH2CH＝CHCH2-，-OCH2CH2CH(CH3)-或-OCH2苯基(CH2)n-(间、对)，-O苯基(CH2)n-(间、对)，n＝0～4；R4代表苯基，苯磺酰基；X代表-O-，-NH-。
通式VII化合物
其中，R1代表H，C2H5-，苄基，Na；R2代表-(CH2)2-，-CH＝CH-，-苯基-(邻)；X代表H，2-CH3，4-CH3，2-氯，3-氯，4-氯，4-氟，4-溴，2-甲氧基，4-甲氧基，2，4-二-氟，3，4-二-氯。
通式VIII化合物
其中，R代表-(CH2)n-，n＝2～8，-CH2CH＝CHCH2-，-CH2C≡CCH2-，-苯基(CH2)n-(邻、间、对)，n＝1～4。
其中，R1代表H，C2H5-，苄基，Na；R2代表-(CH2)2-，-CH＝CH-，-苯基-(邻)；R3代表H，HO-，CH3O-；R4代表-CO-，-CH＝CHCO-；R5代表-(CH2)n-，n＝2～8，-CH2CH＝CHCH2-，-CH2C≡CCH2-，-CH2-吡啶(2，6)-CH2-，-苯基(CH2)n-(邻、间、对)，n＝1～4。
通式I化合物的制备方法：OLA与相应的二溴烷烃反应生成酯1a；或者OLA与三氟乙酸酐反应制得混合酸酐，再与羟基苄溴(邻、间、对)反应，生成酯1b，1a或1b再与硝酸银反应。
1a或1b
其中，R1代表H，CF3CO-；R2代表-(CH2)n-，n＝2～8，-CH2CH＝CHCH2-，-CH2C≡CCH2-，-CH2-吡啶(2，6)-CH2-，-苯基(CH2)n-(邻、间、对)，n＝1～4。
具体反应步骤为：
或
通式II化合物的制备方法：OLA与三氟乙酸酐反应生成混合酸酐，与中间体2a经酯化得2b，2b再与硝酸银反应制得部分II类化合物；其中一些在碳酸氢钠(钾)存在下脱三氟乙酰基得其它II类化合物。
其中，R1代表H-，CF3CO-；R2代表H-，HO-，CH3O-；R3代表-CO-，-CH＝CHCO-；R4代表-(CH2)n-，n＝2～8，-CH2CH＝CHCH2-，-CH2C≡CCH2-，-CH2-吡啶(2，6)-CH2-，-苯基(CH2)n-(邻、间、对)，n＝1～4。
具体反应步骤为：
通式III化合物的制备方法：OLA与三氟乙酸酐反应生成混合酸酐，再与含羟基或氨基的呋咱氮氧化物3a(参见：李瑞文，张奕华，季晖，等.苯磺酰基呋咱氮氧化物与双氯酚酸偶联化合物的合成及抗炎活性[J].药学学报，2001，36(11)：821-826；李瑞文，张奕华，季晖，等.苯基呋咱氮氧化物与双氯酚酸偶联化合物的合成及抗炎镇痛活性[J].药学学报，2002，37(1)：27-32)反应制得部分III类化合物；其中一些在碳酸氢钠(钾)存在下脱三氟乙酰基得其它III类化合物。
其中，R2代表-(CH2)nO-，n＝1～6，-CH(CH3)CH2CH2O-or-(CH2)n苯基OCH2-(间、对)，-(CH2)n苯基O-(间、对)，n＝0～4；R3代表苯基-，苯磺酰基-；X代表O，NH。
具体反应步骤为：
通式IV化合物的制备方法：OLA与三氟乙酸酐反应生成混合酸酐，再与中间体4a(参见：莫若莹，邵国贤，朱丽莲，等.阿魏酸衍生物的合成[J].药学学报，1985，20(8)：584-591)反应制得部分IV类化合物；其中一些在碳酸氢钠(钾)存在下脱三氟乙酰基得其它IV类化合物。
其中，R2代表H-，HO-，CH3O-；R3代表-CO-，-CH＝CHCO-；R4代表-(CH2)nO-，n＝1～6，-CH(CH3)CH2CH2O- or -(CH2)n苯基OCH2-(间、对)，-(CH2)n苯基O-(间、对)，n＝0～4；R5代表苯基-，苯磺酰基-；X代表O，NH。
具体反应步骤为：
通式V化合物的制备方法：OLA与相应的溴代烷(R1Br)反应成酯，再与二酸酐类在4-二甲氨基吡啶(DMAP)催化下得5a，5a与中间体5b在二环己基碳二亚胺(DCC)及DMAP催化下缩合，最后与硝酸银反应；其中一些(R1＝H)与碳酸钠成盐得其它V类化合物(R1＝Na)。
其中，R1代表H，C2H5-，苄基-，Na；R2代表-(CH2)2-，-CH＝CH-，-苯基-(邻)；R3代表H，HO-，CH3O-；R4代表-CO-，-CH＝CHCO-；R5代表-(CH2)n-，n＝2～8，-CH2CH＝CHCH2-，-CH2C≡CCH2-，-CH2-吡啶(2，6)-CH2-，-苯基(CH2)n-(邻、间、对)，n＝1～4。
具体反应步骤为：
通式VI化合物的制备方法：5a与含羟基或氨基的呋咱氮氧化物3a在DCC及DMAP催化下缩合(3a，5a的结构同上)；其中一些(R1＝H)与碳酸钠成盐得其它VI类化合物(R1＝Na)。
具体反应步骤为：
通式VII化合物的制备方法：5a与羟基胍类7a(参见：Renodon-Corniere A，Dijols S，Perollier C，et al.N-Aryl-N’-hydroxyguanidines，a new class of NO-donors afterselective oxidation by nitric oxide synthases：structure-activity releationship[J].J Med Chem，2002，45(4)：944-954)在DCC及DMAP催化下缩合。
其中，X代表H，2-CH3，4-CH3，2-氯，3-氯，4-氯，4-氟，4-溴，2-甲氧基，4-甲氧基，2，4-二-氟，3，4-二-氯。
具体反应步骤为：
通式VIII化合物的制备方法：四氢吡咯与NO气体在高压釜中反应制得偶氮烯鎓二醇盐8a，8a与1a或1b在氮气保护下反应得化合物VIIIA，与8b反应得化合物VIIIB。
其中，R1代表H，C2H5-，苄基，Na；R2代表-(CH2)2-，-CH＝CH-，-苯基-(邻)；R3代表H-，HO-，CH3O-；R4代表-CO-，-CH＝CHCO-；R5代表-(CH2)n-，n＝2～8，-CH2CH＝CHCH2-，-CH2C≡CCH2-，-CH2-吡啶(2，6)-CH2-，-苯基(CH2)n-(邻、间、对)，n＝1～4。
