JPWO2003044512A1 - 生体試料が発する電気信号を測定するための測定デバイスおよび測定方法 - Google Patents

Abstract

測定デバイス１０は、測定セル１１を備えている。測定セル１１は、基板１７と、基板１７上に設けられた基板１６とを備えている。基板１６と基板１７とは互いに貼り合わせられており、基板１６と基板１７とが互いに貼り合わされることによって測定セル１１が構成されたときに、測定セル１１内に流路９が形成される。図３に示すように、測定セル１１の基板１７には、凹形状のウェル１９と、端子４ａに接続され、ウェル１９の側壁面上に設けられた突起状の微小電極１と、ウェル１９（すなわち流路９）の両側面に対向して接続された連通管１５ａおよび１５ｂと、連通管１５ａおよび１５ｂにそれぞれ接続されている抵抗槽６ａおよび６ｂと、抵抗槽６ａおよび６ｂ内にそれぞれ配置された薄膜抵抗体３ａおよび３ｂと、端子４ｂに接続された基準電極２とが設けられている。

Description

技術分野
本発明は、生体試料の電気生理学的評価を行なうための測定デバイスに関する。
背景技術
従来、生体試料（代表的には細胞）を用いる薬品スクリーニング手法では、蛍光色素法または微小ピペット電極法によって細胞の活動をモニターし、細胞に対する薬品の影響、作用などを評価している。
蛍光色素法は、種々のイオン濃度に特異的に感応する蛍光色素や、膜電位感受性の蛍光色素などを用いて、薬品の影響を受ける細胞の活動を、細胞の膜電位変化やイオン濃度変化にともなう蛍光の変化の度合いを光学的に測定する方法である。蛍光色素法では、細胞を色素で染色する工程を必要とするため、細胞に対する色素の影響をなくすることはできない。また、蛍光色素法では、蛍光色素からの蛍光が時間の経過と共に弱くなるため、検出精度に乏しいという欠点がある。
これに対し、微小ピペット電極法は、細胞内の電位、細胞膜に存在するイオンチャネル電流、薬剤受容体作動性チャネル電流などの、細胞の電気的活動を直接測定する方法である。このため、薬品の影響を受ける細胞の活動のより詳細かつ広範な情報を得ることができる。微小ピペット電極法は、細胞の活動情報を得るために非常に有用な方法である。
一般に、微小ピペット電極法の１つである細胞内電位記録法では、細胞内の電位を計測するために、熱融解した石英ガラスもしくはホウケイ酸ガラスを引っ張り加工して、先端直径がサブミクロン単位に製作された微小ピペットを、細胞内に刺入する。また、微小ピペット電極法の１つであるパッチクランプ法では、細胞の０．１〜２０ミクロン程度の微小領域を局所的に測定するために、微小ピペットを細胞膜に押しつけ、微小ピペットと細胞膜とを所定の角度で高精度に密着させる。
解決課題
しかしながら、従来の微小ピペット電極法では、技術者が顕微鏡像を頼りにしながら微小ピペットを操作することによって、基板上に固定された細胞に微小ピペットを刺入する、あるいは密着させている。このため、微小ピペットの高精度な位置制御装置を必要とし、さらには細胞に微小ピペットを刺入する、あるいは密着させるためには熟練が必要である。
従って、微小ピペット電極法は、大量の薬品候補化合物を高速でスクリーニングする手法としては適していないという不具合がある。
特開平９−２８９８８６号公報には、微小ピペット電極法に用いる細胞膜電位検出装置が開示されている。この細胞膜電位検出装置は、複数の有底穴をもつシャーレの底面に設けられた、微小ピペットの役割を果たす細胞刺入用の突起電極と、有底穴の側面周囲に設けられた基準電極とを備えている。
上記公報に開示されている細胞膜電位検出装置にも、やはり、細胞を突起電極に正確に誘導する手段が設けられていない。このため、細胞を突起電極に誘導する操作に技術者の熟練が必要となる不具合がある。
本発明は、上記不具合に鑑みてなされたものであり、簡易で、正確、高速かつ自動的に、生体試料の電気生理学的測定を行なうことが可能な測定デバイスを提供することを目的とする。
発明の開示
本発明の測定デバイスは、生体試料が発する電気信号を測定するための測定デバイスであって、第１の方向に延びる流路と、上記流路の両端に連結された１対の導入口と、上記流路内に設けられた凹形状のウェルと、上記流路内に設けられた基準電極と、上記ウェル内に設けられた少なくとも１つの微小電極と、上記ウェルに連結されており、上記第１の方向と異なる第２の方向に延びる第１連通管と、上記ウェルのうちの、上記第１連通管と異なる部分に連結されており、上記第１の方向および第２の方向のいずれとも異なる第３の方向に延びる第２連通管と、上記第１および第２連通管のそれぞれに接続された第１および第２抵抗槽と、上記第１および第２連通管または上記第１および第２抵抗槽に配置された第１および第２抵抗体とを備える。
本発明の測定デバイスにおいて、第１および第２抵抗体に電流が印加されると、第１および第２抵抗体は電気エネルギーを消費し熱を発生する。流路に電解質溶液を満たし、第１および第２抵抗槽に電解質溶液との界面張力に変化を生じさせることが可能な媒体を充填した状態で使用し、それぞれの抵抗体に異なる電流値で電流を印加する。このことにより、第１および第２抵抗槽に閉じ込められた媒体と、第１および第２連通管に満たされた電解質溶液との間の界面張力が抵抗体で発生する熱量に比例して減少する。その結果、第１および第２連通管内の電解質溶液が、高温側の抵抗槽から低温側の抵抗槽に向かって移動する。このことによって、ウェル内に電解質溶液の局所的流れが生じ、この局所的流れを利用して、生体試料を微小電極に正確で且つ迅速に誘導し、生体試料の電気生理学的測定を行なうことができる。従って、本発明の測定デバイスによれば、従来のこの種の装置では必要であった高精度な位置制御装置、および熟練した操作も不要である。
上記第１連通管と上記第２連通管とは、上記流路を対称軸として線対称に配置されていることが好ましい。
このことによって、第１および第２連通管内にある電解質溶液の局所的流れによって誘導される生体試料の誘導方向および誘導速度の計算を非常に単純化することができる。
上記少なくとも１つの微小電極は、突起状の先端部を有することが好ましい。
このことによって、生体試料に微小電極を刺入することが可能になる。
上記第１連通管および上記第２連通管は、上記第１連通管に沿って延びる直線と、上記第２連通管に沿って延びる直線とが上記少なくとも１つの微小電極に向かって交差するように配置されていることが好ましい。
このことによって、ウェル内に生じる電解質溶液の局所的流れを微小電極に向かう方向に生じさせることができる。
上記少なくとも１つの微小電極は、複数の微小電極である構成としてもよい。
このことによって、複数の生体試料をそれぞれの微小電極に固定し、全ての生体試料を同時に測定することも、各生体試料を別々に測定することも可能となる。
上記基準電極の表面積は、上記複数の微小電極の表面積の合計よりも大きいことが好ましい。
このことによって、溶液流れなどの外乱に対する測定の安定性が向上する。
第１基板と、上記第１基板上に設けられた第２基板とをさらに備え、上記第１基板は、上記ウェルと、上記基準電極と、上記微小電極と、上記第１および第２連通管と、第１および第２抵抗槽と、第１および第２抵抗体とを有し、上記第２基板は、上記第１基板上に設けられた状態で上記流路となる、上記第１の方向に延びる凹部と、上記第１基板上に設けられた状態で上記１対の導入口となる、上記凹部の両端に形成された空洞とを有する構成としてもよい。
上記第２基板は、透明の材料から形成されていることが好ましい。
このことによって、流路を外部から観察することが可能になる。
上記第１基板は、半導体材料から形成されていることが好ましい。
