CN1554656A - 云南狗牙花总生物碱和其盐类以及制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，是用云南狗牙花制备的总生物碱和其盐类以及用其制备防治阿片类物质依赖性药物或食品或镇痛药物的用途。制备方法包括醇提取法和酸水提取法。制得的总生物碱按常规制成盐酸盐、醋酸盐或硫酸盐。经药理活性研究，云南狗牙花总生物碱具有镇痛和戒毒作用，即对吗啡和海洛因成瘾都有脱毒和阻止复吸作用，且本身不具有身体依赖性和精神依赖性，因此，可用于制备防治阿片类物质依赖性药物或食品或镇痛药物。

Description

云南狗牙花总生物碱和其盐类以及制备方法和用途

                             技术领域

本发明涉及医药技术领域，是用云南狗牙花制备的总生物碱和其盐类以及用其制备防治阿片类物质依赖性药物或食品或镇痛药物的用途。

                               背景技术

云南狗牙花(Ervatamia yunnanensis Tsiang)是夹竹桃科狗牙花属植物，分布于我国云南省和广西自治区，生长于海拔1000～1700米山地林中，民间用其茎入药，用于治疗产后体虚、头晕目眩、恶露淋漓、高血压、腹痛、喉痛等疾病。云南狗牙花的化学成分研究较少，Liu Gui等[Liu G，Liu X，Feng XZ.Ervayunine：a new indole alkaloidfrom Ervatamia yunnanensis. Planta Med.1988，54(6)：519-521]从其根部分离到9个吲哚生物碱：伏康京碱(voacangine)，伊波加因碱(ibogaine)，伏康京羟基吲哚利宁碱(voacangine hydroxyindolenine)，(+)-米奴卫辛碱((+)-minovicine)，伏卡络丁碱(voachalotin)，艾瓦云宁碱(ervayunine)，冠狗牙花碱(coronaridine)，19-S-海泥山辣椒碱(19-s-heyneanine)，依泼加木胺(ibogamine)。喻阳等[喻阳，高金明，刘吉开.云南狗牙花成分研究。云南植物研究1999，21(3)：399]则从其地上部分的乙醇提取物中分离鉴定了8个吲哚生物碱：19-S-羟基塔卡明碱(19-S-hydroxytacamine)，19-S-羟基-16-表-塔卡明碱(19-S-hydroxy-16-epi-tacamine)，艾瓦它明碱(ervatamine)，19，20-羟基艾瓦它明碱(19，20-hydroervatamine)，19-表-艾瓦它明碱(19-epi-ervatamine)，17-去甲氧基可瑞纳辛碱B(17-demethoxycorynoxine B)，17-去甲氧基氢化可瑞纳辛碱(17-demethoxyhydrocorynoxine)，塔波纳目亭碱(emaemontanine)。至今未见对上述化合物进行防治阿片类物质精神依赖性和身体依赖性及镇痛作用研究的报道。

                             发明内容

本发明从云南狗牙花的根和茎中提取了总生物碱，并从中分离到11个生物碱单体，它们的化学结构如下：

苦参碱(matrine)(1)                                   冠狗牙花碱(coronaridine)(2)

19，20-二氢异斯替斯瑞克碱

(19，20-dihydroisostitsirikine)(3)                   19-S-海泥山辣椒碱(19-s-heyneanine)(4)

依泼加木胺(ibogamine)(5)                             云南辛碱(yunnanensine)(6)

11’甲氧基-19-S-海泥山辣椒碱                         19，20-E-瓦来萨明碱

(11′-methoxyl-19s-heyneanine)(7)                    (19，20-E-vallesamine)(8)

云南宁碱(yunnanenine)(9)                              10-羟基-19，20-二氢异斯替斯瑞克碱

                                                      (10-hydroxy-19，20-dihydroisositsirikine)(10)

榴花灵碱(conodurine)(11)

上述化合物中，化合物(2)、(4)、(5)与背景技术中所述的三个化合物相同；化合物(6)和(10)为新化合物；化合物(1)、(3)、(7)、(8)、(9)和(11)为该植物中首次发现。

本发明云南狗牙花总生物碱及其盐类的制备方法有醇提取法或酸水提取法两种。

具体制备方法为：

一、醇提取法：

1、云南狗牙花总生物碱的提取：云南狗牙花根和茎或全株粉碎后用8～l0倍量95％乙醇(W/W)分别回流提取三次，将乙醇提取液减压浓缩至无乙醇，得醇提取物，提取物用2％盐酸或2％硫酸等酸水溶解，除去酸水不溶物，酸水液用浓氨水或5％碳酸钠或1％氢氧化钠中和至pH 8～10，即产生沉淀，用氯仿或乙醚或苯萃取三次，萃取液中含生物碱，回收氯仿或乙醚或苯即得云南狗牙花总生物碱。

2、云南狗牙花总生物碱盐的制备：将云南狗牙花总生物碱溶于氯仿，于氯仿溶液中滴加浓盐酸或冰醋酸或2mol/L硫酸至不再产生沉淀，过滤得沉淀，用适量丙酮洗去多余的酸，即得云南狗牙花总生物碱盐酸盐或醋酸盐或硫酸盐。

二、酸水提取法：

1、云南狗牙花总生物碱的提取：云南狗牙花根和茎或全株粉碎后用8～10倍量(W/W)2％盐酸或2％硫酸浸泡(或渗滤)24小时，滤出酸水液，同法浸提三次，合并酸水液，用浓氨水或5％碳酸钠或1％氢氧化钠中和至pH 8～10，产生沉淀，过滤得沉淀，即为云南狗牙花总生物碱的粗制品。

2、云南狗牙花总生物碱的纯化：将上述云南狗牙花总生物碱粗制品干燥后，用适量乙醇或氯仿回流溶解，过滤除去不溶物，滤液减压蒸干即得纯化的云南狗牙花总生物碱。

3、云南狗牙花总生物碱盐的制备：将云南狗牙花总生物碱溶于氯仿，于氯仿溶

液中滴加浓盐酸或冰醋酸或2mol/L硫酸至不再产生沉淀，过滤得沉淀，用适量丙酮洗去多余的酸，即得云南狗牙花总生物碱盐酸盐或醋酸盐或硫酸盐。

本发明用云南狗牙花(Ervatamia yunnanensis Tsiang)制备的总生物碱及其盐(total Ervatamia yunnanensis alkaloids，简称TEYA)，经药理活性研究，发现云南狗牙花总生物碱(TEYA)具有显著镇痛活性和戒毒作用，即对吗啡、海洛因成瘾都有脱毒和阻止复吸作用，且TEYA本身不具有身体依赖性和精神依赖性。因此，可用于制备防治阿片类物质依赖性的药物或镇痛药或食品。为提高云南狗牙花总生物碱在水中的溶解度以便制成注射液，故将其制备成盐。

                           具体实施方式

下面通过实施例，对本发明作进一步说明。

实施例1醇提取法制备总生物碱及其盐类：

云南狗牙花根和茎5kg，粉碎后用8倍量(W/W)95％乙醇分别回流提取三次，合并三次乙醇提取液，减压浓缩至无乙醇，得醇提取物。提取物用2％盐酸1000ml溶解，除去酸水不溶物，酸水溶液用浓氨水中和至pH8～10，即产生沉淀，加入400ml氯仿萃取三次，氯仿溶液含生物碱，回收氯仿即得纯化的云南狗牙花总生物碱。再将云南狗牙花总生物碱溶于200ml氯仿，于氯仿溶液中滴加浓盐酸至不再产生沉淀，滤出沉淀并用适量丙酮洗去多余的酸，即得云南狗牙花总生物碱盐酸盐。