具体反应步骤为：
前述任一项通式化合物在制备抑制细胞凋亡或诱导肝肿瘤细胞凋亡药物中的应用，具体为在制备抗肝炎、肝硬化或抗肝肿瘤药物中的应用。
附图说明
图1、部分目标物的细胞保护作用
图2、VI4的剂量与细胞毒性间的关系
图3、III9的剂量与细胞毒性间的关系
图4、部分目标物NO体外释放量与时间的关系
具体实施方式
以下为本发明化合物的实施例，这些实施例并不意味着对本发明的限制。本发明所用齐墩果酸购自贵州省湄潭县原料药厂，含量＞98％。
实施例1
1)齐墩果酸-2-溴乙酯(1a1)
OLA(1.0g，2.19mmol)悬浮于15ml丙酮中，加三乙胺(2ml)使完全溶解，室温搅拌下加入1，2-二溴乙烷(1.0ml，11.5mmol)，搅拌回流反应6小时，滤除不溶物，滤液浓缩，柱层析[乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝1∶4(V∶V)]，得白色固体0.80g，收率65％，mp：150～152℃。
同法，可由OLA与其它二溴烷烃、二溴烯烃、二溴炔烃等制得另一些中间体如1a。
2)齐墩果酸-2-硝氧乙酯 (I1)
1a1(0.4g，0.71mmol)溶于乙腈和四氢呋喃的混合溶剂中，加入硝酸银(177mg，1.06mmol)，闭光回流反应6小时，滤除黄色的溴化银沉淀，滤液浓缩，得淡黄色油状物，柱层析[乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝1∶4(V∶V)]，得纯品0.3g，收率77.6％，mp：178～180℃。
ESI-MS：568[M+Na]+；
IR(KBr，cm-1)：3447(OH)，1730(C＝O)，1632(ONO2)；
1H-NMR(300MHz，CDCl3)，δ(ppm)：0.71(s，3H，CH3)，0.78(s，3H，CH3)，0.90(s，3H，CH3)，0.93(s，3H，CH3)，0.98(s，3H，CH3)，1.13(s，3H，CH3)，1.49(s，3H，CH3)，2.82～2.86(m，1H，C18-H)，3.20～3.24(m，1H，3α-H)，4.53(t，2H，OCH2，J＝6Hz)，4.13(t，2H，OCH2，J＝6Hz)，5.27～5.29(brs，1H，C12-H)；
Anal.C32H51NO6 Found：(％) N 2.14 C 70.90 H 9.14
Calcd：(％) N 2.57 C 70.42 H 9.42
实施例2
1)3-三氟乙酰氧基齐墩果酸4-溴甲基苯酯(1b1)
OLA(456mg，1mmol)悬浮于甲苯中，加三氟乙酸酐(0.8ml，4mmol)，室温搅拌10分钟后加入对羟基苄溴(238mg，1.4mmol)，搅拌回流反应6小时，冷却室温，10％碳酸氢钠洗至中性，有机层分别用水，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，柱层析[乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝1∶4(V∶V)]得淡黄色油状物，收率67.9％。
2)3-三氟乙酰氧基齐墩果酸4-硝氧甲基苯酯(I8)
1b1(310mg，0.51mmol)溶于乙腈和四氢呋喃的混合溶剂中，加入硝酸银(127mg，0.76mmol)，避光回流搅拌反应4小时，滤除溴化银沉淀，柱层析[乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝1∶4(V∶V)]得纯品190mg，收率63.3％，mp：68～70℃。
ESI-MS：721[M+Na]+；
IR(KBr，cm-1)：3503(OH)，1778(C＝O)，1735(C＝O)，1634(ONO2)；
1H-NMR(300MHz，CDCl3)，δ(ppm)：0.85(s，3H，CH3)，0.92(s，6H，2×CH3)，0.95(s，3H，CH3)，0.98(s，6H，2×CH3)，1.19(s，3H，CH3)，2.96～3.00(m，1H，C18-H)，4.68～4.73(m，1H，3α-H)，5.35(brs，1H，C12-H)，7.05～7.07(m，2H，ArH)，7.22～7.26(m，1H，ArH)，7.36～7.42(m，1H，ArH)；
Anal.C39H52F3NO7 Found：(％) N 1.97 C 66.85 H 7.80
Calcd：(％) N 1.99 C 66.55 H 7.45
实施例3
1)4-羟基-3-甲氧基苯丙烯酸-3-溴丙酯(2a1)
阿魏酸(5g，25.8mmol)溶于50ml丙酮中，加入1，3-二溴丙烷(20.2g，100mmol)，三乙胺10ml，外温50℃加热反应，反应4h，冷却至室温，有大量白色固体析出，过滤，将滤液浓缩，柱层析[乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝1∶4(V∶V)]，得针状固体5.53g。收率：68％，mp：100～102℃。
同法，可由阿魏酸、香草酸、对羟基桂皮酸与其它二溴烷烃、二溴烯烃、二溴炔烃等制得另一些中间体如2a。
2)3-O-三氟乙酰基-齐墩果酸-2-甲氧基-4-[2-(3-溴-丙氧羰基)-乙烯基]-苯酯(2b1)OLA(1.14g，2.5mmol)悬浮于甲苯，搅拌下加入三氟醋酐(2ml，14.85mmol)，反应液澄清，室温搅拌10分钟，加入2a1(0.948g，3mmol)，外温＜90℃反应6小时，冷却，反应液用10％NaOH洗至中性，有机层分别用水，饱和食盐水洗，无水Na2SO4干燥，过滤，减压回收溶剂，柱层析[乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝1∶4(V∶V)]的淡黄色油状物1.57g，收率74％。