このことによって、第１および第２抵抗槽、ならびに第１および第２連通管を、当業者に公知の半導体製造技術を用いて作製することができる。特にウェットエッチングを用いることによって、面方位選択性を利用して、第１および第２抵抗槽、ならびに第１および第２連通管を高精度で形成することが可能である。
上記第１連通管の体積は、上記第１抵抗槽の体積の１／５未満であり、上記第２連通管の体積は、上記第２抵抗槽の体積の１／５未満であることが好ましい。
このことによって、第１および第２抵抗槽の界面張力を適宜調節することによって、電解質溶液の界面が第１および第２連通管の所望の位置に存在するように制御することが容易になる。
上記流路の表面は、親水性処理が施されていることが好ましい。
このことによって、微小な流路内に液体を流すことができる。
上記第１および第２抵抗体は、くし型形状であることが好ましい。
このことによって、狭い領域でも第１および第２抵抗体の長さを大きくでき、抵抗値を大きくすることが可能となる。
上記ウェルのうちの、上記第１および第２連通管と異なる部分に連結されており、上記第２の方向および上記第３の方向のいずれとも異なる第４の方向に延びる第３連通管と、上記第３連通管に接続された第３抵抗槽と、上記第３連通管または上記第３抵抗槽に配置された第３抵抗体とをさらに備えることが好ましい。
このことによって、電解質溶液内に含まれる生体試料の位置制御を自由に行なうことができる。さらに、電解質溶液内に含まれる生体試料の位置制御の自由度が高くなるので、微小電極をウェル内に自由に設けることができる。つまり、ウェル内の設計の自由度が向上する。
上記第１連通管および上記第２連通管は、上記第１連通管に沿って延びる直線と、上記第２連通管に沿って延びる直線とが上記少なくとも１つの微小電極に向かって開くように配置されており、上記第３連通管は、上記少なくとも１つの微小電極の先端部が上記第３連通管に沿って延びる直線上に実質的に位置するように配置されていることが好ましい。
このことによって、ウェル内において、電解質溶液の局所的流れを微小電極に対して前後、左右方向のいずれの方向にも自由に生じさせることが可能である。
上記第１の方向に延びるもう１つの流路と、上記もう１つの流路の両端に連結されたもう１対の導入口と、上記もう１つの流路内に設けられた凹形状のもう１つのウェルと、上記もう１つの流路内に設けられたもう１つの基準電極と、上記もう１つのウェル内に設けられた少なくとも１つのもう１つの微小電極と、上記もう１つのウェルに連結されており、上記第１の方向と異なる第２の方向に延びるもう１つの第１連通管と、上記もう１つのウェルのうちの、上記もう１つの第１連通管と異なる部分に連結されており、上記第１の方向および第２の方向のいずれとも異なる第３の方向に延びるもう１つの第２連通管と、上記もう１つの第１および第２連通管のそれぞれに接続されたもう１つの第１および第２抵抗槽と、上記もう１つの第１および第２連通管または上記もう１つの第１および第２抵抗槽に配置されたもう１つの第１および第２抵抗体とをさらに備える構成としてもよい。
このことによって、同時に複数の測定を行なうことが可能である。
本発明の測定方法は、生体試料が発する電気信号を測定する測定方法であって、第１の方向に延びる流路と、上記流路の両端に連結された１対の導入口と、上記流路内に設けられた凹形状のウェルと、上記流路内に設けられた基準電極と、上記ウェル内に設けられた少なくとも１つの微小電極と、上記ウェルに連結されており、上記第１の方向と異なる第２の方向に延びる第１連通管と、上記ウェルのうちの、上記第１連通管と異なる部分に連結されており、上記第１の方向および第２の方向のいずれとも異なる第３の方向に延びる第２連通管と、上記第１および第２連通管のそれぞれに接続された第１および第２抵抗槽と、上記第１および第２連通管または上記第１および第２抵抗槽に配置された第１および第２抵抗体とを備える測定デバイスを用意する工程（ａ）と、上記流路内の圧力を低減することによって上記流路に電解質溶液を充填する工程（ｂ）と、上記流路内の圧力を大気圧に戻す工程（ｃ）と、上記ウェル内に生体試料を配置する工程（ｄ）と、上記流路を密閉する工程（ｅ）と、上記第１抵抗体または第２抵抗体に電流を印加することによって、上記少なくとも１つの微小電極に上記生体試料を接触させる工程（ｆ）と、上記生体試料が発する電気信号の変化を測定する工程（ｇ）とを含む。
本発明の測定方法によれば、電極に誘導された生体試料の電気生理学的測定を行なう際に、従来では必要であった高精度な位置制御装置、および熟練した操作が不要となる。つまり、簡易で、正確、高速かつ自動的に、生体試料の電気生理学的測定を行なうことができる。
上記工程（ｆ）の後に、上記少なくとも１つの微小電極に電気パルスを印加する工程（ｈ）をさらに含む構成としてもよい。
このことによって、生体試料の電気刺激による電気的な反応を高感度で測定することができる。
上記１対の導入口のいずれか一方から薬剤を投入する工程（ｉ）をさらに含む構成としてもよい。
このことによって、生体試料の薬剤に対する電気的な反応の測定を簡便に行なうことができる。
最良の実施形態
以下、本発明の実施形態を図面を参照しながら説明する。
（実施形態１）
図１は、本実施形態の測定デバイスの構成を示す図である。図２は、図１中に示したＩＩＩ−ＩＩＩ線に沿った断面図である。
図１に示すように、本実施形態の測定デバイス１０は、測定セル１１と、電流印加部１８と、ポンプ３１および３２と、測定部３３と、撮像部３４と、計算機３５とを備えている。
測定セル１１は、基板１７と、基板１７上に設けられた基板１６とを備えている。基板１６と基板１７とは互いに貼り合わせられている。基板１７には、図１に示すように、端子４ａ、４ｂ、５ａおよび５ｂが設けられている。
電流印加部１８は、図１に示すように、基板１７に設けられた端子５ａおよび５ｂに電気的に接続されている。
ポンプ３１および３２は、図１に示すように、入口コネクタ１３および出口コネクタ１４に設けられた開口部１３ａおよび１４ａにそれぞれ接続されている。
測定部３３は、端子４ａおよび４ｂに接続されており、計算機３５は、測定部３３に電気的に接続されている。
撮像部３４は、測定セル１１の直上に位置するように配置されている。図１に示すように、必要に応じて、撮像部３４および電流印加部１８は、計算機３５に電気的に接続される。
次に、測定セル１１のより詳細な構造を説明する。
図１に示すように、測定セルを構成している基板１６の上には、入口コネクタ１３と、出口コネクタ１４とが設けられている。本実施形態では、図１および図２に示すように、入口コネクタ１３および出口コネクタ１４は、接着剤などによって基板１６に接着しているが、これに限定されず、基板１６と一体成形されていてもよい。また、図２に示すように、入口コネクタ１３および出口コネクタ１４の内部は空洞７および８になっており、この空洞７および８は、基板１６を貫通している。さらに、入口コネクタ１３および出口コネクタ１４の上部にはそれぞれ開口部１３ａおよび１４ａが設けられており、入口コネクタ１３および出口コネクタ１４の内部の空洞７および８は、開口部１３ａおよび１４ａからチューブ等によりポンプ３１および３２にそれぞれ通じている。入口コネクタ１３および出口コネクタ１４の内部の空洞７および８は、バルブＶを介してポンプ３１および３２にそれぞれ連結されている。
また、図２に示すように、基板１６には、凹部９ａが形成されている。このため、基板１６と基板１７とが互いに貼り合わされることによって測定セル１１が構成されたときに、測定セル１１内に流路９が形成される。
基板１７は、図２に示すように、凹形状のウェル１９と、ウェル１９の側壁面上に設けられた突起状の微小電極１とを備える。
ここで、測定セル１１のより詳細な構造を図１および図２に加えて、図３を参照しながら説明する。図３は、図１中に示した矢印Ａから見た測定セル１１の透視図である。なお、図３中に示すＩＩＩ−ＩＩＩ線に沿った断面図は、図１と同様に、図２の断面図に相当する。また、図３では、測定セル１１のうちの基板１６の図示を省略している。
