CN1585648A

CN1585648A - 用于调节免疫反应的釉质基质蛋白组合物

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Publication number: CN1585648A
Application number: CNA028226690A
Authority: CN
Inventors: S·P·林斯塔多斯; S·格斯特雷利乌斯
Original assignee: Biora BioEx AB
Current assignee: Institut Straumann AG; Biora AB
Priority date: 2001-09-14
Filing date: 2002-09-06
Publication date: 2005-02-23
Anticipated expiration: 2022-09-06
Also published as: WO2003024479A1; JP2005502726A; PL369029A1; EP1432435A1; RU2004111294A; US20100093632A1; IL160639A; RU2295972C2; JP4668534B2; HK1074770A1; US7608284B2; AU2002334515B2; MXPA04002348A; US7897180B2; US20030077291A1; CA2459773A1; BR0212527A; CN100346823C; IL160639A0

Abstract

本发明涉及诸如牙釉蛋白的活性釉质基质物质的制剂在制备用于调节免疫反应的药物组合物中的用途。可以将所述组合物用于预防和/或治疗哺乳动物的状况或疾病，所述状况或疾病的特征是，所述哺乳动物在它的天然免疫反应中表现出对内部和/或外部刺激的不平衡，即，其中，所述哺乳动物免疫系统的至少一部分是无区别地受到刺激的，对所述免疫原产生过敏反应，或不能对所述刺激产生产应。所述状况通常可能是系统性的或局部性的，如系统性和/或创伤后全身炎症或自身免疫疾病。

Description

用于调节免疫反应的釉质基质蛋白组合物

发明领域

发明背景

免疫系统的正常功能，是保护身体免受诸如细菌和病毒的外源微生物的攻击和破坏。在正常情况下，这些微生物被认为是入侵者，并因此使它们无害。

负责个体免疫反应的是淋巴系统；表示淋巴细胞，它的前体和衍生物，以及所有支持细胞的组合。在异常状况下，或在免疫系统失衡时，它不能对外源微生物作出反应，并且破坏所述外源微生物，将自身的细胞和组织误认为外源组织并且加以攻击，或者以过度敏感的方式不适当地激活。

对抗原制剂(外源抗原或自身抗原)的免疫反应通常以由B淋巴细胞产生抗体，并且通过T淋巴细胞或天然杀伤(NK)破坏所有具有所述抗原的细胞为特征。不过，B或T淋巴细胞的缺陷，可能导致免疫缺陷疾病的发生或免疫反应功能的破坏。所述免疫缺陷或不足可能是先天性的，即通过基因突变引起的，或者它可以是获得性的，例如通过病毒感染而获得，或者是衰老过程的结果。由此产生的缺陷可能是或不是致命性的，这取决于出现这种缺陷时干细胞或淋巴细胞分化所处的阶段。

除了抗原之外，淋巴细胞需要淋巴因子进行全面激活。例如，T-辅助细胞不能增殖，除非它们接收到来自巨噬细胞的信号，而T-细胞毒性细胞和B-细胞取决于来自T-辅助细胞，以及有可能还来自巨噬细胞的信号进行它们的全面发育。充分的免疫反应需要若干种细胞类型的协同活性，这意味着调节淋巴因子的表达或活性，有可能对不利的免疫反应产生有益影响。

在休克，烧伤，广泛的手术过程或创伤之后，免疫系统的功能可能在系统性、无分别的、过度的全身炎症中受到过度刺激，而其他功能则急剧瘫痪。当免疫学宿主反应因此而失控时，所观察到的细胞激活的失衡状态会导致一连串临床状况。所述状况可能是急性期反应，全身炎症，过敏，败血症，感染或器官衰竭，并且可能最终导致多器官衰竭。多器官衰竭或功能障碍是加强监护单元中死亡的最常见原因。当今，针对预防或改善失控免疫反应的治疗方法业已能够显著改变这一结果。

失衡状态的其他例子是免疫系统攻击它自身的身体。这些状态在引起所述攻击的抗原的起源和攻击的机制和表现方面有所不同。这种反应通常分别被称为过敏，延迟型过敏反应，同种异体移植反应和自身免疫反应。

缺乏免疫性是另一种失衡的状况，其中，身体不能对注射的过敏原或抗原作出反应。缺乏免疫反应被认为是在缺乏“共刺激”信号的情况下，T-细胞受体(TCR)和肽-呈递主要组织相容性复合物(MHC)抗原之间相互作用之后，细胞间信号传导的结果。这种共刺激信号正常情况下是呈递在抗原-呈递细胞(APCs)的细胞表面上的。

免疫系统能局部和系统地调节它的功能。例如，延迟型过敏反应可以在特征性皮肤反应中以局部形式表现，或在系统反应中表现，其中，大量的抗原进入血液，并且以发烧，不适，关节疼痛和循环的淋巴细胞数量减少为特征。炎症通常被定义为对细胞损伤的局部反应，而全身炎症或多器官衰竭是系统性炎症。

在创伤之后，单核细胞和巨噬细胞马上被过度激活，以便大量释放促炎细胞因子，这种过度的释放导致了全身炎症的发生，随后在大部分患者体内出现细胞功能的基本瘫痪。在3-5天之后，这种状态被新募集的单核细胞/巨噬细胞克服，不过，这些细胞有可能缺乏完整的活性谱，因为它们是不成熟的细胞。另外，患者还可能经历一个抗炎期(补偿性抗炎反应综合征)，并且有时会观察到促炎和抗炎的混合反应(混合型拮抗反应综合征)。

因此，对细胞介导的免疫调控平衡的创伤后影响，主要是通过同时攻击单核细胞/巨噬细胞系和T细胞引起的，导致完整细胞相互作用的崩解。创伤应激不仅影响每一种细胞类型的适度和特异性性能的能力；它还影响单核细胞/巨噬细胞系和T细胞正常情况下所具有的在多个调控循环中的控制能力和调节监督。这种调控功能的丧失是在损伤发生时临时出现的。

例如，能导致上述最初的系统性超炎反应的已知炎性细胞因子包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，白介素-1(IL-1)，IL-6，和干扰素γ，它有可能与TNF-α协同作用。为了下调所述介质，利用诸如抗内毒素，TNF-α，IL-1的拮抗剂或血小板激活因子的抗体进行的临床试验迄今为止一直是令人失望的。这些制剂不仅被证实没有调节作用，它们甚至会提高致死率。

另外，在应激条件下，容易诱导单核细胞/巨噬细胞系产生并且释放前列腺素E₂(PGE₂)，它有可能是最有效的内源免疫抑制剂。PGE₂是T细胞有丝分裂，IL-2受体表达和B细胞的IgM抗体合成的抑制剂。通过cAMP含量的细胞内提高，PGE₂还能对单核细胞/巨噬细胞系的TNF-α和IL-1的合成产生负面控制作用。PGE₂可以抑制TH₁细胞因子(IL-2，IFNγ)的合成，但不能抑制TH₂细胞的IL-4合成。因此，PGE₂分泌能破坏所述平衡，有利于TH₂型反应，在B细胞生产中导致从IgM到IgG1和IgE的转换。因此，破坏所述平衡能影响TH₁或TH₂-优势反应的形成。

用于调节患者免疫反应的传统试剂和方法通常会导致不需要的副作用。例如，诸如环孢菌素A，硫唑嘌呤和强的松的免疫抑制剂，被用于抑制患有自身免疫病的患者或接受移植物的患者的免疫系统。不过，所述制剂会抑制患者的整体免疫反应，因此，破坏了患者对与原有疾病无关的感染剂产生免疫反应的能力。由于这种有害的副作用以及免疫调节的医学重要性，多年以来用于调控免疫系统的特定部分的试剂和方法一直是研究的主题。

存在于釉质基质中的釉质基质蛋白是最常见的釉质前体。在牙骨质形成之前，釉质基质蛋白沉积在发育中的牙根的顶端根面上。沉积的釉质基质是形成牙骨质的起始因子。同样，牙骨质的形成本身与牙周韧带和牙槽骨骼的发育相关。正如本发明人在本发明之前所证实的，釉质基质蛋白因此可能通过模拟牙齿中的天然连接的形成，促进牙周再生(Gestrelius S，Lyngstadaas SP，Hammarstrm L.Emdogain-基于仿生学的牙周再生。Clin Oral Invest 4：120-125(2000))。

釉质基质包括多种蛋白，如牙釉蛋白，珐琅蛋白，簇蛋白(tuftprotein)，蛋白酶，和白蛋白。釉质基质的主要成分牙釉蛋白是通过可变剪接和受控制的分泌后加工由单个基因产生的一个疏水性蛋白家族。在脊椎动物进化过程中，它们是高度保守的，并且在所有检查过的高等脊椎动物中，表现出很高的总体序列同源性水平(大于80％)。实际上，猪和人牙釉蛋白基因转录物的序列只具有4％的碱基差别，因此，尽管是来源于猪的釉质基质蛋白，在人体中也会被认为是“自身的”，并且可以在人体中促进牙齿再生，而不会诱导过敏反应或其他不希望的反应。

在以前的专利文献中业已披露了釉质基质蛋白和釉质基质衍生物(EMD)能诱导硬组织形成(即牙釉形成，美国专利4,672,032(Slavkin))，硬组织之间的结合(EP-B-0 337 967和EP-B-0 263 086)和伤口愈合，如皮肤和粘膜的愈合(WO 99/43344)。

发明概述

本发明基于这样的惊人发现，活性釉质物质具有调节哺乳动物的免疫机制的能力。免疫调节在本文中被定义为通过各种特异性和非特异性方式引起的免疫反应水平的增强或减弱。

因此，本发明的一种优选实施方案包括活性釉质物质在制备用于预防和/或治疗哺乳动物的状况的药物组合物的用途，其中，所述状况以所述哺乳动物对诸如外部或内部刺激因子的免疫原的免疫反应失衡为特征。

“免疫反应失衡”可能在休克，烧伤，过度手术过程和/或创伤损伤之后出现，该术语表示一种状态/状况，其中，免疫系统的一种或多种功能可能在系统性、无区别的、过度全身炎症中被过度刺激，而其他功能可能同时或分别刺激不足。术语“免疫反应失衡”表示一种状态/状况，其中，所述免疫学宿主反应是不受控制的，并且，所观察到的细胞激活的失衡状态会导致一连串临床状态。所述状态可能是急性期反应，全体炎症，过敏，休克，败血症，感染和/或器官衰竭，并有可能最终导致多器官衰竭。

术语“免疫反应失衡”的其他例子是这样的状态/状况，其中，所述对象的惰性免疫系统攻击它自身的身体。这些状态在引起所述攻击的抗原来源和所述攻击的机制和表现方面有所不同。这些反应通常分别被称为过敏，延迟型过敏反应，同种异体排斥，和自身免疫反应。

术语“免疫反应失衡”可以表示局部和系统状态，正如上文所述。例如，炎症通常被定义为对细胞损伤的局部反应，而全身炎症或多器官衰竭是系统性炎症的例子。

在本文中，术语“免疫原”被用于表示能够引起免疫反应的任何因子。例如，它可以是毒素，真菌，寄生虫，病毒，细菌，花粉，粉尘，污染颗粒，细胞因子，激素，应激，手术，烧伤，移植器官或血液，组织移植物，休克，创伤，或非自身或自身抗原。