3)3-O-三氟乙酰基-齐墩果酸-2-甲氧基-4-[2-(3-硝氧基-丙氧羰基)-乙烯基]-苯酯(II2)2b1(263mg，0.31mmol)溶于乙腈(6ml)及四氢呋喃(2ml)的混合溶液中，加入硝酸银(77.6mg，0.47mmol)，避光回流反应4小时，滤除不溶物，滤液减压浓缩，柱层析[乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝1∶4(V∶V)]得白色固体185mg，收率71.8％，mp：112～114℃。
ESI-MS：854[M+Na]+；
IR(KBr，cm-1)：1779(C＝O)，1750(C＝O)，1715(C＝O)，1635(ONO2)；
1H-NMR(300MHz，CDCl3)，δ(ppm)：0.86(s，3H，CH3)，0.92(s，6H，2×CH3)，0.94(s，3H，CH3)，0.97(s，6H，2×CH3)，1.19(s，3H，CH3)，2.10～2.18(m，2H，CH2)，2.94～3.00(m，1H，C18-H)，3.83(s，3H，OCH3)，4.32(t，2H，OCH2，J＝6Hz)，4.61(t，2H，OCH2，J＝6Hz)，4.68～4.73(m，1H，3α-H)，5.33(brs，1H，C12-H)，6.36(d，1H，＝CH，J＝16Hz)，6.95～6.97(m，1H，Ar-H)，7.07～7.12(m，2H，Ar-H)，7.65(d，1H，＝CH，J＝16Hz)；
Anal.C45H60F3NO10 Found：(％) N 1.56 C 65.34 H 7.31
Calcd：(％) N 1.68 C 64.79 H 7.27
实施例4
1)4-羟基-3-甲氧基苯丙烯酸-4-溴丁酯(2a2)
参照2a1的制备方法，由阿魏酸与1，4-二溴丁烷制得，收率70％，mp：96～98℃。
2)3-O-三氟乙酰基-齐墩果酸-2-甲氧基-4-[2-(4-溴-丁氧羰基)-乙烯基]-苯酯(2b2)
参照2b1的制备方法，由OLA与2a2制得，柱层析[乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝1∶4(V∶V)]得黄色油状物，收率72.5％。
3)3-O-三氟乙酰基-齐墩果酸-2-甲氧基-4-[2-(4-硝氧基-丁氧羰基)-乙烯基]-苯酯(II3)
参照II2的制备方法，由2b2与硝酸银避光反应制得，柱层析[乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝1∶4(V∶V)]得白色固体，收率74％，mp：98～100℃。
ESI-MS：863[M+NH4]+，868[M+Na]+；
IR(KBr，cm-1)：1779(C＝O)，1753(C＝O)，1715(C＝O)，1635(ONO2)；
1H-NMR(300MHz，CDCl3)，δ(ppm)：0.83(s，3H，CH3)，0.90(s，6H，2×CH3)，0.92(s，3H，CH3)，0.95(s，6H，2×CH3)，1.17(s，3H，CH3)，2.88～3.0(m，1H，C18-H)，3.81(s，3H，OCH3)，4.23(t，2H，OCH2，J＝5.8Hz)，4.50(t，2H，OCH2，J＝6.1Hz)，4.65～4.69(m，1H，3α-H)，5.31(brs，1H，C12-H)，6.33(d，1H，＝CH，J＝15.9Hz)，6.94(d，1H，Ar-H，J＝8Hz)，7.06～7.10(m，2H，ArH)，7.61(d，1H，＝CH，J＝15.9Hz)；
Anal.C46H62F3NO10 Found：(％) N 1.46 C 65.38 H 7.56
Calcd：(％) N 1.66 C 65.31 H 7.39
实施例5
1)4-羟基苯丙烯酸-3-溴丙酯(2a3)
参照2a1的制备方法，由对羟基桂皮酸与1，3-二溴丙烷制得，收率73％，mp：98～100℃。
2)3-O-三氟乙酰基-齐墩果酸-4-[2-(4-溴-丁氧羰基)-乙烯基]-苯酯(2b3)
参照2b1的制备方法，由OLA与2a3制得，柱层析[乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝1∶5(V∶V)]得黄色油状物，收率52.2％。
3)3-O-三氟乙酰基-齐墩果酸-4-[2-(4-硝氧基-丙氧羰基)-乙烯基]-苯酯(II10)
参照II2的制备方法，由2b3与AgNO3避光反应制得，柱层析[乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝1∶4(V∶V)]得白色固体，收率53.3％，mp：68～70℃。
ESI-MS：819[M+NH4]+；
IR(KBr，cm-1)：1779(C＝O)，1750(C＝O)，1717(C＝O)，1635(ONO2)；
1H-NMR(300MHz，CDCl3)，δ(ppm)：0.85(s，3H，CH3)，0.92(s，6H，2×CH3)，0.95(s，3H，CH3)，0.97(s，6H，2×CH3)，1.19(s，3H，CH3)，2.13～2.17(m，2H，CH2)，2.96～3.00(m，1H，C18-H)，4.32(t，2H，OCH2，J＝6Hz)，4.60(t，2H，OCH2，J＝6Hz)，4.69～4.73(m，1H，3α-H)，5.35(brs，1H，C12-H)，6.37(d，1H，＝CH，J＝16Hz)，7.06(d，2H，ArH，J＝8.6Hz)，7.53(d，2H，ArH，J＝8.6Hz)，7.68(d，1H，＝CH，J＝16Hz)；
Anal.C44H58F3NO9·0.5H2O Found：(％) N 1.49 C 65.25 H 7.29
Calcd：(％) N 1.73 C 65.18 H 7.28
实施例6
齐墩果酸-3-(3-苯磺酰基-2-氧-呋咱-4-氧)-1-甲基丙酯(III9)
