CN1583787A - 丙型肝炎病毒被膜蛋白hvr1模拟多肽、其编码基因及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了八条丙型肝炎病毒被膜蛋白高变区1(hypervariable region 1，HVR1)模拟多肽及其编码基因。它们能与患者血清产生广泛的交叉反应。同时，本发明还提供了它们的用途。

Description

丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟多肽、其编码基因及用途

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及具有广泛交叉反应性的丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟多肽、其编码基因以及它们的用途。

背景技术

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是引起输血后肝炎及散发性非甲非乙型肝炎的主要病原，世界各地人群中的感染率差异很大，从小于1％至20％，至少70％-80％的HCV感染导致病毒持续存在和慢性肝病，其中20％-30％的人可进展为肝硬化甚至肝细胞肝癌。

HCV为有被膜的单股正链RNA病毒，属黄病毒科丙型肝炎病毒属，基因组约有9500碱基，分为5’非翻译区，一个开放阅读框架(ORF)和3’非翻译区。ORF编码一个约3000氨基酸的多蛋白前体，在宿主细胞信号酶和病毒蛋白酶共同作用下加工成10种病毒蛋白，依次为Core、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。

高变区1(hypervariable region 1，HVR1)位于E2的N端，nt1150-1230，aa384-410，紧接信号肽序列(aa370-383)的下游，约27aa。HVR1是整个病毒基因组变异最大的片段，在病毒株间、个体间、甚至是同一个体的不同时期均有很大差异，是引起感染病毒在个体间和个体内异质性的主要原因。研究表明HVR1是宿主体液免疫中和抗体的重要靶位，但其株特异性可导致部分病毒逃避宿主的免疫识别和感染的持续。尽管如此，HVR1序列中存在较保守的位点，通过合适的HVR1免疫程序，仍可能诱生出保护性抗体(Farci P，Prevention ofhepatitis C virus infection in chimpanzees by hyperimmune serum againstthe hypervariable region 1 of the envelope E2 protein.Proc Natl Acad SciUSA 1996，96：15394-15399；Esumi M，Experimental vaccine activities ofrecombinant E1 and E2 glycoproteins and hypervariable region 1peptides of hepatitis C virus in chimpanzees.Arch Virol1999，144：973-980；Cerino A，Monoclonal antibodies with broadspecificity for hepatitis C virus hypervariable region 1 variants canrecognize viral particles.J Immunol.2001，167：3878-3886)。

已有不少研究利用HVR1自然序列或模拟肽序列，寻找高交叉反应性的HVR1序列，以获得作为丙型肝炎特异性免疫预防和治疗的候选免疫原(Puntoriero G，Towards a solution for hepatitis C virushypervariability：mimotopes of the hypervariable region 1 can induceantibodies cross-reacting with a large number of viral variants.EMBO J.1998，17：3521-3533)。常用的方法是合成HVR1肽段，但费用昂贵，且变异类型有限。采用DNA shuffling或称分子传代(molecularbreeding)方法(图1)(Stemmer WPC..DNA shuffling by randomfragmentation and reassembly：in vitro recombination for molecularevolution.Proc Natl Acad Sci USA.1994，91：10747-10751；Minshull J，Stemmer WPC..Protein evolution by molecular breeding.CurrentOpinion in Chem biol 1999，3：284-290.)，尚未见报道。

目前尚无有效的HCV疫苗，针对HCV的治疗手段也相当有限，研制有效的HCV疫苗及治疗药物至关重要。

因此，本领域迫切需要开发具有HCV免疫原性的模拟多肽及其编码序列。

发明内容

本发明的目的就是提供一类具有HCV免疫原性的、具有与病人血清广泛交叉反应性的模拟多肽及其编码序列。

本发明的另一目的就是提供这类模拟多肽及其编码序列的用途。

在本发明的第一方面，提供一类丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟多肽，其特征在于，该模拟多肽具有SEQ NO：2、4、6、8、10、12、14或16所示的氨基酸序列。

