CN1563044A - 对大肠杆菌o49的o-抗原特异的核苷酸 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种对大肠杆菌O49(Escherichia coliO49)的O-抗原特异的核苷酸,它是大肠杆菌O49中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列,如SEQ ID NO:1所示的分离的核苷酸,全长14256个碱基;或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基,同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO:1的核苷酸;还包括源于大肠杆菌O49的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因和wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸;本发明通过PCR证实寡核苷酸对大肠杆菌O49的O-抗原都有高度的特异性;本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的大肠杆菌O49的方法。
Description
技术领域
本发明涉及大肠杆菌O49(Escherichia coli O49)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列,特别是涉及大肠杆菌O49中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸,可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O49并鉴定这些致病菌中的O-抗原。
背景技术
大肠杆菌O49是一种致病菌,属于VTEC(Vero cytotoxin(VT)producingEscherichia coli),可引起牛等牲畜的腹泻。[Tokhi AM et.al.(1993)“Alongitudinal study of Vero cytotoxin producing Escherichia coli incattle calves in Sri Lanka”.Epidemiol Infect.110(2):197-208.],具有潜在的爆发性流行的危险。因此在农业、食品及卫生系统上急需一个可以快速、准确检测大肠杆菌O49的方法。
位于大肠杆菌表面的脂多糖是大肠杆菌致病的诱因,而O-抗原是脂多糖最外层结构,是免疫系统识别的目标和噬菌体吸附的位点。O-抗原的缺失会造成许多病原体的血清敏感,或者严重削弱病原体的毒力[Frank et al(1987)“The function of antibody and complement in the lysis of bacteria”.RevInfect Dis 177:1750-1753.Pluschke G et al“Role of the capsule andthe O-antigen in resistance of O18:K1Escherichia coli tocomplement-mediated king.J Bacteriol 42:907-913]。大肠杆菌是一个种,种内的菌株一般通过O-抗原和H-抗原(有时通过K-抗原)来鉴定。其中O-抗原具有高度多样性,大肠杆菌有166种不同的O-抗原,O-抗原的变化可能是大肠杆菌的起源和维持其多样性的主要原因[Reeves,P.R(1992)“Variationin antigens,niche specific selection and bacterial populations”.FEMSMicrobiol.Lett,100:509-516]。
O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分,它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚:先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上,然后在内膜的内侧合成寡糖单位,O-抗原的寡糖单位再通过o-抗原转运酶被转移到内膜外侧,而后通过聚合酶聚合成多糖,再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield,C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide Oantigens”.Trends in Microbiology.3:178-185;Schnaitman,C.A.andJ.D.Klena.(1993)“Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis inentericbacteria”.Microbiological Reviews,57(3):655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列,形成一个基因簇[Reeves,P.R.,et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and genenomenclature”Trends in Microbiology,4:495-503]。在大肠杆菌、志贺氏菌和沙门氏菌中,O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen loci:implicationfor Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity,11:6923-6930;Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichiacoli O111 and Salmonella enterica O35 gene clusters:gene clusters encodingthe same colitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal ofBacteriology.182:5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因:糖合成路径基因,糖基转移酶基因,寡糖单位处理基因,其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖;糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位;寡糖单位处理基因包括o-抗原转运酶基因和聚合酶基因,它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧,再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同,单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性,而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着,所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成,也决定了O-抗原的多样性。
因为O-抗原是极强的抗原,是大肠杆菌重要的致病因素之一,同时它又具有极强的多样性,这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定,是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清,而抗血清一般种类不全,数量不足,大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差,所以,现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年,Luk,J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk,J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification ofabequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reactionfor identification of S.enterica major serogroups(A,B,C2,andD)”,J.Clin.Microbiol.31:2118-2123]。Luk,et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1,D1,A,B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年,Paton,A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecular microbiologicalinvestigation of an outbreak of Hemolytic-Uremic Syndrome caused bydry fermented sausage contaminated with Shiga-like toxin producingEscherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34:1622-1627],但是后来的研究表明Paton,A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves,P.R.认为,这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.and Reeves,P.R.(1995)“Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster ofEscherichia coli O111”.Gene 164:17-23],而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖,所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的。
发明内容
本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O49的O-抗原特异的核苷酸。它是大肠杆菌O49的O-抗原基因簇中的核苷酸,是源于o-抗原转运酶基因、聚合酶基因及糖基转移酶基因的特异的核苷酸。
本发明的一个目的是提供了大肠杆菌O49的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。
本发明的次一目的是提供了构成大肠杆菌O49的O-抗原基因簇的基因:转运酶基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因;聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因;糖基转移酶基因,包括orf6、orf9、orf11、orf12基因;糖合成路径基因,包括rmlB、rmlD、rmlA、rmlC、vioA、gne;与脱氢或脱水有关的酶的基因,包括orf7。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中。
本发明的又一目的是提供了寡核苷酸,它们分别源于大肠杆菌O49的O-抗原基因簇中编码转运酶的基因,包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因;源于编码聚合酶的基因,包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因;源于编码糖基转移酶的基因,包括orf6、orf9、orf11、orf12基因。它们是上述基因内的寡核苷酸,长度在10-20nt;它们对大肠杆菌O49的O-抗原是特异的;尤其是表1中列出的源于编码转运酶的基因和聚合酶的基因的寡核苷酸,它们对大肠杆菌O49的O-抗原是高度特异的,而且这些寡核苷酸还可重新组合,组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O49的O-抗原也是高度特异的。
本发明的另一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应,或者作为探针用于杂交反应,或者用于制造基因芯片或微阵列,从而通过这些方法来检测和鉴定大肠杆菌O49的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O49。
本发明的再一目的是提供了分离大肠杆菌O49的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列,也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。
本发明的目的是由以下技术方案实现的。
本发明对大肠杆菌O49的O-抗原特异的核苷酸,其特征在于,其是如SEQID NO:1所示的分离的核苷酸,全长14256个碱基;或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基,同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO:1的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O49的O-抗原特异的核苷酸,其特征在于,其包括命名为rmlB,rmlD,rmlA,rmlC,vioA,orf6,orf 7,wzx,orf9,wzy,orf11,orf12,gne的13个基因组成,都位于galF基因和gnd基因之间。
前述的对大肠杆菌O49的O-抗原特异的核苷酸,其特征在于,所述基因中具有高度特异性的基因包括:转运酶基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因;聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因;糖基转移酶基因,包括orf6、orf9、orf11、orf12基因。其中所述的转运酶基因是SEQ IDNO:1中的6848至8350碱基的核苷酸;聚合酶基因是SEQ ID NO:1中的9551至10723碱基的核苷酸;orf6是SEQ ID NO:1中的5733至6386碱基的核苷酸;orf9是SEQ ID NO:1中的8347至9579碱基的核苷酸;orf11是SEQ ID NO:1中的10738至11559碱基的核苷酸;orf12是SEQ ID NO:1中的11556至12455碱基的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O49的O-抗原特异的核苷酸,其特征在于,其还包括源于所述的wzx基因或wzy基因或糖基转移酶基因的寡核苷酸;以及它们的混合或它们的重组。
前述的对大肠杆菌O49的O-抗原高度特异的核苷酸,其特征在于,所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是:SEQ ID NO:1中的6944至6961碱基的核苷酸和7678至7695碱基的核苷酸,SEQ ID NO:1中的7087至7104碱基的核苷酸和7611至7628碱基的核苷酸;源于wzy基因的寡核苷酸对是:SEQ ID NO:1中的9821至9838碱基的核苷酸和10508至10525碱基的核苷酸,SEQ ID NO:1中的10009至10026碱基的核苷酸和10683至10700碱基的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O49的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。
前述的对大肠杆菌O49的O-抗原特异的核苷酸的重组分子,在通过插入表达而提供表达大肠杆菌O49的O-抗原,以及制备细菌疫苗中的应用。
前述的对大肠杆菌O49的O-抗原特异的核苷酸的应用,其特征在于它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列,供检测细菌的应用。
前述的对大肠杆菌O49的O-抗原特异的核苷酸的分离方法,其特征在于,包括下述步骤:
(1)基因组的提取:在培养基中培养大肠杆菌O49型,离心收集细胞;得到的基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测;
(2)通过PCR扩增大肠杆菌O49型中的O-抗原基因簇:以大肠杆菌O49型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇,将得到的PCR产物,用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性,合并该long PCR产物,并用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物;
(3)构建O-抗原基因簇文库:将Long PCR纯化产物应用鸟枪法构建O-抗原基因簇文库;
(4)对文库中的克隆测序:从文库中挑选插入片段在1kb以上的克隆用实验室常用的DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序,序列达到100%的覆盖率,从而获得O-抗原基因簇的所有序列;
(5)核苷酸序列的拼接及分析:应用生物信息学软件拼接和编辑所有的序列,从而得到大肠杆菌O49型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列;
(6)特异基因的筛选:针对大肠杆菌O49型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物;在每个基因内各设计了两对引物,每对引物分布在相应基因内的不同地方,以确保其特异性;用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR,确定wzx、wzy基因对大肠杆菌O49型的O-抗原的高度特异性;
(7)引物灵敏度的检测:培养大肠杆菌O49,细菌计数后分别将5×103,5×102,5×101,5个和0个活菌加入到一定量的某种待检测物中,混入细菌的待检测物作为检测用样品,将样品加入LB培养基,取一些与样品混合过的LB培养基过滤,将过滤液进行培养,从培养好的菌液中取数毫升处理后作为PCR模板用寡核苷酸进行PCR反应,检测其对大肠杆菌O49的灵敏度。
前述的对大肠杆菌O49的O-抗原特异的核苷酸的分离方法,其特征在于,包括下述步骤:
(1)基因组的提取:在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O49,离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞,37℃温育20分钟,然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10%SDS,50℃温育2小时,再加入3ul10mg/ml的RNase,65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物,取上清液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次,取上清液,再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚,上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA,用玻璃丝卷出DNA并用70%乙醇洗DNA,最后将DNA重悬于30ul TE中,基因组DNA通过0.4%的琼脂糖凝胶电泳检测;