免疫学过敏反应是能导致组织损伤或破坏身体功能的免疫反应。可以根据组织损伤的机制将它们划分成五种类型(I-V)，它们与很多重要的人类疾病和失调相关，如过敏反应，哮喘，食物过敏，重症肌无力和系统性红斑狼疮。

在本发明的一种实施方案中，将一种活性釉质物质用于制备用来预防和/或治疗哺乳动物状况的药物组合物，其中，它的免疫系统的至少一部分对所述免疫原过敏反应。在一种优选实施方案中，所述哺乳动物的免疫系统的至少一部分，因此以无区别的形式受到刺激。

可以从本发明中受益的状况包括这样的状况：其中，所述哺乳动物免疫反应的失衡是局部性的和/或系统性的。在本文中，系统性被定义为与一个系统相关或一个系统所常见的，即与局部反应不同，前者从总体上影响所述身体。例如，所述状况可以是选自下组的自身免疫病：类风湿关节炎，皮肤病，过敏，硬化，动脉硬化，多发性硬化，哮喘，牛皮癣，狼疮，系统性红斑狼疮，糖尿病，重症肌无力，慢性疲劳综合征，纤维肌痛，慢性疲劳综合征，克隆氏病，桥本氏甲状腺炎，格雷夫斯病，阿狄森氏病，格-巴综合征和硬皮病。

在本文中，术语“自身免疫病”表示超过80种不同的严重慢性疾病。在美国，自身免疫病是紧随癌症和心脏病之后的第三大疾病。75-90％的自身免疫病发生在女性身上，并且通常在生育年龄期间发生。除了身体器官之外，自身免疫病还影响神经，肌肉，血液，结缔组织，胃肠系统和所有身体系统。

自身免疫病的原因尚不完全了解或理解，不过，据推测激素，遗传和环境因素在这种病的诱导和发作中发挥着重要作用。这种病的大部分的过程是个体化的，并且是高度不可预测的。自身免疫病不表示耐受机制的普遍衰竭，相反，它们体现了对特定自身抗原的特异性反应的出现。

本发明同样涉及的其他状况是以系统性炎症和/或感染为特征的，并且与创伤，烧伤，手术，透析，休克，和/或细菌或病毒感染相关。在本发明的优选实施方案中，所述系统状况与选自下组的疾病相关：体外膜氧合作用(ECMO)，休克，系统性炎症反应综合征(SIRS)，败血症，多器官衰竭，诸如器官和/或假体的移植物排斥，心脏和肺旁路手术，慢性炎症，哮喘和/或与应激相关的肺病，细菌感染，坏疽，软组织感染，和伤口感染。

若干种严重创伤，如大手术，系统性炎症，烧伤，或休克可能导致患者免疫学反应的重大损伤，这种损伤的临床后果是，创伤个体很容易发生严重系统感染，这种感染可能导致严重组织破坏和器官衰竭。

在本发明的一种实施方案中，活性釉质物质因此被用于生产用于预防和/或治疗哺乳动物状况的药物组合物，其中，所述哺乳动物免疫系统的至少一部分攻击产生它们的生物体的分子，细胞或组织。活性釉质物质在本文中被用于生产用来预防和/或治疗哺乳动物状况的药物组合物，其中，所述状况的特征是系统性炎症和/或感染。

在系统性、无区别的、过度全身炎症中，部分免疫系统受到刺激，而在复杂的细胞介导的免疫性(CMI)中的其他功能则显著瘫痪。在创伤之后发生的一系列细胞激活状态和复杂的事件顺序中，出现了免疫异常，对这种异常尚不十分了解。一种已知的事实是创伤应激诱导的完整单核细胞-T细胞相互作用的分解，它与单核细胞调控和T细胞功能的显著抑制的显著改变相关。在本发明的一种优选实施方案中，活性釉质物质因此被用于生产用于恢复患者的单核细胞-T细胞相互作用平衡的药物组合物，即用于恢复健康的单核细胞调控和T细胞功能。

在本文中，炎症被定义为对细胞损伤的局部反应，其标志为毛细管扩张，白细胞浸润，发红，发热，疼痛，肿胀，和/或功能丧失，并且在正常情况下起到被用作启动消除有毒制剂和受损组织的机制的作用。

在本发明中，活性釉质物质被用于生产用来调节哺乳动物体内T-辅助细胞激活方式(conception)的药物组合物。在所述药物组合物中所包含的所述活性釉质物质在这里可以调节细胞间和/或细胞内信号传导物质的表达的水平，释放和/或功能。在所述药物组合物中所包含的活性釉质物质还可以调节与所述哺乳动物的免疫机制相关的至少一种细胞因子的表达水平，释放和/或功能，或调节与所述哺乳动物的免疫机制相关的细胞信号传导级联反应。

很多常见的和临床上重要的疾病状态，如类风湿关节炎，哮喘，结核，麻风，血吸虫病，慢性肝炎，甲状腺炎和多发性硬化都是慢性炎症及其后果的例子。慢性炎症可能由未能消除急性炎性刺激，由对自身抗原的自身免疫反应所导致，或可能是由持续存在的低强度先天性慢性刺激剂所导致。其特征是同时发炎和修复，通过细胞因子和生长因子的协同作用，引起巨噬细胞，淋巴细胞和其他细胞的募集和激活。本发明的一种优选实施方案，包括利用活性釉质物质生产用于治疗和/或预防慢性炎症的药物组合物。

慢性炎症最好是以过程的形式定义的，其中，持续的炎症和试图通过修复治愈组织是同时进行的。尽管它通常是简单地以时间进程的形式定义的，具有持续超过6周时间的损伤，传统上通常被称为是慢性的，上述定义中的任意一种完全是随意的。在显微水平上，慢性炎症有时是以细胞反应的模式定义的，尽管这种定义是可变的，并且并不总是可靠的。

该过程的独特特征最好通过将它与急性炎症反应加以比较来理解。在急性炎症中，宿主反应导致所述刺激剂的消除，随后是恢复相关的组织再生或修复，与急性炎症相反，慢性炎症的特征是发炎和修复是同时进行的，而不是连续进行的。修复一直是慢性炎症的特征，因为它与导致组织结构破坏的刺激剂相关。修复通常是通过颗粒化组织的向内生长实现的，所述组织包括巨噬细胞，成纤维细胞和新的血管。

急性炎症和慢性炎症的其他重要区别，与渗出和细胞募集之间的相对平衡，以及炎症反应中占优势的细胞类型相关。在慢性炎症中，通常具有不太显著的渗出反应和较强的炎性细胞募集，它可能伴随着局部细胞增殖。与急性炎症相反，它的特征通常是募集大量的中性粒细胞，在所有形式的慢性炎症中主要的浸润细胞是巨噬细胞。根据刺激剂的性质，炎性介质和生长因子(统称为细胞因子)的不同特征通常是局部的，产生慢性炎症的不同的形态学特征。

炎症的系统作用在慢性炎症疾病中更为显著，并且可能造成严重的临床后果。这种系统性作用在很大程度上是由细胞因子介导的。急性炎症的最显著的系统性作用是发烧和白细胞增多，而慢性炎症通常与疲劳，嗜睡，体重减轻和消瘦相关。

当与本发明相关的状况和/或疾病是感染时，所述状况可能是通过选自，但不局限于下组的格兰氏阴性微生物和格兰氏阳性微生物的细菌污染引起的：1)G+：例如，葡萄球菌属和链球菌属，它们能够释放内毒素肽聚糖(PepG)，它是G+微生物的特异性细胞壁成分。2)G-：例如，在感染期间从它们的外层细胞被膜中释放脂多糖(LPS)的大肠菌类和其他微生物。所述免疫学状况，在这里是通过由所述感染微生物产生的内毒素和/或外毒素引起的。

在本发明中，在人类血液中由来自金黄色葡萄球菌(PepG)和大肠杆菌(LPS)的内毒素引起的细胞反应可以通过施用实施例1所述的牙釉蛋白有效调控。这些结果清楚地表明了活性釉质物质对哺乳动物免疫机制的有效调节作用。

在由本发明人进行的，并且披露于本申请的实施例2中的另一种实验中，用猪作为败血症模型，在体内检验釉质基质衍生物的治疗效力。

在实施例2中，EMD，甚至是通过大的药团注射输送的EMD，被证实在以大剂量系统施用时是安全的。另外，在本发明中证实了系统性注射釉质基质衍生物，能对抗猪体内的内毒素(LPS)作用。一般，可以归结为与假操作的猪相比，在处理过的猪体内的脓毒性休克的发作延迟。这种延迟取决于剂量，1mg/kg体重的剂量只能提供短时间的延迟(大约30分钟)，而5mg/kg的剂量似乎能预防或者至少显著延迟(＞5小时)脓毒性休克和相关的多器官衰竭的发作。

可以解释釉质基质衍生物对LPS诱导的休克的有利作用的一种可能的机制是，釉质基质衍生物能结合LPS，并因此使所述毒性作用失活。另一种同样可预见的可能性是釉质基质衍生物与LPS竞争相同的受体，例如，存在于白细胞，巨噬细胞，破骨细胞，和/或肥大细胞上的受体。因此，本发明的优选实施方案涉及活性釉质物质在制备药物组合物中的用途，其中，所述活性釉质物质通过直接与内毒素和/或外毒素结合，和/或通过与所述内毒素和/或外毒素的细胞受体结合，使得由微生物产生的所述内毒素和/或外毒素的毒性作用失活。

第三种高度可能的可能机制是，釉质基质衍生物通过以有利形式调控细胞因子和信号分子的表达级联反应，直接调节所述免疫反应，所述分子在LPS诱导的脓毒性休克中起主要作用。根据在本申请中没有披露的以前的离体实验，将至少一部分釉质基质衍生物的作用归咎于后一种机制似乎是合理的。另外，所进行的血液分析还表明了釉质基质衍生物对在白细胞中表达的细胞因子具有直接作用。所述作用似乎是特异性的，对TNF和IL-6有显著影响，但对IL-1β没有影响。最后，很可能的是上面所提出的所有机制都有关系，并且正是由于这些作用的组合，提供了釉质基质衍生物在该模型中的有利作用。

在实施例2中所披露的脓毒性休克发作的延迟具有重要的临床价值。在本发明的一种设想的实施方案中，所述延迟直接与血液中“游离”LPS的数量相关，并且釉质基质衍生物因此被作为抗生素的佐剂，用于治疗诸如严重菌血症和感染，用于延迟和/或减轻毒素的作用。在抗生素治疗开始之后，所述治疗对于处在关键时间的患者的存活来说是重要的。

在另一种同样优选的实施方案中，釉质基质衍生物的作用，是通过炎性反应的直接调控引起的，因此，可以将釉质基质衍生物用于多种临床状况，其中，休克是一种可能的并发症。所述状况包括所有大手术，移植，创伤，ECMO，急性透析，严重感染，严重过敏和很多其他状况。