図２および図３に示すように、基板１６は、空洞７および８が流路９の両端の上に位置するように基板１７に貼り合わせられている。
図３に示すように、測定セル１１の基板１７には、凹形状のウェル１９と、端子４ａに接続され、ウェル１９の側壁面上に設けられた突起状の微小電極１と、ウェル１９（すなわち流路９）の両側面に対向して接続された連通管１５ａおよび１５ｂと、連通管１５ａおよび１５ｂにそれぞれ接続されている抵抗槽６ａおよび６ｂと、抵抗槽６ａおよび６ｂ内にそれぞれ配置された薄膜抵抗体３ａおよび３ｂと、端子４ｂに接続された基準電極２とが設けられている。
連通管１５ａおよび１５ｂは、流路９（すなわちウェル１９）を対称軸としてほぼ線対称に配置されている。また、連通管１５ａおよび連通管１５ｂは、図３に示すように、連通管１５ａおよび連通管１５ｂがそれぞれ流路９（すなわちウェル１９）に対してなす角度をαとすると、角度αは必ず鈍角になるように配置されている。つまり、連通管１５ａに沿って延びる直線と、連通管１５ｂに沿って延びる直線とが微小電極１に向かって交差するように、連通管１５ａおよび連通管１５ｂが配置されている。
また、本実施形態では、抵抗槽６ａおよび６ｂ、ならびに薄膜抵抗体３ａおよび３ｂもまた、連通管１５ａおよび１５ｂと同様に流路９（すなわちウェル１９）を対称軸としてほぼ線対称に配置されている。
連通管１５ａおよび１５ｂは、抵抗槽６ａおよび６ｂに比べて非常に小さな断面積を有する。抵抗槽６ａおよび６ｂは任意の形状であり得る。
基準電極２は、基板１６に形成された流路９の入口７の近傍に配置されている。なお、基準電極２は、液体と接する位置に存在すればよく、流路９およびウェル１９内に配置されることが好ましい。よって、基板１７上に作製することも可能である。但し、作製の容易さから基板１６に設けることが好ましい。
図１および図３に示すように、微小電極１および基準電極２は、端子４ａおよび４ｂを通じて測定器３３に接続される。測定器３３としては、微小ピペット電極法では、ブリッジバランス回路、電流刺激用回路、および細胞膜容量の容量補正機構を備える電流・電圧増幅器等が好適に用いられる。
図１および図３に示すように、薄膜抵抗体３ａおよび３ｂは、端子５ａおよび５ｂを通じて、電流印加装置１８にそれぞれ接続されている。電流印加装置１８は、薄膜抵抗体３ａおよび３ｂに所望の電流を印加する。
基板１７としては、シリコン基板等からなる半導体基板を用いることが好ましい。基板１７として、半導体基板を用いることによって、抵抗槽６ａおよび６ｂ、ならびに連通管１５ａおよび１５ｂを、当業者に公知の半導体製造技術を用いて作製することができる。特にウェットエッチングによって抵抗槽６ａおよび６ｂ、ならびに連通管１５ａおよび１５ｂを作製することが好ましい。ウェットエッチングを用いれば、面方位選択性を利用して、高精度で微細な構造が形成された基板１７（すなわち測定セル）が得られるからである。
なお、ドライエッチングまたはウェットエッチングのいずれを用いても上記抵抗槽および連通管を作製することができる。ウェットエッチングを行なう場合に用いるエッチャントとしては、等方性を有するエッチャント、または異方性を有するエッチャントが必要に応じて選択されて用いられる。
基板１６としては、撮像器３４から流路９を観察することができるように、透明の基板が用いられることが好ましい。基板１６に設けられる入口コネクタ１３および出口コネクタ１４の空洞７および８、ならびに流路９は、当業者に公知の加工技術（特に切削加工または研削加工など）、あるいは半導体製造技術を用いて作製され得る。特に基板１６としては、ガラス基板を用いることが好ましい。このことによって、当業者に公知の半導体製造技術を用いて基板１６に設けられる入口コネクタ１３および出口コネクタ１４の空洞７および８、ならびに凹部９ａを高精度で作製することが可能になる。
微小電極１は、導電性材料で形成されている。特に、本実施形態では、微小電極１は、単結晶シリコンをアンダーエッチング技術により微小突起の形状とし、このシリコン微小突起の表面に金属薄膜を被覆し、さらにその先端部位を除いて絶縁物で被覆することによって形成されている。このため、微小電極１は、先端直径が０．１μｍ程度の鋭利な突起状となっている。
本実施形態では、基準電極２、端子４ａ、４ｂ、５ａおよび５ｂ、微小電極１と端子４ａとを接続する配線、基準電極２と端子４ｂとを接続する配線、薄膜抵抗体３ａおよび３ｂは、真空蒸着、スパッタなどの薄膜形成技術を用いて作製されている。しかしながら、これらに限定されず、当業者に公知の方法を用いて作製しても全く構わない。
次に、本実施形態の測定デバイス１１の溶液導入法を図４を参照しながら説明する。
図４（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、本実施形態の測定デバイス１１の溶液導入法を模式的に示す図である。
まず、デバイスの流路９の入口８のコネクタに連結するバルブＶを閉め、次いで流路９の出口となる空洞８（すなわち出口コネクタ１４）に連結されたポンプ３２で吸引し、流路９、連通管１５ａおよび１５ｂ、および抵抗槽６ａおよび６ｂのそれぞれの内部の圧力を大気圧Ｐ１よりわずかに低い圧力Ｐｄまで減圧する。次いで、バルブＶを大気に開放すると、図４（ａ）に示すように、バルブＶに連結されたポンプ３１から空洞７（すなわち入口コネクタ１３）を介して電解質溶液１２が流路９内に注入される。
このとき、連通管１５ａおよび１５ｂを介して流路９に連絡している抵抗槽６ａおよび６ｂ内の圧力もまた大気圧Ｐ１より小さい圧力Ｐｄとなっている。従って、流路９に注入された電解質溶液１２は、図４（ｂ）に示すように、ウェル１９を満たして出口となる空洞８（すなわち出口コネクタ１４）に向かうとともに、連通管１５ａおよび１５ｂを満たす。
次いで、電解質溶液１２が流路９の出口となる空洞８に達したとき、出口コネクタ１４に連結されたポンプ３２の吸引を停止する。この後、出口となる空洞８をバルブ操作などによって大気に開放し、流路９内の圧力を大気圧Ｐ１に戻す。ここで、抵抗槽６ａおよび６ｂ内の圧力がほぼＰｄのままである。このため、連通管１５ａおよび１５ｂを満たしていた電解質溶液１２は、抵抗槽６ａおよび６ｂに向かって流れ込む。抵抗槽６ａおよび６ｂ内の圧力がＰ１に等しくなったときに、図４（ｃ）に示すように停止する。ここで、電解質溶液１２の注入を停止し、入口となる空洞７（すなわち入口コネクタ１３）に連結されたバルブＶを閉鎖する。
次に、電解質溶液１２に生体試料２１（本実施形態では細胞）を導入する。本実施形態では、生体試料２１の導入の際に、流路９の形状から得られる特性を利用する。
流路９は、図２に示すように、高さ方向の幅が非常に微細な空間である。このような微細な空間に液体が満たされた状態で、更に後から液体が流入する際には、後から導入された液体が層流となって流れやすいという特性がある。流路９内を流れる液体が層流となって流れると、流れる液体はウェル１９の内部に満たされた液体とはほとんど混合せずに、ウェル１９の上方を通過する。本実施形態では、電解質溶液１２が満たされた流路９内に、バルブＶに連結されたポンプ３１から空洞７（すなわち入口コネクタ１３）を介して生体試料２１を含む試料溶液を注入する。このとき、生体試料２１をモニターしながら、生体試料２１がウェル１９の上方に到達したときに、試料溶液の注入を停止する。このことによって、流路９内に層流がなくなり、電解質溶液１２の拡散が優勢となって、生体試料２１がウェル１９内に導入される。
なお、ここでは、生体試料２１の導入について説明しているが、これに限定されず、薬剤などの導入および除去も全く同様に行なうことができる。
