CN1589399A - 用于测定生物样品产生的电信号的测定装置和测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种测定装置(10)，包括测定单元(11)。测定单元(11)包括基板(17)和在基板(17)上设置的基板(16)。基板(16)和基板(17)被相互粘贴，当通过基板(16)和基板(17)相互粘贴而构成测定单元(11)时，在测定单元(11)内形成流路(9)。在测定单元(11)的基板(17)上设置了凹状的孔(19)；端子(4a)上连接的在孔(19)的侧面上设置的突起状的微电极(1)；朝着孔(19)(即流路9)的两个侧面连接的连通管(15a)和(15b)；在连通管(15a)和(15b)上分别连接的电阻槽(6a)和(6b)；在电阻槽(6a)和(6b)内分别配置的薄膜电阻器(3a)和(3b)；以及端子(4b)连接的基准电极(2)。

Description

用于测定生物样品产生的电信号的测定装置和测定方法
技术领域
本发明涉及用于进行生物样品电生理学评价的测定装置。
背景技术
现在，在使用生物样品(典型为细胞)的药品筛选(screening)方法中，通过荧光色素法或者微小吸管(pipette)电极法来检测细胞的活动和评价药品对细胞的影响和作用等。
荧光色素法是通过使用对各种离子浓度特异敏感的荧光色素或对膜电位敏感的荧光色素等来光学测定受到药品影响的细胞的活动和伴随细胞膜电位变化或离子浓度变化的荧光变化程度的方法。在荧光色素法中，由于用色素染色细胞的工序是必要的，因此不能去掉色素对细胞的影响。而且，在荧光色素法中，由于荧光色素的荧光随时间推移而变弱，因此存在检测精度不足之类的缺点。
与此相反，微小吸管电极法是直接测定诸如细胞内电位、细胞膜上存在的离子通道(ion channel)电流、药物受体工作流路电流等细胞电活动的方法。因此，能够获得受到药品影响之细胞活动的更详细和广泛的信息。微小吸管电极法是用于获得细胞活动信息的非常有用的方法。
通常，在作为微小吸管电极法之一的细胞内电位记录法中，为了测定细胞内电位，将通过拉伸加工热融解石英玻璃或者硼硅酸盐玻璃而制作的尖端直径为亚微米单位的微小吸管刺入细胞内。而且，在作为微小吸管电极法之一的贴片夹(patch clamp)法中，为了局部测定细胞0.1～20微米大小的微区域，将微小吸管按压细胞膜上，并将微小吸管和细胞膜以规定角度高精度地紧贴着。
但是，在现有技术的微小吸管电极法中，技术人员通过一边依赖显微镜图像一边操作微小吸管而将微小吸管刺入或者紧贴着在基板上固定的细胞。因此，需要微小吸管高精度的位置控制装置，并且为了将微小吸管刺入或者紧贴细胞，熟练也是必要的。
因此，微小吸管电极法作为用于高速筛选大量药品候补化合物的方法，具有不适合之类的问题。
在特开平9-289886号公报中，公开了使用微小吸管电极法的细胞膜电位检测装置。该细胞膜电位检测装置包括：在具有多个底部凹孔的有盖玻璃器皿的底面上设置的用于起微小吸管作用的用于刺入细胞的突起电极；和在底部凹孔的侧面周围设置的基准电极。
但在上述公报公开的细胞膜电位检测装置上没有设置用于将细胞正确诱导到突起电极上的机构。因此，仍然存在为了通过突起电极进行诱导细胞，技术人员的操作必须熟练之类的问题。
发明内容
本发明是鉴于上述问题提出的。其目的是提供一种测定装置，其能够简单、正确、高速和自动地进行生物样品电生理学测定。
本发明的测定装置是用于测定生物样品产生的电信号的测定装置，包括：在第一方向延伸的流路；在上述流路两端连接的一对导入口；在上述流路内设置的凹状孔；在上述流路内设置的基准电极；在上述孔内设置的至少一个微电极；连接到上述孔的、在与上述第一方向不同的第二方向上延伸的第一连通管；连接到上述孔之中与上述第一连通管不同部分上的、在与上述第一方向和第二方向都不同的第三方向上延伸的第二连通管；分别连接到上述第一和第二连通管的第一和第二电阻槽；在上述第一和第二连通管或者上述第一和第二电阻槽上配置的第一和第二电阻器。
本发明的测定装置中，在电流被施加到第一和第二电阻器之后，第一和第二电阻器消耗电能而产生热。将电解质溶液充满流路，把与电解质溶液之间的表面张力可产生变化的媒体填充在第一和第二电阻槽中的状态下使用，以不同的电流值对各个电阻器施加电流。由此，在第一和第二连通管充满的电解质溶液之间的表面张力与电阻器产生的热量成比例而减少。其结果，第一和第二连通管内的电解质溶液从高温侧的电阻槽向着低温侧的电阻槽移动。由此，在孔内产生电解质溶液的局部流动，利用这个局部流动，能够正确且迅速地将生物样品诱导到微电极和进行生物样品电生理学的测定。因此，根据本发明的测定装置，在现有技术的这种装置中必需的高精度位置控制装置以及熟练的操作也是不必要的了。
优选地，上述第一连通管和上述第二连通管被配置为以上述流路为对称轴的轴对称。
这样，能够使由第一和第二连通管内存在的电解质溶液的局部流动所诱导的生物样品的诱导方向和诱导速度的计算非常简单。
优选地，上述至少一个微电极具有突起状的尖端部。
这样，能够将微电极刺入生物样品。
优选地，上述第一连通管和上述第二连通管被配置为使得沿着上述第一连通管延伸的直线和沿着上述第二连通管延伸的直线向着上述至少一个微电极方向交叉。
这样，能够在向着微电极的方向上产生孔内发生的电解质溶液的局部流动。
上述至少一个微电极可以是多个微电极。
这样，将多个生物样品固定到各个微电极上，在同时测定全部生物样品的同时还能够个别地测定各个生物样品。
优选地，上述基准电极的表面积比上述多个微电极表面积之和大。
这样，对于诸如溶液流动等外部混乱，提高测定的稳定性。
可构成为还包括第一基板和在上述第一基板上设置的第二基板，上述第一基板具有：上述孔；上述基准电极；上述微电极；上述第一和第二连通管；第一和第二电阻槽；第一和第二电阻器；上述第二基板具有：在设置于上述第一基板上的状态下作为上述流路的、在上述第一方向延伸的凹部；在设置于上述第一基板上的状态下作为上述一对导入口的、在上述凹部两端形成的空洞。