OLA(456mg，1mmol)悬浮于甲苯中，加入三氟醋酐(0.82ml，5.87mmol)，室温搅拌，10分钟后加入中间体2-(3-苯磺酰基-1，2，5-噁二唑-2-氧化物-4-)氧-3-丁醇(305mg，1mmol)(李瑞文，张奕华，季晖，等.苯磺酰基呋咱氮氧化物与双氯酚酸偶联化合物的合成及抗炎活性[J].药学学报，2001，36(11)：821-826)，拌回流反应，6小时后结束反应，冷却，反应液用10％NaOH洗至中性，有机层再分别水洗，饱和食盐水洗，无水Na2SO4干燥，柱层析[乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝1∶4(V∶V)]，得乳白色固体523mg，将其悬浮于甲醇中，加碳酸氢钠溶液(1.2g碳酸氢钠溶于60ml水)调PH至9，室温搅拌，减压蒸除溶剂，残余物加水，用乙酸乙酯萃取，有机层分别用水、饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，柱层析[乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝1∶4(V∶V)]，得纯品484 mg，收率64.4％，mp：66～68℃。
ESI-MS：775[M+Na]+；
IR(KBr，cm-1)：3438(OH)，1720(C＝O)，1170，1367(SO2)；
1H-NMR(300MHz，CDCl3)，δ(ppm)：0.66(s，3H，CH3)，0.73(s，6H，2×CH3)，0.87(s，6H，2×CH3)，0.93(s，3H，CH3)，1.11(s，3H，CH3)，2.79～2.81(m，1H，C18-H)，3.14～3.19(m，1H，3α -H)，4.14～4.46(m，2H，OCH2)，5.07～5.08(m，1H，OCH)，5.24～5.25(brs，1H，C12-H)，7.59～7.64(m，2H，ArH)，7.71～7.73(m，1H，ArH)，8.03～8.06(m，2H，ArH)；
Anal.C42H60N2O8S Found：(％) N 3.45 C 67.06 H 7.92
Calcd：(％) N 3.72 C 66.99 H 8.03
同法可制得R3代表Ph；X代表NH的其它III类化合物。
实施例7
3-O-三氟乙酰基-齐墩果酸-4-{2-[3-(3-苯磺酰基-2-氧-呋咱-4-氧)-1-甲基-丙氧羰基]-乙烯基}-2-甲氧基-苯酯(IV1)
将OLA(456mg，1mmol)悬浮于甲苯(8ml)中，加入三氟乙酸酐(0.70ml，4mmol)，10分钟后加入3-(3-甲氧基-4-羟基)-苯丙烯酸-3-(3-苯磺酰基-2-氧化-呋咱-4-氧)-1-甲基-正丙酯(670mg，1.4mmol)(李瑞文，张奕华，季晖等：苯磺酰基呋咱氮氧化物与双氯酚酸偶联化合物的合成及抗炎活性[J].药学学报，2001，36(11)：821-826；莫若莹，邵国贤，朱丽莲等：阿魏酸衍生物的合成[J].药学学报，1985，20(8)：584-591)搅拌回流反应。反应结束后用10％NaOH洗至中性，有机层分别用水、饱和食盐水洗，有机层浑浊，加乙酸乙酯使澄清，无水Na2SO4干燥；过滤，滤液浓缩，残余物硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1)，得乳白圆体451mg，产率60％，mp：128～130℃。
ESI-MS：1047[M+Na]+；
IR(KBr，cm-1)：1778(C＝O)，1753(C＝O)，1711(C＝O)，1163，1373(SO2)；
1H-NMR(300MHz，CDCl3)，δ(ppm)：0.83(s，3H，CH3)，0.85(s，3H，CH3)，0.88(s，3H，CH3)，0.90(s，3H，CH3)，0.95(s，6H，2×CH3)，1.17(s，3H，CH3)；2.82～2.88(m，1H，C18-H)，4.67～4.71(m，1H，3α-H)，3.80(s，3H，OCH3)，4.51(t，2H，OCH2，J＝16Hz)，5.24～5.28(m，1H，OCH)，5.31(brs，1H，C12-H)，6.34(d，1H，＝CH，J＝16Hz)，6.92(d，1H，ArH，J＝1Hz)，7.06～7.09(m，2H，ArH)，7.60(d，1H，＝CH，J＝16Hz)，7.58～7.63(m，2H，ArH)，7.71～7.76(m，1H，ArH)，8.04～8.07(m，2H，ArH)；
Anal.C54H67F3N2O12S Found：(％) N 2.96 C 63.42 H 6.88
Calcd：(％) N 2.73 C 63.27 H 6.59
同法可制得R5代表Ph；X代表NH的其它IV类化合物。
实施例8
1)3-O-羧丙酰基-齐墩果酸(5a1)
将OLA(2.50g，5.48mmol)、丁二酸酐(2.19g，21.9mmol)、DMAP(0.668g，5.48mmol)、无水CH2Cl2(60ml)依次加入反应瓶中，加热回流反应48小时。反应液水洗3次，有机层无水Na2SO4干燥；过滤，滤液浓缩，浓缩物柱层析[乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝1∶4(V∶V)]得产品1.696g，产率53％。
2)3-O-{4-[2-(2-硝氧基-乙氧羰基)-乙烯基]-苯氧}-琥珀酰基-齐墩果酸(V13)
将5a1(556mg，1mmol)，4-羟基苯丙烯酸-2-溴乙酯(参见实施例3中2a的制备方法)(260mg，1mmol)，DCC(206mg，1mmol)以及催化量的DMAP分别加入反应瓶，无水CH2Cl210ml，室温搅拌反应，过滤，滤液减压浓缩，柱层析[乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝1∶4(V∶V)]得3-O-{4-[2-(2-溴-乙氧羰基)-乙烯基]-苯氧}-琥珀酰基-齐墩果酸598mg，收率75％。
将上述产品(56.6mg，0.071mmol)、硝酸银(18mg，0.11mmol)、乙腈(5ml)依次加入反应瓶中，避光搅拌回流反应过夜，有溴化银黄色沉淀生成。反应结束后，过滤，滤液浓缩，柱层析[乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝1∶4(V∶V)]分离得产品34.3mg，收率61％，mp：110～112℃。