同法，若于总生物碱氯仿溶液中滴加冰醋酸或2mol/L硫酸至不再产生沉淀，滤出沉淀并用适量丙酮洗去多余的酸，即得云南狗牙花总生物碱醋酸盐或硫酸盐。

实施例2  酸水提取法制备总生物碱及其盐类：

云南狗牙花根和茎5kg，粉碎后用10倍量(W/W)2％盐酸浸泡24小时，滤出酸水液。同法浸提三次，合并酸水液，用浓氨水中和至pH8～10，产生沉淀。过滤得沉淀，即为云南狗牙花总生物碱粗制品，置60℃干燥后，用500ml氯仿回流溶解，过滤除去不溶物，氯仿溶液减压蒸干即得纯化的云南狗牙花总生物碱。再将纯化的总生物碱溶于200ml氯仿，于氯仿溶液中滴加浓盐酸至不再产生沉淀，过滤得沉淀，用适量丙酮洗去多余的酸，得云南狗牙花总生物碱盐酸盐。

同法，若于总生物碱氯仿溶液中滴加冰醋酸或2mol/L硫酸至不再产生沉淀，滤出沉淀并用适量丙酮洗去多余的酸，即得云南狗牙花总生物碱醋酸盐或硫酸盐。

下面用云南狗牙花总生物碱的药理活性试验及结果来说明其用途。

实施例3 TEYA对盐酸吗啡精神依赖性的影响及其本身的精神依赖性实验

3.1材料与方法

3.1.1动物：雄性Sprague-Dawley大鼠：160～200g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。雄性昆明种小鼠：18～22g，第二军医大学实验动物中心提供。动物饲养于自然光照动物房(第二军医大学药学院普通级或清洁级医学实验动物环境设施合格证书，上海市医学实验动物管理委员会医动字第02-64号)，随意进食和饮水。

3.1.2药品与试剂

盐酸吗啡(Morphine Hydrochloride，简称吗啡，表中代号Mor)：青海制药厂产品，用pH 3.5～4的生理盐水配成应用液。

盐酸纳洛酮(Naloxone Hydrochloride，简称纳洛酮，表中代号NLX)：北京四环制药厂，用pH3.5～4的生理盐水配成应用液。

云南狗牙花总生物碱(total Ervatamia yunnanensis alkaline，简称TEYA)：按实施例1或实施例2制备的盐酸盐，用pH3.5～4的生理盐水配成应用液。

氢化可的松：上海信谊药厂产品，用生理盐水配成应用液。

3.2.给药方法

3.2.1盐酸吗啡的给药方法

上午皮下注射盐酸吗啡4mg·kg^-1后放入白箱(伴药箱)，下午皮下注射生理盐水后放入黑箱(非伴药箱)。每次在箱内停留50分钟，连续5天。

3.2.2单次剂量给予TEYA的给药方法

小鼠随机分组，即生理盐水组、单独盐酸吗啡组、盐酸吗啡+TEYA 20mg·kg^-1(记作Mor+TEYA₂₀)组、盐酸吗啡+TEYA 40mg·kg^-1(记作Mor+TEYA₄₀)组和盐酸吗啡+TEYA 80mg·kg^-1(记作盐酸吗啡+TEYA₈₀)组。前5天为每天给予盐酸吗啡。试验于第6天观察偏爱反应之前1小时分别给予TEYA 20mg·kg^-1、TEYA 40mg·kg^-1和TEYA80mg·kg^-1。

3.2.3连续给予TEYA的给药方法

小鼠随机分组，即生理盐水组、单独盐酸吗啡8mg·kg^-1组、单独TEYA 5mg·kg^-1组、盐酸吗啡+TEYA2.5mg·gk^-1组、盐酸吗啡+TEYA 5mg·kg^-1组和盐酸吗啡+TEYA 10mg·kg^-1组，于每次皮下注射盐酸吗啡后，立即腹腔内注射TEYA，连续5天。

3.3.实验方法

3.3.1吗啡精神依赖模型，用小鼠条件性位置偏爱试验[万兴旺，黄矛，李万亥，谈冶雄，陶学斌。N-硝基-L-精氨酸对小鼠吗啡和二氢埃托啡精神依赖性的抑制作用.第二军医大学学报1999；20(2)：105-107]

条件性位置偏爱箱  本实验采用的条件性位置偏爱箱为长方形木制穿梭箱，四壁光滑，中间用一活动挡板隔成两箱，两箱的颜色分别为黑色(以下简称黑箱)和白色(以下简称白箱)，每箱尺寸为L25cm×H35cm×W20cm。黑箱底面为金属网的粗糙面，白箱底面为光滑面，两箱之间的挡板下部正中留有一闸门(10cm×10cm)。木箱顶部用透明有机玻璃板盖住，以观察小鼠或大鼠在箱内的活动情况。实验全过程均在安静，温度、湿度和光线相对恒定的房间里进行。

选择实验动物：选用雄性小鼠。打开两室闸门，将小鼠放入中间闸门下，同时用秒表(金雀牌石英秒表，上海秒表厂)计时(准确到秒)，并允许探索黑白箱5分钟，然后记录小鼠15分钟内在黑箱中的停留时间。连续试验3天，选择明显偏爱黑箱的小鼠为实验用动物。

训练动物：将实验用小鼠按体重以随机数字表随机分组。上午皮下注射盐酸吗啡4mg·kg^-1以后放入白箱(伴药箱)，下午皮下注射生理盐水后放入黑箱(非伴药箱)。每次在箱内停留50分钟，连续5天。

观察动物：将完成训练的小鼠于第6天不给任何药物，将其单只放于穿梭箱内，打开两室门，允许探索黑白箱5分钟，然后观察小鼠15分钟内在偏爱侧(黑箱)的停留时间。

3.3.2小鼠吗啡复吸模型

利用上述条件性位置偏爱箱和方法，每天皮下注射盐酸吗啡4mg·kg^-1，训练小鼠7天。第8天停给吗啡，用上述方法观察小鼠在偏爱侧(黑箱)的停留时间，可见小鼠明显偏爱白箱(拌药箱)。之后每隔1天观察一次，直到第7天观察到位置偏爱效应退去。再隔4天，于停给吗啡的第11天对小鼠进行足底电击或皮下注射氢化可的松20mg·kg^-1后，马上放入条件性位置偏爱箱内进行观察。

电击的方法：用有盖的尺寸为L35cm×H28cm×W23cm的箱子，将小鼠置于箱底的不锈钢栅(0.5cm间隔)，通过传送直流电流电击足部，受到电击的小鼠发出吱吱叫声或蹦跳。直流电流由CH-2型高压恒流电刺激器输出，恒定电压为36V，起始直流电流为0.1mA，每10分钟增加0.1mA，共电击30分钟。

3.3.3小鼠复吸模型及TEYA对吗啡小鼠位置偏爱重现的阻断作用

3.4数据的统计学处理

给药组与生理盐水对照组间或不同给药组间比较采用Student t-test。所有数据均以平均值±标准差(x±s)表示。

3.5.实验结果

3.5.1 TEYA对盐酸吗啡条件性位置偏爱的影响及其本身的精神依赖性

3.5.1.1单次给予TEYA对小鼠盐酸吗啡条件性位置偏爱的影响

TEYA腹腔内注射40mg·gk^-1和80mg·kg^-1给药后1小时，或TEYA灌胃80mg·kg^-1给药后3小时，可明显增加盐酸吗啡小鼠在偏爱侧(黑箱)所停留的时间，说明TEYA可阻断盐酸吗啡的精神依赖性反应，并且这种作用可维持12小时。TEYA 20mg·kg^-1对盐酸吗啡小鼠已形成的位置偏爱无显著影响(结果见表1和表2)。

