JPWO2003008620A1 - 無細胞系蛋白質合成用化学反応回路 - Google Patents
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Abstract
蛋白質の合成を行うための化学反応回路として、マイクロチップ上に、少なくとも、蛋白質合成用試薬および／または生成物検出試薬を貯蔵するための１以上の試薬貯蔵槽と、試薬の逆流を防ぐ一方向バルブと、該一方向バルブを介して前記試薬貯蔵槽に連結された反応槽を有してなることを特徴とする無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を提供し、無細胞系蛋白質合成を可能とするマイクロリアクターとする。
Description
技術分野
この出願の発明は、蛋白質の無細胞系合成を行うための小型システムとして有用な無細胞系蛋白質合成用化学反応回路に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、微少量の試薬を用いて蛋白質の無細胞系合成を行うことを可能とする無細胞系蛋白質合成用化学反応回路に関するものである。
背景技術
近年、化学実験の高速化、高効率化、および集積化、あるいは、分析機器の超小型化を目指し、反応、分離、抽出、検出などの基本化学操作を行うための化学反応回路を内部に有する「化学ＩＣ」が盛んに研究されている。
化学ＩＣは、少量の試料で測定、分析が可能なこと、持ち運びが可能となること、低コストが実現されること、使い捨てが可能なことなど、従来のデバイスに比べて、優れている面が多々あり、とくに高価な試薬を使用する実験系や物質のスクリーニング操作において有用性が高い。そこで、これまで基板上への様々な構造体の導入方法が検討されてきた。
例えば、半導体産業における微細加工技術を用いてシリコンやガラス基板上に電極や流路などを作製する方法が実用化されている。具体的には、液体クロマトグラフィーの電気化学検出器や医療現場における小型の電気化学センサーなどに用いられるマイクロ電極がフォトリソグラフィーやエッチング技術を用いて製造されている。
しかし、このような従来のフォトリソグラフィーやエッチング技術に基づいた方法で得られる化学ＩＣは、基板にシリコンやガラスを使用するため、分析機器や化学反応回路として利用する場合には、様々な問題を抱えていた。例えば、シリコンウェハーは不透明であるため、化学の分野で頻繁に行われる透過光による検出ができない、割れやすいなどの欠点があった。また、これらの方法による化学ＩＣの製造は、クリーンルーム内での作業等、特異な装置や設備を要し、得られる製品は、例えば、ガラス基板上のマイクロ電極では１枚数万円と極めて高価になってしまう。したがって、低コスト、使い捨て用途などが期待されていたものの、実際には一般的な化学実験においての使用は現実的ではなかったのが実情である。
さらに、フォトリソグラフィーやエッチング技術によりチャンネルを形成する化学ＩＣの製造方法では、実際には複雑な三次元構造の形成が不可能であり、バルブ、ポンプ、反応槽、濃縮器等を化学ＩＣ上に形成することはできなかった。また、フォトリソグラフィーやエッチングの技術では、高温処理や薬品処理が必要となるため、生物化学的実験に用いられるような化学ＩＣの形成には不向きであるという問題もあった。
発明者らは、これまでに、三次元微細構造物を高精度で製造する方法として、透明な板に注入された液状の光硬化性樹脂に光を照射し、光硬化性樹脂を硬化させる方法（光造形ファブリケーション法）を実現している（日本機械学会発行「ロボテイクス・メカトロニクス講演会講演論文集」ｐｐ．５４５−５４６（１９９２）；日本ロボット学会発行「日本ロボット学会学術講演会」ｐｐ．１２１３−１２１６（１９９２）；Ｐｒｏｃ．ｏｆ ＩＥＥＥ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ Ｍｉｃｒｏ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＥＭＳ’９３），ｐｐ．４２−４７（１９９３）；特開平７−３２９１８８他）。さらに、光造形ファブリケーション法を用いて限外ろ過膜、ＳＭＡアクチュエーター等の金属あるいは樹脂製マイクロ部品を内部に組み込むハイブリッドマイクロ光造形法と、このような方法で形成された精巧な反応槽、濃縮器、マイクロポンプ、切り替えバルブ等の様々な機能を有する化学ＩＣ状の化学集積回路を報告している（Ｐｒｏｃ．ｏｆ ＩＥＥＥ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｍｉｃｒｏ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＥＭＳ’９４），ｐｐ．１−６（１９９４）；Ｐｒｏｃ．ｏｆ ＩＥＥＥ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｍｉｃｒｏ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＥＭＳ’９９），ｐｐ．３７６−３８１（１９９９））。
一方、ヒトゲノム計画等に基づくゲノムの解析によって膨大な遺伝子情報が明らかにされており、遺伝子の機能を解析、解明していくことがこの分野の新たな課題となっている。そして、遺伝子の機能解明のために、遺伝子発現の研究がますます注目されている。
遺伝子発現は、ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡにより、細胞中に存在するリボソームを介して蛋白質に翻訳されることで行われる。したがって、遺伝子発現の研究では、一般に、大腸菌やバクテリア等の生きた細胞を用いる有細胞蛋白質合成法が用いられる。しかし、生細胞中では、細胞自身による様々な自己防衛機構が作用する上、遺伝子を導入した蛋白質を培養した後に細胞を破砕し、目的の蛋白質を分離精製する必要があるため、合成操作が煩雑である等の多くの制約を受ける。
そこで、細胞外で蛋白質合成を行う無細胞系蛋白質合成法が一般に知られている。このような方法では、小麦胚芽や大腸菌の細胞抽出液を用い、アミノ酸、ＡＴＰ等のエネルギー物質やＤＮＡを加えることで、細胞の防衛機構による制約を受けず、また蛋白質の分離精製を大幅に簡略化することができる。しかし、このような無細胞系蛋白質合成法は、バッチ式で行った場合には、反応が約２時間で停止するため、使用される試薬の量に対して得られる蛋白質量が少ないという問題があった。
このような問題に対し、Ｓｐｉｒｉｎらは、無細胞系蛋白質合成法を提案した（Ａ．Ｓ．Ｓｐｉｒｉｎ，Ｖ．Ｉ．Ｂａｒａｎｏｖ，Ｌ．Ａ．Ｒｙａｂｏｖａ，Ｓ．Ｙ．Ｏｖｏｄｏｖ ａｎｄ Ｙ．Ｂ．Ａｌａｋｈｏｖ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２，１１６２−１１６４（１９８８））。この方法では、合成に必要なアミノ酸、ＡＴＰ等を連続的に供給することで、合成反応を数十時間継続することができる。その結果、合成蛋白質量がバッチ式の数倍〜数十倍となるという利点があった。
このような連続無細胞系蛋白質合成に代表される種々の無細胞系蛋白質合成用システムを小型化できれば、蛋白質合成に用いられる試薬を少量用いて遺伝子発現試験を行うことが可能となり、コストを削減することができるため、ポストゲノム研究用の実験装置として有用である。また、多品種少量生産が不可欠であるオーダーメード医療や体内埋め込みデバイスなど多方向への応用も期待される。
そこでこの出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、無細胞系蛋白質合成を可能とするマイクロリアクターを提供することを課題としている。
発明の開示
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、第１には、蛋白質合成を行うための化学反応回路であって、同一のマイクロチップ上に少なくとも、
蛋白質合成用試薬および／または生成物検出試薬を貯蔵するための１以上の試薬貯蔵槽と、
試薬の逆流を防ぐ一方向バルブと、
該一方向バルブを介して前記試薬貯蔵槽に連結された反応槽
を有してなることを特徴とする無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を提供する。
第２には、この出願の発明は、蛋白質合成を行うための化学反応回路であって、２以上の連結可能なマイクロチップ上に少なくとも、
蛋白質合成用試薬および／または生成物検出試薬を貯蔵するための１以上の試薬貯蔵槽と、
試薬の逆流を防ぐ一方向バルブと、
該一方向バルブを介して前記試薬貯蔵槽に連結された反応槽
を有してなることを特徴とする無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を提供する。