(2)通过PCR扩增大肠杆菌O49中的O-抗原基因簇:以大肠杆菌O49的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇;首先根据经常发现于O-抗原基因簇上游的galF基因设计上游引物(5’-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAAGAA ATC-3’),再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCGCGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的ExpandLong Template PCR方法扩增O-抗原基因簇,PCR反应程序如下:在94℃预变性2分钟,然后94℃变性10秒,61℃退火30秒,68℃延伸15分钟,这样进行30个循环;最后,在68℃继续延伸7分钟,得到PCR产物,用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性;合并6管long PCR产物,并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物;
(3)构建O-抗原基因簇文库:用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物,0.9ul 0.1M MnCl2,1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI,反应在室温中进行;酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间,而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应;合并4管同样的反应体系,用等体积的酚抽提一次,用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次,再用等体积的乙醚抽提一次后,用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA,并用70%乙醇洗沉淀,最后重悬于18ul水中;随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP,1mMdGTP,1mMdTTP,10mMdATP),1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶,11℃反应30分钟,将酶切产物补成平端,75℃终止反应后,加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul,70℃反应20分钟,使DNA的3′端加dA尾,此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时,总体积为90ul,其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶;最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物,再用70%乙醇洗沉淀,干燥后溶于30ul水中得到连接产物。用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞,取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后,转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击,电压为2.5千伏,时间为5.0毫秒-6.0毫秒,电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏,然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃过夜培养,次日得到蓝白菌落,将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养,同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小,得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O49的O-抗原基因簇文库;
(4)对文库中的克隆测序:从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序,使序列达到80%的覆盖率,再通过将相联系的序列进行反向测序及测通得到剩余20%的序列,从而获得O-抗原基因簇的所有序列;
(5)核苷酸序列的拼接及分析:用英国剑桥MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列,从而得到大肠杆菌O49的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列,序列的质量主要由两个方面来保证:1)对大肠杆菌O49的基因组作6个Long PCR反应,然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基,保证3个以上高质量的覆盖率;在得到大肠杆菌O49的O-抗原基因簇的核苷酸序列后,用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information,NCBI)的orffinder发现基因,找到13个开放的阅读框,用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因,再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释,用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对,最后得到大肠杆菌O49的O-抗原基因簇的结构;
(6)特异基因的筛选:针对大肠杆菌O49的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物;在每个基因内各设计了两对引物,每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性;用这些引物以166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR,所有引物都在大肠杆菌O49中得到阳性结果,在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带,也就是说,在大多数组中没有得到任何PCR产物带,虽然在少数组中得到PCR产物带,但其大小不符合预期大小,所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O49及其O-抗原都是高度特异的。
(7)引物灵敏度的检测:购买市场上的生猪肉馅,搅拌均匀,分成20g一份,存在-40℃冰箱中备用。将10μl大肠杆菌O49的冻存菌液接种到有20ml LB培养基的三角瓶中,于37℃,200转/分,培养12小时至饱和,取少量培养好的菌液作106和107倍的稀释,其余的菌液放于4℃的冰箱中备用,取50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板,37度,培养12h,对所涂平板计数,计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×103,5×102,5×101,5个和0个活菌,搅拌均匀,加入200ml LB培养基,经6层纱布过滤,过滤液于37℃,200转/分,培养12h。从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5分钟,去上清,加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀,放入100度沸水中煮15分钟,裂解液于12,000g离心8分钟,取1μ上清做为PCR模板。用4对寡核苷酸对,SEQ ID NO:1中的6944至6961碱基的核苷酸和7678至7695碱基的核苷酸,SEQ ID NO:1中的7087至7104碱基的核苷酸和7611至7628碱基的核苷酸,SEQ ID NO:1中的9821至9838碱基的核苷酸和10508至10525碱基的核苷酸,SEQ ID NO:1中的10009至10026碱基的核苷酸和10683至10700碱基的核苷酸,进行PCR反应,PCR反应体系如下:MQ:15.7μl,Mg2+:2.5μl,Buffer:2.5μl,dNTP:1μl,Taq酶:0.3μl,P1:1μl,P2:1μl,模板DNA:1μl。PCR反应条件为:95℃:5′,95℃:30″,56℃:45″,72℃:1′,72℃:5′,共30个循环。反应结束后,取10μl反应产物电泳,若有与预期大小相符的扩增带,则结果为阳性,若没有,则结果为阴性。参入了5×103,5×102,5×101,和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果。参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上述方法时,这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O49的检测灵敏度均为0.25个菌/g。
也就是,本发明的第一个方面,提供了大肠杆菌O49的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列,它的全序列如SEQ ID NO:1所示,全长14256个碱基;或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基,同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO:1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O49的O-抗原基因簇的结构,如表3所述,它其包括命名为rmlB,rmlD,rmlA,rmlC,vioA,orf6,orf7,wzx,orf9,wzy,orf11,orf12,gne的13个基因组成都位于galF基因和gnd基因之间。
本发明的第二个方面,提供了大肠杆菌O49的O-抗原基因簇中的基因,即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因);聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因);糖基转移酶基因,包括orf6、orf9、orf11、orf12基因;细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因,包括rmlB、rmlD、rmlA、rmlC、vioA、gne基因;与脱氢或脱水有关的酶的基因,包括orf7。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中。本发明尤其涉及到o-抗原转运酶基因和聚合酶基因,因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的,对细菌的O-抗原并不是特异的,而本发明涉及到的o-抗原转运酶基因、聚合酶基因和糖基转移酶基因对大肠杆菌O49的O-抗原是特异的。
本发明的第三个方面,提供了源于大肠杆菌O49的O-抗原基因簇中的wzy基因或与wzy有相似功能的基因和wzx基因或与wzx有相似功能的基因的寡核苷酸和糖基转移酶基因包括orf6、orf9、orf11、orf12基因的寡核苷酸,它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是,优先被用的是列于表1中源于大肠杆菌O49的O-抗原基因簇中的wzy基因或与wzy有相似功能的基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因的寡核苷酸对。在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小,这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物只在以大肠杆菌O49为模板进行的PCR扩增中得到预期大小的产物,而在以表2所列的其它菌为模板进行的PCR扩增中都未得到预期大小的产物。更详细地说,以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应在大多数细菌中均未得到任何产物,虽然在有些菌中得到了PCR产物带,但其大小不符合预期大小,这是由于引物结合到基因组的别的位置造成,这种问题可通过用基因内的其它引物做PCR来避免。所以,可以确定这些引物即表1所列的寡核苷酸对大肠杆菌O49及它们的O-抗原是高度特异的。
所述的对大肠杆菌O49的O-抗原特异的核苷酸的分离和鉴定方法包括下述步骤:1)基因组的提取;2)PCR扩增大肠杆菌O49中的O-抗原基因簇;3)O-抗原基因簇文库的构建;4)对文库中的克隆测序;5)核苷酸序列的拼接及分析,最终获得O-抗原基因簇的结构;6)特异基因的筛选;7)引物灵敏度的检测。
本发明的其他方面由于本文的技术的公开,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
如本发明所述,“寡核苷酸”主要是指来源于O-抗原基因簇中的编码转运酶的基因、编码聚合酶的基因和编码糖基转移酶基因内的一段核苷酸分子,它们在长度上可改变,一般在10到20个核苷酸范围内改变。尤其是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO:1的6848至8350碱基),wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO:1的9551至10723碱基)内的寡核苷酸对大肠杆菌O49都是高度特异的。
此外,有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原,从而产生新的细菌类型,新的突变株。在这种环境中,需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此,本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物,它们源于转运酶基因,包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因;源于聚合酶基因,包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因;源于糖基转移酶基因,包括orf6、orf9、orf11、orf12基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的,从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说,这些寡核苷酸的混合物是源于转运酶基因、源于聚合酶基因和源于糖基转移酶基因中的寡核苷酸的组合。
在另一方面,本发明涉及寡核苷酸的鉴定,它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。
本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法,这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交,这些基因是:(i)编码转运酶基因,包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因,包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因。(iii)编码糖基转移酶基因,包括orf6、orf9、orf11、orf12基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交,这些细菌是大肠杆菌O49。可用PCR方法检测,更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测,或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
本发明者考虑到以下情况:当单个的特异的寡核苷酸检测无效时,寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码转运酶基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、编码聚合酶的基因包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸和编码糖基转移酶基因包括orf6、orf9、orf11、orf12基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的,这一特殊细菌O-抗原是由大肠杆菌O49表达的。
另一方面,本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法,这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交,这些基因是:(i)编码转运酶的基因,包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因,包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因(iii)编码糖基转移酶基因,包括orf6、orf9、orf11、orf12基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O49。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品,也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测,或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交,但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上,另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此,当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时,至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交,或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时,此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸,在这里多对寡核苷酸是源于编码转运酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因;源于编码聚合酶的基因包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因;源于编码糖基转移酶基因包括orf5、orf6、orf9基因。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的,这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。
