CN1572871A - 保持或提高腈水合酶活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是通过在不伴有细胞增殖的条件下使含有腈水合酶的细胞或该细胞的处理物与氧化剂接触从而保持或提高腈水合酶活性的方法、以及使用已与氧化剂接触的该细胞或该细胞的处理物由腈化合物制造酰胺化合物的方法。根据本发明，不仅能保持腈水合酶的活性，还能提高一旦降低了的腈水合酶活性，因此能有效地由腈化合物制造酰胺化合物。
Description
技术领域
本发明涉及保持或提高生产丙烯酰胺等工业中使用的腈水合酶的活性的方法。此处所说的‘活性’是用实施例中记载方法测定的腈水合活性。
背景技术
腈水合酶的腈水合活性很不稳定，很容易随着时间延长而降低。作为防止这种腈水合酶的腈水合活性随时间延长而降低、保持其活性的方法，现已公开了一种方法(例如，参照专利文献1、专利文献2)，即，在含有腈水合酶的微生物菌体或菌体处理物的悬浊液或溶液中，添加选自腈类、酰胺类、和有机酸或其盐类中的至少一种化合物，作为稳定剂。
另外，还公开了一种保存方法(例如，参照专利文献3)，即，在将微生物菌体或菌体处理物悬浊于水性介质中的状态下，该水性介质是中性乃至弱碱性且是100mM乃至饱和浓度的无机盐类。然而，上述任何一种方法，仅仅具有只保持腈水合酶活性的效果，对于进一步提高腈水合酶活性的效果，至今还没有任何报导。
[专利文献1]特公平5-43351号公报
[专利文献2]特公平4-48435号公报
[专利文献3]特开平8-112089号公报
另一方面，作为在利用培养而制造含有腈水合酶的微生物菌体后、通过对所得到的菌体或菌体处理物进行某种处理而提高腈水合活性的方法来说，例如公开了一种方法(例如，参照专利文献4)，即，对所得到的具有腈水合酶活性的革兰染色性呈阳性的微生物菌体照射光。然而，这种方法仅仅具有只提高利用培养得到的微生物菌体的腈水合酶活性的效果，却不能提高腈水合酶活性一旦降低了的微生物菌体的活性。并且与保持腈水合酶活性无关。
[专利文献4]特公平2-35号公报
还有报导(例如，参照专利文献5)，即，在培养含有腈水合酶的微生物菌体时，需要氧，并且将培养中的溶解氧浓度保持在1ppm至饱和浓度，就能提高菌体的繁殖，并且能获得腈水合酶活性高的菌体。然而，该方法只报导了在培养时，即在含有腈水合酶的菌体增殖的条件下，在腈水合酶活性的表达中，培养液中的溶解氧浓度存在有最佳值，而对于含有腈水合酶菌体不增殖的条件，即培养结束以后的腈水合酶活性的保持及活性的提高，却没有任何记载。
[专利文献5]特开2002-17339号公报
虽然对腈水合酶的活性的表达以及活性的降低的详细机理仍不清楚，但是，例如记载了(例如，参照非专利文献1)源自红球菌属(Rhodococcus)sp.N-771的铁型腈水合酶的腈水合活性的降低，是由于空气中的氧，把与作为中心金属的非血红素铁(III)配位的半胱胺次磺酸氧化成半胱胺亚磺酸的缘故。
或者，还记载了(例如，参照非专利文献2)例如源自红球菌属(Rhodococcus)sp.N-771的铁型腈水合酶，利用被称为‘2-氰基-2-丙羟基过氧化物’的过氧化物，将作为中心金属的三价铁还原成二价铁，并且，将半胱氨次磺酸氧化成半胱氨亚磺酸，由此，失去了活性。
或者，还记载了(例如，参照非专利文献3)虽然还未确定源自紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)J1的中心金属为钴的腈水合酶的构造，但可以预测其类似于铁型腈水合酶。
[非专利文献1]M.Odaka，M.Tsujishima and I.Endo：RIKENReview，No.41，p58～60(2001)
[非专利文献2]尾高雅文，辻村昌也，遠藤勲；有機化学反応の新展開，No.3，p17～20(2001)
[非专利文献3]P.K.Mascharak，Coordination Chemistry ReviewsNo.225，p201～214(2002)
发明内容