この出願の発明は、第３には、試薬貯蔵槽、一方向バルブおよび反応槽がハイブリッドマイクロ光造形法により製造される前記いずれかの無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を提供する。
さらに、この出願の発明は、第４には、該反応槽において生成した蛋白質を分離するための分離手段と、該分離手段により分離された蛋白質を貯蔵するための生成物貯蔵槽を有する前記いずれかの無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を提供する。
第５には、この出願の発明は、試薬貯蔵槽、一方向バルブ、反応槽、分離手段および生成物貯蔵槽がハイブリッドマイクロ光造形法により製造される無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を提供する。
また、第６には、この出願の発明は、分離手段が限外ろ過膜である無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を提供する。
この出願の発明は、さらに、第７には、分離された蛋白質を検出するための検出センサーを有する無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を提供する。
第８には、この出願の発明は、試薬貯蔵槽、一方向バルブ、反応槽、分離手段、生成物貯蔵槽、および検出センサーがハイブリッドマイクロ光造形法により製造される無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を提供する。
この出願の発明は、第９には、少なくとも、
試薬貯蔵槽を有するチップと、
一方向バルブを有するチップと、
反応槽と限外ろ過膜を介して該反応槽に連結した生成物貯蔵槽を有するチップと、
検出センサーを有するチップを連結し得られる無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を提供する。
そして、この出願の発明は、第１０には、外部装置と接続するためのコネクター部位を有する前記いずれかの無細胞系蛋白質合成用化学反応回路をも提供する。
この出願の発明は、さらに、第１１には、前記第１ないし１０のいずれかの発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路において、少なくとも、第１試薬貯蔵槽に導入された反応試薬Ａと第２試薬貯蔵槽に導入された反応試薬Ｂを反応槽中で反応させる工程を有することを特徴とする無細胞系蛋白質合成方法を、第１２には、反応試薬Ａが少なくともアミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰおよびＤＮＡを含有し、反応試薬Ｂが少なくとも細胞抽出液を含有する前記の無細胞蛋白質合成方法を提供する。
この出願の発明は、第１３には、反応槽中で生成した蛋白質をさらに分離手段により分離する工程を有する前記の無細胞蛋白質合成方法を提供する。
この出願の発明は、第１４には、分離手段により分離精製された蛋白質が検出センサーにより検出・確認される前記の無細胞蛋白質合成方法を、第１５には、蛋白質の検出・確認が第３貯蔵槽に導入された蛋白質検出試薬を該生成物貯蔵槽に供給して行われる前記の無細胞蛋白質合成方法を提供する。
この出願の発明は、第１６には、前記のいずれかの無細胞系蛋白質合成用化学反応回路において、
第１試薬貯蔵槽に少なくともアミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰ、およびＤＮＡを含有する反応試薬Ａを導入し、
第２試薬貯蔵槽に少なくとも細胞抽出液を含有する反応試薬Ｂを導入し、
反応槽に反応試薬Ａおよび反応試薬Ｂを供給して反応させ、
さらに反応試薬Ａを反応槽に供給し、
生成する蛋白質を限外ろ過膜により分離する
ことを特徴とする無細胞系蛋白質合成方法を提供する。
さらに、第１７には、この出願の発明は、生成した蛋白質が、限外ろ過膜を透過した後、生成物貯蔵槽に貯蔵され、第３貯蔵槽に導入された蛋白質検出試薬を該生成物貯蔵槽に供給して、検出センサーにより検出・確認される無細胞系蛋白質合成方法を提供する。
そして、この出願の発明は、第１８には、試薬の供給がコネクター部位に連結された送液手段により行われる無細胞系蛋白質合成方法を、第１９には、送液手段がポンプである無細胞系蛋白質合成方法をも提供する。
発明を実施するための最良の形態
この出願の発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路は、マイクロチップ上に、少なくとも、
（ａ）蛋白質合成用試薬および／または生成物検出試薬を貯蔵するための１以上の試薬貯蔵槽と、
（ｂ）試薬の逆流を防ぐ一方向バルブと、
（ｃ）該一方向バルブを介して前記試薬貯蔵槽に連結された反応槽
を有してなるものである。このような無細胞系蛋白質合成用化学反応回路は、以上（ａ）〜（ｃ）の各部位を有していれば良く、その具体的な配置、形状、大きさ、材質はとくに限定されない。これらの（ａ）〜（ｃ）の各部位は、同一のマイクロチップ上に形成されていてもよいし、別々のマイクロチップに形成されていてもよい。例えば、試薬貯蔵槽と一方向バルブを有する第１のマイクロチップと反応槽を有する第２のマイクロチップが連結されてなるものであってよい。
また、この出願の発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路は、さらに
（ｄ）生成した蛋白質を分離するための分離手段と、
（ｅ）該分離手段により分離された蛋白質を貯蔵するための生成物貯蔵槽
を有するものであってもよい。これら（ｄ）および（ｅ）の各部位も（ａ）〜（ｃ）の部位と同様に同一のマイクロチップ上に形成、配置されていてもよいし、複数のマイクロチップ上に形成され、連結されて無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を構成していてもよい。
このとき、分離手段としては、電気泳動、ゲルカラム、ろ紙、限外ろ過膜等、各種のものが例示される。中でも限外ろ過膜は、分離範囲に応じて適宜膜種を選択でき、マイクロチップへの埋め込みも比較的容易であることから好ましい。
この出願の発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路は、また、
（ｆ）分離された蛋白質を検出するための検出センサー
を有するものであってもよい。このような検出センサーも、前記（ａ）〜（ｅ）の各部位と同一のマイクロチップ上に形成、配置されいてもよいし、別個のマイクロチップ上に形成されていてもよい。
以上のとおりのこの出願の発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路は、どのように形成されるものであってもよく、従来公知の半導体微細加工技術等により設計、加工、形成できる。好ましくは、（ａ）〜（ｆ）の各部位は、前記のとおり発明者らによって開発されたハイブリッドマイクロ光造形法によって三次元成形されたものとする。
ハイブリッドマイクロ光造形法では、液状の光重合高分子を枠に注入し、光を照射することにより照射部位の高分子を硬化させて三次元構造を形成する。具体的には、まず、３Ｄ−ＣＡＤシステムによって所望の立体形状を設計したデータをコンピュータにより高さ方向に等間隔の水平面で切断し、スライス図形のデータ群を作成し、このスライス図形データの最下端のものを取り出し、図１（ａ）に示されるように、このスライス形状に沿ってレーザービーム等の光（１００）をＸ、Ｙ方向に移動させながらガラス等の透明枠（１１０）中に規制された液状光硬化性樹脂（１１１）の液面に照射して、前記スライス図形に対応した形状を有する高さｄの平板状の樹脂板を成形し第１層目とする。次に図１（ｂ）に示されるように、硬化した第１層目の樹脂板上に透明枠（１１０）を設置し、液状光硬化性樹脂（１１１）を厚さｄとなるように注入し、第２層目のスライス図形データの形状に沿って光（１００）を前記同様に移動させ、樹脂を硬化させる。このとき、中空としたい中空部位（１１２）については、残存した液状光硬化性樹脂を溶剤等で洗浄すればよい。以上の操作を繰り返すことにより、所望の立体形状をした成形物が得られるのである（ｃ）。また、このとき、液状光硬化性樹脂（１１１）中に限外ろ過膜（１１３）等の部材を設置してから樹脂を硬化させることにより、濃縮器やバルブ等の複雑な機能を有する三次元構造体を成形することもできる（特開平７−３２９１８８）。