在本发明的第二方面，提供所述的模拟多肽的融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白包括选自SEQ NO：2、4、6、8、10、12、14、16所示的任意二条或二条以上氨基酸序列。优选的，所述融合蛋白包括SEQ NO：2和SEQ NO：4所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的融合蛋白包括选自SEQ NO：2、4、6、8、10、12、14、16所示的任意三条或四条氨基酸序列。

在本发明的第三方面，提供一类丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟基因，其特征在于，该模拟基因编码本发明所述的模拟多肽。

在一优选例中，所述的模拟基因具有SEQ NO：1、3、5、7、9、11、13或15所示的核苷酸序列。

在本发明的第四方面，提供所述的模拟多肽的应用，其特征在于所述模拟多肽在制备检测、预防和/或治疗丙型肝炎的药物中的应用。

在一优选例中，所述的模拟多肽用于制备预防和/或治疗丙型肝炎的疫苗。

在本发明的第五方面，提供所述的融合蛋白的应用，其特征在于所述融合蛋白在制备检测、治疗和/或预防丙型肝炎的药物中的应用。

在一优选例中，所述的融合蛋白用于制备预防和/或治疗丙型肝炎的疫苗。

在本发明的第六方面，提供所述的模拟基因的应用，其特征在于所述模拟基因在制备检测、治疗和/或预防丙型肝炎的药物中的应用。

在本发明的第七方面，提供一种载体，其特征在于，它含有本发明所述的模拟基因。

在本发明的第八方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它是被本发明所述的载体转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第九方面，提供一种制备丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟多肽的条件下，培养本发明所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟多肽。

在本发明的第十方面，提供一种能与本发明所述的模拟多肽特异性结合的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体。

在本发明的第十一方面，提供一种检测试剂盒，其特征在于，它含有本发明所述的模拟多肽、本发明所述的抗体、本发明所述的融合蛋白或其组合。优选的，所述检测试剂盒含有本发明所述的模拟多肽。

在本发明的第十二方面，提供一种体外检测样品中是否存在丙肝病毒抗原或抗丙肝病毒抗体的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)将样品与选自下组的物质接触：本发明所述的模拟多肽、本发明所述的抗体、本发明所述的融合蛋白或其组合。

(b)检测是否形成抗原—抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在丙肝病毒抗原或抗丙肝病毒抗体。

在一优选例中，所述样品为血清。

在另一优选例中，所述物质为本发明所述模拟多肽。

在另一优选例中，所述物质为本发明所述融合蛋白。

在另一优选例中，所述步骤(b)的检测方法为ELISA法或荧光检测法。

本发明的多肽是指“丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟多肽”或“丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟基因产物”。

本发明的多肽可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、噬菌体、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。

在本发明中，术语“丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟多肽”指具有SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14或16所示氨基酸序列的多肽。该术语还包括具有与丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟多肽相同功能的、上述氨基酸序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为15个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。例如，本发明以所述模拟多肽序列取代被膜蛋白原有的HVR1序列获得含有模拟多肽序列的被膜蛋白。

编码本发明多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13或15所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14或16所示氨基酸序列的蛋白质，但与SEQ IDNO：1、3、5、7、9、11、13或15所示的编码序列有差别的核酸序列。

术语“编码本发明多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟基因核苷酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明多肽序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟多肽的编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟多肽。

具体而言，本发明的丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟多肽可通过将相应的编码序列引入宿主细胞(直接引入或通过引入含丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟多肽编码序列的载体)，并在合适的条件下培养转化的宿主细胞以表达丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟多肽，然后分离和纯化出丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟多肽。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟基因产物，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟多肽的细胞可用来免疫动物来生产抗体。

本发明的单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的各类抗体可以利用丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟基因产物，通过常规免疫技术获得。这些模拟基因产物可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

多克隆抗体的生产可用丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟多肽免疫动物，如家兔，羊等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟多肽或所述融合蛋白、所述模拟基因可用于制备检测、预防和/或治疗丙型肝炎的药物。尤其是用于制备预防和/或治疗丙型肝炎的疫苗。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟多肽、所述融合蛋白或其反义核酸，以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约1.0毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