ESI-MS：814[M+Na]+；
IR(KBr，cm-1)：3235(COOH)，1765(C＝O)，1725(C＝O)，1637(ONO2)；
1H-NMR(300MHz，CDCl3)，δ(ppm)：0.76(s，3H，CH3)，0.89(s，6H，2×CH3)，0.91(s，3H，CH3)，0.93(s，3H，CH3)，0.98(s，3H，CH3)，1.14 (s，3H，CH3)，2.76(t，2H，COCH2，J＝6Hz)，2.77～2.81(m，1H，C18-H)，2.90(t，2H，COCH2，J＝6Hz)，4.50(t，2H，OCH2，J＝6Hz)，4.51～4.52(m，1H，3α-H)，4.75(t，2H，OCH2，J＝6Hz)，5.29(brs，1H，C12-H)，6.40(d，1H，＝CH，J＝16Hz)，7.15(d，2H，ArH，J＝8.7Hz)，7.55(d，2H，ArH，J＝8.7Hz)，7.70(d，1H，＝CH，J＝16Hz)；
Anal.C45H61NO11·H2O Found：(％) N 1.29 C 66.31 H 7.79
Calcd：(％) N 1.73 C 66.75 H 7.79
实施例9
3-O-[4-(3-苯磺酰基-5-氧-呋咱-3-氧)-1-甲基-丙氧]-琥珀酰基-齐墩果酸(VI4)
将5a1(233mg，0.42mmol)、4-(3-苯磺酰基-1，2，5-噁二唑-2-氧化物-4-)氧-3-丁醇(130mg，0.42mmol)(参照实施例6的文献)，DCC(86.5mg，0.42mmol)、DMAP(5.1mg，0.42mmol)、无水CH2Cl2(15ml)依次加入反应瓶，室温搅拌反应。反应结束后，滤除不溶物，浓缩物硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1)得产品179mg，收率48.8％，mp：140～142℃。
ESI-MS：875[M+Na]+；
IR(KBr，cm-1)：3398(OH)，1750(C＝O)，1155，1370(SO2)；
1H-NMR(300MHz，CDCl3)，δ(ppm)：0.73(s，3H，CH3)，0.77(s，3H，CH3)，0.81(s，6H，2×CH3)，0.89(s，3H，CH3)，0.91(s，3H，CH3)，1.11(s，3H，CH3)，2.59(s，4H，2×COCH2)，2.77～2.83(m，1H，C18-H)，4.39(brs，1H，3α-H)，4.43(t，2H，OCH2，J＝6Hz)，5.12～5.19(m，1H，OCH)，5.26(brs，1H，C12-H)，7.58～7.63(m，2H，ArH)，7.70～7.75(m，1H，ArH)，8.05(d，2H，ArH，J＝8Hz)；
Ahal.C46H64N2O11S Found：(％) N 3.17 C 64.63 H 7.90
Calcd：(％) N 3.35 C 64.77 H 7.56
VI4与稀碳酸氢钠溶液在室温下搅拌可制得其钠盐。
同法可制得R4代表Ph；X代表NH的其它VI类化合物。
实施例10
3-O-[4-(3-苯磺酰基-2-氧-呋咱-4-氧)-丁氧]-琥珀酰基-齐墩果酸(VI17)
参照VI4的制备方法，由5a1和4-(3-苯磺酰基-1，2，5-噁二唑-2-氧化物-4-)氧丁醇(参照实施例6的文献)反应制得，收率41.5％，mp：154～156℃。
ESI-MS：875[M+Na]+；
IR(KBr，cm-1)：3326(OH)，1731(C＝O)，1168，1311(SO2)；
1H-NMR(300MHz，CDCl3)，δ(ppm)：0.75(s，3H，CH3)，0.85(s，6H，2×CH3)，0.87(s，3H，CH3)，0.92(s，6H，2×CH3)，1.12(s，3H，CH3)，2.64(s，4H，CO(CH2)2)，2.80～2.87(m，1H，C18-H)，4.18(t，2H，OCH2，J＝6Hz)，4.45(t，2H，OCH2，J＝6Hz)，4.49～4.54(m，1H，3α-H)，5.27(brs，1H，C12-H)，7.60～7.65(m，2H，ArH)，7.74～7.79(m，1H，ArH)，8.04～8.07(m，2H，ArH)；
Anal.C46H64N2O11S Found：(％) N 3.17 C 64.63 H 7.90
Calcd：(％) N 3.35 C 64.77 H 7.56
实施例11
3-O-[2-(3-苯磺酰基-2-氧-呋咱-4-氧)-乙氧基-乙氧]-琥珀酰基-齐墩果酸(VI18)
参照VI4的制备方法，由5a1和2-[2-(3-苯磺酰基-1，2，5-噁二唑-2-氧化物-4-)氧乙基氧]丁醇(参照实施例6的文献)反应制得，收率71.8％，mp：130～132℃。
ESI-MS：891[M+Na]+；
IR(KBr，cm-1)：3327(COOH)，1732(C＝O)，1169，1363(ONO2)；
1H-NMR(300MHz，CDCl3)，δ(ppm)：0.75(s，3H，CH3)，0.84(s，3H，CH3)，0.85(s，6H，2×CH3)，0.90(s，3H，CH3)，0.93(s，3H，CH3)，1.13(s，3H，CH3)，2.64(t，4H，CO(CH2)2，J＝4Hz)，2.72～2.79(m，1H，C18-H)，3.79(t，2H，OCH2，J＝4.5Hz)，3.91(t，2H，OCH2，J＝4.5Hz)，4.29(t，2H，OCH2，J＝5Hz)，4.47～4.53(m，1H，3α-H)，4.57(t，2H，OCH2，J＝5Hz)，5.27(brs，1H，C12-H)，7.55～7.65(m，2H，ArH)，7.73～7.798(m，1H，ArH)，7.91～8.08(m，2H，ArH)；