另一方面,本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交,这些基因是:(i)编码转运酶的基因,包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因,包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因(iii)编码糖基转移酶基因,包括orf6、orf9、orf11、orf12基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交,这些细菌是大肠杆菌O49。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品,也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应,或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
更详细地说,以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时,其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于wzx基因或与wzx有相似功能的基因及wzy基因或与wzy有相似功能的基因和糖基转移酶基因包括orf6、orf9、orf11、orf12基因的序列上。此外,当两个寡核苷酸都能杂交上时,它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即,当交叉反应出现问题时,可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。
本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原,而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性,本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。
本发明首次公开了大肠杆菌O49的O-抗原基因簇的全长序列,而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子,通过插入表达可产生表达大肠杆菌O49的O-抗原,并成为有用的疫苗。
具体实施方式:
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件。实施例1:基因组的提取。
在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O49,离心收集细胞。用500ul50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞,37℃温育20分钟,然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10%SDS,50℃温育2小时,再加入3ul 10mg/ml的RNase,65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物,取上清液,再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液抽提两次,取上清液,再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA,用玻璃丝卷出DNA并用70%乙醇洗DNA,最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4%的琼脂糖凝胶电泳检测。
实施例2:通过PCR扩增大肠杆菌O49中的O-抗原基因簇
以大肠杆菌O49的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇上游的galF基因设计上游引物(5’-ATT GTGGCT GCA GGG ATC AAA GAA ATC-3’),再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)。用BoehringerMannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇,PCR反应程序如下:在94℃预变性2分钟;然后94℃变性10秒,61℃退火30秒,68℃延伸15分钟,这样进行30个循环;最后,在68℃继续延伸7分钟,得到PCR产物,用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并6管long PCR产物,并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。
实施例3:构建O-抗原基因簇文库。
首先是连接产物的获得:用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物,0.9ul 0.1M MnCl2,1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI,反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间,而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系,用等体积的酚抽提一次,用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次,再用等体积的乙醚抽提一次后,用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA,并用70%乙醇洗沉淀,最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP,1mMdGTP,1mMdTTP,10mMdATP),1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶,11℃反应30分钟,将酶切产物补成平端,75℃终止反应后,加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul,70℃反应20分钟,使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时,总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物,再用70%乙醇洗沉淀,干燥后溶于30ul水中得到连接产物。
其次是感受态细胞的制备:参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5α。取一环大肠杆菌DH5α单菌落于5ml的LB培养基中,180rpm培养10小时后,取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中,37℃250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右,然后冰浴冷却20分钟,于4℃4000rpm离心15分钟。倾尽上清液,用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体,于4℃4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体,于4℃4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10%的甘油悬浮细胞,4℃6000rpm离心10分钟,弃上清液,最后沉淀用1ml冰预冷的10%的甘油悬浮细胞,即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管,-70℃保存。
最后是电转化感受态细胞:取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后,转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击,电压为2.5千伏,时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养,次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养,同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小,得到白色克隆群构成了大肠杆菌O49的O-抗原基因簇文库。
实施例4:对文库中的克隆测序。
从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序,使序列达到80%的覆盖率。剩余20%的序列再通过反向测序及将有些序列测通得到,最后获得O-抗原基因簇的所有序列。
实施例5:核苷酸序列的拼接及分析。
用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列,从而得到大肠杆菌O49的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证:1)对大肠杆菌O49的基因组作6个Long PCR反应,然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基,保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O49的O-抗原基因簇的核苷酸序列后,用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation,NCBI)的orffinder发现基因,找到13个开放的阅读框,用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因,再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释,用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对,最后得到大肠杆菌O49的O-抗原基因簇的结构,如表3所示。
通过检索和比较,发现orf1,orf2,orf3和orf4都与许多菌的合成鼠李糖前体的dTDP-鼠李糖的四个合成酶基因有非常高的相同性(identity),其中:orf1与大肠杆菌的RmlB在361个氨基酸中有98%的相同性,98%的相似性;Orf2与鲍氏志贺氏菌的RmlD在299个氨基酸中有96%的相同性,97%的相似性;orf3与鲍氏志贺氏菌的RmlA在292个氨基酸中有98%的相同性,99%的相似性,Orf4与鲍氏志贺氏菌的RmlC在180个氨基酸中有81%的相同性,86%的相似性,说明它们都有极高的同源性,可以确定orf1、orf2、orf3、Orf4分别为dTDP-鼠李糖的rmlB基因、rmlD基因、rmlA基因、rmlC基因,因此分别命名为rmlB、rmlD,rmlA、rmlC。blast比较发现orf5与Pseudomonas syringaepv的DegT_DnrJ_EryC1家族的vioA基因相似,与vioA基因编码的转氨酶拥有很高的同源性,在372个氨基酸中有66%的相同性,81%的相似性。可以确定orf5也是一个vioA基因,命名为vioA。通过进行blast比较发现,Orf6与Vcinetobacter lwoffii的乙酰基转移酶在216个氨基酸中分别有53%的相同性,75%的相似性,说明它们之间有较高的同源性,因此推测orf6也是一个乙酰基转移酶基因,暂命名为orf6。Orf7与Caulobactercrescentus CB15的MaoC家族的蛋白在152个氨基酸中分别有48%的相同性,71%相似性;MaoC家族的蛋白是一种脱水酶,因此推测Orf7也是一个脱水酶,暂命名为Orf7。Orf8与Pseudomonas syringae pv的O-抗原转运酶在504个氨基酸的序列中有37%的相同性,61%的相似性。并且通过Eisenberg等人的算法[Eisenberg,D,Schwarz,E.et al(1984).Analysis of membrane and surfaceprotein sequences with the hydrophobic moment plot.J.Mol.Biol.179:125-142]发现orf8有14个潜在的穿膜区,它与许多wzx蛋白相似,而且在wzx蛋白的氨基端有一个大约50个氨基酸的保守基序,所以可以确定orf8是wzx基因,命名为wzx。orf9与Methanosarcina acetivorans str的糖基转移酶在387个氨基酸中有26%的相同性,48%的相似性,所以推测orf9也是一个糖基转移酶,暂命名为orf9。Orf10与许多Wzy蛋白相似,例如,和Streptococcus agalactiae在379个氨基酸中有25%的相同性,46%相似性。另外通过Eisenberg算法得知orf10有9个潜在的穿膜区,与其他的O-抗原聚合酶有相似的二级结构,具有典型的O-抗原聚合酶的特征,所以确定orf10是wzy基因,命名为wzy。Orf11与Clostridium perfringens str的糖基转移酶在282个氨基酸中分别有39%的相同性,60%的相似性,说明它们之间有较高的同源性,因此推测orf11是一个糖基转移酶基因,暂命名为orf11。通过blast比较发现,Orf12与Shigella flexner的rfbG在289个氨基酸中分别有48%的相同性,66%的相似性,说明它们之间有较高的同源性。rfbG属于糖基转移酶家族2,是一个鼠李糖的转移酶,因此推测orf12是一个鼠李糖的转移酶基因,暂命名为orf12。大肠杆菌O49的O-抗原结构未知,但以上结果表明鼠李糖是大肠杆菌O49的O-抗原中的一种单糖。Orf13和Yersiniaenterocolitica type O8的Gne在336个氨基酸中分别有60%的相同性,78%相似性;说明它们有很高的同源性,因此可以确定Ofr13是gne基因,命名为gne。
实施例6:特异基因的筛选
针对大肠杆菌O49的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物,这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。
在表1中列出了大肠杆菌O49的O抗原基因簇的转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内,我们各设计了两对引物,每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ ID NO:1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR,得到了相应的PCR产物,其大小也列于表中。
mdh(malate dehydrogenase)基因是存在于所有的大肠杆菌的基因组中且高度保守的一个基因,所以我们根据mdh基因设计了引物(5′-TTC ATC CTA AACTCC TTA TT-3′)和(5′-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG-3′),然后从166种血清型的大肠杆菌中提取基因组,方法如前所述。用这对引物从166种血清型的大肠杆菌的基因组中PCR以鉴定大肠杆菌并检测其基因组的质量。
表2是用于筛选特异基因的166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源,为了检测的方便,我们将它们每12-19个菌分为一组,总共13组。它们的来源都列于表中。
在第3组中含有大肠杆菌O49的基因组DNA作为阳性对照。第13组中是不含有大肠杆菌O49的基因组DNA,作为阴性对照。以每组菌做模板,用表1中的每对引物按如下条件做PCR:在94℃预变性2分钟后,94℃变性15秒,退火温度因引物的不同而不同(参照表1),退火时间是50秒,72℃延伸2分钟,这样进行30个循环。最后在72℃继续延伸10分钟,反应体系是25ul。反应完毕后,取10ulPCR产物通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。
对于wzx、wzy基因,每个基因都有两对引物被检测,每对引物除了在第9组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外,在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带。所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O49及其O-抗原都是高度特异的。
最后,通过PCR从大肠杆菌O49中筛选到对大肠杆菌O49的O-抗原高度特异的基因:wzx、wzy基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对大肠杆菌O49的O-抗原是特异的,尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O49是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O49,并能鉴定它们的O-抗原。
实施例7:引物灵敏度的检测。
购买市场上的生猪肉馅,搅拌均匀,分成20g一份,存在-40℃冰箱中备用。将10μl大肠杆菌O49的冻存菌液接种到有20ml LB培养基的三角瓶中,于37℃,200转/分,培养12小时至饱和,取少量培养好的菌液作106和107倍的稀释,其余的菌液放于4℃的冰箱中备用,取50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板,37度,培养12h,对所涂平板计数,计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×103,5×102,5×101,5个和0个活菌,搅拌均匀,加入200ml LB培养基,经6层纱布过滤,过滤液于37℃,200转/分,培养12h。从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5分钟,去上清,加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀,放入100度沸水中煮15分钟,裂解液于12,000g离心8分钟,取1μ上清做为PCR模板。用4对寡核苷酸对,SEQ ID NO:1中的6944至6961碱基的核苷酸和7678至7695碱基的核苷酸,SEQ ID NO:1中的7087至7104碱基的核苷酸和7611至7628碱基的核苷酸,SEQ ID NO:1中的9821至9838碱基的核苷酸和10508至10525碱基的核苷酸,SEQ ID NO:1中的10009至10026碱基的核苷酸和10683至10700碱基的核苷酸,进行PCR反应,PCR反应体系如下:MQ:15.7μl,Mg2+:2.5μl,Buffer:2.5μl,dNTP:1μl,Taq酶:0.3μl,P1:1μl,P2:1μl,模板DNA:1μl。PCR反应条件为:95℃:5′,95℃:30″,56℃:45″,72℃:1′,72℃:5′,共30个循环。反应结束后,取10μl反应产物电泳,若有与预期大小相符的扩增带,则结果为阳性,若没有,则结果为阴性。参入了5×103,5×102,5×101,和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果。参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上述方法时,这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O49的检测灵敏度均为0.25个菌/g。