优选地，上述第二基板由透明材料形成。
这样，能够从外部观察流路。
优选地，上述第一基板由半导体材料形成。
这样，能够使用本领域技术人员公知的半导体制造技术来制作第一和第二电阻槽以及第一和第二连通管。特别是通过使用湿法刻蚀，利用面方向选择性，能够高精度地形成第一和第二电阻槽以及第一和第二连通管。
优选地，上述第一连通管的体积是不足上述第一电阻槽体积的1/5；上述第二连通管的体积是不足上述第二电阻槽体积的1/5。
这样，通过合适地调节第一和第二电阻槽的表面张力，能够容易控制使得电解质溶液的界面存在于第一和第二连通管的希望位置上。
优选地，上述流路的表面被实施了亲水性处理。
这样，能够使液体在微流路内流动。
优选地，上述第一和第二电阻器是梳状。
这样，即使在狭小的区域，也能够使第一和第二电阻器的长度长，电阻值大。
优选地，还包括：连接到上述孔之中与上述第一和第二连通管不同部分上的、在与上述第二方向和上述第三方向都不同的第四方向上延伸的第三连通管；连接到上述第三连通管的第三电阻槽；配置在上述第三连通管或者上述第三电阻槽的第三电阻器。
这样，能够自由地进行电解质溶液内所包含生物样品的位置控制。而且，由于电解质溶液内所包含生物样品的位置控制的自由度变高，在孔内能够自由设置微电极。就是说，孔内设计的自由度提高了。
优选地，上述第一连通管和上述第二连通管被配置成使得沿着上述第一连通管延伸的直线和沿着上述第二连通管延伸的直线向着上述至少一个微电极方向散开，上述第三连通管被配置成使得上述至少一个微电极的尖端部分实质上位于沿着上述第三连通管延伸的直线上。
这样，在孔内，在相对微电极的前后、左右方向的任何一个方向上也能够自由地产生电解质溶液的局部流动。
可构成为还包括：在上述第一方向上延伸的又一个流路；连接在上述又一个流路两端的又一对导入口；在上述又一个流路内设置的凹状的又一个孔；在上述又一个流路内设置的又一个基准电极；在上述又一个孔内设置的至少一个的又一个微电极；连接到上述又一个孔的、在与上述第一方向不同的第二方向上延伸的又一个第一连通管；连接到上述又一个孔之中与上述又一个第一连通管不同部分上的、在与上述第一方向和第二方向都不同的第三方向上延伸的又一个第二连通管；分别连接到上述又一个第一和第二连通管的又一个第一和第二电阻槽；在上述又一个第一和第二连通管或者上述又一个第一和第二电阻槽上配置的又一个第一和第二电阻器。
这样，能够同时进行多个测定。
本发明的测定方法是用于测定生物样品产生的电信号的测定方法，包括：准备测定装置的工序(a)，该测定装置包括：在第一方向延伸的流路；在上述流路两端连接的一对导入口；在上述流路内设置的凹状孔；在上述流路内设置的基准电极；在上述孔内设置的至少一个微电极；连接到上述孔的、在与上述第一方向不同的第二方向上延伸的第一连通管；连接到上述孔之中与上述第一连通管不同部分上的、在与上述第一方向和第二方向都不同的第三方向上延伸的第二连通管；分别连接到上述第一和第二连通管的第一和第二电阻槽；在上述第一和第二连通管或者上述第一和第二电阻槽上配置的第一和第二电阻器，通过降低上述流路内压力将电解质溶液引入和填充上述流路的工序(b)；将上述流路内压力恢复到大气压的工序(c)；将生物样品配置到上述孔内的工序(d)；密闭上述流路的工序(e)；通过将电流施加到上述第一电阻器或者第二电阻器而使上述生物样品接触到上述至少一个微电极的工序(f)；测定上述生物样品产生的电信号之变化的工序(g)。
根据本发明的测定方法，当进行电极上被诱导的生物样品之电生理学测定时，不需要在现有技术中必需的高精度位置控制装置和熟练的操作。就是说，能够简单、正确、高速和自动地进行生物样品电生理学测定。
可构成为还包括：在上述工序(f)之后，将电脉冲施加到上述至少一个微电极的工序(h)。
这样，能够根据电刺激来高灵敏度测定生物样品的电反应。
可构成为还包括：从上述一对导入口的任一个中给予药物的工序(i)。
这样，能够简便地进行生物样品对药物电反应的测定。
附图说明
图1是表示实施方式1测定装置结构的示意图。
图2是沿着图1所示III-III线的剖面图。
图3是从图1所示箭头A看的测定单元的立体图。
图4(a)、(b)和(c)是模式表示实施方式1测定装置之操作的示意图。
图5是从图1所示箭头A看的测定单元的立体图。
图6(a)和(b)是表示将细胞引入电极的原理的概括模式图。
图7是表示实施方式2的测定装置结构的示意图。
图8是沿着图1所示III-III线的剖面图。
图9是从图1所示箭头A看的测定单元的立体图。
图10是表示实施方式4测定方法的流程图。
图11是表示通过使用实施方式1测定装置测定的当施加刺激电流时椎实螺(モノアラガイ)神经细胞的活动电位示意图。
图12是表示通过使用实施方式1测定装置测定的当滴下卡巴可时平滑肌细胞的活动电位示意图。
图13是用每10毫秒的标准偏差值的直方图表示通过使用实施方式1测定装置测定的当滴下卡巴可前后之平滑肌细胞的活动电位示意图。
具体实施方式
下面，参考附图说明本发明的实施方式。
实施方式1
图1是表示本实施方式的测定装置结构的示意图。图2是沿着图1所示III-III线的剖面图。
如图1所示，本实施方式的测定装置10包括：测定单元11；电流施加部18；泵31和32；测定部33；摄像部34和计算机35。
测定单元11包括基板17和在基板17上设置的基板16。基板16和基板17被相互粘贴。如图1所示，在基板17上设置了端子4a，4b，5a和5b。
如图1所示，电流施加部18被电连接到基板17上设置的端子5a和5b。
如图1所示，泵31和32被分别连接到入口连接器13和出口连接器14上设置的开口部13a和14a。
测定部33被连接到端子4a和4b，计算机35被电连接到测定部33。
摄像部34被配置在位于测定单元11的正上方。如图1所示，根据需要，摄像部34和电流施加部18被电连接到计算机35。