Anal.C46H64N2O11S Found：(％) N 3.17 C 63.63 H 7.80
Calcd：(％) N 3.22 C 63.57 H 7.42
实施例12
3-O-[N-(4-溴苯基)-N′-羟基胍氧]-琥珀酰基-齐墩果酸(VII1)
将N-(4-溴苯基)-N′-羟基胍(参见：Renodon-Corniere A，Dijols S，Perollier C，et al.N-Aryl-N’-hydroxyguanidines，a new class of NO-donors after selective oxidation by nitric oxidesynthases：structure-activity releationship[J].J Med Chem，2002，45(4)：944-954)(250mg，0.45mmol)悬浮于无水二氯甲烷10ml中，加入DCC(93mg，0.45mmol)和催化量的DMAP，5a1(240mg，0.45mmol)，反应液变澄清，室温搅拌2h，滤去沉淀，滤液柱层析[乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝1∶1(V∶V)]，得白色粉末状固体171mg，收率49％，mp：140～142℃。
ESI-MS：790[M+Na]+；
IR(KBr，cm-1)：3472(OH)，3372，3214，3120(NH)，1731，1696(C＝O)；
1H-NMR(300MHz，CDCl3)，δ(ppm)：0.80(s，3H，CH3)，0.88(s，3H，CH3)，0.90(s，3H，CH3)，0.94(s，3H，CH3)，0.96(s，3H，CH3)，1.04(s，3H，CH3)，1.08(s，3H，CH3)，2.80(brs，3H，C18-H，2×COCH2)，2.81(brs，2H，NH2)，(4.47～4.52(m，1H，3α-H)，5.22～5.24(m，1H，C12-H)，5.53(brs，1H，NH)，7.32～7.37(m，2H，ArH)，7.44～7.51(m，2H，ArH)；
Anal.C41H58BrN3O6 Found：(％) N 4.93 C 64.50 H 7.79
Calcd：(％) N 5.47 C 64.05 H 7.60
同法可制得其它VII类化合物。
实施例13
1)1-(1-四氢吡咯基)-1，2-二醇偶氮烯鎓盐(8a)
四氢吡咯(180ml，2.18mol)溶于500ml乙腈以及500ml乙醚的混合溶剂中，加入3升的反应釜，然后将150g的甲醇钠悬浮于500ml的甲醇中，冷至室温，加入反应釜，开始通N2置换釜及管道中的空气，然后通N2维持压力为400Pa左右，室温搅拌两天，解除压力，过滤，得白色滤饼，以无水乙醚洗涤数次，真空干燥，得乳白色粉末状固体150g，收率46％。
2)O2-齐墩果酸-2-丁烯基-1-(1-四氢吡咯基)-1，2-二醇偶氮烯鎓(VIIIA3)
齐墩果酸4-溴-2-丁烯酯(参见实施例1中1a的制备方法)(59mg，0.1mol)溶于无水四氢呋喃中，加入8a(25mg，0.15mol)的无水DMF溶液，N2保护下室温搅拌反应3天，减压浓缩，加适量水，乙酸乙酯萃取，有机层无水硫酸钠干燥。柱层析，先以[乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝1∶4(V∶V)]除去杂质，再以乙酸乙酯洗脱得目的物，为淡黄色固体，收率69％，mp：236～238℃。
ESI-MS：662[M+Na]+；
IR(KBr，cm-1)：3416(-OH)，1717(C＝O)；
1H-NMR(300MHz，CDCl3)，δ(ppm)：0.71(s，3H，CH3)，0.75(s，3H，CH3)，0.90(s，6H，2×CH3)，0.92(s，3H，CH3)，0.99(s，3H，CH3)，1.14(s，3H，CH3)，2.83～2.88(m，1H，C18-H)，3.22～3.24(m，1H，3α-H)，3.62(d，2H，-OCH2，J＝4Hz)，4.57(d，2H，OCH2，J＝4Hz)，5.30(brs，1H，C12-H)，5.96～6.09(br，2H，＝CH×2)；
Anal.C38H61N3O5 Found：(％) N 6.45 C 70.88 H 9.98
Calcd：(％) N 6.57 C 71.32 H 9.61
同法可由8a与8b制得VIIIB类化合物。
实施例14
通式I-VIII化合物的药理实验如下。
1.抑制Fas介导的细胞凋亡试验研究
受试药物：通式I-VIII化合物(NCX-1000和OLA为参照药)溶于DMSO，浓度为500μM。
细胞系：HepG2细胞，购自美国ATCC。培养液为10％胎牛血清(FCS)的DMEM，在50μg/ml鼠尾I型胶原(BD公司)包被的培养板上培养。
实验方法：细胞以104个/100μl的密度加至96孔板，孵育过夜，实验分组。
(1)阴性对照组：培养介质为含4％FCS(加2μM的cycloheximide)的无酚红DMEM，加入DMSO，稀释至浓度为0.2％(1∶500)
(2)给药组：培养介质为含4％FCS(加2μM的cycloheximide)的无酚红DMEM，同时加不同浓度的受试药物。
(3)阳性对照组：培养介质为含4％FCS(加2μM的cycloheximide)的无酚红DMEM，同时加50ng/ml CH-11(或1.5μg/ml DX2)(CH-11、DX2为两种抗Fas的单克隆抗体)。
(4)最大杀伤浓度组：培养介质为4％FCS的无酚红DMEM(含1％Triton X-100)。
(5)LDH测定：上述每组做三个复孔，培养18小时后，取上清液，采用LDH细胞毒性检测试剂盒(Roche)测定LDH活性，在参考波长490nm，检测波长650nm条件下测定光密度值(OD)，用下面公式计算药物的细胞毒性。
表1、部分目标物的细胞毒指数
Compd 10-6M 10-7M 10-8M 10-9M 10-10M 10-11M
No.