本发明的目的在于提供一种使含有腈水合酶的细胞或该细胞的处理物不仅在不伴有细胞增殖的条件下保持腈水合酶活性，而且也能提高一旦降低了的腈水合酶活性的方法。
本发明人等，为了达到上述目的，经过深入研究，结果发现，对于含有腈水合酶的细胞或该细胞的处理物，在不伴有细胞增殖的条件下，通过与氧化剂的接触，不仅能保持腈水合酶活性，而且，即使是腈水合酶活性一旦降低了的细胞或该细胞的处理物，通过使它们在反应开始前或反应过程中与氧化剂接触，就能提高腈水合酶的活性。至此完成了本发明。
即，本发明提供如下方法：
(1)一种保持或提高腈水合酶活性的方法，其中，在不伴有细胞增殖的条件下，将含有腈水合酶的细胞或该细胞的处理物与氧化剂接触。
(2)根据(1)所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其中，在结束培养后或停止培养后，在实质上不伴有细胞增殖的条件下，将含有腈水合酶的细胞或该细胞的处理物与氧化剂接触。
(3)根据(1)所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其中，使用标准电极电位相对于标准氢电极在0.1～2.1V范围的氧化剂。
(4)根据(1)所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其中，氧化剂是选自氧、过氧化氢、铁氰化钾和过硫酸铵中的至少一种。
(5)根据(4)所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其中，以含有氧的气体的方式供给作为氧化剂的氧。
(6)根据(1)所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其中，氧化剂的浓度在1重量ppm～10重量％的范围内。
(7)根据(1)所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其中，与氧化剂接触时的温度是0～60℃。
(8)根据(1)所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其中，与氧化剂接触时的pH值是5～10。
(9)根据(1)所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其中，腈水合酶是分子内含有钴的腈水合酶。
(10)根据(1)所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其中，在不伴有细胞增殖的条件下，将利用基因转换在分子内表达有含钴腈水合酶的细胞或该细胞的处理物，与氧化剂接触。
(11)根据(1)所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其中，细胞是含有腈水合酶的微生物菌体或该微生物菌体的处理物。
(12)根据(11)所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其中，微生物菌体是基因转换微生物。
(13)根据(12)所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其中，基因转换微生物是基因转换大肠菌。
(14)根据(13)所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其中，基因转换大肠菌的宿主是源自Escherichia coli K-12的W3110株(ATCC27325)、HB101株(ATCC33694)、JM109株(ATCC53223)或WA802株(ATCC33526)。
(15)根据(1)所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其中，含有腈水合酶的细胞或该细胞处理物用于由腈化合物制造酰胺化合物的方法中。
(16)一种使用含有利用(1)～(15)中任一项所述的方法获得的腈水合酶的细胞或该细胞处理物由腈化合物制造酰胺化合物的方法。
具体实施方式
以下对本发明作详细说明