下面说明测定单元11更详细的结构。
如图1所示，在构成测定单元的基板16上，设置了入口连接器13和出口连接器14。在本实施方式中，如图1和图2所示，入口连接器13和出口连接器14通过粘接剂等粘接在基板16上，但是不局限于此，其可与基板16成为一体。如图2所示，入口连接器13和出口连接器14的内部成为空洞7和8，该空洞7和8贯通基板16。而且，在入口连接器13和出口连接器14的上部分别设置了开口部13a和14a，入口连接器13和出口连接器14内部的空洞7和8，从开口部13a和14a通过管路等分别通到泵31和32。入口连接器13和出口连接器14内部的空洞7和8通过阀门V分别连接到泵31和32。
如图2所示，在基板16上形成凹部9a。因此，当通过基板16和基板17相互粘贴而构成测定单元11时，在测定单元11内形成流路9。
如图2所示，基板17包括：凹状孔(well)19和在凹状孔19侧面上设置的突起状微电极1。
这里，参考图3以及图1和图2说明测定单元11更详细的结构。图3是从图1所示箭头A看的测定单元11的立体图。图3所示沿着III-III线的剖面图与图1相同，相当于图2的剖面图。而且，在图3中，省略了测定单元11中基板16的图示。
如图2和图3所示，基板16被粘贴在基板17上，使得空洞7和8位于流路9两端上。
如图3所示，在测定单元11的基板17上设置：凹状孔19；端子4a连接的在孔19侧壁面上设置的突起状微电极1；在孔19(即流路9)两侧面相对连接的连通管15a和15b；在连通管15a和15b上分别连接的电阻槽6a和6b；在电阻槽6a和6b内分别配置的薄膜电阻器3a和3b；以及在端子4b上连接的基准电极2。
连通管15a和15b将流路9(即孔19)作为对称轴大致配置成轴对称。而且，如图3所示，连通管15a和连通管15b被分别配置成相对流路9(即孔19)构成α角度，并且角度α一定成为钝角。就是说，连通管15a和连通管15b被配置成使得沿着连通管15a延伸的直线和沿着连通管15b延伸的直线朝着微电极1交叉。
在本实施方式中，电阻槽6a和6b与薄膜电阻器3a和3b也与连通管15a和15b相同将流路9(即孔19)作为对称轴大致配置成轴对称。
连通管15a和15b与电阻槽6a和6b相比具有非常小的截面面积。电阻槽6a和6b可为任意形状。
基准电极2被配置在基板16上形成的流路9入口7的附近。基准电极2可存在于连着液体的位置上，优选为配置在流路9和孔19内。因此，在基板17上制作也是可能的。但是，为了容易制作，优选设置在基板16上。
如图1和图3所示，微电极1和基准电极2通过端子4a和4b被连接到测定部33上。作为测定部33，在微小吸管电极法中，优选使用桥式平衡电路、电流刺激电路和对细胞膜容量具有容量校正功能的电流/电压放大器等。
如图1和图3所示，薄膜电阻器3a和3b通过端子5a和5b被分别连接到电流施加部18。电流施加部18将希望的电流施加到薄膜电阻器3a和3b。
作为基板17，优选使用由硅基板等构成的半导体基板。通过使用半导体基板作为基板17，能够使用本领域技术人员公知的半导体制造技术来制作电阻槽6a和6b与连通管15a和15b。特别优选通过湿法刻蚀来制作电阻槽6a和6b与连通管15a和15b。如果使用湿法刻蚀，利用面方向选择性，能够获得高精度形成微细结构的基板17(即测定单元)。
即使使用干法刻蚀或者湿法刻蚀的任何一种，都能够制作上述电阻槽和连通管。作为在进行湿法刻蚀时使用的刻蚀剂，根据需要选择使用具有各向同性的刻蚀剂或者具有各向异性的刻蚀剂。
作为基板16，优选使用透明基板，使得能够从摄像部34观察流路9。基板16上设置的入口连接器13和出口连接器14的空洞7和8以及流路9，能够通过使用本领域技术人员公知的加工技术(特别是切削加工或者研磨加工等)或者半导体制造技术制作。作为基板16，特别优选使用玻璃基板。由此，通过使用本领域技术人员公知的半导体制造技术而能够高精度地制作基板16上设置的入口连接器13和出口连接器14的空洞7和8以及凹部9a。
微电极1由导电材料制成。特别地，在本实施方式中，微电极1是通过将单晶硅利用钻蚀(under etching)技术做成微突起形状，在该硅微突起表面上覆盖金属薄膜，并在除了其尖端部位之外的部分覆盖绝缘材料而形成的。因此，微电极1成为其尖端直径是0.1μm大小的锐突起形状。
在本实施方式中，基准电极2、端子4a，4b，5a和5b、连接微电极1和端子4a的布线、连接基准电极2和端子4b的布线、薄膜电阻器3a和3b都可通过使用诸如真空蒸镀和溅射等薄膜形成技术制作。但是，不局限于这些，即使通过使用本领域技术人员公知的方法来制作也全部没有关系。
下面，参考图4说明本实施方式测定装置11的溶液输入方法。
图4(a)、(b)和(c)是模式表示本实施方式测定装置11的溶液输入方法的示意图。
首先，关闭在装置流路9入口8的连接器上连接的阀门V，接着，通过用在成为流路9出口的空洞8(即出口连接器14)上连接的泵32吸引，将流路9、连通管15a和15b、以及电阻槽6a和6b的各自内部压力减小到比大气压P1稍微低的压力Pd上。接着，阀门V对大气打开后，如图4(a)所示，通过空洞7(即入口连接器13)电解质溶液12从阀门V连接的泵31被注入到流路9内。
此时，通过连通管15a和15b在流路9上连接的电阻槽6a和6b内的压力也变成比大气压P1小的压力Pd。因此，如图4(b)所示，注入到流路9的电解质溶液12在充满孔19之后流向作为出口的空洞8(即出口连接器14)的同时，充满连通管15a和15b。
接着，当电解质溶液12到达成为流路9出口的空洞8时，停止出口连接器14上连接的泵32的抽吸。此后，通过诸如操作阀门将成为出口的空洞8通大气，使得流路9内的压力回到大气压P1。这里，电阻槽6a和6b内的压力为Pd，几乎不变。因此，充满了连通管15a和15b的电解质溶液12向着电阻槽6a和6b流入。当电阻槽6a和6b内的压力变为等于P1时，注入停止，如图4(c)所示。这里，停止电解质溶液12的注入，使得关闭在作为入口的空洞7(即入口连接器13)上连接的阀门V。