其意图不是要限制本发明的范围，对本文所披露的活性釉质物质能够调节哺乳动物免疫系统的机制的一种理论上的解释是，它与选自下组的细胞表面受体和/或细胞表面结构的相互作用：ICAM，HLA抗原，白介素1受体，白介素2受体，白介素3受体，白介素4受体，白介素5受体，白介素6受体，白介素7受体，白介素8受体，白介素9受体，白介素10受体，白介素11受体，白介素12受体，白介素13受体，白介素14受体，白介素15受体，白介素16受体，白介素17受体，白介素18受体，IFNα受体，IFNβ受体，IFNΔ受体，IFNγ受体，IFNΩ受体，PDGF受体，TGF受体，TNF受体，EGF受体，CD44受体和整联蛋白受体家族。

细胞表面受体是当通过它们相应的信号传导分子，激活配体时，细胞联通的众所周知的介质。细胞表面受体以高的或低的亲和力结合所述配体，并且将这种细胞外事件转化成一种或多种细胞内信号，该信号能改变靶细胞的行为。因此，活性釉质物质能够通过类似的方式，通过改变靶细胞的行为调节免疫系统。因此，在本发明的一种实施方案中，活性釉质物质能激活细胞表面受体，以便诱导受体特异性细胞间信号传导级联发应，并且改变一种或多种基因的表达，导致所述细胞行为的改变。

在本发明的另一种实施方案中，活性釉质物质能够激活细胞表面受体，该受体可以作为一种酶直接操纵所谓的催化受体，一种例子是，具有起着酪氨酸激酶作用的细胞质结构域的跨膜蛋白。

在本发明的另一种优选实施方案中，活性釉质物质能激活G-蛋白-连接的表面受体，它能间接地使独立的质膜结合酶或离子通道激活或失活。受体和酶和/或离子通道之间的相互作用，通常是由诸如G-蛋白(GTP-结合调控蛋白)的第三种蛋白介导的，它能激活细胞内介质，例如，但不局限于环化AMP，InsP3和Ca²⁺。

诸如白介素，IFNγ和TNFα的细胞因子，都在免疫反应的调节中发挥重要作用。特别感兴趣的是作为T细胞分化成TH1和TH2亚型的一部分的细胞因子基因调控。例如，细胞因子的作用可能通过它的特异性受体介导，所述受体能启动一种信号传导途径，该途径本身能导致细胞因子通过反馈机制释放。

正如在实施例1中所证实的，针对细菌细胞壁产物，牙釉蛋白对细胞因子释放和炎性表面受体的调控具有调节作用。因此，本发明的一种实施方案涉及活性釉质物质在制备药物组合物中的用途，该组合物用于通过介导一种信号调节免疫反应，所述信号是通过诸如IL-2R，IL-4R，IL-10R，IFNγR和TNFαR的细胞因子受体介导的。另外，由于细胞因子的释放是通过它们的表达水平调控的，活性釉质物质还可以通过启动一种或多种细胞因子在哺乳动物中的表达水平的上调和/或下调，调节免疫反应，从而调节一种或多种细胞因子的释放和/或功能。

在本发明的一种特别优选的实施方案中，一种活性釉质物质通过TNFαR介导免疫反应的调控。TNFα受体是在除了红细胞以外的所有类型的体细胞上表达的。业已披露了两种受体，55kDa的受体(TNF-R1；又被命名为：CD120a，还被称为TNF受体超家族成员1A(TNF-RSF1A))和75kDa的受体(TNF-R2；又被命名为：CD120b，还被称为TNF受体超家族成员1B(TNF-RSF1B))。TNFαR与NGF的低亲和力受体相关，并且与人类细胞表面抗原CD40相关，并且能在刺激过的T-细胞和B-淋巴细胞上强表达。第三种受体亚型是在正常人肝脏中表达的。它能结合TNFα但不能结合TNFβ。

业已发现了两种受体亚型的不同作用。似乎是p55受体的结合，特异性导致了细胞粘附分子ICAM-1，E-选择蛋白，V-CAM-1，和CD44的诱导，而p55和p75受体的结合，诱导了α-2整联蛋白的表达。除了膜结合受体之外，业已披露了若干种能结合TNF的可溶性蛋白。这种分子量大约为30kDa的蛋白被称为T-BP-1和T-BP-2(肿瘤坏死因子结合蛋白)，它来自所述膜受体的TNF-结合结构域。它们有可能通过抑制TNF与它的受体的结合，起着TNF活性的生理学调节剂的作用。

IL-2的生物学活性是通过几乎只能在激活的T-细胞，而不能在静息T-细胞上表达的膜受体介导的。IL-5和IL-6能调节IL-2受体的表达。在本发明的另一种优选实施方案中，披露了一种能通过IL-2R调节免疫反应的活性釉质物质。

存在三种不同类型的IL-2受体，它们是以不同方式，独立地表达的。高亲和力IL-2受体占由细胞表达的所有IL-2受体的大约10％。该受体是由两种亚基组成的膜受体复合物：IL-2R-α(TAC抗原＝T-细胞激活抗原；p55)和IL-2R-β(p75；新的名称为：CD122)。p75是以组成形式在静息T-淋巴细胞，NK-细胞，和多种其他细胞类型上组成型表达的，而p55的表达通常只能在细胞激活之后出现。p75与IL-2介导的信号传导相关。另外，IL-2受体与多种其他蛋白(p22，p40，p100)相关，这些蛋白被认为与调节受体链的构象改变，受体介导的细胞吞噬作用，以及其他信号传导过程相关。鉴定的蛋白之一是95kDa的细胞粘附分子ICAM-1，它有可能将IL-2受体集中在细胞与细胞接触的部位，并由此可能介导旁分泌活性，例如，在IL-2-介导的T-细胞刺激期间。与p75相关的另一种蛋白是被称为Ick的酪氨酸特异性蛋白激酶。其他激酶可能同样与IL-2受体相关。业已鉴定了两种这样的激酶，它们被称为fyn和1yn。另外，IL-2受体信号传导还可以通过vav介导。最近，业已披露了第三种64kDa的IL-2受体亚基，它被命名为γ。该亚基是产生高亲和力和中等亲和力IL-2受体所必需的，但是不能通过它本身结合IL-2。最近业已证实了IL-2受体的γ亚基是IL-4和IL-7受体的成分。它还有可能是IL-13受体的成分。

激活的淋巴细胞能连续分泌TAC抗原的42kDa的片段。该片段能在血清和血浆中循环，并且起着可溶性IL-2受体的作用(sIL-2R)。该可溶性受体的浓度在不同的病理学状态下具有很大差别。

在本发明的另一种优选实施方案中，一种活性釉质物质能激活IFNγR。业已披露了分子量在70-160kDa之间的多种IFNγR的结合蛋白。这种蛋白能在除了成熟的红细胞以外的所有类型的人类细胞上表达。在单核细胞和其他造血细胞中表达的所述受体的分子量为140kDa。在其他细胞类型中观察到54kDa的蛋白。

IL-4的生物学活性是通过IL-4受体(IL-4R)介导的。在本发明的一种优选实施方案中，活性釉质物质能激活IL-4R。IL-4受体的细胞外结构域与Epo，IL-6的受体和IL-2受体的β链相关，将其命名为CD124。业已披露了两种形式的所述受体，其中之一是分泌型的。分泌型受体仅包括细胞外IL-4结合结构域，并且能够阻断IL-4活性。业已证实能以与IL-4受体相同的亲和力结合IL-4的IL-4结合蛋白(IL-4-BP)，是一种可溶性IL-4受体变体。可溶性受体可能通过抑制受体结合或通过发挥转运蛋白的作用，起着细胞因子活性的生理学调节剂的作用。IL-4-介导的细胞内信号传导的机制在很大程度上尚属未知。IL-4能影响细胞内钙含量，并且还可能影响肌醇磷脂和蛋白激酶C的代谢。

在人体中，IL10是通过激活的CD8⁺外周血T-细胞，通过抗原特异性和多克隆激活之后的Th₀，Th₁，和Th₂-样CD4⁺T细胞克隆，通过B-细胞淋巴瘤，以及通过LPS-激活的单核细胞和肥大细胞产生的。IL-4和IL10能抑制单核细胞的IL10的合成。在本发明的一种优选实施方案中，一种活性釉质物质能激活IL10受体(IL-10R)。业已克隆了鼠IL-10受体。该受体是一种大约为110kDa的蛋白，它能特异性地结合鼠IL-10。该受体在结构上与IFN的受体相关。

釉质基质衍生物对外周淋巴细胞的作用表明，猪牙釉蛋白衍生物Emdogain能诱导CD25/CD4阳性淋巴细胞体外增殖的略微增强，同时伴随着CD19阳性B-淋巴细胞的减少(Petinaki，E.，S.Nikolopoulos，和E.Castanas.1998。在体外使用Emdogain之后，外周淋巴细胞的低刺激。J Clin Periodontol.25：715-20)。不过，该文献的作者不能证实对免疫球蛋白和/或细胞因子(IL-2和IL-6)生产了任何显著影响。

有趣的是，本发明人业已发现多种成纤维细胞的细胞培养物(来自牙周韧带，鱼鳍或禽皮肤的胚胎，真皮细胞)，与未刺激过的培养物相比，在用EMDOGAIN(BIORA AB，SWEDEN)刺激时，能产生两倍的转化生长因子(TGF-β1)。上述发现支持了活性釉质物质对失衡的免疫反应的潜在调节影响的观点。

釉质基质是釉质的前体，并且可以从任何相关的天然来源获得，即牙齿处在发育中的哺乳动物。一种合适的来源是来自宰杀的动物，例如牛、猪或羊的发育中的牙齿，例如，另一种来源是鱼皮。

正如以前所披露的(EP-B-0 337 967和EP-B-0 263 086)，釉质基质可以用发育中的牙齿制备。剥离釉质基质，并且制备釉质基质衍生物(EMD)，例如，通过用诸如缓冲液，稀酸或碱或水/溶剂混合物的水溶液提取，然后进行大小排阻，脱盐或其他纯化步骤，或者随后进行冷冻干燥。还可以通过加热或溶剂处理使酶失活，在这种情况下，所述衍生物能够以液体形式保存，而不进行冷冻干燥。

作为釉质基质衍生物或蛋白的另一种来源，人们还可以使用本领域技术人员所熟知的普遍采用的合成方法，或使用培养过的真核细胞和/或原核细胞，或者通过DNA技术进行修饰。因此，釉质基质蛋白可以是重组产生的，并且还可以是遗传学修饰的(例如，参见Sambrook，J.等：Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。

在本发明中，釉质基质衍生物或釉质基质蛋白衍生物(EMD)是釉质基质的衍生物，它包括一种或若干种釉质基质蛋白或所述蛋白的部分，它们是通过可变剪接或加工天然产生的，或通过对天然长度的蛋白进行酶促或化学裂解产生的，或通过在体外或体内合成多肽产生的(重组DNA方法，或培养植物或动物细胞的二倍体细胞)。釉质基质衍生物还包括与多肽或蛋白相关的釉质基质。所述多肽或蛋白可以与合适的可生物降解的载体分子结合，如多胺酸或多糖，或它们的组合。另外，术语釉质基质衍生物还包括合成的类似物质。

蛋白是由通过肽键连接在一起的氨基酸残基组成的生物学大分子。线性氨基酸聚合物形式的蛋白又被称为多肽。通常，蛋白具有50-800个氨基酸残基，因此，其分子量在大约6000-大约数十万道尔顿或更高的范围内。小蛋白被称为肽或寡肽。