最終的に、図５に示すように、流路９、ウェル１９、連通管１５ａおよび１５ｂが電解質溶液１２で満たされた状態となる。
なお、本実施形態では、電解質溶液１２として、生体試料２１である細胞の細胞内電位を測定するための細胞外液を用いている。細胞外液としては、２０ｍＭ〜４００ｍＭのＮａＣｌを主成分とする生理食塩水、および種々の栄養素、成長因子、抗生物質などを含有する培地などが用いられる。
特に、本実施形態の測定デバイス１０では、抵抗槽６ａおよび６ｂのそれぞれの体積を、連通管１５ａおよび１５ｂのそれぞれの体積、またはウェル１９の体積に比べてかなり大きくなるように設計されている。このため、抵抗槽６ａおよび６ｂの内部の圧力を適宜調節することによって、気液界面が連通管１５ａおよび１５ｂの所望の位置に存在するように制御することが容易になる。特に、抵抗槽６ａおよび６ｂのそれぞれの体積は、連通管１５ａおよび１５ｂのそれぞれの体積の５倍以上であることが好ましい。
次に、本実施形態の測定デバイス１０において、細胞を電極に導く原理の概略を図６を参照しながら説明する。図６（ａ）および（ｂ）は、細胞を電極に導く原理の概略を示す模式図である。ここでは、測定デバイス１０の抵抗槽６ｂに配置された薄膜抵抗体３ｂに電流を印加する場合を例示的に説明する。
まず、電流印加装置１８から薄膜抵抗体３ｂに電流を印加すると、薄膜抵抗体３ｂでは、以下の式１で示される電気エネルギーＷが消費される。
Ｗ＝ＲＩ^２ （１）
（ここで、Ｒは薄膜抵抗体３ｂの抵抗値［Ω・ｍ］、Ｉは薄膜抵抗体３ｂに流れた電流［Ａ］である。）
消費された電気エネルギーＷは熱エネルギーとなって、これが、抵抗槽６ｂ内の空気を膨張させる。このことによって、図６（ａ）に示すように、抵抗層６ｂ内の圧力をＰｄｄにするとともに、これに連通する連通管１５ｂの気液界面の界面張力を減少させる。流路９の出口となる空洞８における気液界面の界面張力は変化していないので、連通管１５ｂにある気液界面と連通管１５ａにある気液界面との間の界面張力の平衡が崩れ、電解質溶液１２は、抵抗槽６ｂからウェル１９に向かって、図６（ａ）の矢印Ｂで示される方向（低温の抵抗槽の側）に移動する。生体試料２１は、電解質溶液１２のこの流れに従って移動し、微小電極１に誘導され、刺入される。
次に、抵抗体６ｂへの電流供給を停止すると、加熱された抵抗槽６ｂ中の空気の一部は周囲温度に戻り、抵抗槽６ｂ内の圧力はＰｄｄ’となる。ここで、再び界面張力が釣り合うようになって、生体試料２１は、図６（ｂ）に示すように、移動した位置に保持される。連通管１５ｂの体積は非常に小さく、それに含まれる電解質溶液１２の熱容量が小さいので、電解質溶液１２の移動は迅速である。
本実施形態では、細胞活動測定時に入口となる空洞７および出口となる空洞８を閉じているので、電解質溶液１２が連通管１５ｂを移動する距離ｘ（μｍ）は、連通管１５ａ内にある気液界面の界面張力と、連通管１５ｂ内にある気液界面に働く界面張力との差に比例する。従って、薄膜抵抗体３ｂに印加される電流値Ｉｂおよび電流変化速度ΔＩｂ（Ａ／ｓ）を制御するか、または、薄膜抵抗体３ａおよび３ｂにそれぞれ印加される電流値ＩａおよびＩｂの差、および電流変化速度ΔＩａおよびΔＩｂの差を制御することによって、上記の界面張力の差を調節し、連通管１５ｂ内の気液界面の移動距離ｘ（μｍ）およびその移動速度Δｘ（μｍ／ｓ）を調節する。
ここでは、連通管１５ｂ内の気液界面を移動させる場合を説明したが、勿論、連通管１５ａ内の気液界面を移動させる場合も全く同様である。
本実施形態では、細胞に代表される生体試料２１の画像をモニターしながら、生体試料２１の位置をフィードバック制御する。生体試料２１の画像を、透明な基板１６を通して撮像器３４（例えばＣＣＤなど）によりデジタル変換して計算機３５に入力し、生体試料２１の移動量などの画像情報を元に、各薄膜抵抗体３ａおよび３ｂに流す電流量を算出する。算出した電流値を自動的に電流印加装置１８に印加する手段をさらに備えてもよい。勿論、上記の操作を、技術者が手動で全て行なっても構わないが、上記の操作を自動化することによって、より測定を簡単に行なうことが可能である。
以上に述べたように、本実施形態の測定デバイス１０では、薄膜抵抗体３ａおよび３ｂに印加される電流値Ｉａ、Ｉｂおよび電流変化速度ΔＩａおよびΔＩｂ（Ａ／ｓ）を制御することによって、抵抗槽６ａおよび６ｂ（あるいは連通管１５ａおよび１５ｂ）内にある気液界面に働くそれぞれの界面張力の差を調節し、連通管１５ａおよび１５ｂ内の気液界面の移動距離およびその移動速度を調節する。
このため、本実施形態の測定デバイス１０では、ウェル１９内に電解質溶液１２の局所的流れを生じさせ、この局所的流れを利用して、生体試料２１を微小電極１に正確で且つ迅速に誘導し、生体試料２１の電気生理学的測定を行なうことができる。従って、従来のこの種の装置では必要であった高精度な位置制御装置、および熟練した操作も必要としない。
また、本実施形態の測定デバイス１０は、ウェル１９内の細胞２１に、神経刺激物質や化学シナプス情報伝達物質などの化学物質を投与することが可能であるため、薬剤の投与による細胞のイオンチャネル特性や化学シナプスを測定する細胞内記録法と同様の高精度の測定を簡便に行なうことができる。
特に、本実施形態の測定デバイス１０では、連通管１５ａおよび１５ｂが、流路９（すなわちウェル１９）を対称軸としてほぼ線対称に配置されている。このことによって、ウェル１９内に生じる電解質溶液１２の局所的流れを、連通管１５ａと連通管１５ｂとの間で双方向（つまり、微小電極１から見て左右方向）に生じさせることが可能である。
さらに、図３に示すように、連通管１５ａおよび連通管１５ｂは、連通管１５ａおよび連通管１５ｂがそれぞれ流路９（すなわちウェル１９）に対してなす角度をαとすると、αは必ず鈍角になるように配置されている。このことによって、ウェル１９内に生じる電解質溶液１２の局所的流れが必ず微小電極１に向かう方向に生じる。
以上の説明からわかるように、本実施形態の測定デバイス１０では、ウェル１９内において、電解質溶液１２の局所的流れを水平面内で２次元的に生じさせることができる。
また、本実施形態では、連通管１５ａおよび１５ｂが流路９（すなわちウェル１９）を対称軸としてほぼ線対称に配置されていることによって、連通管１５ａおよび１５ｂ内にある気液界面に働くそれぞれの界面張力の差の計算が非常に単純化される。
さらに、本実施形態では、抵抗槽６ａおよび６ｂもまた、連通管１５ａおよび１５ｂと同様に流路９（すなわちウェル１９）を対称軸としてほぼ線対称に配置されている。このことによって、抵抗槽６ａおよび６ｂ（あるいは連通管１５ａおよび１５ｂ）内にある気液界面に働くそれぞれの界面張力の差の計算がさらに単純化される。このため、上記の界面張力の差を非常に容易に調節することができる。
さらにまた、本実施形態の測定デバイス１０では、基準電極２は、基板１６に形成された流路９の入口７の近傍に配置されている。しかしながら、基準電極２は、流路９に電解質溶液１２が満たされたときに、電解質溶液１２に接触する位置に設けられていればよい。特に、正確な測定を行なうためには、基準電極２を電解質溶液１２の局所的流れが生じるウェル１９の外部に設けることが好ましい。
次に、本実施形態の測定デバイス１０の使用例を説明する。
（使用例１：電流で刺激された細胞の活動電位の測定）
従来のガラス微小ピペットを用いた細胞内記録法と同様に、本実施形態の測定デバイス１０は、電圧固定法および電流固定法によって細胞の発する電気信号を測定することが可能である。
具体的には、上述のように細胞２１を微小電極１に誘導して、微小電極１を細胞２１に刺入し、基準電極２に対する微小電極１の電位を測定器３３において測定する。