表1.单次给予TEYA对小鼠盐酸吗啡条件性位置偏爱的作用。x±s. ^aP＞0.05，^bP＜0.05，^cP＜0.01，与给药前比较

                                                   在偏爱侧停留的时间(x±s，秒)

            剂量(mg·kg^-1)     小

^*药物

                                鼠                          给药后

            Mor(sc)TEYA                  给药前

                                数

                                                    90分钟      180分钟      360分钟     720分钟

生理盐水    --      --          12       604±39    604±66^a   604±41^a    604±35^a   604±35^a

盐酸吗啡    8       --          13       651±46    322±79^c   365±75^c    393±72^c   360±65^c

盐酸吗啡

            8       20(ip)      11       618±70    366±98^c   523±88^c    484±112^c  409±172^c

+TEYA₂₀

盐酸吗啡

            8       40(ip)      10       568±42    475±98^b   579±160^a   598±133^a  489±177^a

+TEYA₄₀

盐酸吗啡

            8       80(ip)      10       597±27    687±175^a  727±119^c   627±122^a  568±184^c

+TEYA₈₀

盐酸吗啡

            8       80(ig)      11       572±45    443±182^b  468±174^a   675±220^a  656±209^a

+TEYA₈₀

^*Mor为盐酸吗啡，TEYA₂₀、TEYA₄₀、TEYA₈₀分别为云南狗牙花总生物碱盐酸盐20mg·kg^-1、40mg·kg^-1或80mg·kg^-1；括号内代号为给药途径，sc为皮下注射，ip为腹腔内注射。

表2.单次给予TEYA对小鼠盐酸吗啡条件性位置偏爱的作用(比较给予TEYA前、后的偏爱侧停留的时间差值)。x±s.与生理盐水组比较，^aP＞0.05，^bP＜0.05，^cP＜0.01；与盐酸吗啡组比较，^dP＞0.05，^eP＜0.05，^fP＜0.01。

            ^*剂量(mg·kg^-1)     小

                                               在偏爱侧停留的时间(x±s，秒)

药物

                                  鼠

            Mor(sc)    TEYA

                                  数        90分钟          180分钟        360分钟          720分钟

生理盐水    --         --         12        6±68^f         -5±46^f       2±60^f          8±50^f

盐酸吗啡    8          --         13        328±84^c       285±72^c      258±85^c        291±80^c

盐酸吗啡

            8          20(ip)     11        253±126^c，d    96±120^b，d    135±143^b，d     210±177^c，d

+TEYA₂₀

盐酸吗啡

            8          40(ip)     10        93±121^a，f     -12±181^a，f   -30±129^a，f     79±192^a，f

+TEYA₄₀

盐酸吗啡

            8          80(ip)     10        -90±188^a，f    -130±127^b，f  -30±127^a，f      229±178^c，d

+TEYA₈₀

盐酸吗啡

            8          80(ig)     11        129±187^a，f    104±164^a，f   5±193^a，f        129±187^a，e

+TEYA₈₀

^*Mor为盐酸吗啡，NLX纳洛酮，TEYA²⁰、TEYA⁴⁰、TEYA⁸⁰分别为云南狗牙花总生物碱盐酸盐20mg·kg^-1、40mg·kg^-1或80mg·kg^-1；括号内代号为给药途径，sc为皮下注射，ip为腹腔内注射，ig为灌胃(口服)。

3.5.1.2连续给予TEYA对小鼠盐酸吗啡条件性位置偏爱的影响及TEYA本身的精神依赖性

单纯TEYA 5mg·kg^-1组小鼠给药前后在偏爱侧(黑箱)的停留时间有差异，但同生理盐水组无差异。TEYA 2.5mg·kg^-1、TEYA 5mg·kg^-1不能增加吗啡依赖小鼠在偏爱侧(黑箱)的停留时间；TEYA 10mg·kg^-1可显著增加(P＜0.01)吗啡依赖小鼠在偏爱侧(黑箱)的停留时间(结果见表3)。

表3.连续给予TEYA对小鼠盐酸吗啡条件性位置偏爱的影响及TEYA本身的精神依赖性。x±s.^aP＞0.05，^bP＜0.05，^cP＜0.01，与给药前比较；^dP＞0.05，^eP＜0.05，^fP＜0.01，与生理盐水组比较；^gP＞0.05，^hP＜0.05，ⁱP＜0.01，与盐酸吗啡组比较

                              小            在偏爱侧停留的时间(x±s，秒)

          剂量(mg·kg^-1)

^*药物

                              鼠

                                                                     给药前、后的

           Mor(sc)  TEYA

                                        给药前       给药后

                              数

                                                                     变化

生理盐水    --      --        9         598±71      558±57^a       24±54ⁱ

盐酸吗啡    8       --        9         604±53      422±117^c      181±130^f

TEYA₅      --      5(ip)     10        609±66      540±45^b       69±58^d，h

盐酸吗啡

            8       2.5(ip)   9         585±68      353±125^c      232±148^f，g

+TEYA_2.5

盐酸吗啡

            8       5(ig)     10        616±71      467±111^c      149±115^f，g

+TEYA₅

盐酸吗啡

            8       10(ip)    8         579±65      566±58^a       12±78^d，i

+TEYA₁₀

^*Mor为盐酸吗啡，NLX盐酸纳洛酮，TEYA_2.5、TEYA₅、TEYA₁₀分别为云南狗牙花总生物碱盐酸盐2.5mg·kg^-1、5mg·kg^-1或10mg·kg^-1；括号内代号为给药途径，sc为皮下注射，ip为腹腔内注射，ig为灌胃(口服)。

3.5.1.3单次给予TEYA对大鼠的吗啡条件性位置偏爱的影响

单次给予TEYA20mg·kg^-1对大鼠已形成的位置偏爱无显著性影响。TEYA 40mg·kg^-1可明显增加小鼠在偏爱侧(黑箱)所停留的时间(P＜0.01)。连续单独给予TEYA 5mg·kg^-1不能使大鼠形成位置偏爱，与盐酸吗啡同时给予TEYA 10mg·kg^-1可部分阻断已形成的偏爱(结果见表4)。

表4.单次给予TEYA对大鼠的吗啡条件性位置偏爱的影响。每组小鼠数＝8只，x±s.与给药前比较，^aP＞0.05，^bP＜0.05，^cP＜0.01；与生理盐水组比较，^dP＞0.05，^eP＜0.05，^fP＜0.01；与盐酸吗啡组比较，^gP＞0.05，^hP＜0.05，ⁱP＜0.01。

              剂量(mg·kg^-1)          在偏爱侧的停留时间(x± s秒)

^*药物

            Mor(sc)  TEYA(ip)      给药前      给药后        给药前、后的变化

生理盐水    --       --            641±71     625±71^a     16±63ⁱ

盐酸吗啡    8        --            665±72     497±46^c     168±89^f

TEYA₅      --       5             632±72     617±130^a    15±117^d，i

盐酸吗啡

            8        20            648±91     514±64^c      533±96^f，g

+TEYA₂₀

盐酸吗啡

            8        40            650±69     622±73^a      28±71^d，i

+TEYA₄₀

盐酸吗啡

            8        10            652±74     555±52^c      110±53^e，h

+TEYA₁₀

^*Mor为盐酸吗啡，TEYA₅、TEYA₁₀、TEYA₂₀、TEYA₂₀、TEYA₄₀分别为云南狗牙花总生物碱盐酸盐5mg·kg^-1、10mg·kg^-1、20mg·kg^-1或40mg·kg^-1；括号内代号为给药途径，sc为皮下注射，ip为腹腔内注射。