すなわち、この出願の発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路は、その主要部位の材質が光硬化性樹脂であるものとすることが好ましい。このような光硬化性樹脂は、とくに限定されないが、ポリエステルアクリレート、ポリウレタンアクリレート、ノボラック型エポキシ樹脂、ビスフェノール型エポキシ樹脂等が例示される。また、これらの光硬化性樹脂には、光開始剤としてアセトフェノン系、ベンゾイル系、ベンジルケタール系、あるいはケトン系の開始剤を添加してもよい。また、この無細胞系蛋白質合成用化学反応回路において合成される蛋白質を種々の光学的検出方法により検出することを考慮して、光硬化性樹脂は、光透過性の高いものとすることが好ましい。
もちろん、本願発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路において、各三次元構造体は以上のとおりのハイブリッドマイクロ光造形法のみならず、その改良法等の公知あるいは新規の造形法で形成されるものであってもよい。
そして、以上のとおりの方法で成形される各種三次元構造体は、同一のチップ上に立体成型され、一枚のマイクロチップで本願発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路が構成されてもよいし、各種三次元構造体を有するチップを組み合わせることによって本願発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路が構成されてもよい。
図２にこの出願の発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を例示し、その構成を説明する。すなわち、図２に示されるこの発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路の一例では、蛋白質合成用試薬および／または生成物検出試薬を貯蔵するための試薬貯蔵槽（１）を有するリザーバーチップ（１’）と、一方向バルブ（２）を有するバルブチップ（２’）と、反応槽（３１）と分離手段としての限外ろ過膜（４）を介して下流側に該反応槽に連結した生成物貯蔵槽（３２）を有するリアクターチップ（３’）と、検出センサー（５）を有するセンサーチップ（５’）を結合して構成される。
また、このような無細胞系蛋白質合成用化学反応回路は、各貯蔵層および／または反応槽に各試薬を供給するための送液手段（８）に結合するためのコネクター部位（６）を有するコネクターチップ（６’）を有していることが好ましい。
さらに、これらのチップは、順に積層され、ホルダーユニット（９）により結合一体化されれば、無細胞系蛋白質合成用化学反応回路となる。
もちろん、この出願の発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路は、図２に例示されるものに限定されず、試薬貯蔵槽（１）、一方向バルブ（２）、反応槽（３１）、限外ろ過膜（４）を介して下流側に該反応槽に連結した生成物貯蔵槽（３２）、および検出センサー（５）等が形成された一つのチップとして構成されるものであってもよい。この出願の発明者らによって報告された前記のハイブリッドマイクロ光造形法を適用すれば、このような一体型の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路が形成できる。
以上のとおりの無細胞系蛋白質合成用化学反応回路において、その大きさは、とくに限定されない。しかし、マイクロリアクターとして使用することを考慮すれば、バルブの開閉、液流、あるいは反応を阻害しない範囲でより微細なものとすることが好ましい。例えば各チップの厚さを５ｍｍ以下とし、無細胞系蛋白質合成用化学反応回路の高さを３ｃｍ未満とすることができる。もちろん、用途に応じてより小さく、あるいは大きくしてもよい。
この出願の発明は、さらに、以上のとおりの無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を用いて、細胞の自己防御機能の影響を受けることなく、蛋白質を合成する方法をも提供する。具体的には、第１試薬貯蔵槽（１１）に少なくともアミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰ、およびＤＮＡを含有する反応試薬Ａを導入し、第２試薬貯蔵槽（１２）に少なくとも細胞抽出液を含有する反応試薬Ｂを導入し、限外ろ過膜（４）を有する反応槽（３１）に反応試薬Ａおよび反応試薬Ｂを供給して反応させ、さらに反応試薬Ａを反応槽（３１）に供給して蛋白質合成を連続的に行う方法が例示される。
このとき生成する蛋白質は、限外ろ過膜（４）により分離され、限外ろ過膜（４）を介して下流側に連結した生成物貯蔵槽（３２）に貯蔵される。そして、この生成物貯蔵層（３２）には、第３貯蔵槽（１３）に導入された蛋白質検出試薬を供給することにより、検出センサー（５）により生成した蛋白質を検出することができるのである。
したがって、前記のとおり、各部位の配置等はとくに限定されないものの、生成物貯蔵層（３２）は、検出部位としても作用することから、検出センサー（５）と水平方向に並ぶように配置され、無細胞系蛋白質合成用化学反応回路の水平断面の中央部に位置することが好ましい。
もちろん、この出願の発明の無細胞系蛋白質合成方法は、前記のとおりの無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を用いて行われれば良く、その合成手順や条件は上記のものに限定されない。すなわち、無細胞系蛋白質合成用化学反応回路の各構成部位の数、配置、大きさ等を適宜設計、形成すれば、従来公知、あるいは新規の各種合成手法が適用できるのである。
以上のとおりの無細胞系蛋白質合成方法において、試薬の供給はコネクター部位（６１、６２、６３）に連結された送液手段（８）により行われることが好ましく、このような送液手段（８）としては、各種ポンプが例示される。また、反応後の試薬等は、廃液用コネクター（６４）から無細胞系蛋白質合成用化学反応回路外へ廃棄されてもよいし、再びコネクター部位（６１、６２、６３）から供給され、再利用されてもよい。
さらに、各試薬の供給は、各一方向バルブ（２）の開閉を制御することにより行われる。したがって、この出願の発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路では、バルブ（２）の開閉やポンプ（８）のオン／オフ、さらには、センサー（５）における分析やデータ解析等を行うための制御システム（９）やそれに伴った配線を有していてもよい。
もちろん、以上のとおりのこの出願の発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路において、合成される蛋白質は限定されない。試薬の種類や数、反応槽の構成、温度等の条件を任意に変更することにより、酵素を含む各種の蛋白質を合成することができる。
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
実施例
＜実施例１＞ 無細胞系蛋白質合成用化学反応回路の構築
発明者らによって提案されたハイブリッドマイクロ光造形法（特開平７−３２９１８８；特開２００１−１５８０５０；特開２００１−１５７６６２；特開２００１−１５８０００他）により、コネクター部位（６）を有するマイクロチップとして、コネクターチップ（６’）、試薬貯蔵槽（１）を有するマイクロチップとして、リザーバーチップ（１’）、一方向バルブ（２）を有するマイクロチップとして、バルブチップ（２’）、反応槽（３１）と生成物貯蔵槽（３２）を有するマイクロチップとして、リアクターチップ（３’）およびフォトセンサー（５）を有するマイクロチップとして、センサーチップ（５’）を造形した。バルブチップ（２’）にはシリコン膜、リアクターチップ（３’）には限外ろ過膜（マイクロコンＹＭ１００、ミロポア製）、センサーチップ（５’）にはアバランシェフォトダイオードを内部に組み込んだ。また、各マイクロチップは、コネクターチップ（６’）を除いて１４ｍｍの８角形とし、厚さは各２〜５ｍｍとした。さらに、流路の直径は３００μｍとした。
図３に各マイクロチップ（１’〜６’）およびこれらのマイクロチップを重ねて結合するためのホルダーユニット（７）の形状を示した。また、各マイクロチップを結合して得られる無細胞系蛋白質合成用化学反応回路の断面図は、図２（ｂ）に示したとおりである。
＜実施例２＞ 蛋白質合成実験
実施例１により構築された無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を用いて蛋白質合成実験を行った。目的蛋白質は、検出の容易なホタル発光酵素ルシフェラーゼとした。
図４に、ルシフェラーゼの合成に用いられた無細胞系蛋白質合成用化学反応回路システムの概略模式図を示した。