また、測定器３３内に電流パルス発生器を設置しておき、これに微小電極１を接続しておく。そして、端子４ａを通じて微小電極１から細胞２１に電流刺激を与える。このことによって、電流刺激による細胞の脱分極および一過性の活動電位などを計算機３５で計測することができる。
（使用例２：薬剤投与によって刺激された細胞の膜電位測定）
本実施形態の測定デバイス１０はまた、細胞のイオンチャネル特性を測定するために用いることができる。これは、入口コネクタ１３（空洞７）および出口コネクタ１４（空洞８）、ならびにこれらに連結されているポンプ３１および３２によって、細胞２１に、神経刺激物質、化学シナプス伝達物質などの化学物質を投与することにより実施される。
あるいは、薬剤は、圧電素子を用いたインクジェット法、精密な圧力ポンプまたはマイクロ流体駆動装置を用いた方法、特開平１０−３３７１７７号公報に開示された方法、エレクトロポレーション法などによっても注入することができる。
例えば、エレクトロポレーション法は、薬剤リザーバーと薬剤注入を注入する標的との間にＤＣパルスを印加して所望の量を注入する方法である。具体的には、流路９に電解質溶液１２を満たし、ウェル１９内の電解質溶液１２中に細胞２１と薬剤とを添加した後、基準電極２と微小電極１との間にＤＣパルスを印加することによって、所望量の薬剤をウェル１９内の細胞２１に注入できる。
本実施形態では、微小電極１は、ウェル１９の壁面に設けられているが、底面に配置されていてもよい。
また、本実施形態では、１つの基準電極２に対して、ウェル１９内に微小電極１が複数個設けられていてもよい。微小電極１が複数個設けられている場合、複数の微小電極１が１つの端子４ａに接続されていてもよいし、複数の微小電極１のそれぞれが、複数の端子に接続されていてもよい。但し、微小電極１が複数個設けられている場合、基準電極２の表面積が、複数の微小電極１の表面積の合計よりも大きいことが好ましい。これは、溶液流れなどの外乱に対する測定の安定性が向上するからである。
ウェル１９内に微小電極１が複数個設けられている場合、細胞２１をそれぞれの微小電極１に固定し、全細胞を同時に測定することも、各細胞を別々に測定することも可能である。特に、生体試料である細胞は必ずしも生きているとは限らない。そこで、本実施形態の測定デバイス１０において、ウェル１９内に微小電極１が１０個設けられている構成であれば、例えば、細胞の生存率が９０％である場合、一度の測定で確率的にほぼ９個の細胞のデータが得られる。従って、測定効率の向上にも効果がある。
本実施形態では、上記コネクタ１３および１４は、接着剤などによって基板１６に接着しているが、これに限定されず、基板１６と一体成形されていてもよい。
基板１６および基板１７として用いられる材料は、単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などに代表される半導体材料、ＳＯＩ（シリコン・オン・インシュレータ）などに代表されるこれら半導体材料の複合素材；ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラスなどの無機材料；ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホンなどの有機材料；ノボラック樹脂をベース樹脂とするノボラック樹脂−ジアゾナフトキノン（ＤＮＱ）系感光材料；ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）およびＰＭＭＡとの共重合体、ポリメチレンスルホン、ポリヘキサフルオロブチルメタクリレート、ポリメチルイソプロペニルケトン（ＰＭＩＰＫ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）；および環化ポリイソプレンをベースポリマーとするアジド化合物、例えば、２−６−ジ（４−ジドベザール）−４−メチルシクロヘキサノンなどから構成される感光材料群；を含むがこれらに限定されない。これらの中では、アモルファスシリコン、単結晶シリコン、またはガラスが基板１６および基板１７として好適に用いられる。
なお、流路９を構成する基板１６の凹部９ａおよび基板１７のウェル１９の表面は、親水性処理が施されていることが好ましい。このことによって、微小な流路９内に液体を流すことができる。
微小電極１および基準電極２は、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステンおよびそれらの化合物などの貴金属電極；およびグラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバーに代表される炭素電極などの電極材料から作製されるが、これらに制限されるわけではない。なお、微小電極１および基準電極２は導電性高分子によって被覆されていてもよい。このことによって安定な固定化電極を作製することができる。また、これらの電極を単分子膜によって被覆することも可能である。
薄膜抵抗体３ａおよび３ｂは、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステン、ニッケル、チタンおよびそれらの化合物などの貴金属；グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバーに代表される炭素；Ｓｉ、Ｇｅ、ＺｎＯ、ＣｄＳ、ＴｉＯ_２、ＧａＡｓ、チタンなどの材料から作製され得るが、これらに制限されるわけではない。なお、上記の微小電極１および基準電極２と同様に、薄膜抵抗体３ａおよび３ｂは、導電性高分子によって被覆されてもよく、これによって安定な薄膜抵抗体を作製することができる。また、この抵抗体は、単分子膜によって被覆することもできる。
本実施形態では、抵抗槽６ａおよび６ｂは、空気が充填されている。しかしながら、空気に限定されず、電解質溶液１２との間で界面張力に変化を生じさせることが可能な気体および液体であれば用いることが可能である。
なお、本実施形態では、薄膜抵抗体３ａおよび３ｂを抵抗槽６ａおよび６ｂに配置しているが、連通管１５ａおよび１５ｂに配置しても、本実施形態の測定デバイス１０を全く同様に動作させることが可能である。また、薄膜抵抗体３ａおよび３ｂは、くし型形状であることが好ましい。このことによって、狭い領域でも第１および第２抵抗体を長さを大きくでき、抵抗値を大きくすることが可能となる。
また、本実施形態では、ポンプ３１および３２を用いているが、これに限られず、ポンプ３１および３２のそれぞれに代えてシリンジを用いてもよい。
（実施形態２）
本実施形態では、上記実施形態１の測定デバイス１０において、測定セル１１に代えて用いることができる測定セル１１’を図を参照しながら説明する。なお、説明の簡素化を図るために、上記実施形態１と共通する構成要素を同一の参照符号で示す。
本実施形態の測定セル１１’は、外観上は上記実施形態１の測定セル１１とほぼ同じである。そこで、本実施形態では、図１に示す測定セル１１を、測定セル１１’と置き換えて説明する。
図７は、図１中に示したＩＩＩ−ＩＩＩ線に沿った断面図である。図８は、図１中に示した矢印Ａから見た測定セル１１’の透視図である。なお、図８中に示すＩＩＩ−ＩＩＩ線に沿った断面図は、図７の断面図に相当する。また、図８では、測定セル１１’のうちの基板１６の図示を省略している。
測定セル１１’は、上記実施形態１の測定セル１１とほぼ同じ構造である。但し、図７および図８に示すように、ウェル１９（すなわち流路９）に接続された連通管１５ｃと、連通管１５ｃに接続されている抵抗槽６ｃと、抵抗槽６ｃ内にそれぞれ配置された薄膜抵抗体３ｃとが設けられている点が異なる。