本发明中所说的‘腈水合酶’是指具有将腈化合物的腈基进行水合从而生成对应的酰胺化合物的能力的酶。本发明中所说的‘细胞’可以是微生物、植物细胞、动物细胞中的任何一种。作为含有腈水合酶的微生物来说，只要是能产生出将腈化合物的腈基进行水合从而生成对应的酰胺化合物的能力的微生物就可以，没有特殊限制。作为具体例来说，可以举出嗜热类诺卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)JCM3095、Achromobacter xerosis IFO12668、紫红红球菌(Rhodococcusrhodochrous)J1等。
并且也包括在任意宿主中表达有从该微生物克隆的腈水合酶基因的转化物质。作为在此所说的任意宿主来说，除了大肠菌(Escherichiacoli)外，还有枯草菌(Bacillus subtilis)等杆菌属细菌、酵母和放线菌、丝状菌等。作为基因转换大肠菌的宿主来说，例如可以举出源自Escherichia coli K-12的W3110株(ATCC27325)、HB101株(ATCC33694)、JM109株(ATCC53223)、WA802株(ATCC33526)。作为这种菌株的具体例，可以举出MT-10822(本菌株，以保藏号FERMBP-5785，1996年2月7日保藏于日本国通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(通商產業省工業技術院生命工学工業技術研究所)中，茨城县筑波市东1丁目1番3号(茨城県つくば巿東1丁目1番3号)，是基于专利程序上微生物保藏国际承认的布达佩斯条约进行保藏的)。
另外，通过使用转换DNA技术利用其它的氨基酸置换、缺失、削除或插入该酶的1个或2个以上的结构氨基酸、表达有进一步提高耐药性、耐温度性等的变异型腈水合酶的转化物质也包括在本发明的微生物中。
本发明的微生物通常利用在分子生物学、生物工程学、基因工程学领域内公知的一般方法进行调制。例如，将该微生物植入到LB培养基或M9培养基等通常液体培养基后，在适当的培养温度(一般来说是20～50℃，但在嗜热菌的情况下可以是50℃以上)下进行繁殖，接着，利用离心分离等从培养液中分离出该微生物。
本发明中的细胞处理物是指上述菌体的提取物或磨碎物、将该提取物或磨碎物的腈水合酶活性部分进行分离精制所得到的后分离物、使用适当的载体对该细胞或该细胞的提取物、磨碎物、后分离物进行固定的固定化物等，只要是它们具有腈水合酶活性，就是相当于本发明的细胞处理物。它们当中，既可以单独使用一种，也可将2种以上不同形态的同时或交互使用。
作为本发明中的细胞不增殖的条件来说，例如可以举出将该细胞或该细胞的处理物溶解或悬浊在水、生理食盐水、或者以适当浓度溶解了磷酸盐等缓冲剂、硫酸盐或碳酸盐等无机盐、碱金属的氢氧化物、酰胺化合物等的水溶液等中的条件。还可以举出使用该细胞或该细胞处理物由腈化合物制造酰胺化合物时的反应液。或者，也包括在利用培养来繁殖该微生物时微生物增殖中的静止期以后或停止培养的培养液。或者还包括利用药剂或加热进行杀菌的培养液。
本发明中使用的氧化剂，是相对于标准氢电极，标准电极电位处于0.1～2.1V范围的有机物质和无机物质。由于小于0.1V的物质，作为氧化剂的能力很弱，所以缺乏保持腈水合酶活性及活性化的效果。另外，在大于2.1V的物质的情况下，由于作为氧化剂的能力过强，所以腈水合酶会发生很大的变质，反而降低了腈水合酶的活性，不可取。作为这样的物质的例子来说，在《化学便覧》(日本化学会编)中记载有一系列物质，可以使用其中的1种物质，也可以同时或交互使用2种以上的物质。例如，可以举出氧、过氧化氧、铁氰化钾、过流酸盐、过锰酸盐、过碘酸盐、过氯酸及过氯酸盐、硝酸及硝酸盐、铈(IV)盐等。优选为，使用氧、过氧化氢、铁氰化钾、过流酸铵作为氧化剂。更优选为纯氧或者以空气的方式供给氧。
本发明中使用的氧化剂，可以一次性地与该细胞或该细胞的处理物接触，也可逐次地接触。