釉质基质蛋白是正常情况下存在于釉质基质中的蛋白，即釉质前体(Ten Cate：Oral Histology，1994；Robinson：Eur.J.OralScience，Jan.1998，106 Suppl.1：282-91)，或可以通过裂解所述蛋白获得的蛋白。一般，所述蛋白的分子量低于120,000道尔顿，并且包括牙釉蛋白，非-牙釉蛋白，富脯氨酸非-牙釉蛋白和tuftelins。

用于本发明的蛋白的例子是牙釉蛋白，富脯氨酸非牙釉蛋白，tuftelins，簇蛋白，血清蛋白，唾液蛋白，ameloblastin，sheathlin，和它们的衍生物，以及它们的混合物。含有活性釉质物质的用于本发明中的制剂，还可以包括至少两种上述蛋白类物质。另外，用于本发明中的其他蛋白出现在市售产品EMDOGAIN(BIORA AB，Sweden)中。

EMDOGAIN(BIORA AB，S-205 12 Malmo，Sweden)包括30mg釉质基质蛋白，在大约80℃下加热3小时，以便使残余的蛋白酶失活，以及1ml载体溶液(丙二醇藻酸酯)，在使用之前对它们进行混合，除非所述蛋白和载体是分别测试的。分别位于20，14和5kDa的主要蛋白峰之间的重量比例大约为80/8/12。

一般，釉质基质的主要蛋白被称为牙釉蛋白。它们占基质蛋白的大约90％w/w。其余10％w/w包括富脯氨酸非牙釉蛋白，tuftelins，簇蛋白，血清蛋白和至少一种唾液蛋白。不过，还可能存在其他蛋白，如珐琅蛋白(ameloblastin，sheathlin)，业已证实了它与釉质基质相关。另外，各种蛋白能够以若干种不同的大小(即不同的分子量)合成和/或加工。因此，业已发现釉质基质中的主要蛋白牙釉蛋白是以几种不同的大小存在的，它们共同构成了超分子聚集物。它们主要是疏水性物质，能在生理学条件下形成聚集物。它们可以携带其他蛋白或肽或者是其他蛋白或肽的载体。

发育中的牙釉的牙釉蛋白是组织特异性蛋白，富含脯氨酸，亮氨酸，组氨酸和谷氨酰残基，并且是通过内层牙釉上皮细胞的成釉质细胞合成的。所述蛋白构成了大量的细胞外基质，该基质通过羟基磷灰石相矿物化，成为成熟的牙釉。检查来自多种哺乳动物的牙釉蛋白的氨基酸序列，发现了高度进化序列保守性，暗示了特殊的功能。最近，业已证实在釉质基质中的多种牙釉蛋白成分，是通过一系列分泌后蛋白水解加工和通过由牙釉蛋白基因产生的可变剪接的mRNAs的表达产生的，所述基因位于性染色体上。对重组牙釉蛋白的物理化学研究业已证实，它们在体外经历了自我组装过程，产生了超分子‘纳米球’结构，并且最近的体内发现，揭示了所述纳米球在分泌性釉质基质的超结构组构中的功能作用。这种组构作用能导致最早的矿物晶体的组织化发育。

对牙釉蛋白表达的最新研究业已证实了小鼠牙釉蛋白RNA的可变剪接，产生了7种不同的mRNAs，这些mRNA编码长度为194-44个氨基酸残基的牙釉蛋白。

其他蛋白物质也适用于本发明中。其例子包括诸如富含脯氨酸的蛋白和聚脯氨酸蛋白。适用于本发明的物质的其他例子包括所述蛋白的聚集物，釉质基质衍生物和/或釉质基质蛋白以及釉质基质，釉质基质衍生物和釉质基质蛋白的代谢物。所述代谢物可以具有任何大小，从蛋白的大小到短肽的大小。

如上文所述，用于本发明的蛋白，多肽或肽，通常具有最多为大约120kDa的分子量，通过SDS PAGE电泳测定，例如，最多为100kDa，90kDa，80kDa，70kDa或60kDa。

用于本发明中的蛋白通常是以制剂形式存在的，其中，所述活性釉质物质在所述制剂中的蛋白含量为大约0.005％w/w-100％w/w，如，大约0.5-99％w/w，大约1-95％w/w，大约10-95％w/w，大约10-90％w/w，大约15-90％w/w，大约20-90％w/w，大约30-90％w/w，大约40-85％w/w，大约50-80％w/w，大约60-70％w/w，大约70-90％w/w，或大约80-90％w/w。

一种用于本发明中的活性釉质物质的制剂，还可以包括具有不同分子量的活性釉质物质的混合物。

釉质基质蛋白可以划分成高分子量部分和低分子量部分，并且，业已发现，确定的釉质基质蛋白级份对牙周缺陷(即牙周创伤)的治疗具有有价值的特性。该级份包括乙酸可提取的蛋白，通常被称为牙釉蛋白，并且构成了釉质基质的低分子量部分(参见EP-B-0 337 967和EP-B-0 263 086)。

在本发明中，所述活性蛋白不局限于釉质基质的低分子量部分。目前，优选的蛋白包括釉质基质蛋白，如分子量(在体外通过SDS-PAGE测定)低于大约60,000道尔顿的牙釉蛋白，不过，分子量超过60,000道尔顿的蛋白同样具有作为促进结缔组织生长候选物的有希望的特征。

因此，用于本发明中的活性釉质物质的分子量最高为大约40,000Da，例如，分子量为大约5,000Da至大约25,000Da。

通过分离所述蛋白，例如，通过沉淀，离子交换层析，制备电泳，凝胶渗透层析，反相层析或亲和层析分离，可以纯化不同分子量的牙釉蛋白。

牙釉蛋白分子量的组合可以改变，从主要为20kDa的化合物到具有40至5kDa的多种不同分子量的牙釉蛋白的聚集物，以至主要为5kDa的化合物。正常情况下存在于釉质基质中的其他釉质基质蛋白，如tuftelin或蛋白水解酶可以添加到所述牙釉蛋白聚集物中并且由所述聚集物携带。

在本发明的特别优选的实施方案中，用于制备用来预防和/或治疗哺乳动物的以所述哺乳动物对一种免疫原的免疫反应失衡为特征的状况的所述活性釉质物质，选自氨基酸长度为大约2-13kDa的任何可溶性牙釉蛋白型肽，包括氨基酸长度为2-4.5kDa，3-5.5kDa，4-6.5kDa，5-7.5kDa或5-13kDa的可溶性基于牙釉蛋白的肽，所述肽包含在如图2所示出的通过对加工过的牙釉蛋白进行HPLC分析的第三和/或第四个峰代表的洗脱液中。

在本发明的一种优选实施方案中，所述加工过的牙釉蛋白产物是5kDa的多肽。

根据本发明，活性釉质物质可以与其他活性药物一起使用，如抗细菌，抗炎，抗病毒，抗真菌物质，或与局部化疗，细胞程序死亡诱导剂，诸如TGFβ，PDGF，IGF，FGF，EGF的生长因子，角质细胞生长因子或它们的肽类似物组合。酶-本身存在于釉质基质或它的制剂中或是添加的-还可以与釉质基质，釉质基质衍生物和/或釉质基质蛋白，特别是蛋白酶组合使用。

为了给个体(动物或人类)施用，优选将活性釉质物质和/或它的制剂制备成含有所述活性釉质物质，并且任选含有一种或多种可以药用的赋形剂的药物组合物。

要施用的含有所述活性釉质物质的组合物可能适合通过任何合适的途径施用，例如，通过软管，注射器，喷雾或输液装置给患者系统施用。另外，组合物可能适合与手术结合使用，例如，通过输液进入血液，淋巴，腹水，或脑脊液全身施用，或通过吸入施用。

在下面提供了含有活性釉质物质的合适组合物的例子。

为了给个体(动物或人类)施用，优选将所述物质制备成含有所述物质，并且任选含有一种或多种可以药用的赋形剂的药物组合物。

例如，所述组合物可以是液体，半固体或固体组合物形式的，例如，但不局限于溶解的输液液体，如消毒盐水，Ringer′s溶液，葡萄糖溶液，磷酸缓冲盐溶液，血液，血浆或水，粉末，微胶囊，微球体，纳米颗粒，喷雾剂，气溶胶，吸入装置，溶液，分散液，悬浮液，乳液，混合物。

所述组合物可以按照常规药物学方法制备，例如，参见“Remington：The science and practice of pharmacy”20th ed.Mack Publishing，Easton PA，2000 ISBN 0-912734-04-3和“Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology”，edited bySwarbrick，J.&J.C.Boylan，Marcel Dekker，Inc.，New York，1988 ISBN 0-8247-2800-9。

含有活性物质的药物组合物可以作为药物输送系统。在本文中，术语“药物输送系统”表示药物组合物(药用制剂或剂型)，该组合物在施用时给人或动物的身体提供所述活性物质。因此，术语“药物输送系统”包括多种药物组合物，如液体，粉末和喷雾剂。

用于本发明的组合物中的可以药用的赋形剂的选择以及它的最佳浓度一般无法预测，并且，必须根据它们的实验测定确定。另外，一种可以药用的赋形剂是否适用于药物组合物中一般取决于选择哪一种类型的剂型。不过，药物制剂化领域的技术人员可以从文献中找到有关指南，例如，″Remington：The science and practice ofpharmacy″20th ed.Mack Publishing，Easton PA，2000 ISBN 0-912734-04-3。

可以药用的赋形剂是一种物质，它对施用该组合物的个体基本上是无害的。这种赋形剂通常满足由国家药物管理机构规定的要求。官方药典，如英国药典，美国药典和欧洲药典，规定了众所周知的可以药用的赋形剂的标准。

下面提供了用于本发明的相关药物组合物的概述。该概述基于特定施用途径。不过，可以理解的是，在这种情况下，可以药用的赋形剂能够以不同的剂型或组合物使用，特定可以药用的赋形剂的使用，不局限于所述赋形剂的特定剂型或特定功能。

肠胃外组合物：

为了全身使用，本发明的组合物可以包括传统上无毒性的可以药用的载体和赋形剂，包括微球体和脂质体。

用于本发明的组合物包括所有类型的固体，半固体和液体组合物。例如，特别相关的组合物是溶液，悬浮液，乳液。

可以药用的赋形剂可以包括溶剂，缓冲剂，防腐剂，螯合剂，抗氧化剂，稳定剂，乳化剂，悬浮剂，稀释剂。所述不同制剂的例子参见下文。

在一种最优选的实施方案中，将Emdogain(BIORA AB，Malmo，Sweden)的冷冻干燥粉末以30mg/ml的最终浓度溶解在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中。

其他同样优选的实施方案的例子是以如下终浓度溶解在磷酸缓冲的盐溶液(PBS)中的冷冻干燥的Emdogain(BIORA AB，Malmo，Sweden)粉末：0.01-50mg/ml，如0.01-10mg/ml，0.1-10mg/ml，0.01-5mg/ml，0.1-5mg/ml，0.01-1mg/ml，0.1-1mg/ml，或0.01-0.05mg/ml，包括大约0.01mg/ml，0.02mg/ml，0.03mg/ml，0.04mg/ml 0.05mg/ml，0.06mg/ml，0.07mg/ml，0.08mg/ml，0.09mg/ml，0.1mg/ml，0.2mg/ml，0.3mg/ml，0.4mg/ml，0.5mg/ml，1mg/ml，10mg/ml，20mg/ml，30mg/ml，35mg/ml，40mg/ml，45mg/ml，或50mg/ml的浓度。