3.5.2 TEYA对吗啡“复吸”的阻断作用

3.5.2.1吗啡依赖小鼠条件性位置偏爱效应的消退

在7天吗啡训练期结束后的1～3天，小鼠保持同样强度的条件性位置偏爱效应；第5天条件性位置偏爱效应开始减弱，第7天基本消退(结果见表5)。因而选择训练结束后第11天的小鼠诱发条件性位置偏爱效应重现。

表5.同组小鼠吗啡训练期结束后在不同时间的位置偏爱反应。每组小鼠数＝9只，x±s.与给吗啡前比较，^aP＞0.05，^bP＜0.05，^cP＜0.01；与生理盐水组比较，^dP＞0.05，^eP＜0.05，^fP＜0.01。

                                                 在偏爱侧停留时间(x±s，秒)

药物            剂量

                                                     停给吗啡后不同时间

(皮下注射)      (mg·kg^-1)     给吗啡前

                                              第1天           第3天           第5天           第7天           第9天

生理盐水        --              601±46       554±44^a       546±66^a       563±65^a       544±65^a       548±63^a

盐酸吗啡        4               558±42d      348±133^c，f    366±120^c，f    369±85^c，f     425±147^b，d    501±96^a，d

3.5.2.2TEYA对足底电击诱发小鼠消退的位置偏爱重现的阻断作用

在吗啡训练结束的第11天，对位置偏爱已经消退的小鼠，足底电击可使已经消退的4mg·kg^-1吗啡引起的位置偏爱效应再现，而生理盐水对其位置选择没有改变。单次给予TEYA40mg·kg^-1可阻断这种位置偏爱重现(结果见表6)。

表6.单次TEYA对小鼠足底电击诱发消退的位置偏爱重现的阻断作用。每组小鼠数＝9只，x±s.与足底电击前比较，^aP＞0.05，^bP＜0.05，^cP＜0.01；与足底电击后比较，^dP＞0.05，^eP＜0.05，^fP＜0.01：与生理盐水足比较^gP＞0.05，^hP＜0.05，ⁱP＜0.01。

            剂量                      在偏爱侧停留的时间(x±s，秒)

药物

            (mg·kg^-1)     足底电击前      足底电击后       *TEYA40

生理盐水     -              548±63         546±61^a        553±66^a

盐酸吗啡     4              501±96^g       386±37^c，i      703±256^f

^*TEYA 40为单次腹腔内注射云南狗牙花总生物碱盐酸盐40mg·kg^-1。

3.5.2.3单次给予TEYA对氢化可的松诱发小鼠消退的位置偏爱重现的阻断作用

在吗啡训练结束的第11天，对位置偏爱已经消退的小鼠，皮下注射氢化可的松20mg·kg^-1，可使已经消退的4mg·kg^-1吗啡引起的位置偏爱效应再现，而生理盐水对其位置选择没有改变。单次给予TEYA 40mg·kg^-1可阻断这种位置偏爱重现(结果见表7)。

表7.单次给予TEYA对氢化可的松(皮下注射，20mg·kg^-1)诱发小鼠消退的位置偏爱重现的阻断作用。每组小鼠数＝8只，x±s.与氢化可的松激发前比较，^aP＞0.05，^bP＜0.05，^cP＜0.01；与氢化可的松激发后比较，^dP＞0.05，^eP＜0.05，^fP＜0.01；与生理盐水组比较，^gP＞0.05，^hP＜0.05，ⁱP＜0.01。

药物            剂量                在偏爱侧停留的时间(x±s，秒)

(皮下注射)      (mg·kg^-1)

                              氢化可的松激发前    氢化可的松激发后    *TEYA40

生理盐水         --           531±73             588±87^a           561±78^a

盐酸吗啡         4            586±96^g           331±148^c，i        761±151^f

^*TEYA40为单次腹腔内注射云南狗牙花总生物碱盐酸盐40mg·kg^-1。

实施例4 TEYA对小鼠盐酸吗啡身体依赖的影响及TEYA本身的身体依赖性

4.1材料与方法

4.1.1动物：雄性Sprague-Dawley大鼠：160～200g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。雄性昆明种小鼠：18～22g，第二军医大学实验动物中心提供。动物饲养于自然光照动物房(第二军医大学药学院普通级或清洁级医学实验动物环境设施合格证书，上海市医学实验动物管理委员会医动字第02-64号，1999年2月10日颁发)，随意进食和饮水。

4.1.2药品与试剂

盐酸吗啡(Morphine Hydrochloride简称吗啡，表中代号Mor)：青海制药厂产品，用pH 3.5～4的生理盐水配成应用液。

盐酸纳洛酮(Naloxone Hydrochloride，简称纳洛酮，表中代号为NLX)：北京四环制药厂，用pH 3.5～4的生理盐水配成应用液。

云南狗牙花总生物碱(total Ervatamia yunnanensis alkaloids，简称TEYA)：按实施例1或实施例2自行制备的盐酸盐，用pH 3.5～4的生理盐水配成应用液。

4.2给药方法

4.2.1采用剂量递增法[Way EL，Loh HH，Shen FH.Simultaneous quantitativeassessment of morphine tolerance and physical dependence.J Pharmacol Exp Ther 1969；167(1)：1-8；Wan XW，Li WH，Huang M，You ZD，Tan YX，Lu CL and Gong ZH.Dynamic changes of inmmunoreactive dynorphin A1-13 during the development ofmorphine dependence in rats.Acta Pharmacol Sin 1998；19(6)：560-563]建立小鼠吗啡身体依赖模型。即第一天下午14:00、晚上20:00和第二天早上8:00，皮下注射盐酸吗啡剂量为10mg·kg^-1。第二天下午14:00开始增加盐酸吗啡剂量到15mg·kg^-1，此后每天下午14:00增加5mg·kg^-1，即每天3次共增加盐酸吗啡剂量15mg·kg^-1，连续给药6天，最后一天的盐酸吗啡剂量到达100mg·kg^-1。最后一次注射吗啡后6小时，进行纳洛酮催瘾试验。

盐酸吗啡剂量递增方案见表8。

表8.小鼠身体依赖性模型吗啡剂量递增方案

                   每次皮下注射盐酸吗啡剂量(mg·kg^-1)

    第x天

                  8:00          14:00         20:00

    1             --            10            10

    2             10            15            15

    3             15            20            20

    4             20            25            25

    5             25            30            30

    6             30            30            35

    7             35            0              0

4.2.2单次给予TEYA的给药方法

小鼠随机分组，即生理盐水组、单独盐酸吗啡组、盐酸吗啡+TEYA 20mg·kg^-1(记作Mor+TEYA₂₀)组、盐酸吗啡+TEYA 40mg·kg^-1(记作Mor+TEYA₄₀)组和盐酸吗啡+TEYA 80mg·kg^-1(记作盐酸吗啡+TEYA₈₀)组。于第7天皮下注射盐酸吗啡后5小时30分腹腔内注射TEYA。

4.2.3连续给予TEYA的给药方法

小鼠随机分组，即生理盐水、单独盐酸吗啡8mg·kg^-1组、单独TEYA 5mg·kg^-1组、盐酸吗啡+TEYA 2.5mg·kg^-1、盐酸吗啡+TEYA 5mg·kg^-1和盐酸吗啡+TEYA 10mg·kg^-1，于每次皮下注射盐酸吗啡后，立即腹腔内注射TEYA。