一种检测样品中是否存在丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1的特异性抗体的方法是利用丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟多肽进行检测，它包括：将样品与丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟多肽接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在丙型肝炎病毒。

丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟多肽的多聚核苷酸可用于丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1相关疾病的诊断和治疗。

发明人通过使用DNA shuffling或称分子传代(molecularbreeding)技术可快速改变基因序列，其最显著的进展是自然多样性的体外变换，即尽可能接近自然序列的模拟。其基本原理是一组相关基因被随机切成小片段，退火时各片段上的同源序列互为引物，通过互相重组的方式重新连接，形成新的序列。图1为本技术的基本原理示意图。

本发明采用DNA shuffling的方法体外重组31株从丙肝患者血清中获得的HVR1 cDNA自然序列，构建HVR1模拟序列噬菌体展示文库，通过抗HVR1多克隆抗体的亲和筛选，获得八条广泛交叉反应性的HVR1模拟多肽及其编码基因，其反应性从原来的46.7％-66.7％提高到53.3％-80％。二株反应性最高的HVR1模拟肽为SEQ NO：2(80％)和SEQ NO：4(76.7％)，提示它们可能是重要的免疫原性肽段，其序列与共识序列高度同源可能是导致其广泛反应性的原因。在此基础上，可通过两条或两条以上序列串联表达(融合表达)，构成多表位抗原(融合蛋白)，进一步提高反应率。同时，用相应的合成肽或表达产物制备抗体，观察抗体中和(俘获)病毒的能力，为进一步在机体内诱导产生广泛反应性的相应抗体打下基础。

附图说明

图1.DNA shuffling(分子传代技术)的基本原理示意图

图2.原始HVR1片段PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。

1为PCR Marker；2为DNase I消化后经无引物PCR扩增片段；3为特异性引物PCR扩增片段；4为阴性对照；5-11为从pGEMT-E质粒中扩增出的原始HVR1片段。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：DNA shuffling制备模拟HVR1片段

本研究采用引物HCp7、HCp8从重组的pGEMT-E质粒(将从丙型肝炎患者血清中扩增得到HCV被膜区cDNA片段插入pGEM-T载体(Promega公司))中PCR扩增得到31个HVR1cDNA序列，纯化后用DNaseI消化，取10μl消化产物2％琼脂糖凝胶电泳，呈极淡的Smear状，经无引物退火延伸后，再用同一对引物进行PCR扩增，得到与原来长度相同的模拟HVR1片段。实验结果见图2。图2中1为PCRMarker；2为DNase I消化后经无引物PCR扩增片段；3为特异性引物PCR扩增片段；4为阴性对照；5-11为从pGEMT-E质粒中扩增出的原始HVR1片段。

HCp7：5’ATAC GGCCCAGCCGGCCATGGCCGCCGTTGACGGG 3’

                       Sfi I

HCp8：5’CATTGAAT GCGGCCGCGTTTACAAGCTG 3’

                      Not I

实施例2：HVR1模拟肽噬菌体展示文库的构建

重新获得的HVR1片段被克隆至pCANTAB 5E载体(Pharmacia公司)的Sfi I和Not I位点间，使之融合于M13噬菌体的主要包被蛋白(pIII)基因的5’端，连接产物去盐纯化后，电转化感受态大肠杆菌XL1-blue(Stratagene公司)，原始库大小为1.96×10⁶。为了验证该HVR1文库的质量和复杂度，我们随机选取10个克隆进行测序鉴定。结果表明10个克隆插入的HVR1序列均不相同，因此认为所构建的文库有较高的复杂度。