在与作为氧化剂的氧接触的情况下，可供给含有氧的气体。供给源可以供给空气、纯氧、以一定比率混合了空气和氮或其他气体的气体、以一定比率混合了氧和氮或其他气体的气体中的任一种。在此所说的‘其他气体’，可以使用氮、氩、氦等1种，也可以混合2种以上的气体来使用，只要是不阻碍反应的气体就可以，没有特殊限制。例如，在搅拌槽内将细胞或该细胞的处理物悬浊在水性介质中的情况下，将气体供给至搅拌槽的气相部，通过边净化边搅拌，可以使氧溶解并进行供给。或者，也可以使气体进行喷雾分散而使气体扩散、进一步通过搅拌增加气液接触面积从而进行供给。就此处供给的气体来说，为了防止杂菌混入悬浊液中产生腐败，优选用除菌过滤器进行除菌之后再进行供给。
在本发明中，可以将该细胞或该细胞的处理物直接与氧化剂接触，但通常是以悬浊在水性介质中的状态与氧化剂接触。此处所说的‘水性介质’，是含水的介质，表示生理食盐水、或者以适当浓度溶解了磷酸盐等缓冲剂、硫酸盐或碳酸盐等无机盐、碱金属的氢氧化物、酰胺化合物等的水溶液、或者由腈化合物制造酰胺化合物时的反应液、以及静止期以后的培养液等。
对于该细胞或该细胞的处理物在水性介质中悬浊时的浓度，没有特殊限制，但通常可以是，按换算成该细胞干燥重量计，相对于该水性介质，为0.1～30重量％的范围。
在本发明中，使氧化剂与含有腈水合酶的细胞或该细胞的处理物接触时的氧化剂浓度，只要是能保持或提高腈水合酶活性的浓度就可以，没有特殊限制，通常相对于该水性介质，优选为1重量ppm～10重量％。
本发明中的含有腈水合酶的细胞或该细胞的处理物与氧化剂的接触温度，通常为0～60℃，优选为0～50℃，更优选为5～40℃。并且接触时的pH值，通常为5～10。优选为pH值为5～9，更优选为6～8。
根据本发明，对于含有腈水合酶的细胞或该细胞的处理物，在不伴有细胞增殖的条件下，通过与氧化剂的接触，不仅能保持腈水合酶活性，而且，即使是腈水合酶活性一旦降低了的细胞或该细胞的处理物，通过使它们在反应开始前或反应过程中与氧化剂接触，就能提高腈水合酶的活性。因此，含有腈水合酶的细胞或该细胞处理物与这些氧化剂的接触，可在腈水合反应结束以前的任意时刻进行。
即，可以在将该菌体或菌体处理物供至反应中之前与氧化剂进行接触，或者也可以将该菌体或菌体处理物供至反应中之后，也将氧化剂供至反应中，使该菌体或菌体处理物与氧化剂进行接触。然而，将氧化剂供至反应中时，会有与腈化合物的水合反应不同的副反应、例如腈化合物为(甲基)丙烯腈时、腈化合物本身或者作为对应的生成物的(甲基)丙烯酰胺进行聚合的可能性等，因此，优选在将该菌体或菌体处理物供至反应中之前与氧化剂进行接触。
将培养结束了的微生物菌体或菌体处理物与氧化剂进行接触、提高基于腈水合酶的腈水合活性后，可将该菌体或菌体处理物直接地供至反应中，但根据需要，也可以将它们洗净后再供至反应中。例如，在将该菌体或菌体处理物悬浊在水性介质中的状态下，在与作为氧化剂的氧进行接触的情况下，确认已提高了腈水合活性后，即使通入氮气等来除去水性介质中的溶解氧，也保持了腈水合活性，因此，可以以该状态供至反应中。
在本发明中，对于腈化合物的种类没有特殊限定，具体而言，是碳原子数为2～20左右的腈化合物，包括范围很广的腈、例如有脂肪族腈、芳香族腈等。作为脂肪族腈来说，可以举出碳原子数为2～6的饱和或不饱和腈、例如乙腈、丙腈、丁腈、异丁腈、戊腈、异戊腈、己腈等脂肪族饱和单腈类；丙二腈、丁二腈、己二腈等脂肪族饱和二腈类；丙烯腈、甲基丙烯腈、丁烯腈等脂肪族不饱和腈等。
作为芳香族腈来说，例如可以举出苯腈、o-、m-及p-氯苯腈、o-、m-及p-氟苯腈、o-、m-及p-硝基苯腈、o-、m-及p-甲苯基腈、苄基氰化物等。其中作为优选的例子可以举出丙烯腈、甲基丙烯腈及丁烯腈等。
实施例
以下列举实施例进一步详细地说明本发明，但本发明不受以下实施例任何限定。
以下，反应液的HPLC分析是，使用ULTRON80HG(50×8φmm)作为HPLC柱，使用10mM磷酸水溶液作为展开液。利用220nm的吸光度检测丙烯酰胺及丙烯腈，测定了浓度。并且利用氧电极(InPro6800/12/320，メトラ一·トレド社制)和溶解氧浓度指示计(4050e型メトラ一·トレド社制)测定了溶解氧浓度，但测定前要进行校正，预先用5％的亚硫酸钠水溶液校正零点，然后用空气充分饱和的10℃纯水校正饱和浓度，指示为10.92ppm。