另外，正如在实施例2中所披露的，给需要的哺乳动物施用的釉质基质衍生物制剂的重量应当根据要治疗的哺乳动物的个体体重和需要的EMD效果进行调整，并且最优选为大约0.01-100mgEMD/kg体重，如大约0.01-50mgEMD/kg，0.05-10mgEMD/kg，0.01-1mgEMD/kg，0.1-50mgEMD/kg，0.1-25mgEMD/kg，0.1-15mgEMD/kg，或0.1-10mgEMD/kg，或0.1-1mgEMD/kg体重，还取决于釉质基质衍生物是以高剂量或低剂量使用。

因此，典型的低剂量包括至多0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07，0.08，0.09，0.1，0.12，0.15，0.17，0.2，0.5，1，1.2，1.5，1.6，1.8，2.2，5.5，6，7，8，9，或9.9mgEMD/kg体重，而典型的高剂量包括至少10，15，18，20，25，50，75，或100mgEMD/kg体重。

上述药剂可以每周使用至少一次，如至少1，2，3，4，5，6，7，或更多次/周，使用1-30天，或者使用10-90天，或更长。

各种制剂的例子：

溶剂的例子包括，但不局限于水，醇，血液，血浆，脑脊液，腹水和淋巴液。

缓冲剂的例子包括，但不局限于柠檬酸，乙酸，酒石酸，乳酸，氢磷酸，碳酸氢盐，磷酸盐，二乙胺等。

螯合剂的例子包括，但不局限于EDTA钠和柠檬酸。

抗氧化剂的例子包括，但不局限于丁基化羟基苯甲醚(BHA)，抗坏血酸及其衍生物，生育酚及其衍生物，半胱氨酸及其衍生物。

粉末成分的例子包括，但不局限于藻酸，胶原，乳糖，在涂到伤口上之后能形成凝胶的粉末(吸收液体/伤口渗出液)。

稀释剂和崩解剂的例子包括，但不局限于乳糖，蔗糖，emdex，磷酸钙，碳酸钙，硫酸钙，甘露糖醇，淀粉和微晶纤维素。

结合剂的例子包括，但不局限于蔗糖，山梨糖醇，合欢胶，藻酸钠，明胶，淀粉，纤维素，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟丙基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇。

附图说明

图1：

用10微升FITC或PE偶联的单克隆抗体温育用LPS，PepG和基质蛋白组合物处理过的全血样品。通过流式细胞术分析抗原表达，使用10微升抗-CD14，抗-CD44，抗-ICAM-1，以及同种型阴性对照抗-IgGl和抗-IgG2。所有样品都是在FACScan上使用CellQuest软件进行分析的。

图2：

按照Gestrelius等于1997年披露的方法，从不成熟的猪釉质中提取牙釉蛋白。在溶解于30％的乙腈中之后，使用大小排阻柱在JascoHPLC上分离所述样品。四个不同的峰表示复合物，完整长度的蛋白和可溶性、加工过的牙釉蛋白肽。

图3：

釉质基质衍生物导致了促炎细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)生产的减少，同时伴随着抗炎细胞因子IL-10释放的增加。

参考文献

1.Foster，S.J.1992.Analysis of the autolysins of Bacillus subtilis 168 duringvegetative growth and differentiation by using renaturing polyacrylamide gelelectrophoresis.J Bacteriol.1174：464-70.

2.Gestrelius，S.，C.Andersson，D.Lidstrom，L.Hammarstrom，and M.Somerman.1997.In vitro studies on periodontal ligament cells and enamel matrix derivative.JClin Periodontol.24：685-92.

3.Hoang，A.M.，T.W.Oates，and D.L.Cochran.2000.In vitro wound healingresponses to enamel matrix derivative[In Process Citation].J Periodontol.71：1270-7.

4.Petinaki，E.，S.Nikolopoulos，and E.Castanas.1998.Low stimulation of peripherallymphocytes，following in vitro application of Emdogaln.J Clin Periodontol.25：715-20.

实验部分

实验1

本研究的目的是研究牙釉蛋白对人类全血的先天免疫机制的潜在调控作用。特别感兴趣的是针对细菌细胞壁产物的细胞因子释放和炎性表面受体的调控。

材料和试剂

外周静脉血是从健康的职员体内获得的，并且收集在装有0.129M柠檬酸钠的真空容器中(Becton Dickinson Vacutainer System Eur，Meylan Cedex，France)。以30微克/毫升的终浓度将冷冻干燥的Emdogain粉末(BIORA AB，Malmo，Sweden)溶解在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中。将大肠杆菌026：B6脂多糖(LPS；Difco Laboratories，Detroit，MI，USA)悬浮在无热源无菌盐水中，并且将10纳克/毫升的LPS直接添加到微量离心管中的血液样品中。脂磷壁酸(LTA)是从Sigma化学品公司(St.Louis，Miss.，USA)购买的。肽聚糖(PepG)是按照以前披露的方法从金黄色葡萄球菌中分离的(Foster，S.J.1992J Bacteriol.174：464-70)。对营养生长和分化期间枯草芽孢杆菌168中的自溶酶的分析是通过使用复性聚丙烯凝胶酰胺电泳进行的，以10微克/毫升的浓度将所述自溶酶直接添加到血液样品中。

全血实验

外周静脉血是从健康的职员体内获得的，并且收集到装有0.129M柠檬酸钠的真空容器中(Becton Dickinson Vacutainer System Eur，Meylan Cedex，France)。将全血样品分装到1.5ml的微量离心管中(Sorenson，BioScience Inc.，Salt Lake City，Utah，USA)。用LPS，PepG或LTA刺激之前，在37℃下，用以0，45，150，300，450，600或750克/毫升的终浓度溶解的Emdogain预温育所述血液样品2小时。

然后用10纳克/毫升LPS，10克/毫升PepG或100克/毫升LTA刺激所述血液样品4或6小时。然后在冰上冷却所述血液，并且离心(14000g，1分钟)，并且将血浆移出，进行细胞因子蛋白检测。作为对照，添加等体积的0.9％的氯化钠，以取代所述细菌产物。在抽血之后马上分析基础细胞因子的含量。

初步研究业已证实，与用LPS刺激的4小时相比，PepG和LTA在刺激之后6小时产生TNF-α峰值。因此，选择4小时的LPS刺激和6小时的PepG和LTA刺激。

ELISA技术。按照生产商的说明，用通过商业渠道获得的固相夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(PeliKline Compact，CLB Labs，Amsterdam，The Netherlands)测定TNF-α，IL-6和IL-10的血浆浓度。TNF-α，IL-6和IL-10 ELISA的检测限分别为3，0.4和3pg/ml。在450nm波长下用ELISA读数器对所述平板进行读数(Thermo maxmicroplate reader，Molecular Devices，Menlo Park，CA.，USA)。

抗体标记和流式细胞术。在刺激之后，以100微升的体积马上将全血样品分装到Falcon聚苯乙烯试管(Becton Dickinson，LincolnPark，New Jersey，USA)中，并且在室温下与10微升FITC或PE偶联的单克隆抗体一起遮光温育30分钟。在洗涤和固定之前，用FACS裂解溶液(Becton Dickinson，San JoSe，CA.，USA)裂解红细胞。用CellWash(Becton Dickinson)洗涤样品3次，然后用1％甲醛(Cell FIX，Becton Dickinson，Erembodegem，Belgium)固定。通过流式细胞术分析抗原表达，使用10微升抗-CD14(18D11，DiatecAS，Oslo，Norway)，抗-CD44(Diatec AS，Oslo，Norway)，抗-ICAM-1(Diatec AS，Oslo，Norway)，以及同种型阴性对照抗-IgG1(1B9)和抗-IgG2(5A7)(均为Diatec AS)。所有样品都是在FACScan(Becton Dickinson)上用CellQuest软件进行分析的。结果如图1所示。

在每一个实验中，通过在分布图上的特有位置，将所述单核细胞群确定为CD14阳性细胞。在按照上述特征进行适当的门控之后，测定所述单核细胞群中的荧光强度(FI)，并且记录每一次测定的平均FI(几何平均值)。

统计学分析。数据是以平均值±平均值的标准误(SEM)形式提供的。通过单向方差分析(ANOVA)，分析所述数据，然后进行Tukey测验。P＜0.05被认为是显著的。

如图3所示，釉质基质衍生物导致了促炎细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)生产的减少，这种减少伴随着抗炎细胞因子IL-10释放的增加。以上结果表明釉质基质衍生物具有有效的免疫调节作用。它还表明，釉质基质衍生物可能对伴随多器官衰竭的败血症具有治疗作用。另外，釉质基质衍生物可能对与急性或慢性炎症相关的其他疾病具有治疗作用，如炎性胃肠疾病，移植器官或整形移植物排斥，类风湿关节炎，动脉硬化和若干种其他疾病。

实验2

在本研究中，使用猪脓毒症模型，在体内检验了釉质基质衍生物的治疗作用。该模型根据连续输液大肠杆菌LPS，产生了急性炎性反应。经过一段时间之后(通常在注射LPS半小时-1小时之后)，所述动物出现了脓毒性休克，体现了严重脓毒症的病理生理学特征。该模型是经体外发现与可能的临床实验联系在一起的有效工具。

在脓毒症发作之前30分钟，通过静脉内药团注射(＝注射LPS，1.7微克/千克体重/小时)，给猪施用釉质基质衍生物(最大剂量为5毫克/千克体重，即计算的血清浓度为大约100毫克/升)。据报导，釉质基质衍生物在血液中的半衰期为240分钟。因此，为了保持EMD的治疗性血清水平，利用一种静脉内输液装置每小时输送50毫克包含在100毫升Ringer’s溶液(pH＝6)中的釉质基质衍生物。对于对照来说，用相同方法处理3只‘假处理’猪，所不同的是不施用EMD，而是代之以用血清白蛋白(“安慰剂”)进行注射和输液。

连续记录血液动力学参数，每小时记录1次，直到在输注细菌毒素(LPS)之后5小时该实验结束时为止。在该实验开始之前(0时间)，在开始注射釉质基质衍生物或安慰剂之后马上(0-a时间)，在开始注射LPS之后马上(1时间)以及在脓毒症发作之后每1个小时，从肝静脉和门静脉，腹动脉，和肺动脉中采集血样，并且记录临床参数，并且分析血液平衡参数，器官功能标记物(如血清天冬氨酸转氨酶(ASAT)，血清丙氨酸转氨酶(ALAT)，和作为肝脏功能标记物的血清碱性磷酸酶活性，和作为肾功能标记物的γ-转谷氨酰酶(γ-GT)和肌酐酸，和炎性介质(TNF-α，IL-1β和IL-6)。在所述实验期间，在预定的时间点上分析每小时从所述猪体内采集的血液样品的所述器官功能标记物。所述血液样品是采用挪威国立医院血液学实验室的标准医院方法分析的。通过ELISA，使用购自R&D Systems Inc.(Minneapolis，MN，USA)的猪TNF-α/TNSF2 Quantikine P ELISA试剂盒(#PTA00)，猪IL-6 Quantikine P免疫分析试剂盒(P6000)，和猪IL-1β/IL-1F2Quantikine P ELISA试剂盒(#PTA00)分析相同血液样品中的炎性标记物。采用生产商提供的标准方法，不进行省略或改进。