噬菌体库扩增后，用聚乙二醇(PEG8000)沉淀纯化后，沉淀重悬于5ml TBSB。取10μl稀释后滴定，浓度为1.46×10¹²cfu/ml。

实施例3：HVR1模拟肽库的生物筛选

如前文所述，在大肠杆菌中表达的四种DHFR-HVR1融合蛋白(SH1b、BJ1b、SD1b、SD2a)与抗-HCV阳性丙肝病人血清的结合率分别为66.7％(20/30)、60％(18/30)、53.3％(16/30)和46.7％(14/30)。选择与四个HVR1融合蛋白均能发生反应的四份HCV感染者血清，依次对HVR1文库进行亲和筛选。为了进一步增强模拟肽与不同HVR1抗体的反应性，我们采用不同的血清对富集后的噬菌体进行第二轮亲和筛选，并以健康献血者血清作为对照，富集率由第一轮的10^-7到第四轮的10^-3，提高了10⁴倍(表1)。

Round of panning   phage applied     phage eluted   enrichment factor

1                    8.8×10¹⁰        3.0×10⁴       3.4×10^-7

2                    5.3×10¹⁰        1.3×10⁶       2.4×10^-5

3                    2.9×10¹⁰        3.9×10⁶       1.3×10^-4

4                    2.5×10¹⁰        4.0×10⁷       1.6×10^-3

表1 HVR1噬菌体展示文库的生物筛选结果

实施例4：HVR1模拟肽的鉴定

经四轮生物筛选后挑选8个不同的噬菌体克隆，分别对其进行扩增。所表达的8个模拟肽能被HCV感染者血中的HVR1抗体广泛识别。用ELISA方法检测纯化的噬菌体克隆与抗-HCV阳性血清的结合率，结果8个克隆与30份血清的反应率分别为53.3％-80.0％(表2)。其中，1号克隆反应性最高。对插入模拟肽DNA序列的测定结果显示，所选克隆中没有一个编码与原始病毒株相同的HVR1肽段。

30份血清与8个HVR1模拟肽(序列见表3)的反应率不同，能与所有8个噬菌体克隆发生反应的血清有10份，能与5-7个克隆发生反应的有12份血清，与1-4个克隆反应的血清有4份，不与任一噬菌体克隆反应的有4份血清。具体实验结果见表2。

表2所示为8株HVR1模拟肽与30份丙肝患者血清的反应性。模拟肽名称标注于每个柱的顶端。每行左侧所示为每份血清的编号。表中所示为每份标本与阴性平均OD值的比值。每一列底端标明了8个模拟肽分别与血清的反应率及其总的反应率。

表2：HCV HVR1模拟肽与丙型肝炎患者血清反应性测定结果

序号	氨基酸序列
		1	ETYVSGGSAARNAYGLTSLFTVGPAQK
2	ETYVTGGVAGRTTLGFTSLFTPGPSQ
		3	ETYVTGGMAGRTTLGFTSLSTPGPSQK
4	NTRTIGGTAGSTAFKFTSLFTSGPTQK
		5	STRVSGGGARPYHLGLHVPLYTWAISE

6	DTYVTGGAQGRTTRGFAGLFTSGPAQK
		7	STRVTGEVQGHSLRGLTSFFASGPAQR
8	GTYTTGGAQGRATQGLASLFSRGSARK

表3丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟多肽氨基酸序列表

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                       SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟多肽、其编码基因及用途

<130>030811

<160>18

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>81

<212>DNA

<213>HCV HVR1模拟基因

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(81)

<223>

<400>1

gag acc tac gtg tcg ggg gga tcg gca gcc cgt aac gcc tat ggg ctc        48

Glu Thr Tyr Val Ser Gly Gly Ser Ala Ala Arg Asn Ala Tyr Gly Leu

1               5                   10                  15

acg tcc ttg ttc acg gtt ggg ccg gct cag aag                            81

Thr Ser Leu Phe Thr Val Gly Pro Ala Gln Lys

            20                  25

<210>2

<211>27

<212>PRT

<213>HCV HVR1模拟基因

<400>2

Glu Thr Tyr Val Ser Gly Gly Ser Ala Ala Arg Asn Ala Tyr Gly Leu

1               5                   10                  15

Thr Ser Leu Phe Thr Val Gly Pro Ala Gln Lys

            20                  25

<210>3

<211>81

<212>DNA

<213>HCV HVR1模拟基因

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(81)