（ａ）実施例１で構築した無細胞系蛋白質合成用化学反応回路のコネクターチップ（５’）上の各供給コネクター（５１、５２、５３）をローラーポンプ（８）の吐出側に、排出コネクター（５４）を廃液タンク（８）に接続した。リザーバーチップ（１’）上の第１貯蔵槽（１１）に、超純水３μｌ、Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｍｉｘｔｕｒｅ １（Ｐｒｏｍｅｇａ社製Ｌ１０２０ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ３０ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｃｉｒｃｕｌａｒ ＤＮＡ キット）１．２５μｌ、Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｍｉｘｔｕｒｅ２（Ｐｒｏｍｅｇａ社製Ｌ１０２０ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ３０Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｃｉｒｃｕｌａｒ ＤＮＡ キット）１．２５μｌ、Ｐｒｅｍｉｘ ｗｉｔｈｏｕｔ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製 Ｌ１０２０ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ３０ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｃｉｒｃｕｌａｒ ＤＮＡ キット）１０μｌ、およびｐＢＥＳＴ／ｕｃＤＮＡ，Ｃｉｒｃｕｌａｒ（１μｇ／μｌ；Ｐｒｏｍｅｇａ社製 Ｌ１０２０ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ３０ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｃｉｒｃｕｌａｒ ＤＮＡ キット）≦２μｌからなる試薬Ａ（アミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＤＮＡを含有）を導入し、第２貯蔵槽（１２）にＳ３０ Ｅｘｔｒａｃｔ，Ｃｉｒｃｕｌａｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製 Ｌ１０２０ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ３０ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒＣｉｒｃｕｌａｒ ＤＮＡ キット）７．５μｌからなる試薬Ｂを導入し、第３貯蔵槽（１３）には、ルシフェリン検出試薬としてルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ社製 Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ）を導入した。
（ｂ）ローラーポンプ（８）を稼動し、試薬Ａを第１一方向バルブ（２１）を通して反応槽（３１）に、試薬Ｂを第２一方向バルブ（２２）を通して反応槽（３１）に供給した。反応槽を３５℃に恒温し、１時間インキュベートした。
（ｃ）さらに、第１一方向バルブ（２１）を開け、試薬Ａを反応槽（３１）に供給した。
（ｄ）反応槽（３１）において合成されたルシフェラーゼは、反応槽（３１）の限外ろ過膜（４）を透過し、下流の検出部（生成物貯蔵槽）（３２）に供給された。
（ｅ）第３一方向バルブ（２３）を開け、ルシフェリンを生成物貯蔵槽（３２）に供給し、フォトセンサー（５）により発光強度を測定し、解析装置（９）により解析した。
（ｆ）３５℃、１時間のインキュベートを行い、合成反応を継続させた。さらに、（ｄ）〜（ｅ）を１時間毎に繰り返した。
ルシフェリンおよびＡＴＰを基質として酵素反応による発光反応の測定結果を図５に示した。
図５より、ルシフェラーゼの合成は、８時間以上に渡り持続され、ルシフェラーゼの全合成量は、反応時間に伴って増加することが示された。
これより、本願発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を用いて微少系での蛋白質の合成が可能となることが確認された。
産業上の利用可能性
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、無細胞系蛋白質合成を可能とするマイクロリアクターが提供される。このような無細胞系蛋白質合成用化学反応回路は、微量の試薬を用いた無細胞系における蛋白質の合成において有用であり、目的とする蛋白質や蛋白質合成手法に応じて適宜設計できるものである。また、無細胞系での蛋白質のバッチ合成だけでなく、連続合成も可能となる。
したがって、この発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路は、蛋白質合成に用いられる試薬を少量用いての遺伝子発現試験等に使用でき、ポストゲノム研究用の実験装置として有用である。また、多品種少量生産が不可欠であるオーダーメード医療や体内埋め込みデバイスなどへの応用も期待される。
【図面の簡単な説明】
図１は、この発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路の化学ＩＣを製造するハイブリッドマイクロ光造形法を例示した概略模式図である。
図２は、この発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路の構成を例示した概略模式図である。（ａ：鳥瞰図、ｂ：断面図）
図３は、この発明の実施例において構築された無細胞系蛋白質合成用化学反応回路の各化学ＩＣを示した図である。
図４は、この発明の実施例において構築された無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を用いて無細胞系蛋白質合成を行った際の実験操作を説明する概略模式図である。
図５は、この発明の実施例において構築した無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を用いてルシフェラーゼの合成を行った際の発光反応の経時変化を示す図である。
なお、図中の符号は次のものを示す。
１ 試薬貯蔵槽
１’ リザーバーチップ
１１ 第１試薬貯蔵槽
１２ 第２試薬貯蔵槽
１３ 第３試薬貯蔵槽
２ 一方向バルブ
２’ バルブチップ
２１ 第１一方向バルブ
２２ 第２一方向バルブ
２３ 第３一方向バルブ
３’ リアクターチップ
３１ 反応槽
３２ 生成物貯蔵槽
４ 限外ろ過膜
５ 検出センサー、フォトセンサー
５’ センサーチップ
６ コネクター部位
６’ コネクターチップ
６１ 第１コネクター
６２ 第２コネクター
６３ 第３コネクター
６４ 廃液用コネクター
７ ホルダーユニット
８ 送液手段、ポンプ、ローラーポンプ
９ 制御システム、解析装置
１００ 光
１１０ 透明枠
１１１ 液状光硬化性樹脂
１１２ 中空部位
１１３ 限外ろ過膜等の部材
この出願の発明は、蛋白質の無細胞系合成を行うための小型システムとして有用な無細胞系蛋白質合成用化学反応回路に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、微少量の試薬を用いて蛋白質の無細胞系合成を行うことを可能とする無細胞系蛋白質合成用化学反応回路に関するものである。
背景技術
近年、化学実験の高速化、高効率化、および集積化、あるいは、分析機器の超小型化を目指し、反応、分離、抽出、検出などの基本化学操作を行うための化学反応回路を内部に有する「化学ＩＣ」が盛んに研究されている。
化学ＩＣは、少量の試料で測定、分析が可能なこと、持ち運びが可能となること、低コストが実現されること、使い捨てが可能なことなど、従来のデバイスに比べて、優れている面が多々あり、とくに高価な試薬を使用する実験系や物質のスクリーニング操作において有用性が高い。そこで、これまで基板上への様々な構造体の導入方法が検討されてきた。
例えば、半導体産業における微細加工技術を用いてシリコンやガラス基板上に電極や流路などを作製する方法が実用化されている。具体的には、液体クロマトグラフィーの電気化学検出器や医療現場における小型の電気化学センサーなどに用いられるマイクロ電極がフォトリソグラフィーやエッチング技術を用いて製造されている。
しかし、このような従来のフォトリソグラフィーやエッチング技術に基づいた方法で得られる化学ＩＣは、基板にシリコンやガラスを使用するため、分析機器や化学反応回路として利用する場合には、様々な問題を抱えていた。例えば、シリコンウェハーは不透明であるため、化学の分野で頻繁に行われる透過光による検出ができない、割れやすいなどの欠点があった。また、これらの方法による化学ＩＣの製造は、クリーンルーム内での作業等、特異な装置や設備を要し、得られる製品は、例えば、ガラス基板上のマイクロ電極では１枚数万円と極めて高価になってしまう。したがって、低コスト、使い捨て用途などが期待されていたものの、実際には一般的な化学実験においての使用は現実的ではなかったのが実情である。