在该实验结束之后(所述动物死亡，或在连续注射釉质基质衍生物或安慰剂和LPS 5小时之后)，对所述动物实施安乐死，并且进行尸体解剖。对内部循环器官进行肉眼检查，并且对组织进行取样，以便按照研究计划进行组织学评估。

结果

1号猪

物理学数据：雌性；总体重23.5kg；健康

手术：无并发症

治疗：安慰剂(包含在50毫升PBS药团注射液中的25毫克血清白蛋白，每小时输液的100毫升Ringer’s溶液中的10毫克SA，总的SA剂量＝75毫克)，LPS(溶解在4.5毫升PBS中的40微克/小时，连续注射5小时；总的PBS剂量＝200微克)。

血液动力学观察：所述动物没有表现出对注射安慰剂的反应。出现了对LPS注射的强的初步反应，随后出现的是脓毒性休克状况，该状况在整个实验中持续出现。休克的发作是在LPS注射开始之后1小时内出现的。

死亡时循环器官的解剖学和肉眼外观：所有循环器官具有正常的解剖学。病理学指征出现在肝脏中，肝脏中出现了充血和止血的指征。

血液学：所述动物最初表现出正常的血液学参数值。在该实验中，大部分参数值处在正常值范围内。唯一的例外出现在LPS注射之后4小时和5小时，此时出现了B-中性粒细胞的增加和B-淋巴细胞的减少。

生物化学：在整个实验中，所有的酶活性和肌酐酸处在正常值范围内。观察到了肌酐酸的缓慢但是稳定的减少，不过，它的值从来没有降低到低于正常值。所述猪最初表现出ALP的略微的增加，不过，在施用LPS之前，这种增加恢复正常。在整个实验中，ASAT值同样偏高，不过，没有表现出因为LPS注射而产生的显著变化。

细胞因子：在施用LPS之后，所述猪表现出TNF值的迅速增加。在开始注射LPS之后的1小时之前，所述值超过了检测限(1500微克/升)，并且在整个实验中保持在该水平。在注射LPS之后，IL-6也迅速增加。在本实验中，IL-6水平一直稳定地增加，最后停留在3500微克/升的水平上。IL-1β表现出由LPS注射导致的缓慢增加，这种增加在5小时之后停留在大约700微克/升的水平。

评价：在该实验结束时，血液动力学参数表明了肝脏和肺衰竭。弱的和下降的排尿，表明了肾功能衰弱。器官衰竭的第一个指征是在LPS注射开始之后2小时出现的，在施用LPS之后30分钟观察到了战栗。血液学和生物化学参数值表明，其生命支持系统正常工作，并且，所观察到的作用是通过毒素注射引起的，而不是因为手术的创伤引起的。所述炎性状态表明，所述猪患有脓毒性休克。没有细胞因子值恢复的迹象。这头猪极有可能不能在实验中存活。

2号猪

物理学数据：雌性；总体重21.5kg；健康

手术：无并发症

治疗：釉质基质衍生物(包含在50毫升PBS药团注射液中的21.5毫克釉质基质衍生物，每小时输液的100毫升Ringer’s溶液中的10毫克釉质基质衍生物，总的釉质基质衍生物剂量＝71.5毫克)，LPS(37微克/小时，包含在4.5毫升PBS中，连续注射5小时；总的LPS剂量＝185微克)。

血液动力学观察：所述动物没有表现出对EMD药团注射的反应。出现了对LPS注射的非常迅速而且显著的初步反应(心动过速和加快的动脉流)，随后在LPS注射开始之后大约1小时出现脓毒性休克状况。在这一阶段，观察到了多器官衰竭的早期指征。不过，在随后的时间，所述血液动力学值稳定化，并且恢复了器官功能。

死亡时循环器官的解剖学和肉眼外观：所有循环器官具有正常的解剖学，在检查过的器官中没有发现肉眼可见的病理学指征。

血液学：所述动物最初表现出正常的血液学参数值。在该实验中，所有参数值处在正常值范围内。

生物化学：在整个实验中，所有的酶活性和肌酐酸处在正常值范围内。所述猪最初表现出ALP的略微增加，不过，通过注射釉质基质衍生物或LPS时，该值保持不变。在该实验即将结束时ASAT值略微提高，不过，没有表现出由釉质基质衍生物或LPS注射而产生的任何显著变化。

细胞因子：注射釉质基质衍生物，不会引起分析的循环细胞因子的任何增加。不过，在施用LPS之后，所述猪表现出TNF值的快速增加。在开始注射LPS之后的1小时之前，所述值提高到超过检测限(1500微克/升)，并且在该水平保持大约4小时。4小时之后，TNF值降低，并且表现出正常化的迹象。在注射LPS之后，IL-6同样快速增加。在正常实验中，IL-6水平一直稳定地增加，在1小时之后提高到4800微克/升的峰值。在5小时之后，IL-6值似乎下降，不过，由于该实验(计划)的结束，这种趋势没有得到证实。IL-1β表现出由LPS注射所导致的缓慢的增加，在5小时之后停留在大约1000微克/升的水平。

评价：所述动物似乎从明显的脓毒性休克和器官衰竭发生中恢复过来，表现在血液动力学参数以及肾功能(排尿)恢复和腹水减少方面。从施用LPS之后1小时开始出现了战栗。上述发现是不寻常的，特别是在紧随所述强的对内毒素(LPS)的初步反应之后。血液学和生物化学参数值表明，它的生命支持系统正常工作，并且，所观察到的作用是由毒素注射引起的，而不是由手术的创伤引起的。所述炎性状态表明，所述猪最初患有脓毒性休克。不过，存在IL-6和TNF值缓慢恢复的迹象。IL-1β值似乎不受施用釉质基质衍生物影响。在特定时间内，所述炎性细胞因子水平持续降低，这头猪极有可能在本实验中存活下来。

3号猪

物理学数据：雌性；总体重25.0kg；健康

手术：无并发症

治疗：安慰剂(包含在100毫升PBS药团注射液中的125毫克SA，每小时输液的100毫升Ringer’s溶液中的50毫克SA，总的SA剂量＝350毫克)，LPS(43微克/小时，包含在4.5毫升PBS中，连续注射5小时；总的LPS剂量＝215微克)。

血液动力学观察：所述动物没有表现出对安慰剂注射的反应。在出现脓毒性休克状况之后，观察到了对LPS注射的低至中等的初步反应，该状况在整个实验中一直持续。休克的发作是在开始注射LPS之后大约1小时出现的。

死亡时循环器官的解剖学和肉眼外观：所有循环器官具有正常的解剖学。仅在肝脏中观察到病理学指征，它表现出充血(肿胀和发红)和止血的迹象。

血液学：所述动物最初表现出正常的血液学参数值。在该实验中，大部分参数值处在正常值范围内。唯一的例外出现在LPS注射4和5小时之后，此时，观察到B-中性粒细胞的增加和B淋巴细胞的减少。

生物化学：在整个实验中，大部分酶活性处在正常值范围内。观察到了肌酐酸的缓慢而又稳定的减少，并且，在LPS注射之后2小时，肌酐酸含量降低到低于正常值范围，并且在该实验的其余时间保持在该低水平上。所述猪最初表现出增加的ALP活性，不过，该值是稳定的，并且不受LPS注射的影响。炎性状态表明，所述猪患有脓毒性休克。没有出现细胞因子值恢复的迹象。这头猪很有可能不能在本实验中存活。

细胞因子：在施用LPS之后，所述猪表现出TNF值的迅速增加。在开始注射LPS之后的1小时之前，所述值提高到超过检测限(1500微克/升)，并且在整个实验中都保持在该水平。在LPS注射开始之后，IL-6同样迅速增加。在该实验中，IL-6含量一直稳定地增加，并且在LPS注射之后3小时提到到5000微克/升的峰值，最后停留在3900微克/升的水平上。IL-1β表现出由LPS注射所导致的缓慢增加，在5小时之后停留在大约700微克/升的水平。

评价：在本实验结束时，血液动力学参数表明了肝脏衰竭。低排尿表现出肾衰竭。从开始注射LPS之后3小时开始出现了器官衰竭的迹象。在施用LPS之后30分钟出现了战栗。血液学和生物化学参数值表明，它的生命支持系统正常工作，并且，所观察到的作用是由毒素注射引起的，而不是由手术的创伤引起的。所述炎性状态表明了所述猪患有脓毒性休克。不存在细胞因子值恢复的迹象。所述猪很有可能不能在本实验中存活下来。

4号猪

物理学数据：雌性；总体重24.5kg；健康

手术：无并发症

治疗：釉质基质衍生物(包含在100毫升PBS药团注射液中的125毫克釉质基质衍生物，每小时输液的100毫升Ringer’s溶液中的50毫克釉质基质衍生物，总的釉质基质衍生物剂量＝375毫克)，LPS(42微克/小时，包含在4.5毫升PBS中，连续注射5小时；总的LPS剂量＝210微克)。

血液动力学观察：所述动物没有表现出对EMD药团注射的反应。在开始LPS注射之后大约3小时出现了针对LPS注射的很强的初步反应，随后是弱的脓毒性休克状况。在此阶段。观察到了肺衰竭的早期状况。不过，在随后的时间点上，所述血液动力学值稳定化，并且恢复了所有器官功能。

死亡时循环器官的解剖学和内眼外观：所有循环器官具有正常的解剖学。在检查过的器官中没有发现肉眼可见的病理学指征。

血液学：所述动物最初表现出正常的血液学参数值。在正常实验中，所有参数值处在正常值范围内。

生物化学：在整个实验中，所有的酶活性和肌酐酸处在正常值范围内。所述猪最初表现出略微增强的ALP活性，不过，在注射釉质基质衍生物或LPS时，该活性保持不变。在该实验即将结束时ASAT值略微提高，不过，没有表现出直接与注射釉质基质衍生物或LPS相关的任何显著改变。

细胞因子：注射釉质基质衍生物没有引起分析的循环细胞因子的任何增加。不过，在开始LPS注射之后的1小时之前，所述值提高到超过检测限(1500微克/升)，并且在正常实验保持在该水平。在开始LPS注射之后，IL-6同样快速增加。IL-6含量在实验中一直稳定地增加，在3小时之后提高到超过检测限(＞5000微克/升)。在4小时之后，IL-6值似乎下降，并且在5小时时同样证实了这种趋势。IL-1β表现出由LPS注射所导致的缓慢的稳定增加，在5小时之后停留在大约700微克/升的水平。

评价：正如通过临床和血液动力学参数所发现的，所述动物似乎在严重脓毒性休克和器官衰竭方面受到保护。没有观察到器官衰竭，不过，在整个实验中排尿是低的。产生的腹水很少，并且没有出现战栗。这一发现是不寻常的，特别是在对内毒素(LPS)做出强的初步反应之后更是如此。血液学和生物化学参数值表明，它的生命支持系统能正常工作，并且，所观察到的作用是由毒素注射引起的，而不是由手术的创伤引起的。所述炎性状态表明，所述猪最初有脓毒性休克的发作。不过，存在IL-6和TNF值缓慢恢复的迹象。IL-1β值似乎不受施用釉质基质衍生物影响。由于时间和炎性细胞因子含量的持续降低，以及良好的血液动力学状态，有理由认为这头猪能够在本实验中存活下来。