通过对O抗原基因簇的克隆和在减毒的疫苗菌株中的表达,可以组建重组疫苗。O抗原为最主要的革兰氏阴性菌的表面抗原,可以引起强烈的免疫反应,是制造重组疫苗的最好的靶分子之一。在1993年Viret实验室成功的将志贺氏菌Sonnei的O抗原基因簇在一株沙门氏菌Tyziai疫苗菌中表达,动物实验证明可以引起兔子的免疫反应(Molecular Microbiology1993,7:239-252)。中国军事医学科学院的小组也在从事与Viret实验室类似的工作。王磊实验室在1999年成功的将大肠杆菌O111的O抗原基因簇在沙门氏菌疫苗STM-1中表达,并证明组建成的菌株可以引起小鼠的血液和体液反应(Microbial Pathogenesis 1999,27:55-59)。所以本发明O49的O抗原特异基因序列可以应用于组建重组疫苗。
根据本发明的对大肠杆菌O49型的O-抗原特异的核苷酸序列(SEQ ID NO:1所示),构造特异核酸探针,将其固定到芯片的载体上制成生物芯片,将要检测的样品适当处理后,与生物芯片进行杂交反应,然后利用生物芯片信号分析设备就可以得到样品中相应的细菌情况。这种大肠杆菌O抗原鉴定的DNA芯片将可以直接用于临床和其它检验场所(如食品加工和生产行业,畜牧兽医行业海关检疫等的微生物检验)。这种芯片只需要扩大产量,在完全相同的条件下就可以产业化。
表3是大肠杆菌O49的O-抗原基因簇的结构表,在表中列出了大肠杆菌O49的O-抗原基因簇的结构,共由13个基因组成,每个基因用方框表示,并在方框内写入基因的名称。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因,它们不属于O-抗原基因簇,我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。
表4是大肠杆菌O49的O-抗原基因簇中的基因的位置表,在表中列出了大肠杆菌O49的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置,在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在细菌中开放阅读框的起始密码子有两个:ATG和GTG。
SEQ ID NO:1序列(SEQUENCE LISTING)
<110>天津生物芯片技术有限责任公司
<120>对大肠杆菌O49的O-抗原特异的核苷酸
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>14256
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>1
attgtggctg cagggatcaa agaaatcctc ctggtaactc acgcgtccaa gaacgcggtc 60
gaaaaccact tcgacacctc ttatgagtta gaatcactcc ttgagcagcg cgtgaagcgt 120
caactgctgg cggaagtaca gtccatctgt ccgccgggcg tgaccattat gaacgtgcgt 180
cagggcgaac ctttaggttt aggccactcc attttgtgtg cgcgacctgc cattggtgac 240
aacccatttg tcgtggtact gccagacgtt gtgatcgacg atgccagcgc cgacccgcta 300
cgttacaacc ttgctgccat gattgcacgt ttcaacgaaa cgggccgcag ccaggtgctg 360
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gaactggaac gtactcagcc tggtgcatgg ggacgtattc agctgactga tgctattgcc 600
gagctggcga aaaaacaatc cgttgatgca atgctgatga ccggcgacag ttacgactgc 660
ggcaaaaaaa tgggctatat gcaggcgttt gtgaagtatg gcctacgcaa cctgaaagaa 720
ggggcgaagt tccgtaaagg tattgagaag ctgttaagcg aataatgaaa atctgaccgg 780
atgtaacggt tgataagaaa attataacgg cagtgaaaat tcgcagcaaa agtaatttgt 840
tgcgaatctt cctgccgttg ttttatataa accatcagaa taacaacgag ttagcagtag 900
ggttttattc aaagttttcc aggattttcc ttgtttccag agcggattgg taagacaatt 960
agcgtttgaa tttttcgggt ttagcgcgag tgggtaacgc tcgtcacatc ataggcatgc 1020
atgcagtgct ctggtagctg taaagccagg ggcggtagcg tgcattaata cctctattaa 1080
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gcacctgcaa tggcacggat ttttgctcag catcagccgg atgcagtgat gcacctggct 1380
gctgaaagcc atgttgaccg ttcaattaca ggccctgcgg catttattga aaccaatatt 1440
gttggtactt atgtcctttt ggaagccgct cgcaattact ggtctgctct tgatagcgac 1500
aagaaaaata gcttccgttt tcatcatatt tctactgacg aagtctatgg tgatttgcct 1560
catccagatg aagtaaataa taacgaagaa ttactcttat ttactgagac gacatcttat 1620
gcgccaagca gcccttattc cgcatcaaaa gcatccagcg atcatttagt ccgtgcgtgg 1680
aaacgtacct atggtttacc gaccattgtg actaactgtt cgaataacta cggtccttat 1740
cactttccgg aaaaattgat tccactagta attcttaatg ctctggaagg taaggcattg 1800
cctatttatg gtaaagggga tcaaattcgc gactggctgt atgttgaaga tcatgcacgt 1860
gcgttatata ccgtcgtaac cgaaggtaaa gcgggtgaaa cttataacat tggtggacac 1920
aacgaaaaga aaaacatcga tgtagtgctc actatttgtg atttgttgga tgagattgta 1980
ccgaaagaga aatcttaccg cgagcaaatt acttatgttg ccgatcgtcc gggacacgat 2040
cgccgttatg ccattgatgc tgagaagatt ggtcgcgaat tgggatggaa accacaggaa 2100
acgtttgaga gcgggattcg taaaacggtg gaatggtacc tgtccaatac aaaatgggtt 2160
gataatgtga aaagtggtgc ctatcaattg tggattgaac agaactatga gggccgccag 2220
taatgaatat cctccttttt ggcaaaagag ggcaggtagg ttgggaacta cagcgtgctc 2280
tggcaccttt gggtaatttg attgctcttg atgttcactc cactgattat tgtggtgatt 2340
ttagtaatcc tgaaggtgtg gctgaaaccg tcaaaaaaat tcgccctgat gttattgtta 2400
atgctgcggc tcatactgca gtagataagg ctgagtcaga acccgaattt gcacaattac 2460
tcaatgcgac cagcgttgaa tcaattgcaa aagcggctaa tgaagttggg gcctgggtaa 2520
ttcattactc aactgactac gtatttccgg gaaccggtga aataccatgg ctggagacgg 2580
atgcaaccgc accgctaaat gtttacggtg aaaccaagtt agccggagaa aaagcgttac 2640
aggaacattg cgcgaagcat cttattttcc gtaccagctg ggtatacgca ggtaaaggaa 2700
ataacttcgc caaaacgatg ttgcgtctgg caaaagagcg tgaagaatta gcggttatta 2760
acgatcagtt tggtgcacca acgggtgctg agctgctggc tgattgtacg gcacatgcta 2820
ttcgtgttgc actgaaaaaa ccagaagtcg caggcttgta ccatttggta gccagtggta 2880
ccacaacctg gtacgattat gctgcgctgg tttttgaaga ggcgcgcaaa gcaggcattc 2940
cccttgcact caacaagctc aacgcagtac caacaactgc ctatcctaca ccagctcgtc 3000
gtccacataa ctctcgcctt aatacagaaa aatttcagca gaactttgcg cttgtcttgc 3060
ctgactggca ggttggcgtg aaacgaatgt tcaacgaatt atttacgact acagcaattt 3120
aatagttttt gcatcttgtt cgtgatggtg gagcaagatg aattaaaagg aatgatgaaa 3180
tgaaaacgcg taaaggtatt attttagcgg gtggttctgg tacacgtctt tatcctgtga 3240
ctatggctgt cagtaaacag ctgttaccga tttacgataa accgatgatc tattacccgc 3300
tctctacact gatgttggcg ggtattcgcg atattctgat tatcagtacg ccacaggata 3360
ctcctcgttt tcaacaactg ctgggtgacg ggagccagtg ggggctaaat cttcagtaca 3420
aagtgcaacc gagtccggat ggtcttgcgc aggcatttat catcggtgaa gagtttatcg 3480
gtggtgatga ttgtgctttg gttcttggtg ataatatctt ctacggtcat gatctgccga 3540
agttaatgga tgtcgctgtt aacaaagaaa gtggtgcaac ggtatttgcc tatcacgtta 3600
atgatcctga acgctacggt gttgttgagt ttgataaaaa cggtacggca atcagcctgg 3660
aagaaaaacc gctacaacca aaaagtaatt atgcggtaac cgggctttat ttctatgata 3720
acgacgttgt cgaaatggcg aaaaacctta agccttctgc ccgtggtgaa ctggaaatta 3780
ccgacattaa ccgtatttat atggaacagg ggcgtttatc cgttgccatg atggggcgtg 3840
gttatgcatg gctggatacg gggacacatc agagtcttat tgaagcaagc aacttcattg 3900
ccaccattga agagcgccag ggactaaagg tttcctgccc ggaagaaatt gcttaccgta 3960
aagggtttat tgatgcagag caggtgaaag cattagctga gccgctgaaa aaaaatgctt 4020
atggtcagta tctgctgaaa atgattaaag gttattaata aaatgaacgt aattaaaaca 4080
gagattccag acgtattaat tttcgaaccg aaagtttttg gtgatgagcg tggtttcttt 4140
tttgagagct ttaaccagaa ggtttttgag gaagctgtag gtcgcaaagt tgaatttgtt 4200
caggataacc attcgaagtc tagtaaaggt gttttacgcg ggctgcatta tcagttggaa 4260
ccttatgcac aagggaaatt ggtgcgctgc gttgttggtg aggtttttga tgttgcggtt 4320
gatattcgta aatcgtcacc tacttttggt aagtgcttag aagttatatt atctgcaaat 4380
aataaaaaac aattatggat ccctgaagga tttgcgcatg gatttctaac cttacaagat 4440
gatacagaaa taatatataa aaccacaaat tactattcac cagaatatga aagagccatt 4500
atttggaatg atgaagagct ttcaattaag tggcctagta aaccggatat catatctcaa 4560
aaagatagtt tagcctcagc attttcatct attaaatatt gaagagaaat aaatgaataa 4620
gaaaatacca gttacacaac catttcttcc tgaactaaat gagtttgtcc cttacttgca 4680
acagatatgg gataataaat ggttaacaaa taatggcccc ttccacatgg aactggagga 4740
agaactatgt aaatatttag gggtaaaaca tatatcatta tttacaaacg caacaatagc 4800
attggttaca gctcttcaag ctttacgaat ctcaggagaa gtgatcacta caccttattc 4860
ttttgttgcg actagtcatt ctatattatg gaataatctc aaaccagttt tcgttgatat 4920
agatagtgaa acttttaata ttgatcctga caaaatagag tcagccataa cttctaatac 4980
tacagcaata atgccagttc attgctacgg taatccatgt gatgttgaga aaattcaaaa 5040
aatagctgat gattatgggt taaaggtgat ttatgatgcg gcccatgcct tcggtattaa 5100
atacaaaaat aacagcttgt tgaattatgg tgatttgtca attttaagtt tccatgcaac 5160
aaaggtgttt aatacttttg aaggaggagc aataatttgt aaagatgaaa aaactaagct 5220
taggattgat aaattaaaga attttggatt tgtggatgag gtaactgtta ctgcccccgg 5280
cataaatggg aaaatgagcg aggttaacgc agcgtttgga ttattgcagt taaaatatgt 5340
caatgatgcg attcttaaac gaaaagcaat acacgattat tactgccaat ctttaaatga 5400
agtgacgggc ttgtcgatac ctgagttttc gccaaacgct acaaggaact attcgtattt 5460
tccagttctt attaatgagg atttttcagt atctagggat aaacttcatg agatattgaa 5520
gtataataat atactctctc ggcgatattt ttacccttta attagcaata tgccgatgta 5580
tagaggatta ccttctgctc tttgtcataa tcttagaaat gcaaattctc tctcttcgaa 5640
agttctttgt ttacctattt atagcgaatt aacaatagaa gagtgtgata agattattaa 5700
tctcataaag aaagttaacg aaaggtaatt atatgaaaag cattattggt atttatggtg 5760
ctggtggttt cggtagagag gtgctaccta ttataagaca acaggttgga ttaaaatcag 5820
atgtggtttt tatcgttgat gatatcaaag aaaaggtagt caatgaaaca aaggttgtaa 5880
catttgatga gttttgttcg ctaaaagata tggataaata ttatactgtt gcaatagcag 5940
acagtaaagt gagaatggag atagatataa aatgcatccg agagggaatt aagcccattt 6000
ctatttattc tcaaaacagt gtgataatgg atgatgtact gattggtgat ggtgcgattt 6060
tatctccttt tacttgtata acatcaaatg taagaatcgg gaaatctttt catgccaatt 6120
tatatagtta tatagcgcat gattgtgtta ttggagacta tgtcacttta gcaccaggtg 6180
taaaatgtaa cggtaatgtt attatagagg atcatgctta tgtcggaact ggggcaataa 6240
ttcgacctgg gaccaaaaca aaaccactcg taattggaag ccattctatt attggaatgg 6300
gggcggttgt cactaaaaca gtaccttcag gaaaaacagt atttgggaat ccggcaaaaa 6360
tattaggcaa taagagagaa tcataatatg gatcctatgc aaaatttata catcgggatg 6420
acggcacagt attcccagac tgtaagtgat agtgatataa aagcgttctc tgggctaagt 6480
ggtgataaaa accctgttca tatgagcgat gaatatgcgc agaaaaccat gtttaagaaa 6540
cgaattgctc atggttttat gtcagcaagt tatttttctg caatctttgg cacaaaatta 6600