さらに、フォトリソグラフィーやエッチング技術によりチャンネルを形成する化学ＩＣの製造方法では、実際には複雑な三次元構造の形成が不可能であり、バルブ、ポンプ、反応槽、濃縮器等を化学ＩＣ上に形成することはできなかった。また、フォトリソグラフィーやエッチングの技術では、高温処理や薬品処理が必要となるため、生物化学的実験に用いられるような化学ＩＣの形成には不向きであるという問題もあった。
発明者らは、これまでに、三次元微細構造物を高精度で製造する方法として、透明な板に注入された液状の光硬化性樹脂に光を照射し、光硬化性樹脂を硬化させる方法（光造形ファブリケーション法）を実現している（日本機械学会発行「ロボテイクス・メカトロニクス講演会講演論文集」ｐｐ．５４５−５４６（１９９２）；日本ロボット学会発行「日本ロボット学会学術講演会」ｐｐ．１２１３−１２１６（１９９２）；Ｐｒｏｃ．ｏｆ ＩＥＥＥ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ Ｍｉｃｒｏ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＥＭＳ’９３），ｐｐ．４２−４７（１９９３）；特開平７−３２９１８８他）。さらに、光造形ファブリケーション法を用いて限外ろ過膜、ＳＭＡアクチュエーター等の金属あるいは樹脂製マイクロ部品を内部に組み込むハイブリッドマイクロ光造形法と、このような方法で形成された精巧な反応槽、濃縮器、マイクロポンプ、切り替えバルブ等の様々な機能を有する化学ＩＣ状の化学集積回路を報告している（Ｐｒｏｃ．ｏｆ ＩＥＥＥ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｍｉｃｒｏ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＥＭＳ’９４），ｐｐ．１−６（１９９４）；Ｐｒｏｃ．ｏｆ ＩＥＥＥ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｍｉｃｒｏ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＥＭＳ’９９），ｐｐ．３７６−３８１（１９９９））。
一方、ヒトゲノム計画等に基づくゲノムの解析によって膨大な遺伝子情報が明らかにされており、遺伝子の機能を解析、解明していくことがこの分野の新たな課題となっている。そして、遺伝子の機能解明のために、遺伝子発現の研究がますます注目されている。
遺伝子発現は、ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡにより、細胞中に存在するリボソームを介して蛋白質に翻訳されることで行われる。したがって、遺伝子発現の研究では、一般に、大腸菌やバクテリア等の生きた細胞を用いる有細胞蛋白質合成法が用いられる。しかし、生細胞中では、細胞自身による様々な自己防衛機構が作用する上、遺伝子を導入した蛋白質を培養した後に細胞を破砕し、目的の蛋白質を分離精製する必要があるため、合成操作が煩雑である等の多くの制約を受ける。
そこで、細胞外で蛋白質合成を行う無細胞系蛋白質合成法が一般に知られている。このような方法では、小麦胚芽や大腸菌の細胞抽出液を用い、アミノ酸、ＡＴＰ等のエネルギー物質やＤＮＡを加えることで、細胞の防衛機構による制約を受けず、また蛋白質の分離精製を大幅に簡略化することができる。しかし、このような無細胞系蛋白質合成法は、バッチ式で行った場合には、反応が約２時間で停止するため、使用される試薬の量に対して得られる蛋白質量が少ないという問題があった。
このような問題に対し、Ｓｐｉｒｉｎらは、無細胞系蛋白質合成法を提案した（Ａ．Ｓ．Ｓｐｉｒｉｎ，Ｖ．Ｉ．Ｂａｒａｎｏｖ，Ｌ．Ａ．Ｒｙａｂｏｖａ，Ｓ．Ｙ．Ｏｖｏｄｏｖ ａｎｄ Ｙ．Ｂ．Ａｌａｋｈｏｖ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２，１１６２−１１６４（１９８８））。この方法では、合成に必要なアミノ酸、ＡＴＰ等を連続的に供給することで、合成反応を数十時間継続することができる。その結果、合成蛋白質量がバッチ式の数倍〜数十倍となるという利点があった。
このような連続無細胞系蛋白質合成に代表される種々の無細胞系蛋白質合成用システムを小型化できれば、蛋白質合成に用いられる試薬を少量用いて遺伝子発現試験を行うことが可能となり、コストを削減することができるため、ポストゲノム研究用の実験装置として有用である。また、多品種少量生産が不可欠であるオーダーメード医療や体内埋め込みデバイスなど多方向への応用も期待される。
そこでこの出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、無細胞系蛋白質合成を可能とするマイクロリアクターを提供することを課題としている。
発明の開示
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、第１には、蛋白質合成を行うための化学反応回路であって、同一のマイクロチップ上に少なくとも、
蛋白質合成用試薬および／または生成物検出試薬を貯蔵するための１以上の試薬貯蔵槽と、
試薬の逆流を防ぐ一方向バルブと、
該一方向バルブを介して前記試薬貯蔵槽に連結された反応槽
を有してなることを特徴とする無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を提供する。
第２には、この出願の発明は、蛋白質合成を行うための化学反応回路であって、２以上の連結可能なマイクロチップ上に少なくとも、
蛋白質合成用試薬および／または生成物検出試薬を貯蔵するための１以上の試薬貯蔵槽と、
試薬の逆流を防ぐ一方向バルブと、
該一方向バルブを介して前記試薬貯蔵槽に連結された反応槽
を有してなることを特徴とする無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を提供する。
この出願の発明は、第３には、試薬貯蔵槽、一方向バルブおよび反応槽がハイブリッドマイクロ光造形法により製造される前記いずれかの無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を提供する。
さらに、この出願の発明は、第４には、該反応槽において生成した蛋白質を分離するための分離手段と、該分離手段により分離された蛋白質を貯蔵するための生成物貯蔵槽を有する前記いずれかの無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を提供する。
第５には、この出願の発明は、試薬貯蔵槽、一方向バルブ、反応槽、分離手段および生成物貯蔵槽がハイブリッドマイクロ光造形法により製造される無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を提供する。
また、第６には、この出願の発明は、分離手段が限外ろ過膜である無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を提供する。
この出願の発明は、さらに、第７には、分離された蛋白質を検出するための検出センサーを有する無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を提供する。
第８には、この出願の発明は、試薬貯蔵槽、一方向バルブ、反応槽、分離手段、生成物貯蔵槽、および検出センサーがハイブリッドマイクロ光造形法により製造される無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を提供する。
この出願の発明は、第９には、少なくとも、
試薬貯蔵槽を有するチップと、
一方向バルブを有するチップと、
反応槽と限外ろ過膜を介して該反応槽に連結した生成物貯蔵槽を有するチップと、
検出センサーを有するチップを連結し得られる無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を提供する。
そして、この出願の発明は、第１０には、外部装置と接続するためのコネクター部位を有する前記いずれかの無細胞系蛋白質合成用化学反応回路をも提供する。
この出願の発明は、さらに、第１１には、前記第１ないし１０のいずれかの発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路において、少なくとも、第１試薬貯蔵槽に導入された反応試薬Ａと第２試薬貯蔵槽に導入された反応試薬Ｂを反応槽中で反応させる工程を有することを特徴とする無細胞系蛋白質合成方法を、第１２には、反応試薬Ａが少なくともアミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰおよびＤＮＡを含有し、反応試薬Ｂが少なくとも細胞抽出液を含有する前記の無細胞蛋白質合成方法を提供する。