接着，将生物样品21(本实施方式中为细胞)引入电解质溶液12。在本实施方式中，当引入生物样品21时，利用了从流路9的形状所获得的特性。
如图2所示，流路9是高度方向非常微细的空间。在这种微细空间充满液体的状态下，当此后再流入液体时，后面流入的液体具有通过变为层流而容易流动之类的特性。流路9内流动的液体变为层流流动时，流动的液体与孔19内部充满的液体几乎不发生混合而通过孔19的上部。在本实施方式中，通过空洞7(即入口连接器13)将包含生物样品21的样品溶液从阀门V连接的泵31注入到充满电解质溶液12的流路9内。此时，检测生物样品21并且当生物样品21到达孔19的上部时，停止样品溶液的注入。由此，通过流路9内变为没有层流且电解质溶液12的扩散变成优势而将生物样品21引入孔19内。
在这里，尽管只说明了生物样品21的引入，但其不局限于此，诸如药物的引入和去除等也能够以完全相同的方式进行。
最后，如图5所示，流路9、孔19、连通管15a和15b变成被电解质溶液12充满的状态。
在本实施方式中，将生物样品21即细胞的细胞外液用作为电解质溶液12，该细胞外液用于测定细胞内电位。作为细胞外液，使用将20mM～400mM的NaCl作为主要成分的生理盐水以及包含各种营养素、生长因子和抗生物质等的培养基等。
特别地，在本实施方式的测定装置10中，设计电阻槽6a和6b的各自体积使得与连通管15a和15b的各自体积或者孔19的体积相比变得非常大。因此，容易控制使得通过合适调节电阻槽6a和6b的内部压力，使气液界面处于连通管15a和15b的希望位置上。电阻槽6a和6b的各自体积特别优选为连通管15a和15b各自体积的5倍或者以上。
下面，参考图6说明在本实施方式的测定装置10中将细胞引入电极的原理概要。图6(a)和(b)是表示将细胞引入电极的原理概要的模式图。在这里，示例说明将电流施加到测定装置10电阻槽6b上配置的薄膜电阻器3b上的情况。
首先，在将电流从电流施加部18施加到薄膜电阻器3b上时，在薄膜电阻器3b中消耗由下式表示的电能W。
W＝RI2                                    (1)
(这里，R是薄膜电阻器3b的电阻值[Ω·m]，I是薄膜电阻器3b上流过的电流[A]。)
消耗的电能W变成热能后，使电阻槽6b内的空气膨胀。这样，如图6(a)所示，在电阻槽6b内的压力成为Pdd的同时，与其连通的连通管15b的气液界面的表面张力减小。由于在作为流路9出口的空洞8中的气液界面的表面张力不变化，在连通管15b上存在的气液界面和在连通管15a上存在的气液界面之间的表面张力平衡被打破，电解质溶液12从电阻槽6b流向孔19，移动到图6(a)箭头B所示的方向(低温电阻槽一侧)。生物样品21根据电解质溶液12的该流动而移动，使得被诱导刺入到微电极1。
接着，在停止向电阻器6b供给电流后，被加热电阻槽6b的一部分空气回到周围温度，电阻槽6b内的压力变成Pdd’。这里，表面张力再次变为平衡，生物样品21被保持在所移动的位置上，如图6(b)所示。由于连通管15b的体积足够小以及其中所含的电解质溶液12的热容量小，因此电解质溶液12的移动是迅速的。
在本实施方式中，由于在细胞活动测定时成为入口的空洞7和成为出口的空洞8关闭，电解质溶液12在连通管15b中移动的距离x(μm)与连通管15a内存在的气液界面的表面张力和连通管15b内存在的气液界面上起作用的表面张力之间的差成比例。因此，通过控制薄膜电阻器3b上施加的电流值Ib和电流变化速度ΔIb(A/s)或者控制薄膜电阻器3a和3b上分别施加的电流值Ia和Ib的差以及电流变化速度ΔIa和ΔIb的差，可调节上述表面张力的差和调节连通管15b内气液界面的移动距离x(μm)和其移动速度Δx(μm/s)。
在这里，尽管说明了连通管15b内气液界面被移动的情况，显然，连通管15a内气液界面被移动的情况也是完全相同的。
在本实施方式中，一边检测以细胞为代表的生物样品21的图像，一边反馈控制生物样品21的位置。生物样品21的图像经过透明基板16通过摄像部34(例如CCD等)在数字变换之后输入计算机35，并且基于诸如生物样品21移动量的图像信息而算出在各个薄膜电阻器3a和3b上流动的电流量。还可以包括将算出的电流值自动地施加到电流施加部18的机构。当然，即使上述操作由技术人员完全通过手动来进行也没有关系，但是，通过使上述操作自动化，能够更简单地进行测定。
如上述，在本实施方式的测定装置10中，通过控制薄膜电阻器3a和3b上施加的电流值Ia，Ib以及电流变化速度ΔIa和ΔIb(A/s)，调节电阻槽6a和6b(或者连通管15a和15b)内具有的气液界面上起作用的各自的表面张力的差，以及调节连通管15a和15b内气液界面的移动距离和其移动速度。
因此，在本实施方式的测定装置10中，通过在孔19内产生电解质溶液12的局部流动并利用该局部流动，能够将生物样品21正确且迅速地诱导到微电极1上，进行生物样品21电生理学的测定。因此，在现有技术各种装置中必需的高精度位置控制装置以及熟练操作也都没有必要了。
由于能够将神经刺激物质或化学突触信息传递物质等化学物质提供给孔19内的细胞21，因此，本实施方式的测定装置能够简便地进行与细胞内记录法相同的高精度测定给予药物的细胞的离子通道特性和化学突触的测定。
特别地，在本实施方式的测定装置10中，连通管15a和15b通过将流路9(即孔19)作为对称轴被几乎配置为轴对称。这样，能够在连通管15a和连通管15b之间的双方向(即从微电极看的左右方向)上产生在孔19内产生的电解质溶液12的局部流动。
而且，如图3所示，连通管15a和连通管15b被配置使得连通管15a和连通管15b相对流路9(即孔19)构成的角度分别为α并且α必须为钝角。这样，孔19内产生的电解质溶液12的局部流动必须在流向微电极1的方向上产生。