このため、本実施形態の測定セル１１’では、ウェル１９内において、電解質溶液１２の局所的流れを水平面内で前後左右（つまり、２次元的に完全に自由）に生じさせることができる。従って、本実施形態の測定セル１１’を用いれば、上記実施形態１の測定セル１１を用いるよりも、電解質溶液１２内に含まれる生体試料２１の位置制御を自由に行なうことができる。
さらに、電解質溶液１２内に含まれる生体試料２１の位置制御の自由度が高くなるので、微小電極１をウェル１９内に自由に設けることができる。つまり、ウェル１９内の設計の自由度が向上する。
本実施形態の測定セル１１では、微小電極１に対向してウェル１９（すなわち流路９）に接続された連通管１５ｃと、連通管１５ｃに接続されている抵抗槽６ｃと、抵抗槽６ｃ内にそれぞれ配置された薄膜抵抗体３ｃとが設けられているので、ウェル１９内に生じる電解質溶液１２の局所的流れが微小電極１に向かう方向に生じさせることが可能である。
また、図８に示すように、連通管１５ａおよび連通管１５ｂは、それぞれ流路９（すなわちウェル１９）に対してなす角度をαとすると、角度αは必ず鋭角になるように配置されている。つまり、連通管１５ａに沿って延びる直線と、連通管１５ｂに沿って延びる直線とが微小電極１に向かって開くように、連通管１５ａおよび連通管１５ｂが配置されている。このことによって、ウェル１９内に生じる電解質溶液１２の局所的流れが必ず微小電極１から遠ざかる方向に生じさせることが可能である。
さらに、連通管１５ａおよび１５ｂが、流路９（すなわちウェル１９）を対称軸としてほぼ線対称に配置されている。このため、ウェル１９内に生じる電解質溶液１２の局所的流れを、連通管１５ａと連通管１５ｂとの間で双方向（つまり、微小電極１から見て左右方向）に生じさせることが可能である。
以上の説明からわかるように、本実施形態の測定セル１１’は、図８に示すように、非常に対称性の高い構造を有しているので、抵抗槽６ａ、６ｂおよび６ｃ（あるいは連通管１５ａ、１５ｂおよび１５ｃ）内にある気液界面に働くそれぞれの界面張力の差の計算が単純化される。このため、上記の界面張力の差を容易に調節することができる。
特に、本実施形態の測定セル１１’において、連通管１５ａおよび連通管１５ｂがそれぞれ流路９（すなわちウェル１９）に対してなす角度αは、ほぼ６０°であり、連通管１５ｃが微小電極１に対向して設けられていることが好ましい。このことによって、抵抗槽６ａ、６ｂおよび６ｃ（あるいは連通管１５ａ、１５ｂおよび１５ｃ）内にある気液界面に働くそれぞれの界面張力の差の計算が最も単純化される。このため、上記の界面張力の差を非常に容易に調節することができる。
なお、本実施形態では、互いに異なる３方向に延びる連通管とそれらに接続された各抵抗槽および各抵抗体を設ける構成としているが、さらに上記３方向とは互いに異なる方向に延びる連通管とそれに接続された抵抗槽および抵抗体とを追加して設けてもよい。このことによって、追加した連通管が延びる方向に、生体物質２１を容易に誘導することができる。つまり、生体物質２１を容易に誘導することができる方向が増える。このため、生体物質２１の微小電極１への誘導をより精密に行なうことが可能になる。
（実施形態３）
図９は、本実施形態の測定デバイスの構成を示す図である。
図９に示すように、本実施形態の測定デバイス１０’は、上記実施形態１または２の測定デバイス１０と同様に、測定セル１１または１１’を備える。特に、本実施形態の測定デバイス１０’では、測定セル１１または１１’が複数設けられており、複数の測定セル１１または１１’がマトリクス状に集積化されている。測定セル１１または１１’の構成は、それぞれ上記実施形態１または実施形態２と全く同じである。
各測定セル１１または１１’が備える入口コネクタ１３および出口コネクタ１４は、バルブおよびポンプを備えた流路切替器３８に連結されている。流路切替器３８によって、入口コネクタ１３を出口として、出口コネクタ１４を入口として、交換可能に用いることも可能な構成となっている。
さらに、本実施形態の測定デバイス１０’では、各流路切替器３８に接続された流体駆動装置４１ａおよび４１ｂ、ならびに４２ａおよび４２ｂが設けられている。流体駆動装置４１ａおよび４１ｂ、ならびに４２ａおよび４２ｂとしては、例えば、ポンプ、空気圧縮機、シリンジなどが用いられる。
また、本実施形態の測定デバイス１０’では、電流印加装置１８および測定器３３は、マルチプレクサ３６および３７によりそれぞれスイッチング可能であるように構成されている。電流印加装置１８、測定器３３、マルチプレクサ３６および３７の動作は、電流印加装置１８および測定器３３に接続された計算機３５で制御される。
本実施形態の測定デバイス１０’によれば、同時に複数の測定を行なうことが可能である。
（実施形態４）
本実施形態では、上記実施形態１の測定デバイス１０を用いて行なう測定方法を図１０を参照しながら説明する。図１０は、本実施形態の測定方法を表すフローチャートである。
まず、図１０に示すように、ステップＳｔ１において、上記実施形態１で述べた層流を利用する方法でウェル１９内に細胞２１を導入し、細胞２１の位置を制御して微小電極１１に固定した後、細胞内電位を測定する。
次に、図１０に示すように、ステップＳｔ２において、バルブＶを切り替えて入口コネクタ１３から刺激剤溶液を流路９に注入する。刺激剤がウェル１９上に到達したときに、刺激剤溶液の注入を停止し、流路９内の液体の流れを止める。このことによって、刺激剤はウェル１９内に拡散し、微小電極１１に固定された細胞２１が刺激される。
次に、図１０に示すように、ステップＳｔ３において、再度、細胞内電位を測定する。
次に、図１０に示すように、ステップＳｔ４において、ウェル１９内を洗浄する。具体的には、バルブＶを切り替えて入口コネクタ１３から洗浄液を流路９に注入し、洗浄液がウェル１９上に到達したときに、洗浄液の注入を停止する。このことによって、洗浄液がウェル１９内に拡散する。続いて、洗浄液を出口コネクタ１４から排出する。特に本ステップでは、洗浄液の注入および排出の操作を繰り返す。このことによって、ウェル１９内が洗浄される。
次に、図１０に示すように、ステップＳｔ１〜４を、刺激剤溶液における刺激剤の濃度を順次増大させながら繰り返す。このことによって、刺激剤の濃度と細胞内電位との相関関係を調査することができる。
また、上記ステップＳｔ２の前に、予め拮抗剤を、刺激剤と同様の手順でウェル１９内に導入しておくことによって、拮抗剤と細胞内電位との相関関係を調査することも可能である。
以下に、本発明の実施例を説明する。以下に述べる実施例は、本発明の例示であり、本発明を制限するものではない。
―実施例―
ここでは、上記実施形態１の測定デバイス１０を用いて、生体試料として単離細胞を測定する場合の実施例について説明する。
（実施例１）
測定デバイスの製作
基板１６の材料として２ｍｍ厚のガラス板を用いた。幅６０ｍｍ×長さ１００ｍｍのガラス板の表面に、φ１００μｍのエンドミルを使い、幅１５０μｍ、長さ３ｍｍ、深さ７０μｍの凹部９ａを形成した。その後、凹部９ａを丹念に研磨した。凹部９ａの両端に入口および出口となる直径１．５ｍｍの貫通穴をあけた。
基板１７の材料として単結晶シリコンウェハを用いた。基板１７の表面に、フォトリソグラフィーおよび異方性エッチングを用い、幅１５０μｍ、長さ５００μｍ、深さ３０μｍの逆台形型のウェル１９、幅４００μｍ、長さ１０００μｍ、深さ３０μｍの逆台形型の抵抗槽６ａおよび６ｂ、幅１０μｍ、長さ５００μｍ、深さ７．１μｍの逆三角柱型の連通管１５ａおよび１５ｂを形成した。具体的な製作工程は以下に述べるとおりである。