OLA 0.94
NCX-1000 0.6642 0.8782 0.9726
II2 0.5368 0.5590 0.5760 0.7012 0.8636 0.9470
II3 0.5138 0.5280 0.6148 0.7972 0.9762
II4 0.6444 0.7942 0.9123 0.9870
II6 0.7800 0.8900 0.9800
II10 0.6685 0.7544 0.8604 0.9768
II11 0.7402 0.7864 0.9270 0.9912
V13 0.7585 0.8963 0.9815
VI3 0.6266 0.6654 0.7766 0.9460 0.9796
VI9 0.6020 0.6162 0.7282 0.8934 0.9950
对细胞的保护作用可以图1表示：(1-细胞毒指数)×100％。
二、对人HepG2细胞毒性试验研究
受试药物：I-VIII类化合物(NCX-1000和OLA为参照药)溶于DMSO，浓度为500μM。
细胞系：HepG2 cells(人肝癌细胞)，HeLa cells(宫颈上皮癌细胞)，PC3 cells(人前列腺癌细胞)，MCT-7 cells(人乳腺癌细胞)，HEK293 cells(人肾上皮细胞)，均购自ATCC，小鼠淋巴细胞系新鲜分离制备，培养条件为含10％小牛血清(FCS)的DMEM培养基；(HepG2 cells除外，需培养于50μg/ml鼠尾I型胶原培养板上)。
实验方法：细胞以104个/100μl的密度加至96孔板，孵育过夜，实验分组。
(1)阴性对照组：培养介质为含4％FCS(加或不加2μM的cycloheximide)的无酚红DMEM，加入DMSO，稀释至浓度为0.2％(1∶500)。
(2)给药组：培养介质为含4％FCS(加或不加2μM的cycloheximide)的无酚红DMEM，同时加受试药物及50μg/ml CH-11(或1.5μg/ml DX2)。
(3)阳性对照组：培养介质为4％FCS的无酚红DMEM(含1％Triton X-100)。
(4)LDH测定：上述每组做三个复孔，培养24～72小时后，取上清液，采用LDH细胞毒性检测试剂盒(Roche)测定LDH活性，在参考波长490nm，检测波长650nm条件下测定光密度值(OD)，用下面公式计算药物的细胞毒性。
研究显示，细胞上清液中LDH的活性与死细胞的数目相关，因此我们采用测定LDH活性的方法来鉴定受试药物是否对体外培养的人肿瘤细胞具有特异性的细胞毒作用。Figure 2和Figure 3显示VI4和III9对HepG2细胞的死亡具有剂量依赖性关系。其IC50值分别为0.05μM、0.27μM，延长孵育时间(48或72小时)并不能提高细胞上清液中LDH活性，推测化合物的半衰期较短，而且我们观察了在cycloheximide存在与否两种情况下，(不管是否包被I型胶原)两种化合物相似的HepG2细胞毒性作用，提示它们的毒性作用并不需要新的蛋白合成。最后，我们未观察到受试药物对其他肿瘤或非肿瘤细胞的任何毒性作用，提示这些化合物可在体外特异性地诱导肝细胞凋亡。活性化合物的细胞毒作用见表2。
表2、活性化合物的细胞毒作用
化合物No. 1μM 0.1μM 0.01μM 0.001 μ
M
OLA 0
NCX-1000 0
III9 89.21 55.11 6.67 0
VI2 67.41 13.68 10.07 0
VI4 100.00 93.50 13.34 1.70
VI4-Na 65.43 31.26 3.25 0
VI13 74.53 13.01 8.51 0
VI17 98.16 56.35 10.96 2.60
VI18 95.63 67.96 17.32 2.70
三、VI4的急性毒性实验
目的：考察活性化合物VI4的毒副作用
化合物：VI4溶于DMSO(500μM)，然后取适量VI4缓慢稀释于PBS中。对照组注射PBS(含相同浓度的DMSO)。
动物：Balb/c小鼠，每组10只。
方法：腹腔注射给药，高剂量组：50mg/kg/day；低剂量组：15mg/kg/day，每天给药1次，共3天，观察14天内的动物变化。
结果：与对照组小鼠比较，给药组小鼠自给药日起14天内未见体重及行为异常。
四、细胞毒性的机制研究
目的：考察活性化合物VI4对HepG2 cell细胞毒作用的机制
药物：VI4、NCX-1000
细胞系：HepG2 cells
方法：将HepG2 ells与受试药物(或空白)孵育18小时，然后用anti-Annexin V和Propidium Iodide染色，通过FACS分析法，观察HepG2细胞凋亡情况。
结果：NCX-1000几乎未引起细胞凋亡；而化合物VI4引起高频率的细胞凋亡，且呈剂量依赖关系，这一初步结果显示，VI4在体外具有诱导细胞凋亡的作用，由此介导细胞毒性。
五、部分活性化合物体外释放一氧化氮(NO)的研究