实施例1
本实施例中使用的含有腈水合酶的细胞是，在大肠菌HB101株中导入腈水合酶基因，并使用了三井化学株式会社保藏的MT-10822株(FERM BP-5785，参照特开平11-253168号公报)。
本菌株的培养，是在30L的培养槽内，调整下述组成的培养基15.0L，利用121℃、高压蒸汽灭菌20分钟。向该培养基中添加氨苄西林，最终浓度为50μg/ml，然后，将上述菌株植入一白菌耳，在37℃、700rpm下培养20小时。这时，在培养开始后约15小时，添加IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)，使终浓度达到100μmol/L，进行培养。
(培养基组成)
酵母提取液 5.0g/L
多胨 10.0g/L
NaCl 5.0g/L
氯化钴·六水合物 10.0mg/L
硫酸铁·七水合物 40.0mg/L
pH值7.5
培养结束后，将500mL停止菌体增殖的菌体悬浊液，转移到安装有氧电极和温度计的1L烧瓶内。一边保持内温10℃，一边以400N-ml/min向烧瓶气相部通入空气、并进行排气，进行搅拌。在保持0、24小时后，取出一部分菌体悬浊液。这期间，该菌体悬浊液的溶解氧浓度指示为10.0～10.9ppm。
在预先用氮气充分置换内部的100ml可密封的玻璃容器内，将23.0mg该菌体悬浊液，悬浊在10.0g预先脱氧的50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐水溶液(pH值8.1)中，向该悬浊液中添加预先脱氧的丙烯腈，其终浓度为19重量％，在20℃下边搅拌边反应2小时。添加80g的10mM磷酸水溶液，结束反应后，利用HPLC分析，测定反应结束液中的丙烯酰胺浓度，接着求出该菌体悬浊液的干燥菌体重量浓度，并计算出每单位干燥菌体重量的丙烯酰胺生成量。将保存第0小时的生成量设为1，则第24小时为1.1，这期间稳定地保持了腈水合酶的腈水合活性。
实施例2
将500mL的与实施例1同样得到的停止了菌体增殖的菌体悬浊液，转移到装有氧电极和温度计的1L烧瓶内。一边保持10℃内温，一边向烧瓶气相部以400N-ml/min通入空气、以4000N-ml/min通入氮气地通入混合气体，并进行排气，进行搅拌。在保存0、24小时后，取出一部分菌体悬浊液。这期间，该菌体悬浊液的溶解氧浓度指示为1.0～1.5ppm。与实施例1同样，求出该菌体悬浊液的每单位干燥菌体重量的丙烯酰胺生成量。将保存第0小时的生成量设为1时，则第24小时为1.0，这期间稳定地保持了腈水合酶的腈水合活性。
比较例1
将500mL的与实施例1同样得到的停止了菌体增殖的菌体悬浊液，转移到装有氧电极和温度计的1L烧瓶内。一边保持10℃内温，一边以400N-ml/min向烧瓶气相部通入氮气，并进行排气，进行搅拌，对该菌体悬浊液进行脱氧。在保存0、1、3小时后，取出一部分菌体悬浊液。这期间，该菌体悬浊液的溶解氧浓度指示为0.0ppm。与实施例1同样，求出该菌体悬浊液的每单位干燥菌体重量的丙烯酰胺生成量。将保存0小时的生成量设为1时，则第1小时为0.45，第3小时为0.20，这期间，腈水合酶的腈水合活性随着时间延长而降低了。
比较例2
将500mL的与实施例1同样得到的停止了菌体增殖的菌体悬浊液，转移到装有氧电极和温度计的1L烧瓶内，一边保持10℃内温，一边以400N-ml/min向烧瓶气相部通入氮气，并进行排气，进行搅拌。与实施例1同样，求出保存0小时后的该菌体悬浊液的每单位干燥菌体重量的丙烯酰胺生成量。保存1小时后，取出一部分菌体悬浊液，在氮气环境中，对菌体悬浊液进行离心分离(15000G×15分钟)，从悬浊液中只分离出菌体，得到湿菌体。
在预先用氮气充分置换内部的100mL可密封的玻璃容器内，将上述得到的0.20g湿菌体悬浊在预先脱氧的纯水中，调整总量为20.00g。一边保持20℃内温，一边对该菌体悬浊液搅拌15分钟。