如从上述说明可知，在本实施方式的测定装置10中，在孔19内，能够在水平面内两维产生电解质溶液12的局部流动。
在本实施方式中，通过将连通管15a和15b以流路9(即孔19)作为对称轴几乎配置为轴对称，使得在连通管15a和15b内存在的气液界面上起作用的各个表面张力的差的计算非常简单。
在本实施方式中，电阻槽6a和6b也与连通管15a和15b相同以流路9(即孔19)作为对称轴被几乎配置为轴对称。这样，使得在电阻槽6a和6b(或者连通管15a和15b)内存在的气液界面上起作用的各个表面张力的差的计算更简单。因此，能够非常容易地调节上述表面张力的差。
在本实施方式的测定装置10中，基准电极2被配置在形成于基板16的流路9入口7的附近。但是，当电解质溶液12充满了流路9时，基准电极2如果设置在接触电解质溶液12的位置上也是可以的。特别地，为了进行正确的测定，优选将基准电极2设置在产生电解质溶液12之局部流动的孔19的外部。
下面，说明本实施方式测定装置10的使用例子。
(使用例子1：通过电流刺激细胞之活动电位的测定)
与使用现有技术玻璃微小吸管的细胞内记录法相同，本实施方式测定装置10能够通过固定电压法和固定电流法来测定细胞产生的电信号。
具体地，通过如上述将细胞21诱导到微电极1，将微电极1刺入细胞21，在测定部33中测定微电极1相对基准电极2的电位。
在测定部33内设置了电流脉冲发生器，并且微电极1与此连接。然后，经过端子4a从微电极1给细胞21提供电流刺激。这样，能够用计算机35计算测定由电流刺激导致的细胞去极化和一过性的活动电位等。
(使用例子2：通过给予药物刺激细胞的膜电位测定)
本实施方式的测定装置10也能够用来测定细胞的离子通道特性。这通过入口连接器13(空洞7)和出口连接器14(空洞8)以及与它们连接的泵31和32，通过将诸如神经刺激物质和化学突触传递物质等化学物质提供给细胞21而实现。
或者，也能够通过使用压电元件的喷墨法、使用精密压力泵或者微流体驱动装置的方法、特开平10-337177号公报公开的方法以及电极化法等注入药物。
例如，电极化法是通过在药物储藏室和用于注入药物的靶之间施加DC脉冲来注入希望量药物的方法。具体地，在电解质溶液12充满流路9且将细胞21和药物添加到孔19内的电解质溶液12中之后，通过在基准电极2和微电极1之间施加DC脉冲而能够将希望量的药物注入到孔19内的细胞21上。
在本实施方式中，尽管微电极1被设置在孔19的壁面上，但是配置在底面上也可。
在本实施方式中，对于一个基准电极2，可以在孔19内设置多个微电极1。当设置多个微电极1时，多个微电极1可以被连接到一个端子4a上。多个微电极1的每一个也可被连接到多个端子。但是，当设置多个微电极1时，基准电极2的表面积优选比多个微电极1表面积之和要大。这是对诸如溶液流动等外部混乱为了提高测定的稳定性而要求的。
当在孔19内设置多个微电极1时，将细胞21固定到各自的微电极1，可以同时测定全部细胞，也可以分别测定各个细胞。特别地，作为生物样品的细胞未必限于活着的。因此，在本实施方式的测定装置10中，如果是在孔19内设置了10个微电极1的结构，例如在细胞的生存率是90％的情况下，则在一次测定中可获得的概率为9个细胞的数据。因此，获得了提高测定效率的效果。
在本实施方式中，上述连接器13和14尽管通过粘接剂等粘接到基板16，但不限定于此。其可与基板16形成为一体。
作为基板16和基板17所使用的材料包括：以单晶硅、非晶硅、碳化硅、氧化硅和氮化硅等为代表的半导体材料以及以SOI(硅-绝缘体)等为代表的这些半导体材料的复合材；玻璃、石英玻璃、氧化铝；蓝宝石、陶瓷、镁橄榄石、感光性玻璃等无机材料；聚乙烯、乙烯、聚丙烯、聚异丁烯、聚对苯二甲酸乙二酯、不饱和聚酯、含氟树脂、聚氯乙烯、聚氯亚乙烯、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯乙缩醛、丙烯酸树脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、缩醛树脂、聚碳酸酯、聚酰胺、酚醛树脂、尿素树脂、环氧树脂、三聚氰胺树脂、苯乙烯-丙烯腈共聚物、丙烯腈-丁二烯苯乙烯共聚物、聚苯醚和聚砜等有机材料；以酚醛树脂为基质树脂的酚醛树脂-重氮萘醌(DNQ)系列感光材料；聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和与PMMA的共聚物、聚亚甲基砜、聚六氟丁基甲基丙烯酸酯、聚甲基异丙烯酮(PMIPK)聚二甲基硅氧烷(PDMS)；以及以环化聚异戊二烯为基质聚合物的氨基化合物例如2-6-二(4-didobezaol)(ジドベザ-ル)-4-甲基环己酮等构成的感光材料群。但不局限于此。其中，优选使用非晶硅、单晶硅或者玻璃作为基板16和基板17。
构成流路9的基板16的凹部9a和基板17的孔19的表面最好施加亲水性处理。这样，能够使液体在微小的流路9内流动。
微电极1和基准电极2是由铂、铂黑、金、钯、铑、银、汞、钨和它们的化合物等贵金属材料；以及石墨、古拉系碳(グラシ-か-ボン)、热解石墨、碳膏、碳纤维代表的碳材料等电极材料制成，但是其不局限于这些。微电极1和基准电极2也可以由导电性高分子覆盖。由此能够制作稳定的固定电极。而且，也可以由单分子膜覆盖这些电极。
薄膜电阻器3a和3b能够由铂、铂黑、金、钯、铑、银、汞、钨、镍、钛和它们的化合物等贵金属材料；石墨、古拉系碳(グラシ-か-ボン)、热解石墨、碳膏、碳纤维代表的碳材料；以及Si、Ge、ZnO、CdS、TiO2、GaAs、钛等材料制成，但是其不局限于这些。与上述微电极1和基准电极2相同，薄膜电阻器3a和3b也可以由导电性高分子覆盖，由此能够制作稳定的薄膜电阻器。而且，这些电阻器也能够由单分子膜覆盖。
在本实施方式中，电阻槽6a和6b被充填了空气。但是，其不局限于空气，如果是能够使在电解质溶液12之间的表面张力产生变化的气体和液体也是能够使用的。