4.3实验方法

小鼠跳跃试验[Way EL，Loh HH，Shen FH.Simultaneous quantitative assessment ofmorphine tolerance and physical dependence.J Pharmacol Exp Ther 1969；167(1)：1-8；Wan XW，Li WH，Huang M，You ZD，Tan YX，Lu CL and Gong ZH.Dynamic changesof inmmunoreactive dynorphin A1-13 during the development of morphine dependence inrats.Acta Pharmacol Sin 1998；19(6)：560-563]

采用上述剂量递增法建立的小鼠身体依赖模型，于最后一次皮下注射盐酸吗啡后6小时、腹腔内注射TEYA后30分钟，腹腔内注射纳洛酮4mg·kg^-1后，立即单只放入5000ml的玻璃烧杯内，记录小鼠在15分钟内跳跃的次数及1小时后的体重。

4.4数据的统计学处理

给药组与生理盐水对照组间或不同给药组间比较采用Student t-test。所有数据均以平均值±标准差(x±s)表示。

4.5.实验结果

4.5.1单次给予TEYA对小鼠盐酸吗啡身体依赖的影响

TEYA 20mg·kg^-1、TEYA40mg·kg^-1和TEYA 80mg·kg^-1均不能减少小鼠的跳跃次数(结果见表9)，但可部分阻断盐酸纳洛酮催促后的体重丢失(结果见表10)。

表9.  单次给予TEYA对盐酸纳洛酮激发吗啡依赖小鼠跳跃次数的作用。每组小鼠数＝8只，x±s。与生理盐水组比较，^aP＞0.05，^bP＜0.05，^cP＜0.01；与盐酸吗啡组比较，^dP＞0.05，^cP＜0.05，^fP＜0.01。

                 ^*剂量(mg·kg^-1)                           平均跳跃次数

    ^*药物

                                       跳跃发生率(％)

                 Mor(sc)  TEYA

                                                            (x± s，次)

    生理盐水     --       --           0                     0±0^f

    盐酸吗啡     10       --           100                   21.50±13.74^c

    盐酸吗啡

                 10       20(ip)       87.5                  11.25±9.70^c，d

    +TEYA₂₀

    盐酸吗啡

                 10       40(ip)       75.0                  14.12±12.69^c，d

    +TEYA₄₀

    ^*Mor为盐酸吗啡，TEYA₂₀、TEYA₄₀分别为云南狗牙花总生物碱盐酸盐20mg·kg^-1或40mg·kg^-1；括号内代号为给药途径，sc为皮下注射，ip为腹腔内注射。

表10.单次给予TEYA对盐酸纳洛酮激发吗啡依赖小鼠体重丢失的作用。每组小鼠数＝8只，x±s.与生理盐水组比较，^aP＞0.05，^bP＜0.05，^cP＜0.01；与盐酸吗啡组比较，^dP＞0.05，^eP＜0.05，^fP＜0.01。

                                                             体重(g)

              剂量(mg·kg^-1)

药物

              Mor(sc)   TEYA      盐酸纳洛酮    盐酸纳洛酮

                                                                 丢失体重          丢失体重(％)

                                  激发前         激发后

生理盐水      --        --        26.20±1.40    26.16±1.38     0.04±0.07^f      0.14±0.003^f

盐酸吗啡      10        --        20.85±0.87    20.02±0.98     0.82±0.26^c      3.97±0.013^c

盐酸吗啡

              10        20(ip)    21.18±0.90    20.8±0.86      0.38±0.16^c，f    1.76±0.007^c，f

+TEYA₂₀

盐酸吗啡

              10        40(ip)    21.32±1.61    20.01±1.62     0.30±0.18^c，f    1.47±0.008^c，f

+TEYA₄₀

盐酸吗啡

              10        80(ip)    20.81±1.43    20.55±1.47     0.30±0.18^c，f    1.28±0.010^c，f

+TEYA₈₀

盐酸吗啡

              10        80(ig)    20.11±1.24    20.78±1.16     0.34±0.18^c，f    1.58±0.008^c，f

+TEYA₈₀

^*Mor为吗啡，TEYA₂₀、TEYA₄₀、TEYA₈₀分别为云南狗牙花总生物碱盐酸盐20mg·kg^-1、40mg·kg^-1或80mg·kg^-1；括号内代号为给药途径，sc为皮下注射，ip为腹腔内注射，ig为灌胃(口服)。

4.5.2连续给予TEYA对小鼠盐酸吗啡身体依赖的影响和本身的身体依赖性

单纯TEYA 20mg·kg^-1组小鼠跳跃次数和Naloxone 4mg·kg^-1催促后体重丢失给药前后无显著差异。而盐酸吗啡+TEYA 5mg·kg^-1(fP＜0.01)和盐酸吗啡+TEYA 10mg·kg^-1(fP＜0.01)可以显著减少小鼠跳跃次数并呈剂量依赖，但TEYA 2.5mg·kg^-1未能减轻Naloxone催促后的体重丢失，而盐酸吗啡+TEYA 5mg·kg^-1(eP＜0.05)和TEYA 10mg·kg^-1(fP＜0.01)可以剂量依赖的减少Naloxone催促后的体重丢失(结果见表11)。

表11.连续给予TEYA对小鼠盐酸吗啡身体依赖的影响。每组小鼠数＝9只。

与生理盐水组比较，^aP＞0.05，^bP＜0.05，^cP＜0.01；与盐酸吗啡组比较，^dP＞0.05，^eP＜0.05，^fP＜0.01。

              ^*剂量(mg·kg^-1)   跳跃发生率       跳跃次数

^*药物

            Mor(sc)   TEYA(ip)    (％)             (x±s)

生理盐水    --        --          0                0±0^f

盐酸吗啡    10        --          88.9             32.4±35.35^c

TEYA₂₀     10        20          22.2             0.22±0.67^a，f

盐酸吗啡

            10        2.5         55.6             12.40±20.09^b，d

+TEYA_2.5

盐酸吗啡

            10        5           44.4             4.56±7.21^a，e

+TEYA₅

盐酸吗啡

            10       10           33.3             5.88±8.40^a，e

+TEYA₁₀

^*Mor为盐酸吗啡，TEYA_2.5、TEYA₅、TEYA₁₀、TEYA₂₀分别为云南狗牙花总生物碱盐酸盐2.5mg·kg^-1、5mg·kg^-1、10mg·kg^-1或20mg·kg^-1；括号内代号为给药途径，

sc为皮下注射，ip为腹腔内注射。

4.5.2多次给予TEYA对小鼠盐酸吗啡身体依赖的影响

TEYA20mg·kg^-1、TEYA40mg·kg^-1和TEYA 80mg·kg^-1均不能减少小鼠的跳跃次数，但可部分的阻断盐酸纳洛酮催促后的体重丢失(结果见表12)。

表12.多次给予TEYA对盐酸纳洛酮激发吗啡依赖小鼠体重丢失的作用。每组小鼠数＝9只，x±s.与生理盐水组比较，^aP＞0.05，^bP＜0.05，^cP＜0.01；与盐酸吗啡组比较，^dP＞0.05，^eP＜0.05，^fP＜0.01。

            ^*剂量(mg·kg^-1)                         体重(x±s，g)

^*药物

                                  盐酸纳洛酮     盐酸纳洛酮

            Mor(sc)  TEYA(ip)

                                                                  体重丢失(g)        体重丢失％

                                  激发前         激发后

生理盐水    --       --           27.26±1.13    27.2±1.12       0.07±0.14^f       0.14±0.003^f

盐酸吗啡    10       --           21.5±1.22     20.77±1.15      0.73±0.24^c       3.87±0.012^c