この出願の発明は、第１３には、反応槽中で生成した蛋白質をさらに分離手段により分離する工程を有する前記の無細胞蛋白質合成方法を提供する。
この出願の発明は、第１４には、分離手段により分離精製された蛋白質が検出センサーにより検出・確認される前記の無細胞蛋白質合成方法を、第１５には、蛋白質の検出・確認が第３貯蔵槽に導入された蛋白質検出試薬を該生成物貯蔵槽に供給して行われる前記の無細胞蛋白質合成方法を提供する。
この出願の発明は、第１６には、前記のいずれかの無細胞系蛋白質合成用化学反応回路において、
第１試薬貯蔵槽に少なくともアミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰ、およびＤＮＡを含有する反応試薬Ａを導入し、
第２試薬貯蔵槽に少なくとも細胞抽出液を含有する反応試薬Ｂを導入し、
反応槽に反応試薬Ａおよび反応試薬Ｂを供給して反応させ、
さらに反応試薬Ａを反応槽に供給し、
生成する蛋白質を限外ろ過膜により分離する
ことを特徴とする無細胞系蛋白質合成方法を提供する。
さらに、第１７には、この出願の発明は、生成した蛋白質が、限外ろ過膜を透過した後、生成物貯蔵槽に貯蔵され、第３貯蔵槽に導入された蛋白質検出試薬を該生成物貯蔵槽に供給して、検出センサーにより検出・確認される無細胞系蛋白質合成方法を提供する。
そして、この出願の発明は、第１８には、試薬の供給がコネクター部位に連結された送液手段により行われる無細胞系蛋白質合成方法を、第１９には、送液手段がポンプである無細胞系蛋白質合成方法をも提供する。
発明を実施するための最良の形態
この出願の発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路は、マイクロチップ上に、少なくとも、
（ａ）蛋白質合成用試薬および／または生成物検出試薬を貯蔵するための１以上の試薬貯蔵槽と、
（ｂ）試薬の逆流を防ぐ一方向バルブと、
（ｃ）該一方向バルブを介して前記試薬貯蔵槽に連結された反応槽
を有してなるものである。このような無細胞系蛋白質合成用化学反応回路は、以上（ａ）〜（ｃ）の各部位を有していれば良く、その具体的な配置、形状、大きさ、材質はとくに限定されない。これらの（ａ）〜（ｃ）の各部位は、同一のマイクロチップ上に形成されていてもよいし、別々のマイクロチップに形成されていてもよい。例えば、試薬貯蔵槽と一方向バルブを有する第１のマイクロチップと反応槽を有する第２のマイクロチップが連結されてなるものであってよい。
また、この出願の発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路は、さらに
（ｄ）生成した蛋白質を分離するための分離手段と、
（ｅ）該分離手段により分離された蛋白質を貯蔵するための生成物貯蔵槽
を有するものであってもよい。これら（ｄ）および（ｅ）の各部位も（ａ）〜（ｃ）の部位と同様に同一のマイクロチップ上に形成、配置されていてもよいし、複数のマイクロチップ上に形成され、連結されて無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を構成していてもよい。
このとき、分離手段としては、電気泳動、ゲルカラム、ろ紙、限外ろ過膜等、各種のものが例示される。中でも限外ろ過膜は、分離範囲に応じて適宜膜種を選択でき、マイクロチップへの埋め込みも比較的容易であることから好ましい。
この出願の発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路は、また、
（ｆ）分離された蛋白質を検出するための検出センサー
を有するものであってもよい。このような検出センサーも、前記（ａ）〜（ｅ）の各部位と同一のマイクロチップ上に形成、配置されいてもよいし、別個のマイクロチップ上に形成されていてもよい。
以上のとおりのこの出願の発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路は、どのように形成されるものであってもよく、従来公知の半導体微細加工技術等により設計、加工、形成できる。好ましくは、（ａ）〜（ｆ）の各部位は、前記のとおり発明者らによって開発されたハイブリッドマイクロ光造形法によって三次元成形されたものとする。
ハイブリッドマイクロ光造形法では、液状の光重合高分子を枠に注入し、光を照射することにより照射部位の高分子を硬化させて三次元構造を形成する。具体的には、まず、３Ｄ−ＣＡＤシステムによって所望の立体形状を設計したデータをコンピュータにより高さ方向に等間隔の水平面で切断し、スライス図形のデータ群を作成し、このスライス図形データの最下端のものを取り出し、図１（ａ）に示されるように、このスライス形状に沿ってレーザービーム等の光（１００）をＸ、Ｙ方向に移動させながらガラス等の透明枠（１１０）中に規制された液状光硬化性樹脂（１１１）の液面に照射して、前記スライス図形に対応した形状を有する高さｄの平板状の樹脂板を成形し第１層目とする。次に図１（ｂ）に示されるように、硬化した第１層目の樹脂板上に透明枠（１１０）を設置し、液状光硬化性樹脂（１１１）を厚さｄとなるように注入し、第２層目のスライス図形データの形状に沿って光（１００）を前記同様に移動させ、樹脂を硬化させる。このとき、中空としたい中空部位（１１２）については、残存した液状光硬化性樹脂を溶剤等で洗浄すればよい。以上の操作を繰り返すことにより、所望の立体形状をした成形物が得られるのである（ｃ）。また、このとき、液状光硬化性樹脂（１１１）中に限外ろ過膜（１１３）等の部材を設置してから樹脂を硬化させることにより、濃縮器やバルブ等の複雑な機能を有する三次元構造体を成形することもできる（特開平７−３２９１８８）。
すなわち、この出願の発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路は、その主要部位の材質が光硬化性樹脂であるものとすることが好ましい。このような光硬化性樹脂は、とくに限定されないが、ポリエステルアクリレート、ポリウレタンアクリレート、ノボラック型エポキシ樹脂、ビスフェノール型エポキシ樹脂等が例示される。また、これらの光硬化性樹脂には、光開始剤としてアセトフェノン系、ベンゾイル系、ベンジルケタール系、あるいはケトン系の開始剤を添加してもよい。また、この無細胞系蛋白質合成用化学反応回路において合成される蛋白質を種々の光学的検出方法により検出することを考慮して、光硬化性樹脂は、光透過性の高いものとすることが好ましい。
もちろん、本願発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路において、各三次元構造体は以上のとおりのハイブリッドマイクロ光造形法のみならず、その改良法等の公知あるいは新規の造形法で形成されるものであってもよい。
そして、以上のとおりの方法で成形される各種三次元構造体は、同一のチップ上に立体成型され、一枚のマイクロチップで本願発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路が構成されてもよいし、各種三次元構造体を有するチップを組み合わせることによって本願発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路が構成されてもよい。
図２にこの出願の発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を例示し、その構成を説明する。すなわち、図２に示されるこの発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路の一例では、蛋白質合成用試薬および／または生成物検出試薬を貯蔵するための試薬貯蔵槽（１）を有するリザーバーチップ（１’）と、一方向バルブ（２）を有するバルブチップ（２’）と、反応槽（３１）と分離手段としての限外ろ過膜（４）を介して下流側に該反応槽に連結した生成物貯蔵槽（３２）を有するリアクターチップ（３’）と、検出センサー（５）を有するセンサーチップ（５’）を結合して構成される。
また、このような無細胞系蛋白質合成用化学反応回路は、各貯蔵層および／または反応槽に各試薬を供給するための送液手段（８）に結合するためのコネクター部位（６）を有するコネクターチップ（６’）を有していることが好ましい。
さらに、これらのチップは、順に積層され、ホルダーユニット（９）により結合一体化されれば、無細胞系蛋白質合成用化学反応回路となる。