在本实施方式中，尽管将薄膜电阻器3a和3b配置在电阻槽6a和6b中，但若配置在连通管15a和15b中，也能够使本实施方式的测定装置10进行完全相同的操作。薄膜电阻器3a和3b优选为梳状。这样，即使在狭小区域也能够使第一和第二电阻器长和大，阻抗值大。
在本实施方式中，尽管使用泵31和32，但不限定于此，使用注射器分别代替泵31和32也是可以的。
实施方式2
在本实施方式中，参考图说明在上述实施方式1的测定装置10中能够用来代替测定单元11的测定单元11’。为了使说明简单，将与上述实施方式1共同的构成要素用同一参考标记表示。
本实施方式的测定单元11’在外观上与上述实施方式1的测定单元11几乎相同。因此，在本实施方式中，将图1所示测定单元11与测定单元11’置换而说明。
图7是沿着图1所示III-III线的剖面图。图8是从图1所示箭头A看的测定单元11’的立体图。图8所示沿着III-III线的剖面图与图7相当。而且，在图8中，省略了测定单元11’中基板16的图示。
测定单元11’是与上述实施方式1的测定单元11几乎相同的结构。但是，如图7和图8所示，其不同点在于设置了与孔19(即流路9)连接的连通管15c、与连通管15c连接的电阻槽6c和在电阻槽6c上配置的薄膜电阻器3c。
因此，在本实施方式的测定单元11’中，在孔19内能够在水平面内的前后左右(即两维完全自由地)产生电解质溶液12的局部流动。因此，如果使用本实施方式的测定单元11’，其比使用上述实施方式1的测定单元11更能自由地进行电解质溶液12内所含生物样品21的位置控制。
由于电解质溶液12内所含生物样品21之位置控制的自由度高，因此能够在孔19内自由地设置微电极1。即，在孔19内设计的自由度提高了。
在本实施方式的测定单元11中，由于设置了对着微电极1的在孔19(即流路9)连接的连通管15c、在连通管15c连接的电阻槽6c和在电阻槽6c内分别配置的薄膜电阻器3c，因此在孔19内产生的电解质溶液12的局部流动有可能在流向微电极1的方向上产生。
如图8所示，连通管15a和连通管15b分别被配置使得它们相对流路9(即孔19)构成的角度假设为α并且角度α必须为锐角。就是说，配置连通管15a和连通管15b使得沿着连通管15a延伸的直线和沿着连通管15b延伸的直线向着微电极1散开。这样，孔19内产生的电解质溶液12的局部流动有可能必须在距微电极1疏远的方向上产生。
而且，使连通管15a和15b以流路9(即孔19)作为对称轴被配置成几乎轴对称。因此，能够在连通管15a和连通管15b之间的双方向(即从微电极看的左右方向)上产生在孔19内产生的电解质溶液12的局部流动。
从上述说明可知，由于本实施方式的测定单元11’具有非常高对称性的结构，如图8所示，使电阻槽6a、6b和6c(或者连通管15a、15b和15c)内存在的气液界面上起作用的各个表面张力的差的计算简单。因此，能够容易地调节上述表面张力的差。
特别优选的是，在本实施方式的测定装置11’中，连通管15a和连通管15b分别相对流路9(即孔19)构成的角度α几乎是60度，连通管15c对着微电极1设置。这样，就使电阻槽6a、6b和6c(或者连通管15a、15b和15c)内存在的气液界面上起作用的各个表面张力的差的计算最为简单。因此，能够非常容易地调节上述表面张力的差。
在本实施方式中，作为结构，尽管在相互不同的三个方向上设置了延伸的连通管、与它们连接的各个电阻槽和各个电阻器，但是仍然在与上述3方向互相不同的方向上追加设置延伸的连通管、与它们连接的各个电阻槽和各个电阻器也是可以的。这样，在追加连通管延伸方向上，能够容易诱导生物样品。就是说，增加了能够容易诱导生物样品21的方向。因此，能够更精密地进行将生物样品21诱导到微电极1。
实施方式3
图9是表示本实施方式测定装置的结构示意图。
如图9所示，本实施方式的测定装置10’与上述实施方式1或者2的测定装置10相同，包括测定单元11或者测定单元11’。特别是，在本实施方式的测定装置10’中，设置了多个测定单元11或者11’，多个测定单元11或者11’被集成为矩阵形状。测定单元11或者11’的结构是分别与上述实施方式1或者实施方式2的完全相同。
各个测定单元11或者11’包括的入口连接器13和出口连接器14被连接到包括阀门和泵的流路变换器38上。通过流路变换器38，将入口连接器13作为出口，将出口连接器14作为入口，所以其能够成为可用来交换的结构。
而且，在本实施方式的测定装置10’中，设置了在各个流路变换器38连接的流体驱动装置41a和41b以及42a和42b。作为流体驱动装置41a和41b以及42a和42b，例如可使用泵、空气压缩机以及注射器等。
在本实施方式的测定装置10’中，电流施加部18和测定部33被构成为能够通过多路转换器36和37分别进行转换。电流施加部18、测定部33、多路转换器36和37的操作由在电流施加部18和测定部33连接的计算机35控制。
根据本实施方式的测定装置10’，能够同时进行多个测定。
实施方式4
在本实施方式中，参考图10说明通过使用上述实施方式1测定装置10而进行的测定方法。图10是表示本实施方式测定方法的流程图。
首先，如图10所示，在步骤St1，通过利用在上述实施方式1描述的层流的方法将细胞21引入孔19内，在控制细胞21的位置而使其固定在微电极11上之后，测定细胞内电位。
接着，如图10所示，在步骤St2，切换阀门V而将刺激剂溶液从入口连接器13注入到流路9。当刺激剂溶液到达孔19上时，停止刺激剂溶液的注入，并阻止流路9内液体的流动。这样，刺激剂扩散到孔19内，并刺激在微电极11上固定的细胞21。
接着，如图10所示，在步骤St3，再次测定细胞内电位。
接着，如图10所示，在步骤St4，清洗孔19内部。具体地，切换阀门V将清洗液从入口连接器13注入流路9，当清洗液到达孔19上时，停止清洗液的注入。这样，清洗液扩散到孔19内。接着，清洗液从出口连接器14排出。特别在本步骤中，重复清洗液的注入和排出操作。这样，可清洗孔19内部。