TEYA₂₀     --       20           22.13±1.76    22.08±1.77      0.04±0.07^a，f     1.76±0.007^a，f

盐酸吗啡

            10       2.5          22.19±1.03    20.56±1.01      0.52±0.25^c，d     1.40±0.008^c，d

+TEYA_2.5

盐酸吗啡

            10       5            22.56±1.67    22.22±1.84      0.33±0.43^a，e     1.11±0.008^a，e

+TEYA₅

盐酸吗啡

            10       10           23.88±1.45    23.61±1.25      0.26±0.34^a，f     1.52±0.008^a，f

+TEYA₁₀

^*Mor为盐酸吗啡，TEYA_2.5、TEYA₅、TEYA₁₀、TEYA₂₀分别为云南狗牙花总生物碱盐酸盐2.5mg·kg^-1、5mg·kg^-1、10mg·kg^-1或20mg·kg^-1；括号内代号为给药途径，sc为皮下注射，ip为腹腔内注射。

实施例5 TEYA的镇痛作用及对盐酸吗啡镇痛作用的影响

5.1材料与方法

5.1.1实验动物

雌性昆明种小鼠：18～22g，第二军医大学实验动物中心提供。动物饲养于自然光照动物房(第二军医大学药学院普通级或清洁级医学实验动物环境设施合格证书，上海市医学实验动物管理委员会医动字第02-64号)，随意进食和饮水。

5.1.2试剂及其配制

盐酸吗啡(Morphine Hydrochloride简称吗啡，表中代号Mor)：青海制药厂产品，用pH 3.5～4的生理盐水配成应用液。

盐酸纳洛酮(Naloxone Hydrochloride，简称纳洛酮，表中代号NLX)：北京四环制药厂，用pH3.5～4的生理盐水配成应用液。

云南狗牙花总生物碱(total Ervatamia yunnanensis alkaloids，简称TEYA)：按实施例1或实施例2制备的盐酸盐，用pH 3.5～4的生理盐水配成应用液。

氢化可的松：上海信谊药厂，用生理盐水配成应用液。

5.2给药方法

5.2.1吗啡

5.2.2单次给予TEYA的给药方法

小鼠随机分组，即生理盐水组、单独盐酸吗啡组、盐酸吗啡+TEYA20mg·kg^-1组(记作Mor+TEYA₂₀)、盐酸吗啡+TEYA 40mg·kg^-1组(记作Mor+TEYA₄₀)和盐酸吗啡+TEYA80mg·kg^-1组(记作盐酸吗啡+TEYA₈₀)。

5.3实验方法

镇痛试验——小鼠热板(hot-plate)法，按照徐叔云，卞如濂，陈修主编.药理实验方法学.第二版.北京：人民卫生出版社，1991：695

用雌性昆明种小鼠。恒温水浴箱和玻璃烧杯组成的热板测痛仪测定小鼠痛阈。玻璃烧杯底(热板)温度维持在55℃±0.5℃。秒表(金雀牌石英秒表，上海秒表厂)记录自小鼠足底接触热板至出现舔后足的时间(单位：秒)，即热板反应潜伏期(或称为痛反应时间)作为痛阈指标。实验选用热板反应潜伏期(基础痛阈)＞15秒但＜30秒的小鼠。每只小鼠基础痛阈为该小鼠3次痛反应时间的平均值，每次测定痛反应时间的间隔大于15分钟；给药后小鼠热板反应潜伏期＞60秒者，为减轻烫伤程度将小鼠撤离热板，并以60秒计。实验时室温维持在23℃～25℃。

5.4数据的统计学处理

给药组与生理盐水对照组间或不同给药组间比较采用Student t-test。所有数据均以平均值±标准差(x±s)表示。

5.5.实验结果

5.5.1 TEYA的镇痛作用

TEYA具有镇痛作用，并随剂量的增大而增强，与盐酸吗啡相比具有缓慢、持久的特点。与盐酸吗啡8mg·kg^-1相比，可见灌胃TEYA 20mg·kg^-1、TEYA 40mg·kg^-1和TEYA 80mg·kg^-1，以及腹腔内注射TEYA40mg·kg^-1，均具有明显的镇痛作用，灌胃后的作用产生比腹腔内注射后的慢，但作用强度与腹腔内注射后的相当，表明灌胃给药后吸收是比较完全的(结果见表13)。

表13.TEYA在小鼠热板法上的镇痛作用。每组小鼠数＝9只，x±s.与生理盐水组比较，^aP＞0.05，^bP＜0.05，^cP＜0.01；与盐酸吗啡组比较，^dP＞0.05，^eP＜0.05，^fP＜0.01。

                                          撤后肢潜伏期(痛阈)(x±s，秒)

        剂量(mg·kg^-1)

^*药物

                                                             给药后

            Mor(sc)   TEYA

                                给药前

                                                  30分钟            60分钟               120分钟            240分钟

生理盐水    --        --        24.1±2.8^d       25.7±2.7^f       25.9±3.2^f          25.7±1.7^d        25.0±2.3^d

盐酸吗啡    8         --        24.2±1.8^a       59.4±1.3^c       36.6±5.9^c          28.6±7.4^a        28.9±5.6^a

TEYA₄₀     --        40(ip)    25.0±1.8^a，d     41.1±12.1^c，f    35.9±9.7^c，d        30.2±7.6^a，d      29.6±5.8^b，d

TEYA₂₀     --        20(ig)    25.3±1.6^a，d     34.9±7.4^c，f     34.9±1.4^c，d        34.8±3.2^c，e      30.6±3.3^c，d

TEYA₄₀     --        40(ig)    24.6±2.5^a，d     35.3±5.2^c，f     44.3±11.1^c，d       35.9±8.8^c，d      30.6±6.1^b，d

TEYA₈₀     --        80(ig)    24.0±3.8^a，d     37.9±7.2^c，f     49.3±9.3^c，f        36.8±8.5^c，e      31.7±6.9^b，d

^*Mor为盐酸吗啡，TEYA₂₀、TEYA₄₀、TEYA₈₀分别为云南狗牙花总生物碱盐酸盐20mg·kg^-1、40mg·kg^-1或80mg·kg^-1；括号内代号为给药途径，sc为皮下注射，ip为腹腔内注射，ig为灌胃(口服)。

5.5.2 TEYA对盐酸吗啡镇痛作用的影响

与盐酸吗啡4mg·k^-1相比，TEYA 40mg·kg^-1比盐酸吗啡的镇痛作用明显。同时给予阿片受体拮抗剂盐酸纳洛酮1mg·kg^-1，盐酸吗啡的镇痛作用可被取消。TEYA 40mg·kg^-1的镇痛作用可被腹腔内注射4mg·kg^-1的盐酸纳洛酮部分地阻断；当同时给予盐酸吗啡4mg·kg^-1和TEYA 10mg·kg^-1、盐酸吗啡4mg·kg^-1和TEYA 20mg·kg^-1时镇痛作用出现协同。结果提示TEYA的镇痛作用可能部分通过阿片受体来实现(结果见表14)。

表14.小鼠热板法上TEYA对吗啡镇痛作用的影响。每组小鼠数＝9只，x±s.与生理盐水组比较，^aP＞0.05，^bP＜0.05，^cP＜0.01；与盐酸吗啡组比较，^dP＞0.05，^eP＜0.05，^fP＜0.01。

               ^*剂量(mg·kg^-1)                                撤后肢潜伏期(痛阈)(x±s，秒)

^*药物

                                                                       给药后

            Mor   NLX   TEYA

                                给药前

           (sc)   (ip)  (ip)