単結晶シリコンウェハを１２０℃で２０分間ベイクした後、十分脱水し、その表面にフォトレジストを１０００ｒｐｍで５秒間スピンコートして成膜した。その後、この基板を９０℃で１０分間プリベイクし、ウェルを露光によりマスクパターンし、専用現像液を用いて現像および洗浄し、ウエットエッチングによりウェル１９および抵抗槽６ａおよび６ｂおよび連通管１５ａおよび１５ｂを完成した。ここでは、２４ｗｔ％ＫＯＨ、および界面活性剤であるＩＰＡ（イソプロピルアルコール）の混合溶液をエッチャントとして用いた。この混合溶液を、循環ポンプを用いて循環し、そして溶液温度を７３℃３℃に制御した状態で３５分エッチングを行った。
微小電極１は、単結晶シリコンを材料とし、円形エッチングマスク直下でアンダーエッチングして作製した。微小電極は、先端が尖った略円錐形状となり、その外周面が凹み方向へ湾曲し、先端近傍径がほぼ１μｍ、底面部の直径がほぼ１６μｍ、高さほぼ８μｍであった。その後、微小電極表面を、タングステンをスパッタにて成膜した後、先端部を残して、ポリイミドで絶縁被覆した。
その後、基板１７に、薄膜抵抗体３ａおよび３ｂ、ならびにその引出し配線、基準電極２およびその引出し配線、ならびに微小電極１からの引出し配線を製作した。簡単に述べれば、基板１７に真空蒸着法により０．５μｍ厚の白金膜を形成した。その後、フォトリソグラフィーによって、白金膜のうち、上記の電極、抵抗体および配線以外の部分を除去した。なお、配線は８０μｍ幅、薄膜抵抗体３ａおよび３ｂは２５μｍ幅を有するくし型形状とした。
ここで、基板１６と基板１７とを陽極接合により接合し、閉じた流路９を形成した。陽極接合は、４００〜６００℃、６００Ｖの直流電圧を１０分間印加する条件で行った。その後、入口コネクタ１３および出口コネクタ１４を、基板１６の凹部９ａの両端に形成した貫通穴に接続した。次いで、流路９の出口に接続されたコネクタに、３方コックおよびフィッティングジョイントを介してコンプレッサーを接続した。
（実施例２）
神経細胞の活動電位の測定
測定デバイス１０の流路９の出口コネクタ１４側を、大気圧よりわずかに低い圧力になるように減圧し、入口コネクタ１３に連結されたペレスタティックポンプを用い、モノアラガイ用培地（４０ｍＭ ＮａＣｌ、１．７ｍＭ ＫＣｌ、４．１ｍＭ ＣａＣｌ_２、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５ｍＭ グルコース、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９）を、入口コネクタ１３から１０μｌ／分〜１００μｌ／分の流速で流路９に注入した。このとき、連通管１５ａおよび１５ｂを通って抵抗槽６ａおよび６ｂ内に培地が入っていくのが観測された。
ここで、モノアラガイ用培地が出口コネクタ１４まで注入されたことを確認した後、出口コネクタ１４側からの減圧操作を止め、三方コックを解放し出口コネクタ１４側を大気圧に戻した。このとき、連通管１５ａおよび１５ｂにはさらに培地が流れ込み、連通管１５ａおよび１５ｂと抵抗槽６ａおよび６ｂとの接続部位に気液界面が位置するようになった。
モノアラガイより摘出した神経節を、１ｍｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅａｓｅ Ｔｙｐｅ１４（ＳＩＧＭＡ、Ｐ−５１４７）溶液中で３７℃２５分間振とうし、神経細胞を単離させた。得られたモノアラガイ神経細胞を、モノアラガイ用培地に懸濁し、入口コネクタ１３から注意深く流路９に導入した。そして、顕微鏡下で流路９を観察し、モノアラガイ神経細胞がウェル１９の上方に到達した瞬間に、入口コネクタ１３および出口コネクタ１４に連結されたバルブＶを閉めたところ、神経細胞がウェル１９内に導入されたことを確認した。
次いで、薄膜抵抗体３ａおよび３ｂに、１０ｍＡｐ−ｐ（ミリアンペア ピーク トウ ピーク）を３０秒間印加したところ、神経細胞はウェル１９内を移動して微小電極１に突き刺さった。ここで、微小電極１に１０ｎＡｐ−ｐで１ミリ秒間矩形波電流刺激パルスを印加し、膜電流固定法により細胞内電位を測定した。細胞内電位は、３１０ミリ秒を１区間として６０回分、サンプリング周波数５０ｋＨｚで記録した。
次に、電流刺激を、８ｎＡｐ−ｐ、１ミリ秒の矩形波電流刺激を印加することにより測定を行った。３回の測定結果を図１１に示す。なお、本実施例の測定は全て、ブリッジバランスを取り、デバイス容量の補正を施した。また、測定データは、５ｋＨｚ四次バタワース型ローパスフィルタを通した後、計算機に取り込まれようにした。
図１１に示すように、１５０ミリ秒から２５０ミリ秒の間に電流刺激による細胞の電位応答が観測され、従来の細胞内記録法によるものと同様に神経細胞の活動電位が検出されることが示された。
（実施例３）
生体試料２１としてラット動脈由来の平滑筋（ＳＭ）を用いた。測定デバイス１０内に注入する溶液として、１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）を添加したＤＭＥＭ培地を使用した。実施例２と同様の操作を行うことによって平滑筋細胞を微小電極１に刺し、アセチルコリンのアナログである、Ｃａｒｂａｃｈｏｌを１００μＭの濃度の溶液として導入したときの、膜電流固定法による細胞内電位を測定した。
Ｃａｒｂａｃｈｏｌを投与したときに計測された自発性の活動電位を測定した結果を図１２に示す。図１２に示されるように、Ｃａｒｂａｃｈｏｌに応答する活動電位が検出された。これは、従来の細胞内記録法によるものと同様の測定結果である。
さらに、図１３に、細胞内記録法によるデータに、信号処理を加えたときの１０ミリ秒毎の標準偏差値のヒストグラムを示す。図１３はＣａｒｂａｃｈｏｌ投与前後の１０ミリ秒毎の標準偏差値のヒストグラムである。Ｃａｒｂａｃｈｏｌ投与前後のヒストグラムを正規分布により近似して求めたグラフの平均値および半値幅は、投与前では０．１８５および０．０４、投与後では０．５４５および０．２１であり、Ｃａｒｂａｃｈｏｌ投与前後で、１０ミリ秒毎の偏差値の平均値が増加していることがわかる。これはＣａｒｂａｃｈｏｌを投与することによって、モノアラガイ神経細胞のイオンチャンネルが活性化され、その活性化されたチャンネルの開閉によるコンダクタンスの変動が電圧変化として表されているためである。図１３から、測定デバイス１０は、従来の細胞内記録法によるものと同様に、神経刺激物質に対するイオンチャネル特性が決定できることがわかった。
このように、測定デバイス１０では、従来の細胞内記録を行わなずに、イオンチャンネル活性度抽出方法により、簡便にチャンネルの開閉に伴う細胞活動を測定することができる。従って、測定デバイス１０を用いて、細胞への薬物投与の前後またはその投与量に対するチャンネル活性度の絶対値やチャンネル活性度の増減を比較することによって、細胞チャンネル活性度の測定や、薬物の作用効果の定性的または定量的な分類を行うことが可能となる。
以上に述べた実施例２および３の結果から、測定デバイス１０は、微小電極１に誘導された細胞２１から、細胞膜電位および一過性の活動電位を微小電極１によって高感度に取得することが可能であることがわかる。
以上に説明したように、本発明によれば、簡易で、正確、高速かつ自動的に、生体試料の電気生理学的評価を行なうことが可能な測定デバイスが提供される。
産業上の利用可能性
本発明の測定デバイスおよび測定方法は、薬品スクリーニング等に代表される生体試料の電気生理学的評価を行なうために利用される。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施形態１の測定デバイスの構成を示す図である。
図２は、図１中に示したＩＩＩ−ＩＩＩ線に沿った断面図である。
図３は、図１中に示した矢印Ａから見た測定セルの透視図である。
図４（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、実施形態１の測定デバイスの動作を模式的に示す図である。
図５は、図１中に示した矢印Ａから見た測定セルの透視図である。