接着，如图10所示，一边顺次增大刺激剂溶液中刺激剂的浓度一边重复步骤St1～4。这样，就能够调查刺激剂的浓度和细胞内电位之间的相关关系。
在上述步骤St2之前，通过预先将拮抗剂通过与刺激剂相同的程序引入到孔19内，也能够调查拮抗剂和细胞内电位之间的相关关系。
下面，说明本发明的实施例。下面描述的实施例是本发明的例子表示，不限制本发明。
实施例
在这里，说明通过使用上述实施方式1的测定装置10测定作为生物样品的单细胞时的实施例。
实施例1
测定装置制作
使用2mm厚的玻璃板作为基板16的材料。在宽60mm×长100mm玻璃板的表面上使用100μm的立铣刀(end mill)形成宽150μm长3mm深70μm的凹部9a。此后，将凹部9a精心研磨。在凹部9a的两端开出作为入口和出口的直径为1.5mm的直通孔。
使用单晶硅晶片作为基板17的材料。在基板17的表面上，使用光刻法和各向异性刻蚀形成宽150μm长500μm深30μm的倒梯形孔19，宽400μm长1000μm深30μm的倒梯形电阻槽6a和6b，宽10μm长500μm深7.1μm的倒三角柱形连通管15a和15b。具体制造工序如下所述。
在将单晶硅晶片于120℃下烘烤20分钟之后，进行充分地脱水，在其表面上将光刻胶以1000rpm旋涂5秒而成膜。之后，将该基板在90℃下预烘烤10分钟，通过曝光晶片形成掩膜图形，使用专用显影液进行显影和清洗，以及通过湿法刻蚀完成孔19、电阻槽6a和6b、以及连通管15a和15b。在这里，将24wt％KOH以及作为界面活性剂的IPA(异丙醇)的混合溶液用作为刻蚀剂。使用循环泵循环该混合溶液，在溶液温度被控制在73℃±3℃的状态下进行35分钟的刻蚀。
微电极1以单晶硅为材料，在圆形刻蚀掩膜正下方进行钻蚀而制成。微电极成为尖端尖锐的大致圆锥形状，其外周面向凹的方向弯曲，尖端附近直径约1μm，底面直径约16μm，高约8μm。之后，通过溅射钨使微电极表面成膜之后，保留尖端部，用聚酰亚胺绝缘覆盖。
此后，在基板17上，制作薄膜电阻器3a和3b及其引出布线、基准电极2及其引出布线、以及微电极1的引出布线。如果简单描述，就在基板17上通过真空蒸镀法形成0.5μm厚的铂膜。然后，通过光刻法，在铂膜之中去掉上述电极、电阻器和布线之外的部分。布线为80μm宽，薄膜电阻器3a和3b具有25μm宽，构成梳状。
这里，通过阳极接合将基板16和基板17粘合，并形成封闭的流路9。阳极接合在400～600℃下施加10分钟600V直流电压的条件下进行。之后，将入口连接器13和出口连接器14连接到在基板16凹部9a的两端形成的直通孔。接着，通过介入的三通阀门和装配接头将压缩机连接到流路9出口连接的连接器。
实施例2
神经细胞活动电位的测定
降压使得测定装置10流路9出口连接器14一侧成为比大气压稍微低的压力，使用入口连接器13所连接的帕莱斯塔特库(ペレスタテイツク)泵将椎实螺用的培养基(40mM NaCl，1.7mM KCl，4.1mM CaCl2，1.5mMMgCl2，5mM葡萄糖，5mM HEPES，pH7.9)从入口连接器13以10μl/分～100μl/分的流速注入到流路9。此时，观测培养基通过连通管15a和15b进入到电阻槽6a和6b内。
这里，在确认椎实螺用的培养基已经被注入到出口连接器14之后，终止源于出口连接器14侧的减压操作，释放三通阀门将出口连接器14一侧恢复到大气压。此时，还有培养基流入到连通管15a和15b，使气液界面变为位于连通管15a和15b与电阻槽6a和6b之间的连接部位上。
从椎实螺摘出的神经节在1mg/ml的蛋白酶型14(SIGMA、P-5147)的溶液中在37℃下振荡25分钟，分离出椎实螺神经细胞。将所获得的椎实螺神经细胞悬浊于椎实螺用的培养基中，并精心地从入口连接器13引入到流路9。然后，在显微镜下观察流路9，在椎实螺神经细胞到达孔19上方的瞬间，关闭入口连接器13和出口连接器14所连接的阀门V，结果确认了神经细胞已经引入到孔19内。
接着，在薄膜电阻器3a和3b上施加10mAp-p(毫安，peak to peak)30秒时，神经细胞在孔19内移动被突然刺入微电极1。这里，在微电极1上施加了10nAp-p下的毫秒矩形波电流刺激脉冲，通过膜电流固定法测定细胞内电位。在将310毫秒作为一个区间60次、采样频率50kHz下记录细胞内电位。
接着，通过施加8nAp-p、1毫秒的矩形波刺激电流进行测定。图11示出3次的测定结果。本实施例的测定全部采用桥式平衡而施加装置容量的校正。测定数据在经过5kHz四次巴特沃型低通滤波器之后被输入计算机。
如图11所示，其示出：观测到在150毫秒到250毫秒之间通过电流刺激产生的细胞的电位响应，以及通过现有技术的细胞内记录法与此同样检测出神经细胞的活动电位。
实施例3
使用来自老鼠动脉的平滑肌(SM)作为生物样品21。将添加了10％FBS(胎牛血清(Fetal Bovine Serum))的DMEM培养基使用作为注入到测定装置10内的溶液。通过进行与实施例2相同的操作将平滑肌细胞刺入微电极1，当将作为乙酰胆碱之相似物的卡巴可(Carbachol)调制为100μM浓度的溶液而引入时，通过膜电流固定法测定细胞内电位。
图12示出了当给予了卡巴可时计算测定的自发性活动电位的测定结果。如图12所示，检测出对应于卡巴可的活动电位。这是与通过现有技术的细胞内记录法相同的测定结果。
图13表示了当将信号处理施加到细胞内记录法获得的数据时，每10毫秒的标准偏差值的直方图。图13是在卡巴可提供前后每10毫秒之标准偏差值的直方图。将卡巴可提供前后的直方图通过正态分布近似而求得的曲线平均值和半值幅度，在给予前是0.185和0.04，给予后是0.545和0.21，可见在卡巴可给予前后，每10毫秒的偏差值之平均值增加了。通过给予卡巴可，椎实螺神经细胞的离子通道被活性化，通过该被活性化通道的关闭引起的电导的变动是表现作为电压变化。从图13可知，测定装置10与通过现有技术细胞内记录法实现的相同，能够确定对于神经刺激物质的离子通道特性。