在预先用氮气充分置换内部的100mL可密封的玻璃容器内，将66.0mg该菌体悬浊液，悬浊在10.0g的预先脱氧的50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐水溶液(pH值8.1)中，向该悬浊液中添加预先脱氧的丙烯腈，其终浓度为19重量％，在20℃下边搅拌边反应4小时。添加80g的10mM磷酸水溶液，反应结束后，利用HPLC分析，测定反应结束液中的丙烯酰胺浓度。接着求出该菌体悬浊液的干燥菌体重量浓度，并计算出每单位干燥菌体重量的丙烯酰胺生成量。将保存1小时后利用离心分离得到的湿菌体的生成量设为1.0时，则保存0小时的生成量为2.9，确认了比较例2得到的湿菌体是腈水合酶活性降低了的菌体。
实施例3～9
将与实施例1同样得到的停止了菌体增殖的菌体悬浊液，利用离心分离(15000G×15分钟)从悬浊液中只分离出菌体，得到湿菌体。在预先用氮气充分置换内部的100ml可密封的玻璃容器内，将0.20g所得到的湿菌体悬浊在预先脱氧的纯水中，进而添加并悬浊作为氧化剂的铁氯化钾，形成下表1所示那样的终浓度，调整总量为20.00g。另一方面，同样地调整不添加氧化剂的菌体悬浊液。一边保持20℃内温，一边将该菌体悬浊液搅拌15分钟。
在预先用氮气充分置换内部的100ml可密封的玻璃容器内，将66.0mg该菌体悬浊液，悬浊在10.0g预先脱氧的50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐水溶液(pH值8.1)中，并向该悬浊液中添加预先脱氧的丙烯腈，其终浓度为19重量％，20℃下边搅拌边反应4小时。添加80g的10mM磷酸水溶液，反应结束后，利用HPLC分析，测定反应结束液中的丙烯酰胺浓度。接着求出该菌体悬浊液的干燥重量浓度，并计算出每单位干燥菌体重量的丙烯酰胺生成量。将没有添加氧化剂时的每单位干燥菌体重量的丙烯酰胺生成量设为1.0，将实施例3～9的生成量，以相对值示于下表1中。
实施例10～11
取代实施例3中使用的铁氯化钾，作为氧化剂，添加、悬浊过硫酸铵，形成下表1所示的终浓度，除此以外，同样地求出每单位干燥菌体重量的丙烯酰胺生成量。将不添加氧化剂时的每单位干燥菌体重量的丙烯酰胺生成量设为1.0，将实施例10～11的生成量以相对值示于表1中。
实施例12
取代实施例3中使用的铁氰化钾，作为氧化剂，添加、悬浊30重量％过氧化氢水，使过氧化氢终浓度如下表1所示，除此之外，同样地求出每单位干燥菌体重量的丙烯酰胺生成量。将未添加氧化剂时的每单位干燥菌体重量的丙烯酰胺生成量设为1.0，将实施例12的生成量以相对值示于表1中。
表1
| 试剂 | 浓度(重量％) | 丙烯酰胺生成量(相对值) | |
| - | - | 无添加 | 1.0 |
| 实施例3 | 铁氰化钾 | 0.20 | 1.4 |
| 实施例4 | 铁氰化钾 | 0.39 | 1.7 |
| 实施例5 | 铁氰化钾 | 0.81 | 2.0 |
| 实施例6 | 铁氰化钾 | 1.9 | 2.4 |
| 实施例7 | 铁氰化钾 | 1.6 | 2.6 |
| 实施例8 | 铁氰化钾 | 2.0 | 2.9 |
| 实施例9 | 铁氰化钾 | 10.0 | 2.9 |
| 实施例10 | 过硫酸铵 | 1.3 | 1.6 |
| 实施例11 | 过硫酸铵 | 2.7 | 1.6 |
| 实施例12 | 过氧化氢 | 0.21 | 2.4 |
从上述结果可知，当将微生物菌体与铁氰化钾、过氧化氢、过硫酸铵这样的氧化剂接触时，可提高腈水合酶的腈水合活性。
实施例13
将与实施例3同样地得到的0.20g湿菌体，在预先用氮气充分置换内部的100ml可密封的玻璃容器内，悬浊在预先脱氧的纯水中，而且，作为氧化剂，添加、悬浊铁氰化钾，终浓度为0.77重量％，调整总量达到20.00g。一边保持20℃内温，一边搅拌该菌体悬浊液。在搅拌开始后，经过0小时、10分钟、2小时、24小时的时刻，采取少量该菌体悬浊液，与实施例3同样，计算出每单位干燥菌体重量的丙烯酰胺生成量。将搅拌开始后第0小时的每单位干燥菌体重量的丙烯酰胺生成量设为1，将搅拌开始后第10分钟、2小时、24小时的生成量以相对值示于表2中。