<223>

<400>3

gag acc tac gtg acg ggg ggg gtg gca ggc agg act acc ctt ggg ttc        48

Glu Thr Tyr Val Thr Gly Gly Val Ala Gly Arg Thr Thr Leu Gly Phe

1               5                   10                  15

acg tcc ttg ttt acg cct ggg ccg tct cag                                78

Thr Ser Leu Phe Thr Pro Gly Pro Ser Gln

            20                  25

<210>4

<211>26

<212>PRT

<213>HCV HVR1模拟基因

<400>4

Glu Thr Tyr Val Thr Gly Gly Val Ala Gly Arg Thr Thr Leu Gly Phe

1               5                   10                  15

Thr Ser Leu Phe Thr Pro Gly Pro Ser Gln

            20                  25

<210>5

<211>81

<212>DNA

<213>HCV HVR1模拟基因

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(81)

<223>

<400>5

gag acc tac gtg acg ggg ggg atg gca ggc agg act acc ctt ggg ttc       48

Glu Thr Tyr Val Thr Gly Gly Met Ala Gly Arg Thr Thr Leu Gly Phe

1               5                   10                  15

acg tcc ttg tct acg cct ggg ccg tct cag aag                           81

Thr Ser Leu Ser Thr Pro Gly Pro Ser Gln Lys

            20                  25

<210>6

<211>27

<212>PRT

<213>HCV HVR1模拟基因

<400>6

Glu Thr Tyr Val Thr Gly Gly Met Ala Gly Arg Thr Thr Leu Gly Phe

1               5                   10                  15

Thr Ser Leu Ser Thr Pro Gly Pro Ser Gln Lys

            20                  25

<210>7

<211>81

<212>DNA

<213>HCV HVR1模拟基因

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(81)

<223>

<400>7

aac acc cgc acg ata ggg ggg aca gca ggc tct acc gcc ttt aag ttc        48

Asn Thr Arg Thr Ile Gly Gly Thr Ala Gly Ser Thr Ala Phe Lys Phe

1               5                   10                  15

acg tcc ctc ttt acg tca ggg ccg act cag aaa                             81

Thr Ser Leu Phe Thr Ser Gly Pro Thr Gln Lys

            20                  25

<210>8

<211>27

<212>PRT

<213>HCV HVR1模拟基因

<400>8

Asn Thr Arg Thr Ile Gly Gly Thr Ala Gly Ser Thr Ala Phe Lys Phe

1               5                   10                  15

Thr Ser Leu Phe Thr Ser Gly Pro Thr Gln Lys

            20                  25

<210>9

<211>81

<212>DNA

<213>HCV HVR1模拟基因

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(81)

<223>

<400>9

agc aca cgt gtg tcg ggg ggg ggt gca agg cca tac cat ctg ggg ctt    48

Ser Thr Arg Val Ser Gly Gly Gly Ala Arg Pro Tyr His Leu Gly Leu

1               5                   10                  15

cac gtc cct ctt tac acc tgg gcc atc tca gaa                        81

His Val Pro Leu Tyr Thr Trp Ala Ile Ser Glu

            20                  25

<210>10

<211>27

<212>PRT

<213>HCV HVR1模拟基因

<400>10

Ser Thr Arg Val Ser Gly Gly Gly Ala Arg Pro Tyr His Leu Gly Leu

1               5                   10                  15

His Val Pro Leu Tyr Thr Trp Ala Ile Ser Glu

            20                  25

<210>11

<211>81

<212>DNA

<213>HCV HVR1模拟基因

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(81)

<223>

<400>11

gac aca tat gtg acg ggg ggg gcg cag ggc cgt acc acc cgg ggc ttc       48

Asp Thr Tyr Val Thr Gly Gly Ala Gln Gly Arg Thr Thr Arg Gly Phe

1               5                   10                  15

gcg ggc ctc ttt aca tct ggg cca gct cag aaa                           81

Ala Gly Leu Phe Thr Ser Gly Pro Ala Gln Lys

            20                  25

<210>12

<211>27

<212>PRT

<213>HCV HVR1模拟基因

<400>12

Asp Thr Tyr Val Thr Gly Gly Ala Gln Gly Arg Thr Thr Arg Gly Phe

1               5                   10                  15

Ala Gly Leu Phe Thr Ser Gly Pro Ala Gln Lys

            20                  25

<210>13

<211>81

<212>DNA

<213>HCV HVR1模拟基因

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(81)