这样，在测定装置10中，不进行现有技术的细胞内记录，通过离子通道活度提取方法，能够简便地测定随着通道的开闭的细胞活动。因此，使用测定装置10，通过将给细胞提供药物前后或者相对其提供量的通道活度的绝对值或通道活度的增减进行比较，能够进行细胞通道活度的测定和药物作用效果的定性或者定量的分类。
从上述实施例2和3的结果可知，能够从微电极1诱导的细胞21中通过微电极1高灵敏度地取得细胞膜电位和一过性的活动电位。
如上述说明，根据本发明，提供了一种测定装置，其能够简单、正确、高速和自动地进行生物样品电生理学评价。
工业实用性
本发明的测定装置和测定方法被使用于进行药品筛选等中代表的生物样品的电生理学评价。

Claims (17)

1一种测定装置，用于测定生物样品产生的电信号，包括：
在第一方向延伸的流路；
在上述流路两端连接的一对导入口；
在上述流路内设置的凹状孔；
在上述流路内设置的基准电极；
在上述孔内设置的至少一个微电极；
连接到上述孔的、在与上述第一方向不同的第二方向上延伸的第一连通管；
连接到上述孔中的与上述第一连通管不同部分上的、在与上述第一方向和第二方向都不同的第三方向上延伸的第二连通管；
分别连接到上述第一和第二连通管的第一和第二电阻槽；
在上述第一和第二连通管或者上述第一和第二电阻槽上配置的第一和第二电阻器。
2根据权利要求1所述的测定装置，特征在于，
上述第一连通管和上述第二连通管被配置为以上述流路为对称轴的轴对称。
3根据权利要求1所述的测定装置，特征在于，
上述第一连通管和上述第二连通管被配置为使得沿着上述第一连通管延伸的直线和沿着上述第二连通管延伸的直线向着上述至少一个微电极方向交叉。
4根据权利要求1所述的测定装置，特征在于，
上述至少一个微电极具有突起状的尖端部。
5根据权利要求1所述的测定装置，特征在于，
上述至少一个微电极是多个微电极。
6根据权利要求5所述的测定装置，特征在于，
上述基准电极的表面积比上述多个微电极表面积之和大。
7根据权利要求1所述的测定装置，特征在于，还包括第一基板和在上述第一基板上设置的第二基板，
上述第一基板具有：上述孔；上述基准电极；上述微电极；上述第一和第二连通管；第一和第二电阻槽；第一和第二电阻器；
上述第二基板具有：在设置于上述第一基板上的状态下作为上述流路的、在上述第一方向延伸的凹部；在设置于上述第一基板上的状态下作为上述一对导入口的、在上述凹部两端形成的空洞。
8根据权利要求7所述的测定装置，特征在于，
上述第二基板由透明材料形成。
9根据权利要求7所述的测定装置，特征在于，
上述第一基板由半导体材料形成。
10根据权利要求1所述的测定装置，特征在于，
上述第一连通管的体积是不足上述第一电阻槽体积的1/5；
上述第二连通管的体积是不足上述第二电阻槽体积的1/5。
11根据权利要求1所述的测定装置，特征在于，
上述流路的表面被实施了亲水性处理。
12根据权利要求1所述的测定装置，特征在于，
上述第一和第二电阻器是梳状。
13根据权利要求3所述的测定装置，特征在于，还包括：
连接到上述孔之中的与上述第一和第二连通管不同部分上的、在与上述第二方向和上述第三方向都不同的第四方向上延伸的第三连通管；
连接到上述第三连通管的第三电阻槽；
配置在上述第三连通管或者上述第三电阻槽的第三电阻器。
14根据权利要求13所述的测定装置，特征在于，
上述第一连通管和上述第二连通管被配置成使得沿着上述第一连通管延伸的直线和沿着上述第二连通管延伸的直线向着上述至少一个微电极方向散开，
上述第三连通管被配置成使得上述至少一个微电极的尖端部分实质上位于沿着上述第三连通管延伸的直线上。
15根据权利要求1所述的测定装置，特征在于，还包括：
在上述第一方向上延伸的又一个流路；
连接在上述又一个流路两端的又一对导入口；
在上述又一个流路内设置的凹状的又一个孔；
在上述又一个流路内设置的又一个基准电极；
在上述又一个孔内设置的至少一个的又一个微电极；
连接到上述又一个孔的、在与上述第一方向不同的第二方向上延伸的又一个第一连通管；
连接到上述又一个孔之中的与上述又一个第一连通管不同部分上的、在与上述第一方向和第二方向都不同的第三方向上延伸的又一个第二连通管；
分别连接到上述又一个第一和第二连通管的又一个第一和第二电阻槽；
在上述又一个第一和第二连通管或者上述又一个第一和第二电阻槽上配置的又一个第一和第二电阻器。
16一种测定方法，用于测定生物样品产生的电信号，包括：
准备测定装置的工序(a)，该测定装置包括：在第一方向延伸的流路；在上述流路两端连接的一对导入口；在上述流路内设置的凹状孔；在上述流路内设置的基准电极；在上述孔内设置的至少一个微电极；连接到上述孔的、在与上述第一方向不同的第二方向上延伸的第一连通管；连接到上述孔之中的与上述第一连通管不同部分上的、在与上述第一方向和第二方向都不同的第三方向上延伸的第二连通管；分别连接到上述第一和第二连通管的第一和第二电阻槽；在上述第一和第二连通管或者上述第一和第二电阻槽上配置的第一和第二电阻器；
通过降低上述流路内压力将电解质溶液引入和填充上述流路的工序(b)；
将上述流路内压力恢复到大气压的工序(c)；
将生物样品配置到上述孔内的工序(d)；
密闭上述流路的工序(e)；
通过将电流施加到上述第一电阻器或者第二电阻器而使上述生物样品接触到上述至少一个微电极的工序(f)；
测定上述生物样品产生的电信号之变化的工序(g)。
17根据权利要求16所述的测定方法，特征在于，还包括：
在上述工序(f)之后，将电脉冲施加到上述至少一个微电极的工序(h)。
18根据权利要求16或17所述的测定方法，特征在于，还包括：
从上述一对导入口的任一个给予药物的工序(i)。
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