试验目的：本试验通过Griess法，观察受试物体外释放一氧化氮(NO)的情况。
受试药物：NCX-1000、II2、II3、III9、VI3、VI4、VI9溶于DMSO(批号：940618，上海菲达有限公司)
主要步骤：Griess试剂的配制：氨苯磺胺4g，N-萘乙烯二胺盐酸盐0.2g，85％磷酸10ml，用蒸馏水稀释至100ml。
标准曲线的制备：配置0.01、0.03、0.05、0.07、0.09、0.2、0.4μg/ml的亚硝酸盐氮系列标准溶液，各取10ml与2.5ml Griess试剂充分混匀，室温放置10min后，于540nm波长处测定其吸收值。根据所得数据绘制标准曲线。
受试药物NO释放量的测定：所有受试物均先溶于二甲亚砜中(1ml)，再用磷酸缓冲液(PH7.4)缓慢滴加、振荡，稀释至50ml，缓冲液中含有过量的半胱氨酸(5mmol/l)，受试物终浓度为10-4mol/l。将溶液置于37℃环境下孵化，于不同时间点取反应液2ml与500μl Griess试剂混合，室温放置10分钟，在540nm处测吸收值，以NCX-1000为阳性对照。NO的释放量以其相当于氧化产物——亚硝酸盐(NO2 -)的量表示。
试验结果：受试物NO体外释放结果(参见图4)
试验结论：所有化合物中以III9和VI4的NO释放量最大，在300分钟时分别达到最大值0.059和0.058μg/ml。VI9和NCX1000分别在270分钟达到最大值0.029和0.028μg/ml。II2、II3、VI3的释放量较低，最大值均小于0.012μg/ml。
Claims (10)
1.通式I化合物
其中，R1代表H，CF3CO-；R2代表-(CH2)n-，n＝2～8，-CH2CH＝CHCH2-，-CH2C≡CCH2-，-CH2-吡啶(2，6)-CH2-，-苯基(CH2)n-(邻，间，对)，n＝1～4。
2.通式II化合物
其中，R1代表H，CF3CO-；R2代表H，HO，CH3O；R3代表-CO-，-CH＝CHCO-；R4代表-(CH2)n-，n＝2～8，-CH2CH＝CHCH2-，-CH2C≡CCH2-，-CH2-吡啶(2，6)-CH2-，-苯基(CH2)n-(邻，间，对)，n＝1～4。
3.通式III化合物
其中，R1代表H，CF3CO-；R2代表-(CH2)nO-，n＝1～6，-CH(CH3)CH2CH2O-或-(CH2)n苯基OCH2-(间，对)，-(CH2)n苯基O-(间，对)，n＝0～4；R3代表苯基，苯磺酰基；X代表-O-，-NH-。
4.通式IV化合物
其中，R1代表H，CF3CO-；R2代表H，HO-，CH3O-；R3代表-CO-，-CH＝CHCO-；R4代表-(CH2)nO-，n＝1～6，-CH(CH3)CH2CH2O-或-(CH2)n苯基OCH2-(间，对)，-(CH2)n苯基O-(间，对)，n＝0～4；R5代表苯基，苯磺酰基；X代表-O-，-NH-。
5.通式V化合物
其中，R1代表H，C2H5-，苄基，Na；R2代表-(CH2)2-，-CH＝CH-，苯基(邻)；R3代表H，HO-，CH3O-；R4代表-CO-，-CH＝CHCO-；R5代表-(CH2)n-，n＝2～8，-CH2CH＝CHCH2-，-CH2C≡CCH2-，-CH2-吡啶(2，6)-CH2-，-苯基(CH2)n-(邻、间、对)，n＝1～4。
6.通式VI化合物
其中，R1代表H，C2H5-，苄基-，Na；R2代表-(CH2)2-，-CH＝CH-，-苯基-(邻)；R3代表-O(CH2)n-，n＝1～6，-OCH2CH＝CHCH2-，-OCH2CH2CH(CH3)-，-OCH2苯基(CH2)n-(间、对)，-O苯基(CH2)n-(间、对)，n＝0～4；R4代表苯基，苯磺酰基；X代表-O-，-NH-。
7.通式VII化合物
其中，R1代表H，C2H5-，苄基-，Na；R2代表-(CH2)2-，-CH＝CH-，-苯基-(邻)；X代表H，2-CH3，4-CH3，2-氯，3-氯，4-氯，4-氟，4-溴，2-甲氧基，4-甲氧基，2，4-二-氟，3，4-二-氯。
8.通式VIII化合物
其中，R代表-(CH2)n-，n＝2～8，-CH2CH＝CHCH2-，-CH2C≡CCH2-，-苯基(CH2)n-(邻、间、对)，n＝1～4。
其中，R1代表H，C2H5-，苄基，Na；R2代表-(CH2)2-，-CH＝CH-，苯基(邻)；R3代表H，HO-，CH3O-；R4代表-CO-，-CH＝CHCO-；R5代表-(CH2)n-，n＝2～8，-CH2CH＝CHCH2-，-CH2C≡CCH2-，-CH2-吡啶(2，6)-CH2-，-苯基(CH2)n-(邻、间、对)，n＝1～4。
9、权利要求1～8任一项权利要求通式化合物在制备抑制细胞凋亡或诱导肝肿瘤细胞凋亡药物中的应用。
10、权利要求9化合物在制备抗肝炎、肝硬化或抗肝肿瘤药物中的应用。
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