5号猪

物理学数据：雌性；总体重25.0kg；健康

手术：无并发症

治疗：釉质基质衍生物(包含在100毫升PBS药团注射液中的125毫克釉质基质衍生物，每小时输液的100毫升Ringer’s溶液中的50毫克釉质基质衍生物，总的釉质基质衍生物剂量＝375毫克)，LPS(43微克/小时，包含在4.5毫升PBS中，连续注射5小时；总的LPS剂量＝215微克)。

血液动力学观察：作为对EMD药团注射的最初反应，所述动物表现出初步的肺血压提高。这种作用是非常短暂的(数分钟)，并且不取决于剂量。这表明了釉质基质衍生物溶液对肺毛细管具有短时间的血管收缩作用。在所述药团注射结束之前，所出现的作用已正常化。没有发现通过釉质基质衍生物注射产生的其他作用。该动物根本没有出现对LPS注射的任何显著反应。在整个实验中，没有出现脓毒性休克状况的迹象，并且器官循环是稳定的。在实验期间，对LPS流量和LPS插管的位置进行若干次控制，以便确保LPS是按照实验计划输送的。

死亡时循环器官的解剖学和肉眼外观：所有循环器官具有正常的解剖学。在检查过的器官中没有出现肉眼可见的病理学指征。

血液学：所述动物最初表现出正常的血液学参数值，只有白细胞的数量除外。白细胞的数量从手术开始(0-样品)起显著增加(为正常值的2倍)。不过，不同白细胞的相对含量似乎正常，并且，在本实验中保持稳定。在整个实验过程中，所有其他参数值处在正常值范围内。

生物化学：在整个实验中，所有酶活性和肌酐酸处在正常值范围内。ALP除外，它的含量从该实验开始起提高，不过，在整个观察阶段保持稳定。在注射釉质基质衍生物或LPS时，ALP含量保持不变。从注射LPS开始到该实验结束，ALAT值略微提高。不过，这种提高是非常小的，并且很少上升到高于正常限。

细胞因子：注射釉质基质衍生物，没有引起分析中的循环细胞因子的任何增加。不过，所述猪甚至在实验开始之前就表现出TNF值的显著增加(＞1500微克/升)，直到施用LPS之后2小时，该值都保持在高于检测范围。不过，从此时开始，观察到了TNF值的迅速降低，并且在本实验结束之前，TNF含量接近正常化。在LPS注射开始之后，IL-6迅速增加。IL-6含量稳定地增加，直到开始注射LPS之后2小时，达到2500微克/升的峰值。然后，IL-6含量逐渐降低，在注射LPS之后5小时达到正常含量。IL-1β表现出由注射LPS引起的缓慢的稳定的增加，在5小时之后停留在大约900微克/升的水平。

评价：正如通过临床和血液动力学参数所观察到的，所述动物似乎完全避免了LPS诱导的脓毒性休克和器官衰竭。在整个实验中，没有出现器官衰竭，并且排尿良好而且稳定。产生的腹水很少，并且没有出现战栗。极不寻常的是，所述动物没有以这种方式对中枢内毒素(LPS)注射作出反应。血液学和生物化学参数值表明，其生命支持系统能正常工作，并且，所出现的作用是由所述毒素注射引起的，而不是由手术造成的创伤引起的。所述炎性状态表明了所述猪最初患有弱的脓毒性休克发作，不过，存在IL-6和TNF参数值迅速恢复的明确迹象。IL-1β值似乎没有受到施用釉质基质衍生物的影响。如果允许的话，该动物在本实验中存活下来是没有疑问的。

6号猪

物理学数据：雌性；总体重23.0kg；健康

手术：无并发症

治疗：釉质基质衍生物(包含在100毫升PBS药团注射液中的115毫克釉质基质衍生物，每小时输液的100毫升Ringer’s溶液中的50毫克釉质基质衍生物，总的釉质基质衍生物剂量＝365毫克)，LPS(39微克/小时，包含在4.5毫升PBS中，连续注射5小时；总的LPS剂量＝195微克)。

血液动力学观察：作为对EMD药团注射的反应，所述动物表现出肺血压的最初的升高。该反应是临时和短暂的(数分钟)，并且不取决于剂量，这表明注射釉质基质衍生物对肺毛细管具有短时间的血管收缩作用。在所述药团注射结束之前，这种作用正常化。

出现了对注射LPS的很强的最初反应(心跳速度和动脉血流的快速而又短暂的增加)，随后在整个实验过程中持续中等程度高血压状态。没有出现脓毒性休克的迹象，也没有出现任何器官衰竭的迹象。

血液学：所述动物最初表现出正常的血液学参数值。在整个实验中，所有参数值保持在正常范围内。

生物化学：在整个实验中，所有酶活性和肌酐酸处在正常值范围内，ALP和ASAT除外，它们的含量从该实验开始起略微增加，不过，在整个观察阶段保持稳定。ALP和ASAT含量没有因为注射釉质基质衍生物或LPS而改变。

细胞因子：注射釉质基质衍生物没有引起分析的循环细胞因子的任何增加。不过，所述猪在施用LPS之后，表现出TNF值的迅速增加。在开始注射LPS之后1小时之前所述值上升到高于检测限(1500微克/升)，并且在该水平保持大约3小时。在3小时之后，TNF值迅速降低，并且在观察期结束时正常化。在开始注射LPS之后，IL-6同样迅速增加。在注射LPS之后2小时，IL-6含量上升到2700微克/升的峰值。不过，在该实验结束时，IL-6的值已经降低到接近正常值(350微克/升)。IL-1β表现出由LPS注射引起的缓慢的稳定的增加，在4小时之后上升到大约1200微克/升的峰值。

评价：正如通过血液动力学和临床参数所发现的，所述动物似乎没有出现严重的脓毒性休克和器官衰竭。在整个实验期间，没有出现器官衰竭，并且排尿多而且稳定。产生的腹水很少，并且仅仅在LPS输液之后大约4小时观察到了战栗。上述发现是不寻常的，特别是在本实验中所观察到的对内毒素(LPS)的强的初步反应之后更是如此。血液学和生物化学参数值表明，其生命支持系统能正常工作，并且，所出现的作用是由所述毒素注射引起的，而不是由手术造成的创伤引起的。所述炎性状态表明，所述猪最初患有强的脓毒性休克发作(TNF和IL-6的快速而又明显的增加)。不过，存在IL-6和TNF值全面恢复的明确迹象。IL-1β值似乎没有受到施用釉质基质衍生物的影响。如果允许的话，该动物在本实验中在本实验中存活下来是没有疑问的。

总结

对照(1和3号猪)

这两种对照都表现正常，即在开始注射LPS之后大约30分钟，它们都进入了脓毒性休克状态。这两头猪在注射LPS之后存活了5小时，不过，它们表现出严重的不受控制的脓毒性休克的明确临床体征，出现较高的体温，多器官衰竭，肾衰，低血压和降低的心输出。另外，对血液的分析发现了脓毒性休克的明确迹象。所述炎性状态还与伴随TNF-α和白介素-6强表达的急性毒素诱导的脓毒性休克吻合。在所述实验结束时，所述猪的状况是如此严重，以至于判断它们不适合继续生活。

低的釉质基质衍生物剂量(2号猪)

施用低的釉质基质衍生物剂量的猪也进入了脓毒性休克状态。不过，与假操作动物相比，对LPS的急性炎性反应的发作延迟了大约30-60分钟。在败血症发作之后，所述猪稳定化，然后缓慢地从休克中恢复过来。这头猪表现出稍好一些的临床参数，并且没有出现肾衰的迹象(通过排尿衡量)。在开始注射LPS之后5小时，按计划对这头猪实施安乐死。所述药团注射，以及紧随其后的用“低”剂量的釉质基质衍生物输液没有在这头猪体内引起不良反应的任何临床体征，也没有出现针对釉质基质衍生物注射的任何监测的参数。这头猪还表现出TNF和IL-6值降低的倾向。这一发现与所述临床观察一起暗示了该动物已经从休克中恢复过来。

高釉质基质衍生物剂量(4号猪，5号和6号猪)

三只施用高剂量釉质基质衍生物的动物无一出现由注射LPS引起的严重的脓毒性休克状况。两只动物(4号猪和6号猪)经历了初步的，但是短暂的内毒素反应，不过，该状况很快稳定，并且所述动物很快恢复，并且在整个实验中保持“受控制”状态。第三只动物(5号猪)对注射LPS根本没有反应。这些动物中没有一只出现多器官衰竭或肾衰的迹象。只有一头猪(6号猪)出现了由注射LPS诱导的典型的战栗。与对照相比，所述战栗的发作被明显延迟了(4小时)。在开始注射LPS之后5小时，按计划对这些猪实施安乐死。

在这些猪中，药团注射和随后的用“高”剂量的釉质基质衍生物输液没有引起任何持久的临床体征或不良反应。在这些猪中有两头(5号猪和6号猪)观察到了对药团注射的初步反应。这种反应是以肺动脉压力的快速而短暂的提高形式出现的，表明了高浓度釉质基质衍生物溶液(大约1.25mg/m1)的中枢药团注射，诱导了肺小动脉和/或毛细管的自发的收缩。这种作用是即时的，并且与剂量无关。所观察到的作用在数分钟内恢复正常，并且所述猪是稳定的，在药团注射结束之前表现出正常的血液动力学参数和临床状态。

在初步的LPS反应之后，TNF和IL-6值还表现出下降的趋势。实际上，在这三只动物中有两只(5号猪和6号猪)的TNF和IL-6在所述观察期结束之前接近正常化。这一发现与所述临床观察一起暗示了这些动物没有出现LPS诱导的休克和随后的多器官衰竭。在这些猪上施用的釉质基质衍生物注射液，能保护这些动物免受注射毒素的严重损伤，并因此防止所述动物出现脓毒性休克。所有三只动物都能在实验中存活下来。

Claims

1.活性釉质物质和/或活性釉质物质制剂在制备用于预防和/或治疗哺乳动物中的状况的药物组合物中的用途，其中，所述状况以所述哺乳动物对免疫原的免疫反应失衡为特征。

2.如权利要求1的用途，其中，所述活性釉质物质能调节所述哺乳动物免疫机制的功能。

3.如权利要求1或2的用途，其中，所述免疫系统的至少一部分能对所述免疫原过敏反应。

4.如权利要求1-3中任意一项的用途，其中，所述免疫系统的至少一部分是无区别地受到刺激的。

5.如权利要求1-4中任意一项的用途，其中，所述免疫系统的至少一部分不能对所述刺激作出反应。

6.如权利要求1-5中任意一项的用途，其中，所述免疫反应的失衡是局部性的。

7.如权利要求1-5中任意一项的用途，其中，所述免疫反应的失衡是系统性的。

8.如权利要求1-7中任意一项的用途，其中，所述状况以自身免疫病为特征。

9.如权利要求8的用途，其中，所述自身免疫病选自下组：

类风湿关节炎，皮肤病，过敏，硬化，动脉硬化，多发性硬化，哮喘，牛皮癣，狼疮，糖尿病，重症肌无力，慢性疲劳综合征，纤维肌痛，克隆氏病，桥本氏甲状腺炎，格雷夫斯病，阿狄森氏病，格-巴综合征和硬皮病。