表2
| 搅拌时间 | 丙烯酰胺生成量(相对值) | |
| 实施例13 | 0小时 | 1.0 |
| 10分钟 | 1.7 | |
| 2小时 | 2.5 | |
| 24小时 | 2.4 |
从上述结果可知，当将微生物菌体与铁氰化钾这样的氧化剂接触时，在因接触时间使得腈水合酶的腈水合活性提高的同时，并保持住已提高了的活性。
实施例14
与实施例3同样地得到湿菌体。接着在装有氧电极和温度计的100ml烧瓶内，将1.5g在上述所得到的湿菌体悬浊在48.5g的纯水中。一边保持10℃内温，一边以40N-ml/min向烧瓶气相部通入空气，并进行排气，进行搅拌。在保存0、1、2、3、7、19天后，采取一部分菌体悬浊液。这期间，该菌体悬浊液的溶解氧浓度指示为10.0～10.9ppm。对所采取的该菌体悬浊液，与实施例3同样，求出每单位干燥菌体重量的丙烯酰胺生成量。将保存第0天的每单位干燥菌体重量的丙烯酰胺生成量设为1，将保存第1、2、3、7、19天的生成量以相对值示于表3中。
实施例15
与实施例3同样地得到湿菌体。在安装有氧电极和温度计的100ml烧瓶内，将1.5g在上述所得到的湿菌体悬浊在48.5g的纯水中。一边保持10℃内温，一边向烧瓶气相部以40N-ml/min通入空气和以400N-ml/min通入氮气即通入混合气体，并进行排气，进行搅拌。在保存0、1、2、3、7、19天后，采取一部分菌体悬浊液。这期间，该菌体悬浊液的溶解氧浓度指示为1.0～1.5ppm。与实施例3同样，求出所采取的该菌体悬浊液中每单位干燥菌体重量的丙烯酰胺生成量。将保存第0天的每单位干燥菌体重量的丙烯酰胺生成量设为1，将保存第1、2、3、7、19天的生成量以相对值示于下表3中。
表3
| 保存天数(天) | 0 | 1 | 2 | 3 | 7 | 19 |
| 实施例14 | 1.0 | 2.4 | 2.3 | 2.4 | 2.5 | 2.5 |
| 实施例15 | 1.0 | 1.6 | 2.3 | 2.4 | 2.5 | 2.4 |
从上述结果可知，当使作为氧化剂的氧与微生物菌体接触时，因接触时间使得腈水合酶的腈水合活性提高，经过某时间后，腈水合活性仍稳定地保持为很高状态。
实施例16～18
将0.20g的与实施例3同样所得到的湿菌体，在预先用氮气充分置换内部的100ml可密封的玻璃容器内，悬浊在预先脱氧的纯水中，进而添加作为氧化剂的铁氰化钾，最终浓度达到2.0重量％，接着用氢氧化钠水溶液或硫酸调整到表4所示的pH值，调整到总量为20.00g。另一方面，也同样地调制了不添加氧化剂、不调整pH的菌体悬浊液。边保持20℃内温，边搅拌该菌体悬浊液15分钟。与实施例3同样，计算出每单位干燥菌体重量的丙烯酰胺生成量。将不添加氧化剂、不调整pH值时的每单位干燥菌体重量的丙烯酰胺生成量设为1，将实施例16～18的生成量以相对值示于下表4中。
表4
| 试剂 | 悬浊液pH | 丙烯酰胺生成量(相对值) | |
| - | 无添加 | 未调整(7.1) | 1.0 |
| 实施例16 | 铁氰化钾 | 5.0 | 1.8 |
| 实施例17 | 铁氰化钾 | 6.7 | 2.9 |
| 实施例18 | 铁氰化钾 | 10.0 | 2.0 |
实施例19～21
将0.20g的与实施例3同样得到的时菌体，在预先用氮气充分置换内部的100ml可密封的玻璃容器内，悬浊在预先脱氧的纯水中，进而添加并悬浊作为氧化剂的铁氰化钾，使最终浓度达到2.0重量％，调整成总量为20.00g。另一方面，也同样地调制不添加氧化剂的菌体悬浊液。将内温保持在下表6的温度下，搅拌该菌体悬浊液15分钟。与实施例3同样，计算出每单位干燥菌体重量的丙烯酰胺生成量。将不添加氧化剂并在20℃内温下悬浊的每单位干燥菌体重量的丙烯酰胺生成量设为1，将实施例19～21的生成量以相对值示于下表5中。
表5
| 试剂 | 悬浊液内温(℃) | 丙烯酰胺生成量(相对值) | |
| - | 无添加 | 20 | 1.0 |
| 实施例19 | 铁氰化钾 | 0 | 3.2 |