ccaggggagg gatgtgtata tctttctcag acactaaaat ttataaagcc agtttatatt 6660
ggtgatacag ttaccgctat tgtaaccttg acgaaaataa attcacgctc tcggcgattg 6720
acatttgata caatctgtgt tgtcaagaat gaaactgtga tatccggtgt tgcagagata 6780
tatttaccta aaataagtga gtagatgata attagatttt aaaaagtaaa acattaagcg 6840
aaaatacatg ttaagaagaa atgttgtttt taattattta gggcaatttt acatatccct 6900
tatggggata tgtatttttc ctctatattt aagatatatt ggagaggaag cgtatggttt 6960
aattggtttt tttgtttgcc ttcaaacatg gatgctttta tttgatttag gcatgtcacc 7020
aacactttct aggcaagtgg ccataactaa tgctaataat gattttgatt ttttaagaaa 7080
attgatgaga agtctcgaat cggtattttt ctttatagca ttaattatta tgctgttaat 7140
ggccattttt tgtaatgata tagcccaaaa atggttggcc gttaagaact taaatattga 7200
tgaagtggca gtatgcattg caataatggg aggggttgtt tctttacgat ggtttactag 7260
tctctataaa agcggaataa atggttatga aaagcaagca tggctcaatg tagttaatat 7320
ttttattgta acattaagat tgcctgcatc tttgcttcta tttatttact tttcaaaatc 7380
cctaataata tattttgtat atcagctgat tatatctatt gttgaattgt ttatttataa 7440
caggaaaatg tatagatgtc tgccaaaacg attaaatgat aatcataaga tatatttaat 7500
atcatgggat gttttaaaaa gtgttttacc ttttgctgca ggaactgcgt atactgcagg 7560
aatatgggtg ttattaacgc aattggataa gcttttactt tcgaaagtgt taacgctcag 7620
caactttggt tttttttcat tggttgcaac gttggttgga ggtatattaa tgctttcttc 7680
tcccatcagt aatgccattt taccgcgaat aacggttctt gtgtcgcaag gtaaaattga 7740
gcaagtagtt ggtttgtata cacgttgtac aagatttgtt tgttgcgtaa tatttcctat 7800
tacgatggtt atgatatgtt atccttatca ggttatttat ggatggacag gaaatgacgt 7860
taccgcaaaa tgggcgatga acgtattgcc cctgtattct ttgggtaatg ctcttttagc 7920
agttattgga tttcagtatt acttacaata tgcgtatggt aaattaaaat tacacattat 7980
atataacact gtattggcga ttgtgtcgat accagcagta agtttttttg ctattagata 8040
tgcagcaata ggcacgggaa ttgtttggat cgcaattaat agtattacat tattgttttg 8100
gacgtatatt gtgcataata aatttcttaa aggagttcat ttcagatggt tatttcaaga 8160
cgttttattc cccgcattga tttcagcaat gatcatattt attatttcaa ataatataga 8220
cacaacatca cagagtagaa ttgaaaatat actttttgta tctttagtta gttttacaac 8280
aataattata tctctttttg tttctttttt taccgatatt atgagctttt ttaaaggaat 8340
ggttaaatga aaaatgtttt atttattaat agtggttttg aacttggcgg aattgaaaca 8400
ttccttgtta gagcagctaa aaatttatct aaagatgtaa agtatacact cttaataatg 8460
agtgatgcta cgaacaaaga tctccttgac aagttctcta tatatggcga tgttattttt 8520
ttgagtgatt tgctattatt taatgcaggt aaatatgcaa tactaagaac ccttttacct 8580
cttaatcgac aaaaagttag aactttgctc tctcacattg atataattca tgcctcgtgc 8640
tctttctcat taattctaat gcgaaaacta agttgtattc ttaataaagg aatactagag 8700
tcagttggtg tctatcattc cagagagttt ttatgggggg aaaaaaaaag attaatgagg 8760
aaaactcaac tttcaatgtt taaaaaaatt cctgcaaata acgtactttt catgaatgaa 8820
tatacagtta aattatattc agatatattt aaggtgaatt attataatgc tttaccaatt 8880
ggtatcgata ttggtattta ttctgaatgt ataccgaata aaaatagcgg aagaattgta 8940
tccatcggaa gattggtcga ttttaaaaca tataattatc atatgataga ttatttatct 9000
acattatcta gtgaaagaag aaatatgtta tgttttgaaa tatatggaga tggcccggaa 9060
tcagttgcac tgaaaaaatt agcaaaacaa aggaatgtga aagtaaagtt tggagggcga 9120
ttagagtata aagatatgcc atccatttta gatggtgcaa gtttatttat aggttcaggt 9180
actgccatcg ttgaagcggc ggcagctggt gtaccttgta tcatagggat tgaatcaatt 9240
gatgagcctc tgacatatgg ttttcttaca gaaacagtgg ggctttcgtt ccaagaaatg 9300
ggactgaatt atccccttaa aaaatatgaa atggcgatga gtgaatttta tgaactttca 9360
gaagaagatt acttaatatt atcagataag catagaagaa gagccaaaga tttttcatta 9420
gataatatga agtcaattat acttgattat tatgaaaatt tatctgataa cacaactaga 9480
aataaaccat gtataatgta tgcattaagc acaatgtttt ggatgatatt aaataaaatg 9540
aaaattaata atgagagaaa ttcaatgtat gatttctgaa aagaaaaaca tgagaatgtc 9600
tagttttaaa gctcctttaa tattttgtct tcttgcagca tttttacctc taggtagtac 9660
aattggagtt gccttttctt gggtgatatt tccagctatt gccataatat taactttttt 9720
agtttcacgt tttttttata gatctggtgt ttatttttta gttctgtcga tagtacttct 9780
agttttaaat tatggcatag ttttacaata tgtttcattt gcagagcgtt tagagtttaa 9840
tatgctgctt gcaattattg gttgttttta tatgtcagtg gttttttttt catataaatt 9900
caatttttct gacttgtcaa aagcaattaa tatagtatta ctaattagta ttattttatt 9960
ttttattcaa tttttatcat attatttgtt taattatagg atcgattata gtttagctac 10020
aggtggtatt ggtactcgta acgattatgg ctcattgtat agagcatctg gtatctttaa 10080
tgaaccagct gagtattcat cagcaataac tgttcttgtt gtttcaagtt atttaataaa 10140
cagaaaatta tcactattaa atatcatagc ccttataagc acaatgttat ctttttcatt 10200
tgtgggaatt attcagtctt tctttgtcat atatattgtt ttattccgaa atctttgtag 10260
gaaaccggta tatatttttt taattatcgg tattgttatt ttggtttgga tttctttttt 10320
tgatttattt attgacagat atgaggcatt tattaatgga agtgatggta gcaataatac 10380
aaaactagat acgttaaatt tctttttaac gcatacagaa taccttttgg ggggggctgg 10440
cttaattgga tacgatccag aaacgatgcc attatttatg caaggattat atgatctaac 10500
attctttggc tcgtgtatca gtatttttgg tattgttatt ggttcattta ttgccatagc 10560
ggtgactgtt tatattatat ataattatac tatttctgat atgacactaa tttttatatg 10620
tttgttaaaa attaatgtaa tgatatatgc agtatactgg ttttttataa tattaattat 10680
aattctgcct aactacatac aaaaaacgaa ggtacatgtg tgaaaattca tttattaatg 10740
cctacgatag ggcgggctga agaaattgaa aaattcatat catcagtaaa taagaataat 10800
gcatcagtgc aattgcttat cgctgatcaa aatgaagtag gatttcttga acctaaaaaa 10860
ttatatgaat gcgctaagaa tcagaatatt gacatgcatt attttcatag tgaacaaaaa 10920
ggattgtctc gtaacagaaa ctttttactt tcaaaattag atgcccatga aggtattata 10980
gcattccctg atgatgactg cctatattat gaagatactt tagatttggt aatgtcattt 11040
tttgaaaata atccgagtgt tgatgtttta ttgggatgta tatacgatag ggaatatgac 11100
agatatttat ttaaaaagtg gccgagaaaa agtgttgtgg ttaattattt aaatgtatat 11160
tttatgtctt cctctataac aatttttgtt cggaaaccga atcagcaaaa attcgatcaa 11220
gcacttggag caggggctgt atacgggtca tgtgaagatc cagattatct ttatagttta 11280
ctaaaaaaag gatgcaaaat agtatatgaa ccctccatcc aagtttggca tcctgctcct 11340
gattatcatc aaatatcctt gagtaaggta tattcctatg ctaaaggatt cggatatttt 11400
atacgtaaag atattgacgt ttataaatct atattgttag tattgttaat ttctaaaaaa 11460
ctgtttcaat tgatatttag atttaaacat tttccgataa aatatttcag agcgtatttt 11520
tcaggtttaa ttagtggact attgagaaag caaacatgag tcttgtcaag agagttgctg 11580
ttttattagc agcatataat ggagttaagt ggattgaaga acaaattcaa tcaatactta 11640
atcagaaaag tattgatgtg acaatattta taagcgttga taaatctact gacggtacag 11700
aggctttggt taaaaaaatt agccacaaat atagtaatgt aaaatattta cccttcggtt 11760
ttaaattcgg aggtgcagct aaaaattttt ataggctcat aaaagaggtt gattttgagc 11820
tatttgactt tgtatctctg tcagatcaag atgatatttg gtaccctaat aaattgatta 11880
cagctgttaa taagatcaac accggttacg atttttactc aagtaacgtt gtggcttttt 11940
ggaaaaatgg taaaagaata attattaaca aagcgcaaaa acaactaccg tatgattatt 12000
tttttgaagc cgctggtcct ggatgtacat atgtttttaa atcttttcaa gctatcaagc 12060
tgaaagaatt tattatttct aattataaat ctgtatcaga aattgcactt catgattggt 12120
taatttatgc ctttgcacga aattacaact ataaatggta tattgatgaa tggccatcca 12180
tggattatcg acaacatgaa aataaccagg ttggtgctaa tgtaaccata tatggtgtaa 12240
taaaacgcgt aagactagta agacaaaagt ggtaccgaaa tgaaattata aaaatagcaa 12300
aattattaca ggtatcaaat aatcatttta tctcaaaatg tttacaagaa agatacttga 12360
gtaactttta catgatcatg aatatgcata aaatccgacg tagaagaaga gatagggtta 12420
tgttattcct gctgtgtgtg attaattggt tttaatttca tacataattc gattgtattc 12480
agctatattt atggtgtttt ccattggatt ccatttaata ataaatagga ggtaacgttg 12540
acaattctga ttactggcgg agcaggatac attggttctc atacagtgtt ggctcttttg 12600
tgcaatgaat atgatgtcat tgttctggat aacgaatgca attcttctat tgaatcgtta 12660
tctcgtgtta agtcaatcac cggaaaggaa tttttatatg ttaatggtga tgtaagagat 12720
cgtggaaagt tacgtactat ttttaaacaa catgaaatta ctgatattat acattttgca 12780
gggttgaaat ctgtcggtga atctattaaa gcacctttac aatactacaa taataatgtt 12840
atgggtgcaa ttgttctttt agaggaaatg attagtttta atattcctca tattatattt 12900
agttcttcgg caacagttta tggcgaacct actgaaatac ctgtaactga aagatcgaaa 12960
ataggaggaa caactaatcc atatggtact tcaaaactta tggttgagca gatcttagag 13020
gacgttactc gtactaatcc tgaatttaga gcaactatac tacgttattt caaccctgtt 13080
ggtgctcatc cttcaggtca cataggtgaa gatcctaacg gtactcctaa caatctagtt 13140
ccttatgttt gccaagttgc tatcggaaaa tataaacagg tttcaatata tggcaatgat 13200
tatccaacta aagatggtac aggtgttcgt gatttcattc atgtcatgga tcttgctgac 13260
ggtcatgttg cagcagtaca acaccggaat gaagggaaga atcataaaat atataacctt 13320
ggaacaggtg taggacactc agttttagat attttgaaaa cctttaaacg tgttgcgtca 13380
attaatattc catattcttt taataataga cgtccggggg atattgctga gtgttggtcc 13440
gatcctacca aggcattaaa tgaattaggg tggaaagcaa aatatgattt agatgaaatg 13500
gttcgagatg cttggaattg gcagagaaaa aatcctaatg gttatagtaa accttaatta 13560
atttctatct atgtttatat tctctgcggt caaaaaattt taatggtttc attacaaatt 13620
aattcccctg acaggagtaa acaatgtcaa agcaacagat cggcgtcgtc ggtatggcag 13680
tgatggggcg caaccttgcg ctcaacatcg aaagccgtgg ttataccgtc tctattttca 13740
accgttcccg tgaaaagacg gaagaagtga ttgccgaaaa tccgggcaag aagctggttc 13800
cttactatac ggtgaaagag tttgttgaat ctctggaaac gcctcgtcgc atcctgttaa 13860
tggtgaaagc aggtgctggc acggatgctg ctattgattc cctcaagcca tacctcgata 13920