もちろん、この出願の発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路は、図２に例示されるものに限定されず、試薬貯蔵槽（１）、一方向バルブ（２）、反応槽（３１）、限外ろ過膜（４）を介して下流側に該反応槽に連結した生成物貯蔵槽（３２）、および検出センサー（５）等が形成された一つのチップとして構成されるものであってもよい。この出願の発明者らによって報告された前記のハイブリッドマイクロ光造形法を適用すれば、このような一体型の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路が形成できる。
以上のとおりの無細胞系蛋白質合成用化学反応回路において、その大きさは、とくに限定されない。しかし、マイクロリアクターとして使用することを考慮すれば、バルブの開閉、液流、あるいは反応を阻害しない範囲でより微細なものとすることが好ましい。例えば各チップの厚さを５ｍｍ以下とし、無細胞系蛋白質合成用化学反応回路の高さを３ｃｍ未満とすることができる。もちろん、用途に応じてより小さく、あるいは大きくしてもよい。
この出願の発明は、さらに、以上のとおりの無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を用いて、細胞の自己防御機能の影響を受けることなく、蛋白質を合成する方法をも提供する。具体的には、第１試薬貯蔵槽（１１）に少なくともアミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰ、およびＤＮＡを含有する反応試薬Ａを導入し、第２試薬貯蔵槽（１２）に少なくとも細胞抽出液を含有する反応試薬Ｂを導入し、限外ろ過膜（４）を有する反応槽（３１）に反応試薬Ａおよび反応試薬Ｂを供給して反応させ、さらに反応試薬Ａを反応槽（３１）に供給して蛋白質合成を連続的に行う方法が例示される。
このとき生成する蛋白質は、限外ろ過膜（４）により分離され、限外ろ過膜（４）を介して下流側に連結した生成物貯蔵槽（３２）に貯蔵される。そして、この生成物貯蔵層（３２）には、第３貯蔵槽（１３）に導入された蛋白質検出試薬を供給することにより、検出センサー（５）により生成した蛋白質を検出することができるのである。
したがって、前記のとおり、各部位の配置等はとくに限定されないものの、生成物貯蔵層（３２）は、検出部位としても作用することから、検出センサー（５）と水平方向に並ぶように配置され、無細胞系蛋白質合成用化学反応回路の水平断面の中央部に位置することが好ましい。
もちろん、この出願の発明の無細胞系蛋白質合成方法は、前記のとおりの無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を用いて行われれば良く、その合成手順や条件は上記のものに限定されない。すなわち、無細胞系蛋白質合成用化学反応回路の各構成部位の数、配置、大きさ等を適宜設計、形成すれば、従来公知、あるいは新規の各種合成手法が適用できるのである。
以上のとおりの無細胞系蛋白質合成方法において、試薬の供給はコネクター部位（６１、６２、６３）に連結された送液手段（８）により行われることが好ましく、このような送液手段（８）としては、各種ポンプが例示される。また、反応後の試薬等は、廃液用コネクター（６４）から無細胞系蛋白質合成用化学反応回路外へ廃棄されてもよいし、再びコネクター部位（６１、６２、６３）から供給され、再利用されてもよい。
さらに、各試薬の供給は、各一方向バルブ（２）の開閉を制御することにより行われる。したがって、この出願の発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路では、バルブ（２）の開閉やポンプ（８）のオン／オフ、さらには、センサー（５）における分析やデータ解析等を行うための制御システム（９）やそれに伴った配線を有していてもよい。
もちろん、以上のとおりのこの出願の発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路において、合成される蛋白質は限定されない。試薬の種類や数、反応槽の構成、温度等の条件を任意に変更することにより、酵素を含む各種の蛋白質を合成することができる。
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
実施例
＜実施例１＞ 無細胞系蛋白質合成用化学反応回路の構築
発明者らによって提案されたハイブリッドマイクロ光造形法（特開平７−３２９１８８；特開２００１−１５８０５０；特開２００１−１５７６６２；特開２００１−１５８０００他）により、コネクター部位（６）を有するマイクロチップとして、コネクターチップ（６’）、試薬貯蔵槽（１）を有するマイクロチップとして、リザーバーチップ（１’）、一方向バルブ（２）を有するマイクロチップとして、バルブチップ（２’）、反応槽（３１）と生成物貯蔵槽（３２）を有するマイクロチップとして、リアクターチップ（３’）およびフォトセンサー（５）を有するマイクロチップとして、センサーチップ（５’）を造形した。バルブチップ（２’）にはシリコン膜、リアクターチップ（３’）には限外ろ過膜（マイクロコンＹＭ１００、ミロポア製）、センサーチップ（５’）にはアバランシェフォトダイオードを内部に組み込んだ。また、各マイクロチップは、コネクターチップ（６’）を除いて１４ｍｍの８角形とし、厚さは各２〜５ｍｍとした。さらに、流路の直径は３００μｍとした。
図３に各マイクロチップ（１’〜６’）およびこれらのマイクロチップを重ねて結合するためのホルダーユニット（７）の形状を示した。また、各マイクロチップを結合して得られる無細胞系蛋白質合成用化学反応回路の断面図は、図２（ｂ）に示したとおりである。
＜実施例２＞ 蛋白質合成実験
実施例１により構築された無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を用いて蛋白質合成実験を行った。目的蛋白質は、検出の容易なホタル発光酵素ルシフェラーゼとした。
図４に、ルシフェラーゼの合成に用いられた無細胞系蛋白質合成用化学反応回路システムの概略模式図を示した。
（ａ）実施例１で構築した無細胞系蛋白質合成用化学反応回路のコネクターチップ（５’）上の各供給コネクター（５１、５２、５３）をローラーポンプ（８）の吐出側に、排出コネクター（５４）を廃液タンク（８）に接続した。リザーバーチップ（１’）上の第１貯蔵槽（１１）に、超純水３μｌ、Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｍｉｘｔｕｒｅ １（Ｐｒｏｍｅｇａ社製Ｌ１０２０ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ３０ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｃｉｒｃｕｌａｒ ＤＮＡ キット）１．２５μｌ、Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｍｉｘｔｕｒｅ２（Ｐｒｏｍｅｇａ社製Ｌ１０２０ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ３０Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｃｉｒｃｕｌａｒ ＤＮＡ キット）１．２５μｌ、Ｐｒｅｍｉｘ ｗｉｔｈｏｕｔ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製 Ｌ１０２０ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ３０ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｃｉｒｃｕｌａｒ ＤＮＡ キット）１０μｌ、およびｐＢＥＳＴ／ｕｃＤＮＡ，Ｃｉｒｃｕｌａｒ（１μｇ／μｌ；Ｐｒｏｍｅｇａ社製 Ｌ１０２０ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ３０ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｃｉｒｃｕｌａｒ ＤＮＡ キット）≦２μｌからなる試薬Ａ（アミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＤＮＡを含有）を導入し、第２貯蔵槽（１２）にＳ３０ Ｅｘｔｒａｃｔ，Ｃｉｒｃｕｌａｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製 Ｌ１０２０ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ３０ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒＣｉｒｃｕｌａｒ ＤＮＡ キット）７．５μｌからなる試薬Ｂを導入し、第３貯蔵槽（１３）には、ルシフェリン検出試薬としてルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ社製 Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ）を導入した。