                                                  30分钟            60分钟            120分钟            240分钟

生理盐水    --    --    --      21.8±3.2^d       22.5±3.0^f       21.4±3.8^f       21.2±2.7^f        20.5±2.3^d

盐酸吗啡    4     --    --      22.1±1.9^a       39.4±8.7^c       33.0±4.0^c       28.0±5.3^c        22.8±4.5^a

盐酸吗啡

            4     1     --      22.8±2.6^a，d     22.8±3.5^a，f     22.1±3.2^a，f     22.6±5.0^a，d      21.8±4.5^a，d

+NLX

TEYA₄₀           --    40      21.8±2.4^a，d     55.4±8.6^c，f     56.4±7.3^c，f     37.1±10.1^c，e     21.0±3.7^a，d

TEYA₄₀+

                  4     40      22.9±3.7^a，d     54.4±9.4^c，f     34.2±7.9^c，d     32.4±10.2^b，d     23.4±3.6^a，d

NLX

盐酸吗啡

            4     --    10      21.2±2.4^a，d     40.1±10.3^c，d    31.8±7.1^c，d     28.0±8.8^a，d      22.4±8.4^a，d

+TEYA₁₀

盐酸吗啡

            4     --    20      22.2±2.2^a，d     41.5±12.0^c，d    40.0±9.1^c，d     35.1±11.9^c，d     30.9±7.5^c，f

+TEYA₂₀

^*Mor为吗啡，NLX盐酸纳洛酮，TEYA₁₀、TEYA₂₀、TEYA₄₀分别为云南狗牙花总生物碱盐酸盐10mg·kg^-1、20mg·kg^-1或40mg·kg^-1；括号内代号为给药途径，sc为皮下注射，ip为腹腔内注射。

由于阿片类的成瘾及其治疗，在许多方面与其镇痛的机制都有密切联系。周身肌肉关节疼痛是海洛因成瘾脱毒后的主要稽延性症状之一，也是促使吸毒者复吸的重要原因之一。因此，非成瘾性镇痛药在减少复吸的治疗中具有相当重要的意义。狗牙花在我国民间就用于风湿骨痛、跌打损伤或蛇咬伤。

以上镇痛实验结果表明TEYA具有明显的镇痛作用，且呈剂量依赖关系，并与盐酸吗啡有协同作用；TEYA的这种作用可被阿片受体拮抗剂Naloxone部分地阻断，这表明TEYA的镇痛作用可能部分通过阿片系统来实现。TEYA的镇痛作用，对于减轻吸毒病人脱毒后的稽延性症状将会有积极的辅助治疗作用。

实施例6 TEYA对吗啡依赖小鼠脑内一氧化氮(NO)含量的影响

6.1材料与方法

6.1.1动物：雄性昆明种小鼠：18～22g，第二军医大学实验动物中心提供。动物饲养于自然光照动物房(第二军医大学药学院普通级或清洁级医学实验动物环境设施合格证书，上海市医学实验动物管理委员会医动字第02-64号)，随意进食和饮水。

6.1.2药品与试剂

盐酸吗啡(Morphine Hydrochloride，简称吗啡，表中代号Mor)：青海制药厂产品，用pH3.5～4的生理盐水配成应用液。

云南狗牙花总生物碱(total Ervatamia yunnanensis alkaloids，简称TEYA)：按实施例1或实施例2自行制备的盐酸盐，用pH3.5～4的生理盐水配成应用液。

氢化可的松：上海信谊药厂，用生理盐水配成应用液。

N-乙酰半胱氨酸：上海化学试剂公司进口分装(美国)

小牛血清白蛋白：上海化学试剂公司进口分装(日本)

硫酸奎宁：上海试剂二厂

亚硝酸钠：上海振兴试剂厂

Comassie G-250，NA：上海华舜生物工程有限公司进口分装

6.2给药方法

6.2.1吗啡精神依赖模型同实施例3。吗啡身体依赖模型同实施例4。

6.2.2连续给予TEYA的给药方法

小鼠随机分组，即生理盐水、单独盐酸吗啡、盐酸吗啡+TEYA 20mg·kg^-1(记作Mor+TEYA₂₀)、盐酸吗啡+TEYA 40mg·kg^-1(记作Mor+TEYA₄₀)和盐酸吗啡+TEYA 80mg·kg^-1(记作盐酸吗啡+TEYA₈₀)。前5天为每天给予盐酸吗啡。试验于第6天观察动物之前1小时分别给予TEYA 20mg·kg^-1、TEYA 40mg·kg^-1和TEYA 80mg·kg^-1；身体依赖性试验于第7天皮下注射盐酸吗啡后5小时30分钟给予TEYA。

6.2.3连续给予TEYA的给药方法

小鼠随机分组，即生理盐水、单独盐酸吗啡8 mg·kg^-1组、单独TEYA 5mg·kg^-1组、盐酸吗啡+TEYA 2.5mg·kg^-1、盐酸吗啡+TEYA 5mg·kg^-1和盐酸吗啡+TEYA 10mg·kg^-1，于每次皮下注射盐酸吗啡后，立即腹腔内注射TEYA。

6.3实验方法

6.3.1 NO含量测定

参考：卫国，张均田.荧光分析法测定大鼠脑组织一氧化氮和一氧化氮合成酶.药学学报1996；31(7)：530-534；钟慈声，孙安阳主编.一氧化氮的生物医学.上海：上海科技大学出版社，1997：361-362

6.3.1.1硝基-N-乙酰半胱氨酸(NACNO)的制备：

将0.2mol·L^-1硫酸配制的1.6mmol·L^-1 N-乙酰半胱氨酸1ml与4mmol·L^-1的亚硝酸钠等体积混合，反应生成硝基-N-乙酰半胱氨酸。反应产物于日立F-4000荧光分光光度计进行最大发射波长扫描。利用硝基-N-乙酰半胱氨酸对硫酸奎宁荧光强度的内滤作用测定硝基-N-乙酰半胱氨酸含量。

6.3.1.2 NO的标准曲线：

将0.3ml不同浓度的硝基-N-乙酰半胱氨酸与1μmol·L^-1硫酸奎宁溶液3ml混合后加1mol·L^-1 HCl 0.1ml及0.1mol·L^-1磷酸盐缓冲液(pH 7.4)0.3ml摇匀后于激发波长334nm，发射波长445nm，狭缝宽度均为5nm测定荧光强度。以硝基-N-乙酰半胱氨酸的浓度为横坐标，所测荧光强度为纵坐标，绘制NO的标准曲线。

6.3.1.3蛋白质标准曲线和样品蛋白质浓度测定

依考马斯亮蓝G-250法[张均田主编.现代药理实验方法(上册).北京：北京医科大学/中国协和医科大学联合出版社，1998：63]测定。

制备蛋白质标准曲线：取试管编号，依次分别加入0，5，10，15，20，25，30，35，40，45和50μl的100μgml^-1标准小牛血清白蛋白溶液，用重蒸馏水补足到50μl，加100μl考马斯亮蓝G-250染色液，立即混匀，室温(20℃～25℃)放置5分钟，以752型分光光度计(上海分析仪器厂)于595nm处比色测定。

样品蛋白质浓度测定：另取样品如制备蛋白质标准曲线，从其A₅₉₅值从蛋白质标准曲线推算出其浓度。每次样本的测定以同一时间所作的标准曲线为准。

6.3.1.4一氧化氮(NO)含量测定：

观察完条件性位置偏爱后，大鼠断头取脑称重，冰浴下用0.1mol·L^-1磷酸缓冲液(pH＝7.4)制成20％脑匀浆，用TGL-16G型冷冻台式高速离心机(上海医用分析仪器厂)4℃下10 000g离心30分钟，取上清适量与1μmol·L^-1硫酸奎宁(pH＝1)3ml混匀，加入1mol·L^-1硫酸0.10ml及16mmo1·L^-1 N-乙酰半胱氨酸0.30ml，摇匀后于F-4000荧光分光光度仪(日本HITACHI公司)激发波长334nm，发射波长445nm处测定荧光强度，根据NO的标准曲线计算NO的含量。