aaggtgacat catcattgat ggtggtaata ccttcttcca ggacaccatt cgccgtaacc 13980
gtgagctttc tgccgaaggc tttaacttca tcggtaccgg tgtttccggc ggtgaagagg 14040
gcgcgctgaa aggtccttcc attatgcctg gtggccagaa agaagcctat gaactggttg 14100
ctccgatcct gaccaaaatc gccgccgttg ctgaagatgg ggagccatgt gttacctata 14160
ttggtgccga tggcgcgggt cactatgtaa aaatggttca caacggtatt gaatacggtg 14220
atatgcagct gattgctgaa gcctattctc tccttg 14256
表1大肠杆菌O49的O抗原基因簇中wzx基因和wzy基因及其中的引物及PCR数据
产生正
PCR的
基因的 正向引物位置 反向引物位置 PCR产物 确大小
基因 功能
退火温
碱基位置 长度 电泳带
度(℃)
的组数
wzx O-抗原 6848-8350 6944-6961 7678-7695 752bp 0 62
转运酶
7087-7104 7611-7628 542bp 0 62
wzy O-抗原 9551-10723 9821-9838 10508-10525 705bp 0 62
聚合酶
10009-10026 10683-10700 692bp 0 63
表2 166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源
组号 该组中含有的菌株 来源
1、野生型大肠杆菌 O1,O2,O5,O7,O8,O9,O12,O13,O14,O15,O16,O17,O18, IMVSa
O19ab,O20,O21,O22,O23,O24
2、野生型大肠杆菌 O4,O10,O25,O26,O27,O28,O29,O30,O32,O33,O34,O35, IMVSa
O36,O37,O38,O40,O41,O42,O43
3、野生型大肠杆菌 O6,O44,O45,O46,O48,O49,O50,O51,O52,O54,O55,O56, IMVSa
O57,O58,O60,O61,O62,O53
4、野生型大肠杆菌 O63,O65,O66,O69,O70,O71,O74,O75,O76,O77,O78, IMVSa
O79,O80,O81,O82,O83,O68
5、野生型大肠杆菌 O84,O85,O86,O87,O88,O89,O90,O91,O92,O98,O99, IMVSa
O101,O102,O103,O104,O105,O106,O97,
6、野生型大肠杆菌 O107,O108,O109,O110,O111,O112ab,O112ac,O113, IMVSa
O115,O116,O118,O120,O123,O125,O126,O128,O117
7、野生型大肠杆菌 O129,O130,O131,O132,O133,O134,O135,O136,O137, IMVSa
O138,O139,O141,O142,O143,O144,O145,O140
8、野生型大肠杆菌 O146,O147,O148,O150,O152,O154,O156,O157,O158, IMVSa
O159,O160,O161,O163,O164,O165,O166,O153 b
9、野生型大肠杆菌 O168,O169,O170,O171,O172,O173, c
痢疾志贺氏菌 D1,D2,D3,D4,D5,D6,D7,D8,D9,D10,D11,D12,D13 d
10、鲍氏志贺氏菌 B1,B2,B3,B4,B6,B7,B8,B9,B10,B11,B12,B13,B14,B15, d
B16,B17,B18
11、福氏志贺氏菌 F1a,F1b,F2a,F2b,F3,F4a,F4b,F5(v:4),F5(v:7),F6, d
DS,DR
12、野生型大肠杆菌 O3,O11,O39,O59,O64,O73,O96,O95,O100,O114,O151,O155,IMVSa
O124,O167,O162,O121,O127,O149,O119
13、野生型大肠杆菌 去除大肠杆菌O49的第三组的菌
为了检测的方便,每12-19个菌分为一组,总共12组,第13组作为阴性对照
a.Institude of Medical and Veterinary Science,Anelaide,Australia
b.Statens Serum Institut,Copenhagen,Denmark
c.O172和O173来自于Statens Serum Institut,Copenhagen,Denmark,其余来自于IMVS
d.中国预防医学科学院流行病学研究所
表3是大肠杆菌O49的O-抗原基因簇的结构表
galF rmlB rmlD rmlA rmlC vioA orf6 orf7 wzx orf9 wzy orf11 orf12 gne gnd
1kb___
表4是大肠杆菌O49的O-抗原基因簇中的基因的位置表
ATTGTGGCTG CAGGGATCAA AGAAATCCTC CTGGTAACTC ACGCGTCCAA GAACGCGGTC 60
GAAAACCACT TCGACACCTC TTATGAGTTA GAATCACTCC TTGAGCAGCG CGTGAAGCGT 120
CAACTGCTGG CGGAAGTACA GTCCATCTGT CCGCCGGGCG TGACCATTAT GAACGTGCGT 180
CAGGGCGAAC CTTTAGGTTT AGGCCACTCC ATTTTGTGTG CGCGACCTGC CATTGGTGAC 240
AACCCATTTG TCGTGGTACT GCCAGACGTT GTGATCGACG ATGCCAGCGC CGACCCGCTA 300
CGTTACAACC TTGCTGCCAT GATTGCACGT TTCAACGAAA CGGGCCGCAG CCAGGTGCTG 360
GCAAAACGTA TGCCGGGTGA CCTCTCTGAA TACTCCGTCA TCCAGACTAA AGAGCCGCTG 420
GACCGTGAGG GTAAAGTCAG CCGCATTGTT GAATTTATCG AAAAACCGGA TCAGCCGCAG 480
ACGCTGGACT CAGACATCAT GGCCGTAGGT CGCTATGTGC TTTCTGCCGA TATTTGGCCG 540
GAACTGGAAC GTACTCAGCC TGGTGCATGG GGACGTATTC AGCTGACTGA TGCTATTGCC 600
GAGCTGGCGA AAAAACAATC CGTTGATGCA ATGCTGATGA CCGGCGACAG TTACGACTGC 660
GGCAAAAAAA TGGGCTATAT GCAGGCGTTT GTGAAGTATG GCCTACGCAA CCTGAAAGAA 720
GGGGCGAAGT TCCGTAAAGG TATTGAGAAG CTGTTAAGCG AATAATGAAA ATCTGACCGG 780
ATGTAACGGT TGATAAGAAA ATTATAACGG CAGTGAAAAT TCGCAGCAAA AGTAATTTGT 840
TGCGAATCTT CCTGCCGTTG TTTTATATAA ACCATCAGAA TAACAACGAG TTAGCAGTAG 900
GGTTTTATTC AAAGTTTTCC AGGATTTTCC TTGTTTCCAG AGCGGATTGG TAAGACAATT 960
AGCGTTTGAA TTTTTCGGGT TTAGCGCGAG TGGGTAACGC TCGTCACATC ATAGGCATGC 1020
ATGCAGTGCT CTGGTAGCTG TAAAGCCAGG GGCGGTAGCG TGCATTAATA CCTCTATTAA 1080
Orf1的起始
TCAAACTGAG AGCCGCTTAT TTCACAGCAT GCTCTGAAGT AATATGGAAT AAATTAA
GTG 1140
AAAATACTTG TTACTGGTGG CGCAGGATTT ATTGGTTCAG CTGTAGTTCG TCACATTATA 1200
AATAATACGC AGGATAGTGT TGTTAATGTC GATAAATTAA CGTACGCCGG AAACCGGGAA 1260
TCACTTGCTG ATGTTTCTGA TTCTGAACGC TATGTTTTTG AACATGCGGA TATTTGCGAT 1320
GCACCTGCAA TGGCACGGAT TTTTGCTCAG CATCAGCCGG ATGCAGTGAT GCACCTGGCT 1380
GCTGAAAGCC ATGTTGACCG TTCAATTACA GGCCCTGCGG CATTTATTGA AACCAATATT 1440
GTTGGTACTT ATGTCCTTTT GGAAGCCGCT CGCAATTACT GGTCTGCTCT TGATAGCGAC 1500
AAGAAAAATA GCTTCCGTTT TCATCATATT TCTACTGACG AAGTCTATGG TGATTTGCCT 1560
CATCCAGATG AAGTAAATAA TAACGAAGAA TTACTCTTAT TTACTGAGAC GACATCTTAT 1620
GCGCCAAGCA GCCCTTATTC CGCATCAAAA GCATCCAGCG ATCATTTAGT CCGTGCGTGG 1680
AAACGTACCT ATGGTTTACC GACCATTGTG ACTAACTGTT CGAATAACTA CGGTCCTTAT 1740
CACTTTCCGG AAAAATTGAT TCCACTAGTA ATTCTTAATG CTCTGGAAGG TAAGGCATTG 1800
CCTATTTATG GTAAAGGGGA TCAAATTCGC GACTGGCTGT ATGTTGAAGA TCATGCACGT 1860
GCGTTATATA CCGTCGTAAC CGAAGGTAAA GCGGGTGAAA CTTATAACAT TGGTGGACAC 1920
AACGAAAAGA AAAACATCGA TGTAGTGCTC ACTATTTGTG ATTTGTTGGA TGAGATTGTA 1980
CCGAAAGAGA AATCTTACCG CGAGCAAATT ACTTATGTTG CCGATCGTCC GGGACACGAT 2040
CGCCGTTATG CCATTGATGC TGAGAAGATT GGTCGCGAAT TGGGATGGAA ACCACAGGAA 2100
ACGTTTGAGA GCGGGATTCG TAAAACGGTG GAATGGTACC TGTCCAATAC AAAATGGGTT 2160
GATAATGTGA AAAGTGGTGC CTATCAATTG TGGATTGAAC AGAACTATGA GGGCCGCCAG 2220
Orf1的终止Orf2的起始
TAATGAATAT CCTCCTTTTT GGCAAAAGAG GGCAGGTAGG TTGGGAACTA CAGCGTGCTC 2280
TGGCACCTTT GGGTAATTTG ATTGCTCTTG ATGTTCACTC CACTGATTAT TGTGGTGATT 2340
TTAGTAATCC TGAAGGTGTG GCTGAAACCG TCAAAAAAAT TCGCCCTGAT GTTATTGTTA 2400
ATGCTGCGGC TCATACTGCA GTAGATAAGG CTGAGTCAGA ACCCGAATTT GCACAATTAC 2460
TCAATGCGAC CAGCGTTGAA TCAATTGCAA AAGCGGCTAA TGAAGTTGGG GCCTGGGTAA 2520
TTCATTACTC AACTGACTAC GTATTTCCGG GAACCGGTGA AATACCATGG CTGGAGACGG 2580
ATGCAACCGC ACCGCTAAAT GTTTACGGTG AAACCAAGTT AGCCGGAGAA AAAGCGTTAC 2640
AGGAACATTG CGCGAAGCAT CTTATTTTCC GTACCAGCTG GGTATACGCA GGTAAAGGAA 2700
ATAACTTCGC CAAAACGATG TTGCGTCTGG CAAAAGAGCG TGAAGAATTA GCGGTTATTA 2760
ACGATCAGTT TGGTGCACCA ACGGGTGCTG AGCTGCTGGC TGATTGTACG GCACATGCTA 2820
TTCGTGTTGC ACTGAAAAAA CCAGAAGTCG CAGGCTTGTA CCATTTGGTA GCCAGTGGTA 2880
CCACAACCTG GTACGATTAT GCTGCGCTGG TTTTTGAAGA GGCGCGCAAA GCAGGCATTC 2940
CCCTTGCACT CAACAAGCTC AACGCAGTAC CAACAACTGC CTATCCTACA CCAGCTCGTC 3000
GTCCACATAA CTCTCGCCTT AATACAGAAA AATTTCAGCA GAACTTTGCG CTTGTCTTGC 3060
Orf2的终止
CTGACTGGCA GGTTGGCGTG AAACGAATGT TCAACGAATT ATTTACGACT ACAGCAATT
T 3120
Orf3的起始
AATAGTTTTT GCATCTTGTT CGTGATGGTG GAGCAAGATG AATTAAAAGG AATGATGAA
A 3180
TGAAAACGCG TAAAGGTATT ATTTTAGCGG GTGGTTCTGG TACACGTCTT TATCCTGTGA 3240
CTATGGCTGT CAGTAAACAG CTGTTACCGA TTTACGATAA ACCGATGATC TATTACCCGC 3300
TCTCTACACT GATGTTGGCG GGTATTCGCG ATATTCTGAT TATCAGTACG CCACAGGATA 3360
CTCCTCGTTT TCAACAACTG CTGGGTGACG GGAGCCAGTG GGGGCTAAAT CTTCAGTACA 3420
AAGTGCAACC GAGTCCGGAT GGTCTTGCGC AGGCATTTAT CATCGGTGAA GAGTTTATCG 3480
GTGGTGATGA TTGTGCTTTG GTTCTTGGTG ATAATATCTT CTACGGTCAT GATCTGCCGA 3540
AGTTAATGGA TGTCGCTGTT AACAAAGAAA GTGGTGCAAC GGTATTTGCC TATCACGTTA 3600
ATGATCCTGA ACGCTACGGT GTTGTTGAGT TTGATAAAAA CGGTACGGCA ATCAGCCTGG 3660
AAGAAAAACC GCTACAACCA AAAAGTAATT ATGCGGTAAC CGGGCTTTAT TTCTATGATA 3720
ACGACGTTGT CGAAATGGCG AAAAACCTTA AGCCTTCTGC CCGTGGTGAA CTGGAAATTA 3780
CCGACATTAA CCGTATTTAT ATGGAACAGG GGCGTTTATC CGTTGCCATG ATGGGGCGTG 3840
GTTATGCATG GCTGGATACG GGGACACATC AGAGTCTTAT TGAAGCAAGC AACTTCATTG 3900
CCACCATTGA AGAGCGCCAG GGACTAAAGG TTTCCTGCCC GGAAGAAATT GCTTACCGTA 3960
AAGGGTTTAT TGATGCAGAG CAGGTGAAAG CATTAGCTGA GCCGCTGAAA AAAAATGCTT 4020
Orf3的终止Orf4的起始
ATGGTCAGTA TCTGCTGAAA ATGATTAAAG GTTAT
TAATA AA
ATGAACGT AATTAAAACA 4080
GAGATTCCAG ACGTATTAAT TTTCGAACCG AAAGTTTTTG GTGATGAGCG TGGTTTCTTT 4140
TTTGAGAGCT TTAACCAGAA GGTTTTTGAG GAAGCTGTAG GTCGCAAAGT TGAATTTGTT 4200
CAGGATAACC ATTCGAAGTC TAGTAAAGGT GTTTTACGCG GGCTGCATTA TCAGTTGGAA 4260
CCTTATGCAC AAGGGAAATT GGTGCGCTGC GTTGTTGGTG AGGTTTTTGA TGTTGCGGTT 4320
GATATTCGTA AATCGTCACC TACTTTTGGT AAGTGCTTAG AAGTTATATT ATCTGCAAAT 4380
AATAAAAAAC AATTATGGAT CCCTGAAGGA TTTGCGCATG GATTTCTAAC CTTACAAGAT 4440
GATACAGAAA TAATATATAA AACCACAAAT TACTATTCAC CAGAATATGA AAGAGCCATT 4500
ATTTGGAATG ATGAAGAGCT TTCAATTAAG TGGCCTAGTA AACCGGATAT CATATCTCAA 4560
Orf4的终止 Orf5的起始
AAAGATAGTT TAGCCTCAGC ATTTTCATCT ATTAAATAT
T GAAGAGAAAT AA
ATGAATAA 4620
GAAAATACCA GTTACACAAC CATTTCTTCC TGAACTAAAT GAGTTTGTCC CTTACTTGCA 4680
ACAGATATGG GATAATAAAT GGTTAACAAA TAATGGCCCC TTCCACATGG AACTGGAGGA 4740
AGAACTATGT AAATATTTAG GGGTAAAACA TATATCATTA TTTACAAACG CAACAATAGC 4800
ATTGGTTACA GCTCTTCAAG CTTTACGAAT CTCAGGAGAA GTGATCACTA CACCTTATTC 4860
TTTTGTTGCG ACTAGTCATT CTATATTATG GAATAATCTC AAACCAGTTT TCGTTGATAT 4920
AGATAGTGAA ACTTTTAATA TTGATCCTGA CAAAATAGAG TCAGCCATAA CTTCTAATAC 4980
TACAGCAATA ATGCCAGTTC ATTGCTACGG TAATCCATGT GATGTTGAGA AAATTCAAAA 5040
AATAGCTGAT GATTATGGGT TAAAGGTGAT TTATGATGCG GCCCATGCCT TCGGTATTAA 5100
ATACAAAAAT AACAGCTTGT TGAATTATGG TGATTTGTCA ATTTTAAGTT TCCATGCAAC 5160
AAAGGTGTTT AATACTTTTG AAGGAGGAGC AATAATTTGT AAAGATGAAA AAACTAAGCT 5220
TAGGATTGAT AAATTAAAGA ATTTTGGATT TGTGGATGAG GTAACTGTTA CTGCCCCCGG 5280
CATAAATGGG AAAATGAGCG AGGTTAACGC AGCGTTTGGA TTATTGCAGT TAAAATATGT 5340
CAATGATGCG ATTCTTAAAC GAAAAGCAAT ACACGATTAT TACTGCCAAT CTTTAAATGA 5400
AGTGACGGGC TTGTCGATAC CTGAGTTTTC GCCAAACGCT ACAAGGAACT ATTCGTATTT 5460