（ｂ）ローラーポンプ（８）を稼動し、試薬Ａを第１一方向バルブ（２１）を通して反応槽（３１）に、試薬Ｂを第２一方向バルブ（２２）を通して反応槽（３１）に供給した。反応槽を３５℃に恒温し、１時間インキュベートした。
（ｃ）さらに、第１一方向バルブ（２１）を開け、試薬Ａを反応槽（３１）に供給した。
（ｄ）反応槽（３１）において合成されたルシフェラーゼは、反応槽（３１）の限外ろ過膜（４）を透過し、下流の検出部（生成物貯蔵槽）（３２）に供給された。
（ｅ）第３一方向バルブ（２３）を開け、ルシフェリンを生成物貯蔵槽（３２）に供給し、フォトセンサー（５）により発光強度を測定し、解析装置（９）により解析した。
（ｆ）３５℃、１時間のインキュベートを行い、合成反応を継続させた。さらに、（ｄ）〜（ｅ）を１時間毎に繰り返した。
ルシフェリンおよびＡＴＰを基質として酵素反応による発光反応の測定結果を図５に示した。
図５より、ルシフェラーゼの合成は、８時間以上に渡り持続され、ルシフェラーゼの全合成量は、反応時間に伴って増加することが示された。
これより、本願発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を用いて微少系での蛋白質の合成が可能となることが確認された。
産業上の利用可能性
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、無細胞系蛋白質合成を可能とするマイクロリアクターが提供される。このような無細胞系蛋白質合成用化学反応回路は、微量の試薬を用いた無細胞系における蛋白質の合成において有用であり、目的とする蛋白質や蛋白質合成手法に応じて適宜設計できるものである。また、無細胞系での蛋白質のバッチ合成だけでなく、連続合成も可能となる。
したがって、この発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路は、蛋白質合成に用いられる試薬を少量用いての遺伝子発現試験等に使用でき、ポストゲノム研究用の実験装置として有用である。また、多品種少量生産が不可欠であるオーダーメード医療や体内埋め込みデバイスなどへの応用も期待される。
【図面の簡単な説明】
図１は、この発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路の化学ＩＣを製造するハイブリッドマイクロ光造形法を例示した概略模式図である。
図２は、この発明の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路の構成を例示した概略模式図である。（ａ：鳥瞰図、ｂ：断面図）
図３は、この発明の実施例において構築された無細胞系蛋白質合成用化学反応回路の各化学ＩＣを示した図である。
図４は、この発明の実施例において構築された無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を用いて無細胞系蛋白質合成を行った際の実験操作を説明する概略模式図である。
図５は、この発明の実施例において構築した無細胞系蛋白質合成用化学反応回路を用いてルシフェラーゼの合成を行った際の発光反応の経時変化を示す図である。
なお、図中の符号は次のものを示す。
１ 試薬貯蔵槽
１’ リザーバーチップ
１１ 第１試薬貯蔵槽
１２ 第２試薬貯蔵槽
１３ 第３試薬貯蔵槽
２ 一方向バルブ
２’ バルブチップ
２１ 第１一方向バルブ
２２ 第２一方向バルブ
２３ 第３一方向バルブ
３’ リアクターチップ
３１ 反応槽
３２ 生成物貯蔵槽
４ 限外ろ過膜
５ 検出センサー、フォトセンサー
５’ センサーチップ
６ コネクター部位
６’ コネクターチップ
６１ 第１コネクター
６２ 第２コネクター
６３ 第３コネクター
６４ 廃液用コネクター
７ ホルダーユニット
８ 送液手段、ポンプ、ローラーポンプ
９ 制御システム、解析装置
１００ 光
１１０ 透明枠
１１１ 液状光硬化性樹脂
１１２ 中空部位
１１３ 限外ろ過膜等の部材
Claims (19)
- 蛋白質合成を行うための化学反応回路であって、同一のマイクロチップ上に少なくとも、
蛋白質合成用試薬および／または生成物検出試薬を貯蔵するための１以上の試薬貯蔵槽と、
試薬の逆流を防ぐ一方向バルブと、
該一方向バルブを介して前記試薬貯蔵槽に連結された反応槽
を有してなることを特徴とする無細胞系蛋白質合成用化学反応回路。 - 蛋白質合成を行うための化学反応回路であって、２以上の連結可能なマイクロチップ上に少なくとも、
蛋白質合成用試薬および／または生成物検出試薬を貯蔵するための１以上の試薬貯蔵槽と、
試薬の逆流を防ぐ一方向バルブと、
該一方向バルブを介して前記試薬貯蔵槽に連結された反応槽
を有してなることを特徴とする無細胞系蛋白質合成用化学反応回路。 - 試薬貯蔵槽、一方向バルブおよび反応槽は、ハイブリッドマイクロ光造形法により製造される請求項１または２のいずれかの無細胞系蛋白質合成用化学反応回路。
- 該反応槽において生成した蛋白質を分離するための分離手段と、該分離手段により分離された蛋白質を貯蔵するための生成物貯蔵槽を有する請求項１または２の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路。
- 試薬貯蔵槽、一方向バルブ、反応槽、分離手段および生成物貯蔵槽は、ハイブリッドマイクロ光造形法により製造される請求項４の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路。
- 分離手段は限外ろ過膜である請求項４または５の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路。
- 分離された蛋白質を検出するための検出センサーを有する請求項４の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路。
- 試薬貯蔵槽、一方向バルブ、反応槽、分離手段、生成物貯蔵槽、および検出センサーは、ハイブリッドマイクロ光造形法により製造される請求項７の無細胞系蛋白質合成用化学反応回路。
- 少なくとも、
試薬貯蔵槽を有するチップと、
一方向バルブを有するチップと、
反応槽と限外ろ過膜を介して該反応槽に連結した生成物貯蔵槽を有するチップと、
検出センサーを有するチップを
連結して得られる無細胞系蛋白質合成用化学反応回路。 - 外部装置と接続するためのコネクター部位を有する請求項１ないし９のいずれかの無細胞系蛋白質合成用化学反応回路。
- 請求項１ないし１０のいずれかの無細胞系蛋白質合成用化学反応回路において、少なくとも
第１試薬貯蔵槽に導入された反応試薬Ａと第２試薬貯蔵槽に導入された反応試薬Ｂを反応槽中で反応させる工程
を有することを特徴とする無細胞系蛋白質合成方法。 - 反応試薬Ａは少なくともアミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰおよびＤＮＡを含有し、反応試薬Ｂは少なくとも細胞抽出液を含有する請求項１１の無細胞蛋白質合成方法。
- 反応槽中で生成した蛋白質をさらに分離手段により分離する工程を有する請求項１１または１２の無細胞蛋白質合成方法。
- 分離手段により分離精製された蛋白質は検出センサーにより検出・確認される請求項１３の無細胞蛋白質合成方法。
- 蛋白質の検出・確認は、第３貯蔵槽に導入された蛋白質検出試薬を該生成物貯蔵槽に供給して行う請求項１４の無細胞蛋白質合成方法。
- 請求項１ないし１０のいずれかの無細胞系蛋白質合成用化学反応回路において、
第１試薬貯蔵槽に少なくともアミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰ、およびＤＮＡを含有する反応試薬Ａを導入し、
第２試薬貯蔵槽に少なくとも細胞抽出液を含有する反応試薬Ｂを導入し、
反応槽に反応試薬Ａおよび反応試薬Ｂを供給して反応させ、
さらに反応試薬Ａを反応槽に供給し、
生成する蛋白質を限外ろ過膜により分離する
ことを特徴とする無細胞系蛋白質合成方法。 - 生成した蛋白質は、限外ろ過膜を透過した後、生成物貯蔵槽に貯蔵され、第３貯蔵槽に導入された蛋白質検出試薬を該生成物貯蔵槽に供給して、検出センサーにより検出・確認される請求項１６の無細胞系蛋白質合成方法。
- 試薬の供給はコネクター部位に連結された送液手段により行われる請求項１６または１７のいずれかの無細胞系蛋白質合成方法。
- 送液手段は、ポンプである請求項１８の無細胞系蛋白質合成方法。
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