10.如权利要求7的用途，其中，所述状况以系统性炎症和/或感染为特征。

11.如权利要求10的用途，其中，所述系统性状况与创伤、烧伤、手术、透析、休克和/或细菌或病毒感染相关。

12.如权利要求10的用途，其中，所述系统性状况与选自下组的疾病相关：体外膜氧合作用(ECMO)，休克，系统性炎症反应综合征(SIRS)，败血症，多器官衰竭，诸如器官和/或假体的移植物排斥，心脏和肺旁路手术，慢性炎症，哮喘和/或与应激相关的肺病，细菌感染，坏疽，软组织感染，和伤口感染。

13.如权利要求11或12的用途，其中，所述感染是由选自格兰氏阴性微生物和格兰氏阳性微生物的细菌污染引起的。

14.如权利要求13的用途，其中，所述感染是由所述微生物产生的内毒素和/或外毒素引起的。

15.如权利要求14的用途，其中，所述感染是由来自金黄色葡萄糖球菌的PepG引起的。

16.如权利要求14的用途，其中，所述感染是由来自大肠杆菌的LPS引起的。

17.如权利要求11-16中任意一项的用途，其中，包含在所述药物组合物中的所述活性釉质物质和/或所述制剂通过与由所述微生物产生的内毒素和/或外毒素结合，使由所述微生物产生的内毒素和/或外毒素的毒性作用失活。

18.如权利要求11-16中任意一项的用途，其中，包含在所述药物组合物中的所述活性釉质物质和/或所述制剂通过与由所述微生物产生的内毒素和/或外毒素的细胞受体结合，使由所述微生物产生的内毒素和/或外毒素的毒性作用失活。

19.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，包含在所述药物组合物中的所述活性釉质物质和/或所述制剂能调节所述哺乳动物体内T-辅助细胞激活的方式。

20.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，包含在所述药物组合物中的所述活性釉质物质和/或所述制剂能调节细胞间和/或细胞内信号传导物质。

21.如权利要求20的用途，其中，包含在所述药物组合物中的所述活性釉质物质和/或所述制剂能调节与所述哺乳动物的免疫机制相关的至少一种细胞因子的表达水平，释放和/或功能。

22.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，

包含在所述药物组合物中的所述活性釉质物质和/或所述制剂能调节与所述哺乳动物的所述免疫机制相关的细胞信号传导级联反应。

23.如权利要求22的用途，其中，包含在所述药物组合物中的所述活性釉质物质和/或所述制剂能与选自下组中任意一个的细胞表面受体和/或细胞表面结构相互作用：ICAM，HLA抗原，白介素受体，PDGF受体，TGF受体，TNF受体，EGF受体，CD44或整联蛋白。

24.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，所述药物组合物是系统施用的。

25.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，所述活性釉质物质是釉质基质，釉质基质衍生物和/或釉质基质蛋白。

26.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，所述活性釉质物质选自下组：珐琅蛋白，牙釉蛋白，非-牙釉蛋白，富脯氨酸非牙釉蛋白，tuftelins，它们的衍生物和混合物。

27.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，所述活性釉质物质选自牙釉蛋白和/或肽，它们的衍生物和混合物。

28.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，所述活性釉质物质的分子量最多为大约120kDa，如最多为100kDa，90kDa，80kDa，70kDa或60kDa，该分子量是通过SDS PAGE电泳测定。

29.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，所述活性釉质物质和/或所述制剂包括不超过13kDa的牙釉蛋白加工产物。

30.如权利要求29的用途，其中，所述加工过的牙釉蛋白产物选自氨基酸长度为大约2-13kDa的基于可溶性牙釉蛋白的肽，包括氨基酸长度为2-4.5kDa，3-5.5kDa，4-6.5kDa，5-7.5kDa，或5-13kDa的基于可溶性牙釉蛋白的肽。

31.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，所述加工过的牙釉蛋白产物包含在通过如图2所示的降解的牙釉蛋白的HPLC分析的第三和/或第四个峰表示的洗脱液。

32.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，所述加工过的牙釉蛋白产物是5kDa的多肽。

33.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，所述活性釉质物质的分子量最高为大约40,000。

34.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，所述活性釉质物质的分子量为大约5,000至大约25,000。

35.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，所述活性釉质物质的主要部分的分子量为大约20kDa。

36.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，所述活性釉质物质制剂包括具有不同分子量的活性釉质物质的混合物。

37.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，所述活性釉质物质制剂包括至少两种选自下组的物质：牙釉蛋白，富脯氨酸非牙釉蛋白，tuftelins，簇蛋白，血清蛋白，唾液蛋白，ameloblastin，sheathlin，和它们的衍生物。

38.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，在所述制剂中，所述活性釉质物质的蛋白含量为大约0.005％w/w-100％w/w，如大约5-99％w/w，大约10-95％w/w，大约15-90％w/w，大约20-90％w/w，大约30-90％w/w，大约40-85％w/w，大约50-80％w/w，大约60-70％w/w，大约70-90％w/w，或大约80-90％w/w。

39.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，所述药物组合物还包括可以药用的赋形剂。

40.如权利要求39的用途，其中，所述可以药用的赋形剂是磷酸缓冲盐溶液(PBS)。

41.一种用于治疗和/或预防有需要的哺乳动物中的状况的方法，包括施用有效量的含有活性釉质物质和/或活性釉质物质制剂的药物组合物，所述状况的特征是由外部和/或内部刺激造成的所述哺乳动物的免疫反应失衡。

42.如权利要求41的方法，其中，所述活性釉质物质能调节有需要的哺乳动物体内的免疫机制的功能。

43.如权利要求41或42的方法，其中，所述免疫反应的失衡是对所述刺激的过敏性反应。

44.如权利要求41-43中任意一项的方法，其中，所述免疫反应的失衡以不能对所述刺激反应为特征。

45.如权利要求41-43中任意一项的方法，其中，所述免疫反应的失衡以所述免疫系统的无区别的刺激为特征。

46.如权利要求41-45中任意一项的方法，其中，所述哺乳动物的免疫反应失衡是局部性的。

47.如权利要求41-46中任意一项的方法，其中，所述哺乳动物的免疫反应失衡是系统性的。

48.如权利要求47的方法，其中，所述状况以系统性炎症和/或感染为特征。

49.如权利要求47或48的方法，其中，所述系统性状况与创伤，烧伤，手术，透析，休克和/或细菌或病毒感染相关。

50.如权利要求47-49中任意一项的方法，其中，所述系统性状况与体外膜氧合作用(ECMO)，休克，系统性炎症反应综合征(SIRS)，败血症，多器官衰竭，诸如器官和/或假体的移植物排斥，心脏和肺旁路手术，慢性炎症，哮喘和与应激相关的肺病，细菌感染，坏疽，软组织感染，和/或伤口感染相关。

51.如权利要求47-50中任意一项的方法，其中，所述感染是由选自格兰氏阴性微生物和格兰氏阳性微生物的细菌污染引起的。

52.如权利要求47-51中任意一项的方法，其中，所述感染是由所述微生物产生的内毒素和/或外毒素引起的。

53.如权利要求41-46的方法，其中，所述免疫反应失衡是自身免疫病。

54.如权利要求53的方法，其中，所述自身免疫病选自，但不局限于：类风湿关节炎，皮肤病，过敏，硬化，动脉硬化，多发性硬化，哮喘，牛皮癣，狼疮，糖尿病，重症肌无力，慢性疲劳综合征，纤维肌痛，慢性疲劳综合征，克隆氏病，桥本氏甲状腺炎，格雷夫斯病，阿狄森氏病，格-巴综合征和硬皮病。

55.如权利要求41-54中任意一项的方法，其中，所述药物组合物中的活性釉质物质能调节所述哺乳动物体内T-辅助细胞激活的方式。

56.如权利要求41-55中任意一项的方法，其中，所述药物组合物中的活性釉质物质能调节细胞间信号传导物质。

57.如权利要求56的方法，其中，所述药物组合物中的活性釉质物质能调节与所述哺乳动物免疫机制相关的细胞因子的表达水平，释放和/或功能。

58.如权利要求41-57的方法，其中，所述药物组合物中的活性釉质物质能调节与所述哺乳动物免疫机制相关的细胞信号传导级联反应。

59.如权利要求58的方法，其中，包含在所述药物组合物中的活性釉质物质能与选自下组中任意一种的细胞表面受体和/或细胞表面结构相互作用：ICAM，HLA抗原，白介素受体，PDGF受体，TGF受体，TNF-受体，EGF受体，CD44或整联蛋白。

60.如权利要求41-58中任意一项的方法，其中，所述含有活性釉质物质的药物组合物是系统性施用的。

61.如权利要求41-60中任意一项的方法，其中，所述活性釉质物质是釉质基质，釉质基质衍生物和/或釉质基质蛋白。

62.如权利要求41-61中任意一项的方法，其中，所述活性釉质物质选自下组：珐琅蛋白，牙釉蛋白，非-牙釉蛋白，富脯氨酸非牙釉蛋白，tuftelins，它们的衍生物和它们的混合物。

63.如权利要求41-62中任意一项的方法，其中，所述活性釉质物质的分子量最多为大约120kDa，如，最多为100kDa，90kDa，80kDa，70kDa或60kDa，该分子量是通过SDS PAGE电泳测定的。

64.如权利要求41-63中任意一项的方法，其中，所述活性釉质物质制剂包括具有不同分子量的活性釉质物质的混合物。

65.如权利要求41-64中任意一项的方法，其中，所述活性釉质物质制剂包括至少两种选自下组的物质：牙釉蛋白，富脯氨酸非牙釉蛋白，tuftelins，簇蛋白，血清蛋白，唾液蛋白，ameloblastin，sheathlin，和它们的衍生物。

66.如权利要求41-65中任意一项的方法，其中，所述活性釉质物质的分子量最高为大约40,000。

67.如权利要求41-66中任意一项的方法，其中，所述活性釉质物质的分子量为大约5,000至大约25,000。

68.如权利要求41-67中任意一项的方法，其中，所述活性釉质物质的主要部分的分子量为大约20kDa。

69.如权利要求41-68中任意一项的方法，其中，所述制剂中所述活性釉质物质的蛋白含量为大约0.005％w/w-100％w/w，如大约5-99％w/w，大约10-95％w/w，大约15-90％w/w，大约20-90％w/w，大约30-90％w/w，大约40-85％w/w，大约50-80％w/w，大约60-70％w/w，大约70-90％w/w，或大约80-90％w/w。

70.如权利要求41-69中任意一项的方法，其中，所述药物组合物还包括一种可以药用的赋形剂。

71.如权利要求70的方法，其中，所述可以药用的赋形剂是磷酸缓冲盐溶液(PBS)。

72.如权利要求71的方法，其中，所述药物组合物包括30微克釉质基质蛋白，和1ml的磷酸缓冲盐溶液(PBS)。