<223>

<400>13

agc acc cgt gtg acg ggg gag gtg caa ggc cac tcc ctc cgg ggc ctc       48

Ser Thr Arg Val Thr Gly Glu Val Gln Gly His Ser Leu Arg Gly Leu

1               5                   10                  15

acg tcc ttc ttt gca tct ggg cca gct cag agg                           81

Thr Ser Phe Phe Ala Ser Gly Pro Ala Gln Arg

            20                  25

<210>14

<211>27

<212>PRT

<213>HCV HVR1模拟基因

<400>14

Ser Thr Arg Val Thr Gly Glu Val Gln Gly His Ser Leu Arg Gly Leu

1               5                   10                  15

Thr Ser Phe Phe Ala Ser Gly Pro Ala Gln Arg

            20                  25

<210>15

<211>81

<212>DNA

<213>HCV HVRl模拟基因

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(81)

<223>

<400>15

ggc acc tat acg acg ggg ggg gcg cag ggc cgt gcc acc cag ggc ctc       48

Gly Thr Tyr Thr Thr Gly Gly Ala Gln Gly Arg Ala Thr Gln Gly Leu

1               5                   10                  15

gcg tcc ctc ttt tca cgt ggg tcg gct cgg aaa                           81

Ala Ser Leu Phe Ser Arg Gly Ser Ala Arg Lys

            20                  25

<210>16

<211>27

<212>PRT

<213>HCV HVR1模拟基因

<400>16

Gly Thr Tyr Thr Thr Gly Gly Ala Gln Gly Arg Ala Thr Gln Gly Leu

1               5                   10                  15

Ala Ser Leu Phe Ser Arg Gly Ser Ala Arg Lys

            20                  25

<210>17

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(35)

<223>引物

<400>17

atacggccca gccggccatg gccgccgttg acggg                                   35

<210>18

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(28)

<223>引物

<400>18

cattgaatgc ggccgcgttt acaagctg                                             28

Claims (13)

1.一类丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟多肽，其特征在于，该模拟多肽具有SEQ NO：2、4、6、8、10、12、14或16所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的模拟多肽的融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白包括选自SEQ NO：2、4、6、8、10、12、14、16所示的任意二条或二条以上氨基酸序列。

3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白包括SEQ NO：2和SEQ NO：4所示的氨基酸序列。

4.一类丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟基因，其特征在于，该模拟基因编码权利要求1所述的模拟多肽。

5.如权利要求4所述的模拟基因，其特征在于该模拟基因具有SEQ NO：1、3、5、7、9、11、13或15所示的核苷酸序列。

6.如权利要求1所述的模拟多肽的应用，其特征在于所述模拟多肽在制备检测、预防和/或治疗丙型肝炎的药物中的应用。

7.如权利要求2或3所述的融合蛋白的应用，其特征在于该融合蛋白在制备检测、预防和/或治疗丙型肝炎的药物中的应用。

8.一种载体，其特征在于，它含有权利要求4或5所述的模拟基因。

9.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它是被权利要求8所述的载体转化或转导的宿主细胞。

10.一种制备丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟多肽的条件下，培养权利要求9所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出丙型肝炎病毒被膜蛋白HVR1模拟多肽。

11.一种能与权利要求1所述的模拟多肽特异性结合的抗体。

12.一种检测试剂盒，其特征在于，它含有权利要求1所述的模拟多肽、权利要求11所述的抗体、权利要求2所述的融合蛋白或其组合。

13.一种体外检测样品中是否存在丙肝病毒抗原或抗丙肝病毒抗体的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)将样品与选自下组的物质接触：权利要求1所述的模拟多肽、权利要求11所述的抗体、权利要求2所述的融合蛋白或其组合。

(b)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在丙肝病毒抗原或抗丙肝病毒抗体。

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