TCCAGTTCTT ATTAATGAGG ATTTTTCAGT ATCTAGGGAT AAACTTCATG AGATATTGAA 5520
GTATAATAAT ATACTCTCTC GGCGATATTT TTACCCTTTA ATTAGCAATA TGCCGATGTA 5580
TAGAGGATTA CCTTCTGCTC TTTGTCATAA TCTTAGAAAT GCAAATTCTC TCTCTTCGAA 5640
AGTTCTTTGT TTACCTATTT ATAGCGAATT AACAATAGAA GAGTGTGATA AGATTATTAA 5700
Orf5的终止Orf6的起始
TCTCATAAAG AAAGTTAACG AAAGG
TAATT AT
ATGAAAAG CATTATTGGT ATTTATGGTG 5760
CTGGTGGTTT CGGTAGAGAG GTGCTACCTA TTATAAGACA ACAGGTTGGA TTAAAATCAG 5820
ATGTGGTTTT TATCGTTGAT GATATCAAAG AAAAGGTAGT CAATGAAACA AAGGTTGTAA 5880
CATTTGATGA GTTTTGTTCG CTAAAAGATA TGGATAAATA TTATACTGTT GCAATAGCAG 5940
ACAGTAAAGT GAGAATGGAG ATAGATATAA AATGCATCCG AGAGGGAATT AAGCCCATTT 6000
CTATTTATTC TCAAAACAGT GTGATAATGG ATGATGTACT GATTGGTGAT GGTGCGATTT 6060
TATCTCCTTT TACTTGTATA ACATCAAATG TAAGAATCGG GAAATCTTTT CATGCCAATT 6120
TATATAGTTA TATAGCGCAT GATTGTGTTA TTGGAGACTA TGTCACTTTA GCACCAGGTG 6180
TAAAATGTAA CGGTAATGTT ATTATAGAGG ATCATGCTTA TGTCGGAACT GGGGCAATAA 6240
TTCGACCTGG GACCAAAACA AAACCACTCG TAATTGGAAG CCATTCTATT ATTGGAATGG 6300
GGGCGGTTGT CACTAAAACA GTACCTTCAG GAAAAACAGT ATTTGGGAAT CCGGCAAAAA 6360
Orf6的终止Orf7的起始
TATTAGGCAA TAAGAGAGAA TCA
TAAT
ATGGATCCTATGC AAAATTTATA CATCGGGATG 6420
ACGGCACAGT ATTCCCAGAC TGTAAGTGAT AGTGATATAA AAGCGTTCTC TGGGCTAAGT 6480
GGTGATAAAA ACCCTGTTCA TATGAGCGAT GAATATGCGC AGAAAACCAT GTTTAAGAAA 6540
CGAATTGCTC ATGGTTTTAT GTCAGCAAGT TATTTTTCTG CAATCTTTGG CACAAAATTA 6600
CCAGGGGAGG GATGTGTATA TCTTTCTCAG ACACTAAAAT TTATAAAGCC AGTTTATATT 6660
GGTGATACAG TTACCGCTAT TGTAACCTTG ACGAAAATAA ATTCACGCTC TCGGCGATTG 6720
ACATTTGATA CAATCTGTGT TGTCAAGAAT GAAACTGTGA TATCCGGTGT TGCAGAGATA 6780
Orf7的终止
TATTTACCTA AAATAAGTGA G
TAGATGATA ATTAGATTTT AAAAAGTAAA ACATTAAGCG 6840
Orf8的起始
AAAATAC
ATG TTAAGAAGAA ATGTTGTTTT TAATTATTTA GGGCAATTTT ACATATCCCT 6900
TATGGGGATA TGTATTTTTC CTCTATATTT AAGATATATT GGAGAGGAAG CGTATGGTTT 6960
AATTGGTTTT TTTGTTTGCC TTCAAACATG GATGCTTTTA TTTGATTTAG GCATGTCACC 7020
AACACTTTCT AGGCAAGTGG CCATAACTAA TGCTAATAAT GATTTTGATT TTTTAAGAAA 7080
ATTGATGAGA AGTCTCGAAT CGGTATTTTT CTTTATAGCA TTAATTATTA TGCTGTTAAT 7140
GGCCATTTTT TGTAATGATA TAGCCCAAAA ATGGTTGGCC GTTAAGAACT TAAATATTGA 7200
TGAAGTGGCA GTATGCATTG CAATAATGGG AGGGGTTGTT TCTTTACGAT GGTTTACTAG 7260
TCTCTATAAA AGCGGAATAA ATGGTTATGA AAAGCAAGCA TGGCTCAATG TAGTTAATAT 7320
TTTTATTGTA ACATTAAGAT TGCCTGCATC TTTGCTTCTA TTTATTTACT TTTCAAAATC 7380
CCTAATAATA TATTTTGTAT ATCAGCTGAT TATATCTATT GTTGAATTGT TTATTTATAA 7440
CAGGAAAATG TATAGATGTC TGCCAAAACG ATTAAATGAT AATCATAAGA TATATTTAAT 7500
ATCATGGGAT GTTTTAAAAA GTGTTTTACC TTTTGCTGCA GGAACTGCGT ATACTGCAGG 7560
AATATGGGTG TTATTAACGC AATTGGATAA GCTTTTACTT TCGAAAGTGT TAACGCTCAG 7620
CAACTTTGGT TTTTTTTCAT TGGTTGCAAC GTTGGTTGGA GGTATATTAA TGCTTTCTTC 7680
TCCCATCAGT AATGCCATTT TACCGCGAAT AACGGTTCTT GTGTCGCAAG GTAAAATTGA 7740
GCAAGTAGTT GGTTTGTATA CACGTTGTAC AAGATTTGTT TGTTGCGTAA TATTTCCTAT 7800
TACGATGGTT ATGATATGTT ATCCTTATCA GGTTATTTAT GGATGGACAG GAAATGACGT 7860
TACCGCAAAA TGGGCGATGA ACGTATTGCC CCTGTATTCT TTGGGTAATG CTCTTTTAGC 7920
AGTTATTGGA TTTCAGTATT ACTTACAATA TGCGTATGGT AAATTAAAAT TACACATTAT 7980
ATATAACACT GTATTGGCGA TTGTGTCGAT ACCAGCAGTA AGTTTTTTTG CTATTAGATA 8040
TGCAGCAATA GGCACGGGAA TTGTTTGGAT CGCAATTAAT AGTATTACAT TATTGTTTTG 8100
GACGTATATT GTGCATAATA AATTTCTTAA AGGAGTTCAT TTCAGATGGT TATTTCAAGA 8160
CGTTTTATTC CCCGCATTGA TTTCAGCAAT GATCATATTT ATTATTTCAA ATAATATAGA 8220
CACAACATCA CAGAGTAGAA TTGAAAATAT ACTTTTTGTA TCTTTAGTTA GTTTTACAAC 8280
AATAATTATA TCTCTTTTTG TTTCTTTTTT TACCGATATT ATGAGCTTTT TTAAAGGAAT 8340
Orf9的起始Orf8的终止
GGTTAA
ATGA AAAATGTTTT ATTTATTAAT AGTGGTTTTG AACTTGGCGG AATTGAAACA 8400
TTCCTTGTTA GAGCAGCTAA AAATTTATCT AAAGATGTAA AGTATACACT CTTAATAATG 8460
AGTGATGCTA CGAACAAAGA TCTCCTTGAC AAGTTCTCTA TATATGGCGA TGTTATTTTT 8520
TTGAGTGATT TGCTATTATT TAATGCAGGT AAATATGCAA TACTAAGAAC CCTTTTACCT 8580
CTTAATCGAC AAAAAGTTAG AACTTTGCTC TCTCACATTG ATATAATTCA TGCCTCGTGC 8640
TCTTTCTCAT TAATTCTAAT GCGAAAACTA AGTTGTATTC TTAATAAAGG AATACTAGAG 8700
TCAGTTGGTG TCTATCATTC CAGAGAGTTT TTATGGGGGG AAAAAAAAAG ATTAATGAGG 8760
AAAACTCAAC TTTCAATGTT TAAAAAAATT CCTGCAAATA ACGTACTTTT CATGAATGAA 8820
TATACAGTTA AATTATATTC AGATATATTT AAGGTGAATT ATTATAATGC TTTACCAATT 8880
GGTATCGATA TTGGTATTTA TTCTGAATGT ATACCGAATA AAAATAGCGG AAGAATTGTA 8940
TCCATCGGAA GATTGGTCGA TTTTAAAACA TATAATTATC ATATGATAGA TTATTTATCT 9000
ACATTATCTA GTGAAAGAAG AAATATGTTA TGTTTTGAAA TATATGGAGA TGGCCCGGAA 9060
TCAGTTGCAC TGAAAAAATT AGCAAAACAA AGGAATGTGA AAGTAAAGTT TGGAGGGCGA 9120
TTAGAGTATA AAGATATGCC ATCCATTTTA GATGGTGCAA GTTTATTTAT AGGTTCAGGT 9180
ACTGCCATCG TTGAAGCGGC GGCAGCTGGT GTACCTTGTA TCATAGGGAT TGAATCAATT 9240
GATGAGCCTC TGACATATGG TTTTCTTACA GAAACAGTGG GGCTTTCGTT CCAAGAAATG 9300
GGACTGAATT ATCCCCTTAA AAAATATGAA ATGGCGATGA GTGAATTTTA TGAACTTTCA 9360
GAAGAAGATT ACTTAATATT ATCAGATAAG CATAGAAGAA GAGCCAAAGA TTTTTCATTA 9420
GATAATATGA AGTCAATTAT ACTTGATTAT TATGAAAATT TATCTGATAA CACAACTAGA 9480
AATAAACCAT GTATAATGTA TGCATTAAGC ACAATGTTTT GGATGATATT AAATAAAATG 9540
Orf10的起始 Orf9的终止
AAAATTAATA
ATGAGAGAAA TTCAATGTAT GATTTC
TGAA AAGAAAAACA TGAGAATGTC 9600
TAGTTTTAAA GCTCCTTTAA TATTTTGTCT TCTTGCAGCA TTTTTACCTC TAGGTAGTAC 9660
AATTGGAGTT GCCTTTTCTT GGGTGATATT TCCAGCTATT GCCATAATAT TAACTTTTTT 9720
AGTTTCACGT TTTTTTTATA GATCTGGTGT TTATTTTTTA GTTCTGTCGA TAGTACTTCT 9780
AGTTTTAAAT TATGGCATAG TTTTACAATA TGTTTCATTT GCAGAGCGTT TAGAGTTTAA 9840
TATGCTGCTT GCAATTATTG GTTGTTTTTA TATGTCAGTG GTTTTTTTTT CATATAAATT 9900
CAATTTTTCT GACTTGTCAA AAGCAATTAA TATAGTATTA CTAATTAGTA TTATTTTATT 9960
TTTTATTCAA TTTTTATCAT ATTATTTGTT TAATTATAGG ATCGATTATA GTTTAGCTAC 10020
AGGTGGTATT GGTACTCGTA ACGATTATGG CTCATTGTAT AGAGCATCTG GTATCTTTAA 10080
TGAACCAGCT GAGTATTCAT CAGCAATAAC TGTTCTTGTT GTTTCAAGTT ATTTAATAAA 10140
CAGAAAATTA TCACTATTAA ATATCATAGC CCTTATAAGC ACAATGTTAT CTTTTTCATT 10200
TGTGGGAATT ATTCAGTCTT TCTTTGTCAT ATATATTGTT TTATTCCGAA ATCTTTGTAG 10260
GAAACCGGTA TATATTTTTT TAATTATCGG TATTGTTATT TTGGTTTGGA TTTCTTTTTT 10320
TGATTTATTT ATTGACAGAT ATGAGGCATT TATTAATGGA AGTGATGGTA GCAATAATAC 10380
AAAACTAGAT ACGTTAAATT TCTTTTTAAC GCATACAGAA TACCTTTTGG GGGGGGCTGG 10440
CTTAATTGGA TACGATCCAG AAACGATGCC ATTATTTATG CAAGGATTAT ATGATCTAAC 10500
ATTCTTTGGC TCGTGTATCA GTATTTTTGG TATTGTTATT GGTTCATTTA TTGCCATAGC 10560
GGTGACTGTT TATATTATAT ATAATTATAC TATTTCTGAT ATGACACTAA TTTTTATATG 10620
TTTGTTAAAA ATTAATGTAA TGATATATGC AGTATACTGG TTTTTTATAA TATTAATTAT 10680
Orf10的终止 Orf11的起始
AATTCTGCCT AACTACATAC AAAAAACGAA GGTACATGTG
TGAAAATTCA TTTATTA
ATG10740
CCTACGATAG GGCGGGCTGA AGAAATTGAA AAATTCATAT CATCAGTAAA TAAGAATAAT 10800
GCATCAGTGC AATTGCTTAT CGCTGATCAA AATGAAGTAG GATTTCTTGA ACCTAAAAAA 10860
TTATATGAAT GCGCTAAGAA TCAGAATATT GACATGCATT ATTTTCATAG TGAACAAAAA 10920
GGATTGTCTC GTAACAGAAA CTTTTTACTT TCAAAATTAG ATGCCCATGA AGGTATTATA 10980
GCATTCCCTG ATGATGACTG CCTATATTAT GAAGATACTT TAGATTTGGT AATGTCATTT 11040
TTTGAAAATA ATCCGAGTGT TGATGTTTTA TTGGGATGTA TATACGATAG GGAATATGAC 11100
AGATATTTAT TTAAAAAGTG GCCGAGAAAA AGTGTTGTGG TTAATTATTT AAATGTATAT 11160
TTTATGTCTT CCTCTATAAC AATTTTTGTT CGGAAACCGA ATCAGCAAAA ATTCGATCAA 11220
GCACTTGGAG CAGGGGCTGT ATACGGGTCA TGTGAAGATC CAGATTATCT TTATAGTTTA 11280
CTAAAAAAAG GATGCAAAAT AGTATATGAA CCCTCCATCC AAGTTTGGCA TCCTGCTCCT 11340
GATTATCATC AAATATCCTT GAGTAAGGTA TATTCCTATG CTAAAGGATT CGGATATTTT 11400
ATACGTAAAG ATATTGACGT TTATAAATCT ATATTGTTAG TATTGTTAAT TTCTAAAAAA 11460
CTGTTTCAAT TGATATTTAG ATTTAAACAT TTTCCGATAA AATATTTCAG AGCGTATTTT 11520
Orf12的起始Orf11的终止
TCAGGTTTAA TTAGTGGACT ATTGAGAAAG CAAAC
ATGAG TCTTGTCAAG AGAGTTGCTG 11580
TTTTATTAGC AGCATATAAT GGAGTTAAGT GGATTGAAGA ACAAATTCAA TCAATACTTA 11640
ATCAGAAAAG TATTGATGTG ACAATATTTA TAAGCGTTGA TAAATCTACT GACGGTACAG 11700
AGGCTTTGGT TAAAAAAATT AGCCACAAAT ATAGTAATGT AAAATATTTA CCCTTCGGTT 11760
TTAAATTCGG AGGTGCAGCT AAAAATTTTT ATAGGCTCAT AAAAGAGGTT GATTTTGAGC 11820
TATTTGACTT TGTATCTCTG TCAGATCAAG ATGATATTTG GTACCCTAAT AAATTGATTA 11880
CAGCTGTTAA TAAGATCAAC ACCGGTTACG ATTTTTACTC AAGTAACGTT GTGGCTTTTT 11940
GGAAAAATGG TAAAAGAATA ATTATTAACA AAGCGCAAAA ACAACTACCG TATGATTATT 12000
TTTTTGAAGC CGCTGGTCCT GGATGTACAT ATGTTTTTAA ATCTTTTCAA GCTATCAAGC 12060
TGAAAGAATT TATTATTTCT AATTATAAAT CTGTATCAGA AATTGCACTT CATGATTGGT 12120
TAATTTATGC CTTTGCACGA AATTACAACT ATAAATGGTA TATTGATGAA TGGCCATCCA 12180
TGGATTATCG ACAACATGAA AATAACCAGG TTGGTGCTAA TGTAACCATA TATGGTGTAA 12240
TAAAACGCGT AAGACTAGTA AGACAAAAGT GGTACCGAAA TGAAATTATA AAAATAGCAA 12300
AATTATTACA GGTATCAAAT AATCATTTTA TCTCAAAATG TTTACAAGAA AGATACTTGA 12360
GTAACTTTTA CATGATCATG AATATGCATA AAATCCGACG TAGAAGAAGA GATAGGGTTA 12420
Orf12的终止
TGTTATTCCT GCTGTGTGTG ATTAATTGGT TT
TAATTTCA TACATAATTC GATTGTATTC 12480
AGCTATATTT ATGGTGTTTT CCATTGGATT CCATTTAATA ATAAATAGGA GGTAACGTTG 12540
Orf13的起始
ACAATTCTGA TTACTGGCGG AGCAGGATAC ATTGGTTCTC ATACA
GTGTT GGCTCTTTTG 12600
TGCAATGAAT ATGATGTCAT TGTTCTGGAT AACGAATGCA ATTCTTCTAT TGAATCGTTA 12660