6.4数据的统计学处理

给药组与生理盐水对照组间或不同给药组间比较采用Student t-test。所有数据均以平均值±标准差(x±s)表示。

6.5实验结果

吗啡精神依赖小鼠脑内NO的含量显著升高。单纯连续给予TEYA 5mg·kg^-1对NO的含量无影响。单次给予TEYA 40mg·kg^-1可以使NO的含量降至正常水平。连续给予吗啡+TEYA10mg·kg^-1可使NO含量低于正常水平，说明TEYA的抗吗啡依赖作用与降低吗啡依赖小鼠脑内NO的含量有关。结果见表15。

表15.单次或连续给予TEYA对吗啡精神依赖小鼠脑NO含量的影响。每组小鼠数＝7只，x±s.与生理盐水组比较，^aP＞0.05，^bP＜0.05，^cP＜0.01；与盐酸吗啡组比较，^dP＞0.05，^eP＜0.05，^fP＜0.01。

                ^*剂量(mg·kg^-1)       NO

^*药物

              Mor(sc)    TEYA(ip)       (nmol·mg蛋白^-1)

生理盐水      --         --             127±41

盐酸吗啡      8          --             184±26^b

连续TEYA₅    --         5              116±36^a，f

盐酸吗啡+

              8          40             115±20^a，f

单次TEYA₄₀

盐酸吗啡+

              8          10             95±17^b，f

连续TEYA₁₀

^*TEYA₅、TEYA₁₀、TEYA₄₀分别为云南狗牙花总生物碱盐酸盐5mg·kg^-1、10mg·kg^-1或40mg·kg^-1；括号内代号为给药途径，sc为皮下注射，ip为腹腔内注射。

伴随盐酸吗啡单次给予TEYA10mg·kg^-1(^eP＜0.05)和TEYA40mg·kg^-1(^fP＜0.01)，均可降低小鼠脑内NO的水平(结果见表16)，说明TEYA的抗吗啡依赖作用与降低吗啡依赖小鼠脑内NO的含量有关。

表16.连续或单次给予TEYA对吗啡身体依赖小鼠脑NO含量(nmol·mg蛋白^-1)的影响。每组小鼠数＝9只，x±s.^aP＞0.05，^bP＜0.05，^cP＜0.01，与生理盐水组比较；^dP＞0.05，^eP＜0.05，^fP＜0.01，与盐酸吗啡组比较

                        剂量(mg·kg^-1)          NO含量

^*药物

                盐酸吗啡(sc)    TEYA(ip)         (nmol·mg蛋白^-1)

生理盐水        --              --               78±18

盐酸吗啡        10              --               117±40^b

单次TEYA₂₀     --              20               125±21^c，d

盐酸吗啡

                8               10               75±14^a，e

+TEYA₁₀

盐酸吗啡

                8               40               66±6^a，f

+TEYA₄₀

^*TEYA₁₀、TEYA₂₀、TEYA₄₀分别为云南狗牙花总生物碱盐酸盐10mg·kg^-1、20mg·kg^-1或40mg·kg^-1；括号内代号为给药途径，sc为皮下注射，ip为腹腔内注射。

结论

以上实施例3～6的试验结果表明：在所试验的剂量范围内，TEYA在不具有身体依赖和精神依赖的同时，单次大剂量和多次小剂量均能显著地抑制吗啡诱导的条件性位置偏爱；多次小剂量给予TEYA，还可明显的抑制纳洛酮催促后吗啡小鼠的跳跃次数及体重丢失。可以阻断由应激刺激和给予外源性糖皮质激素引起的小鼠对吗啡的“复吸”行为。TEYA具有明显的镇痛作用。灌胃和腹腔内注射给予TEYA的药效试验提示，TEYA在胃肠道内吸收比较完全而迅速，适合口服给药。其抗阿片成瘾的机制部分涉及阿片肽系统和一氧化氮(NO)系统等。从目前积累的研究资料看，TEYA已初步具备作为有效防治海洛因成瘾脱毒治疗后减少复吸的药物的基本条件。因此，本发明云南狗牙花总生物碱及其盐类可用于制备防治阿片类物质依赖性药物或食品或制备镇痛药物。

Claims (4)

1、云南狗牙花总生物碱和其盐类的制备方法，包括醇提取法和酸水提取法，其特征在于所说的醇提取法按如下步骤操作：

云南狗牙花根和茎或全株粉碎后用8～10倍量95％乙醇(W/W)回流提取，将乙醇提取液减压浓缩至无乙醇，得醇提取物，提取物用酸水溶解，酸水可为2％盐酸或2％硫酸，除去酸水不溶物，酸水液用浓氨水或5％碳酸钠或1％氢氧化钠中和至pH8～10，即产生沉淀，用氯仿或乙醚或苯萃取，有机溶剂萃取液中含生物碱，回收氯仿或乙醚或苯即得云南狗牙花总生物碱；将云南狗牙花总生物碱溶于氯仿，于氯仿溶液中滴加浓盐酸或冰醋酸或2mol/L硫酸至不再产生沉淀，过滤得沉淀，用适量丙酮洗去多余的酸，即得云南狗牙花总生物碱盐酸盐或醋酸盐或硫酸盐；

所述的酸水提取法按下列步骤操作：

云南狗牙花根和茎或全株粉碎后用8～10倍量(W/W)2％盐酸或2％硫酸浸泡或渗滤，滤出酸水液，酸水液用浓氨水或5％碳酸钠或1％氢氧化钠中和至pH8～10，产生沉淀，过滤得沉淀，即为云南狗牙花总生物碱的粗制品；将云南狗牙花总生物碱粗制品干燥后，用适量乙醇或氯仿回流溶解，过滤除去不溶物，滤液减压蒸干即得纯化的云南狗牙花总生物碱；再将云南狗牙花总生物碱溶于氯仿，于氯仿溶液中滴加浓盐酸或冰醋酸或2mol/L硫酸至不再产生沉淀，过滤得沉淀，用适量丙酮洗去多余的酸，即得云南狗牙花总生物碱盐酸盐或醋酸盐或硫酸盐。

2、权利要求1所述方法制备的云南狗牙花总生物碱和其盐类。

3、按权利要求2所述的云南狗牙花总生物碱和其盐类，其特征在于含有如下化合物：苦参碱(matrine)(1)，冠狗牙花碱(coronaridine)(2)，19，20-二氢异斯替斯瑞克碱(19，20-dihydroisostitsirikine)(3)，19-S-海泥山辣椒碱(19-s-heyneanine)(4)，依泼加木胺(ibogamine)(5)，云南辛碱(yunnanensine)(6)，11’甲氧基-19-S-海泥山辣椒碱(11′-methoxyl-19s-heyneanine)(7)，19，20-E-瓦来萨明碱(19，20-E-vallesamine)(8)，云南宁碱(yunnanenine)(9)，10-羟基-19，20-二氢异斯替斯瑞克碱(10-hydroxy-19，20-dihydroisositsirikine)(10)，榴花灵碱(conodurine)(11)。

4、权利要求2或3所述的云南狗牙花总生物碱和其盐类在制备防治阿片类物质依赖性药物或镇痛药或食品中的应用。