図６（ａ）および（ｂ）は、細胞を電極に導く原理の概略を示す模式図である。
図７は、実施形態２の測定デバイスの構成を示す図である。
図８は、図１中に示したＩＩＩ−ＩＩＩ線に沿った断面図である。
図９は、図１中に示した矢印Ａから見た測定セルの透視図である。
図１０は、実施形態４の測定方法を表すフローチャートである。
図１１は、実施形態１の測定デバイスを用いて測定した、電流刺激印加時のモノアラガイ神経細胞の活動電位を示す図である。
図１２は、実施形態１の測定デバイスを用いて測定した、カルバコール滴下時の平滑筋細胞の活動電位を示す図である。
図１３は、実施形態１の測定デバイスを用いて測定した、カルバコール滴下前後の平滑筋細胞の活動電位を、１０ミリ秒毎の標準偏差値のヒストグラム表示した図である。

Claims (18)

1. 生体試料が発する電気信号を測定するための測定デバイスであって、
   第１の方向に延びる流路と、
   上記流路の両端に連結された１対の導入口と、
   上記流路内に設けられた凹形状のウェルと、
   上記流路内に設けられた基準電極と、
   上記ウェル内に設けられた少なくとも１つの微小電極と、
   上記ウェルに連結されており、上記第１の方向と異なる第２の方向に延びる第１連通管と、
   上記ウェルのうちの、上記第１連通管と異なる部分に連結されており、上記第１の方向および第２の方向のいずれとも異なる第３の方向に延びる第２連通管と、
   上記第１および第２連通管のそれぞれに接続された第１および第２抵抗槽と、
   上記第１および第２連通管または上記第１および第２抵抗槽に配置された第１および第２抵抗体とを備える測定デバイス。
2. 請求項１に記載の測定デバイスにおいて、
   上記第１連通管と上記第２連通管とは、上記流路を対称軸として線対称に配置されていることを特徴とする測定デバイス。
3. 請求項１に記載の測定デバイスにおいて、
   上記第１連通管および上記第２連通管は、上記第１連通管に沿って延びる直線と、上記第２連通管に沿って延びる直線とが上記少なくとも１つの微小電極に向かって交差するように配置されていることを特徴とする測定デバイス。
4. 請求項１に記載の測定デバイスにおいて、
   上記少なくとも１つの微小電極は、突起状の先端部を有することを特徴とする測定デバイス。
5. 請求項１に記載の測定デバイスにおいて、
   上記少なくとも１つの微小電極は、複数の微小電極であることを特徴とする測定デバイス。
6. 請求項５に記載の測定デバイスにおいて、
   上記基準電極の表面積は、上記複数の微小電極の表面積の合計よりも大きいことを特徴とする測定デバイス。
7. 請求項１に記載の測定デバイスにおいて、
   第１基板と、上記第１基板上に設けられた第２基板とをさらに備え、
   上記第１基板は、上記ウェルと、上記基準電極と、上記微小電極と、上記第１および第２連通管と、第１および第２抵抗槽と、第１および第２抵抗体とを有し、
   上記第２基板は、上記第１基板上に設けられた状態で上記流路となる、上記第１の方向に延びる凹部と、上記第１基板上に設けられた状態で上記１対の導入口となる、上記凹部の両端に形成された空洞とを有することを特徴とする測定デバイス。
8. 請求項７に記載の測定デバイスにおいて、
   上記第２基板は、透明の材料から形成されていることを特徴とする測定デバイス。
9. 請求項７に記載の測定デバイスにおいて、
   上記第１基板は、半導体材料から形成されていることを特徴とする測定デバイス。
10. 請求項１に記載の測定デバイスにおいて、
    上記第１連通管の体積は、上記第１抵抗槽の体積の１／５未満であり、
    上記第２連通管の体積は、上記第２抵抗槽の体積の１／５未満であることを特徴とする測定デバイス。
11. 請求項１に記載の測定デバイスにおいて、
    上記流路の表面は、親水性処理が施されていることを特徴とする測定デバイス。
12. 請求項１に記載の測定デバイスにおいて、
    上記第１および第２抵抗体は、くし型形状であることを特徴とする測定デバイス。
13. 請求項３に記載の測定デバイスにおいて、
    上記ウェルのうちの、上記第１および第２連通管と異なる部分に連結されており、上記第２の方向および上記第３の方向のいずれとも異なる第４の方向に延びる第３連通管と、
    上記第３連通管に接続された第３抵抗槽と、
    上記第３連通管または上記第３抵抗槽に配置された第３抵抗体とをさらに備えることを特徴とする測定デバイス。
14. 請求項１３に記載の測定デバイスにおいて、
    上記第１連通管および上記第２連通管は、上記第１連通管に沿って延びる直線と、上記第２連通管に沿って延びる直線とが上記少なくとも１つの微小電極に向かって開くように配置されており、
    上記第３連通管は、上記少なくとも１つの微小電極の先端部が上記第３連通管に沿って延びる直線上に実質的に位置するように配置されていることを特徴とする測定デバイス。
15. 請求項１に記載の測定デバイスにおいて、
    上記第１の方向に延びるもう１つの流路と、
    上記もう１つの流路の両端に連結されたもう１対の導入口と、
    上記もう１つの流路内に設けられた凹形状のもう１つのウェルと、
    上記もう１つの流路内に設けられたもう１つの基準電極と、
    上記もう１つのウェル内に設けられた少なくとも１つのもう１つの微小電極と、
    上記もう１つのウェルに連結されており、上記第１の方向と異なる第２の方向に延びるもう１つの第１連通管と、
    上記もう１つのウェルのうちの、上記もう１つの第１連通管と異なる部分に連結されており、上記第１の方向および第２の方向のいずれとも異なる第３の方向に延びるもう１つの第２連通管と、
    上記もう１つの第１および第２連通管のそれぞれに接続されたもう１つの第１および第２抵抗槽と、
    上記もう１つの第１および第２連通管または上記もう１つの第１および第２抵抗槽に配置されたもう１つの第１および第２抵抗体とをさらに備えることを特徴とする測定デバイス。
16. 生体試料が発する電気信号を測定する測定方法であって、
    第１の方向に延びる流路と、上記流路の両端に連結された１対の導入口と、上記流路内に設けられた凹形状のウェルと、上記流路内に設けられた基準電極と、上記ウェル内に設けられた少なくとも１つの微小電極と、上記ウェルに連結されており、上記第１の方向と異なる第２の方向に延びる第１連通管と、上記ウェルのうちの、上記第１連通管と異なる部分に連結されており、上記第１の方向および第２の方向のいずれとも異なる第３の方向に延びる第２連通管と、上記第１および第２連通管のそれぞれに接続された第１および第２抵抗槽と、上記第１および第２連通管または上記第１および第２抵抗槽に配置された第１および第２抵抗体とを備える測定デバイスを用意する工程（ａ）と、
    上記流路内の圧力を低減することによって上記流路に電解質溶液を導入して充填する工程（ｂ）と、
    上記流路内の圧力を大気圧に戻す工程（ｃ）と、
    上記ウェル内に生体試料を配置する工程（ｄ）と、
    上記流路を密閉する工程（ｅ）と、
    上記第１抵抗体または第２抵抗体に電流を印加することによって、上記少なくとも１つの微小電極に上記生体試料を接触させる工程（ｆ）と、
    上記生体試料が発する電気信号の変化を測定する工程（ｇ）と、
    を含む測定方法。
17. 請求項１６に記載の測定方法において、
    上記工程（ｆ）の後に、上記少なくとも１つの微小電極に電気パルスを印加する工程（ｈ）をさらに含むことを特徴とする測定方法。
18. 請求項１６または１７に記載の測定方法において、
    上記１対の導入口のいずれか一方から薬剤を投入する工程（ｉ）をさらに含むことを特徴とする測定方法。

Images