| 实施例20 | 铁氰化钾 | 20 | 2.9 |
| 实施例21 | 铁氰化钾 | 60 | 1.4 |
产业上的可利用性
根据本发明，可以用简便方法，在不伴有细胞增殖的条件下，对含有腈水合酶的细胞或该细胞的处理物，不仅能保持腈水合酶的活性，还能提高一旦降低了的腈水合酶活性，所以在工业上可有利于由腈化合物制造酰胺化合物。
Claims (16)
1.一种保持或提高腈水合酶活性的方法，其特征在于：在不伴有细胞增殖的条件下，将含有腈水合酶的细胞或该细胞的处理物与氧化剂接触。
2.根据权利要求1所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其特征在于：在结束培养后或停止培养后，在实质上不伴有细胞增殖的条件下，将含有腈水合酶的细胞或该细胞的处理物与氧化剂接触。
3.根据权利要求1所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其特征在于：使用标准电极电位相对于标准氢电极在0.1～2.1V范围的氧化剂。
4.根据权利要求1所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其特征在于：氧化剂是选自氧、过氧化氢、铁氰化钾和过硫酸铵中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其特征在于：以含有氧的气体的方式供给作为氧化剂的氧。
6.根据权利要求1所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其特征在于：氧化剂的浓度在1重量ppm～10重量％的范围内。
7.根据权利要求1所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其特征在于：与氧化剂接触时的温度是0～60℃。
8.根据权利要求1所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其特征在于：与氧化剂接触时的pH值是5～10。
9.根据权利要求1所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其特征在于：腈水合酶是分子内含有钴的腈水合酶。
10.根据权利要求1所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其特征在于：在不伴有细胞增殖的条件下，将利用基因转换在分子内表达有含钴腈水合酶的细胞或该细胞的处理物，与氧化剂接触。
11.根据权利要求1所述的保持或提高腈水合活性的方法，其特征在于：细胞是含有腈水合酶的微生物菌体或该微生物菌体的处理物。
12.根据权利要求11所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其特征在于：微生物菌体是基因转换微生物。
13.根据权利要求12所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其特征在于：基因转换微生物是基因转换大肠菌。
14.根据权利要求13所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其特征在于：基因转换大肠菌的宿主是源自Escherichia coli K-12的W3110株(ATCC27325)、HB101株(ATCC33694)、JM109株(ATCC53223)或WA802株(ATCC33526)。
15.根据权利要求1所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其特征在于：含有腈水合酶的细胞或该细胞处理物用于由腈化合物制造酰胺化合物的方法中。
16.一种由腈化合物制造酰胺化合物的方法，其特征在于：使用含有利用权利要求1～15中任一项所述的方法获得的腈水合酶的细胞或该细胞处理物。
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