TCTCGTGTTA AGTCAATCAC CGGAAAGGAA TTTTTATATG TTAATGGTGA TGTAAGAGAT 12720
CGTGGAAAGT TACGTACTAT TTTTAAACAA CATGAAATTA CTGATATTAT ACATTTTGCA 12780
GGGTTGAAAT CTGTCGGTGA ATCTATTAAA GCACCTTTAC AATACTACAA TAATAATGTT 12840
ATGGGTGCAA TTGTTCTTTT AGAGGAAATG ATTAGTTTTA ATATTCCTCA TATTATATTT 12900
AGTTCTTCGG CAACAGTTTA TGGCGAACCT ACTGAAATAC CTGTAACTGA AAGATCGAAA 12960
ATAGGAGGAA CAACTAATCC ATATGGTACT TCAAAACTTA TGGTTGAGCA GATCTTAGAG 13020
GACGTTACTC GTACTAATCC TGAATTTAGA GCAACTATAC TACGTTATTT CAACCCTGTT 13080
GGTGCTCATC CTTCAGGTCA CATAGGTGAA GATCCTAACG GTACTCCTAA CAATCTAGTT 13140
CCTTATGTTT GCCAAGTTGC TATCGGAAAA TATAAACAGG TTTCAATATA TGGCAATGAT 13200
TATCCAACTA AAGATGGTAC AGGTGTTCGT GATTTCATTC ATGTCATGGA TCTTGCTGAC 13260
GGTCATGTTG CAGCAGTACA ACACCGGAAT GAAGGGAAGA ATCATAAAAT ATATAACCTT 13320
GGAACAGGTG TAGGACACTC AGTTTTAGAT ATTTTGAAAA CCTTTAAACG TGTTGCGTCA 13380
ATTAATATTC CATATTCTTT TAATAATAGA CGTCCGGGGG ATATTGCTGA GTGTTGGTCC 13440
GATCCTACCA AGGCATTAAA TGAATTAGGG TGGAAAGCAA AATATGATTT AGATGAAATG 13500
Orf13的终止
GTTCGAGATG CTTGGAATTG GCAGAGAAAA AATCCTAATG GTTATAGTAA ACCT
TAATTA 13560
ATTTCTATCT ATGTTTATAT TCTCTGCGGT CAAAAAATTT TAATGGTTTC ATTACAAATT 13620
AATTCCCCTG ACAGGAGTAA ACAATGTCAA AGCAACAGAT CGGCGTCGTC GGTATGGCAG 13680
TGATGGGGCG CAACCTTGCG CTCAACATCG AAAGCCGTGG TTATACCGTC TCTATTTTCA 13740
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CTTACTATAC GGTGAAAGAG TTTGTTGAAT CTCTGGAAAC GCCTCGTCGC ATCCTGTTAA 13860
TGGTGAAAGC AGGTGCTGGC ACGGATGCTG CTATTGATTC CCTCAAGCCA TACCTCGATA 13920
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TTGGTGCCGA TGGCGCGGGT CACTATGTAA AAATGGTTCA CAACGGTATT GAATACGGTG 14220
ATATGCAGCT GATTGCTGAA GCCTATTCTC TCCTTG 14256
以上仅是本发明较佳实施例,并非对本发明作任何限制,凡依本发明技术实质对以上实施例作修改、等同变化与修饰,均属本发明技术方案的范围内。
Claims (10)
1、一种对大肠杆菌O49的O-抗原特异的核苷酸,其特征在于,其是如SEQ ID NO:1所示的分离的核苷酸,全长14256个碱基;或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基,同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO:1的核苷酸。
2、按照权利要求1所述的对大肠杆菌O49的O-抗原特异的核苷酸,其特征在于,其包括命名为rmlB,rmlD,rmlA,rmlC,vioA,orf6,orf7,wzx,orf9,wzy,orf11,orf12,gne的13个基因组成,都位于galF基因和gnd基因之间。
3、按照权利要求2所述的对大肠杆菌O49的O-抗原特异的核苷酸,其特征在于,所述基因中具有高度特异性的基因包括:转运酶基因,包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因;聚合酶基因,包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因;糖基转移酶基因,包括orf6、orf9、orf11、orf12基因。其中所述的转运酶基因是SEQ ID NO:1中的6848至8350碱基的核苷酸;聚合酶基因是SEQ ID NO:1中的9551至10723碱基的核苷酸;orf6是SEQ ID NO:1中的5733至6386碱基的核苷酸;orf9是SEQ ID NO:1中的8347至9579碱基的核苷酸;orf11是SEQ ID NO:1中的10738至11559碱基的核苷酸;orf12是SEQ ID NO:1中的11556至12455碱基的核苷酸。
4、按照权利要求1或2所述的对大肠杆菌O49的O-抗原特异的核苷酸,其特征在于,其还包括源于所述的wzx基因、wzy基因中的寡核苷酸或糖基转移酶基因包括orf6、orf9、orf11、orf12基因的寡核苷酸;以及它们的混合或它们的重组。
5、按照权利要求4所述的对大肠杆菌O49的O-抗原高度特异的核苷酸,其特征在于,所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是:SEQ ID NO:1中的6944至6961碱基的核苷酸和7678至7695碱基的核苷酸,SEQ ID NO:1中的7087至7104碱基的核苷酸和7611至7628碱基的核苷酸;源于wzy基因的寡核苷酸对是:SEQ ID NO:1中的9821至9838碱基的核苷酸和10508至10525碱基的核苷酸,SEQ ID NO:1中的10009至10026碱基的核苷酸和10683至10700碱基的核苷酸。
6、权利要求1所述的对大肠杆菌O49的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。
7、权利要求1所述的对大肠杆菌O49的O-抗原特异的核苷酸的重组分子,在通过插入表达而提供表达大肠杆菌O49的O-抗原,以及制备细菌疫苗中的应用。
8、权利要求1所述的对大肠杆菌O49的O-抗原特异的核苷酸的应用,其特征在于,它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列,供检测细菌。
9、权利要求1所述的对大肠杆菌O49型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法,其特征在于,其包括下述步骤:
(1)基因组的提取:在培养基中培养大肠杆菌O49型,离心收集细胞;得到的基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测;
(2)通过PCR扩增大肠杆菌O49型中的O-抗原基因簇:以大肠杆菌O49型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇,将得到的PCR产物,用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性,合并该long PCR产物,并用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物;
(3)构建O-抗原基因簇文库:将Long PCR纯化产物应用鸟枪法构建O-抗原基因簇文库;
(4)对文库中的克隆测序:从文库中挑选插入片段在1kb以上的克隆用实验室常用的DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序,序列达到100%的覆盖率,从而获得O-抗原基因簇的所有序列;
(5)核苷酸序列的拼接及分析:应用生物信息学软件拼接和编辑所有的序列,从而得到大肠杆菌O49型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列;
(6)特异基因的筛选:针对大肠杆菌O49型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、基因设计引物;在每个基因内各设计了两对引物,每对引物分布在相应基因内的不同地方,以确保其特异性;用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR,确定wzx、wzy基因对大肠杆菌O49型的O-抗原的高度特异性;
(7)引物灵敏度的检测:培养大肠杆菌O49,细菌计数后分别将5×103,5×102,5×101,5个和0个活菌加入到一定量的某种待检测物中,混入细菌的待检测物作为检测用样品,将样品加入LB培养基,取一些与样品混合过的LB培养基过滤,将过滤液进行培养,从培养好的菌液中取数毫升处理后作为PCR模板用寡核苷酸进行PCR反应,检测其对大肠杆菌O49的灵敏度。
10、权利要求9所述的对大肠杆菌O49的O-抗原特异的核苷酸的分离和鉴定方法,其特征在于,包括下述步骤:
(1)基因组的提取:在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O49,离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞,37℃温育20分钟,然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10%SDS,50℃温育2小时,再加入3ul10mg/ml的RNase,65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物,取上清液,再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)的溶液抽提两次,取上清液再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚,上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA,用玻璃丝卷出DNA并用70%乙醇洗DNA,最后将DNA重悬于30ul TE中,基因组DNA通过0.4%的琼脂糖凝胶电泳检测;
(2)通过PCR扩增大肠杆菌O49中的O-抗原基因簇:以大肠杆菌O49的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇;首先根据经常发现于O-抗原基因簇上游的galF基因设计上游引物(5’-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAAGAA ATC-3’),再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCGCGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的ExpandLong Template PCR方法扩增O-抗原基因簇,PCR反应程序如下:在94℃预变性2分钟,然后94℃变性10秒,61℃退火30秒,68℃延伸15分钟,这样进行30个循环;最后,在68℃继续延伸7分钟,得到PCR产物,用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性;合并6管long PCR产物,并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物;
(3)构建O-抗原基因簇文库:用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库;反应体系是300ng PCR纯化产物,0.9ul 0.1M MnCl2,1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI,反应在室温中进行;酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间,而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应;合并4管同样的反应体系,用等体积的酚抽提一次,用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液抽提一次,再用等体积的乙醚抽提一次后,用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA,并用70%乙醇洗沉淀,最后重悬于18ul水中;随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP,1mMdGTP,1mMdTTP,10mMdATP),1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶,11℃反应30分钟,将酶切产物补成平端,75℃终止反应后,加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul,70℃反应20分钟,使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时,总体积为90ul,其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶;最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物,再用70%乙醇洗沉淀,干燥后溶于30ul水中得到连接产物;用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞,取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后,转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击,电压为2.5千伏,时间为5.0毫秒-6.0毫秒,电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏,然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃过夜培养,次日得到蓝白菌落,将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养,同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小,得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O49的O-抗原基因簇文库;
(4)对文库中的克隆测序:从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序,使序列达到80%的覆盖率,再通过将相联系的序列进行反向测序及测通得到剩余20%的序列,从而获得O-抗原基因簇的所有序列。
(5)核苷酸序列的拼接及分析:用英国剑桥MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列,从而得到大肠杆菌O49的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列,序列的质量主要由两个方面来保证:1)对大肠杆菌O49的基因组作6个Long PCR反应,然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基,保证3个以上高质量的覆盖率;在得到大肠杆菌O49的O-抗原基因簇的核苷酸序列后,用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information,NCBI)的orffinder发现基因,找到13个开放的阅读框,用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因,再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释,用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对,最后得到大肠杆菌O49的O-抗原基因簇的结构;
(6)特异基因筛选:针对大肠杆菌O49的O-抗原基因簇中wzx、wzy基因设计引物;在每个基因内各设计两对引物,每对引物分布在相应基因内不同地方以确保其特异性;用这些引物以166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌基因组为模板进行PCR,所有引物在大肠杆菌O49中得到阳性结果,在其他组中没有扩增到任何大小正确的带,也就是,在大多数组中没有得到任何PCR产物带,虽在少数组中得到PCR产物带,但其大小不符合预期大小,所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O49及其O-抗原都是高度特异的。
(7)引物灵敏度的检测:将大肠杆菌O49的冻存菌液接种到有LB培养基的三角瓶中,30℃-40℃培养,180至250转/分,培养数小时至饱和,取培养好的菌液稀释,取稀释菌液涂布LB琼脂平板,30℃至40℃,培养数小时计数,计算原液中活菌浓度;在5份重量均为20g的生猪肉馅中分别掺入5×103,5×102,5×101,5个和0个活菌,搅拌均匀,加入LB培养基,过滤,过滤液于30℃-40℃培养,180至250转/分,培养数小时;从培养好的菌液中取数ml于6,000g离心数分钟,去上清,加MQ超纯水吹开沉淀并混匀,放入100℃沸水中煮数分钟,裂解液于12,000g离心数分钟,取上清做为PCR模板;用寡核苷酸(SEQ ID NO:1中的6944至6961碱基的核苷酸和7678至7695碱基的核苷酸,SEQ ID NO:1中的7087至7104碱基的核苷酸和7611至7628碱基的核苷酸,SEQ ID NO:1中的9821至9838碱基的核苷酸和10508至10525碱基的核苷酸,SEQ ID NO:1中的10009至10026碱基的核苷酸和10683至10700碱基的核苷酸)进行PCR反应,PCR反应体系如下:MQ:15.7μl,Mg2+:2.5μl,Buffer:2.5μl,dNTP:1μl,Taq酶:0.3μl,P1:1μl,P2:1μl,模板DNA:1μl。PCR反应条件为:95℃:5′,95℃:30″,56℃:45″,72℃:1′,72℃:5′,共30个循环;反应结束后,取10μl反应产物电泳,若有与预期大小相符的扩增带,则结果为阳性,若没有,则结果为阴性;参入了5×103,5×102,5×101,和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果;参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果;说明使用上述方法时,这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O49的检测灵敏度均为0.25个菌/g。
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