CN1546662A - 具有靶向活性的重组半胱天冬酶-6基因及其抗肿瘤应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种具有靶向活性的重组半胱天冬酶－6基因、由所述基因编码的多肽、含有所述基因的载体及上述物质在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。本发明中具有靶向活性的重组半胱天冬酶－6基因表达后，能特异性识别并结合于HER2阳性肿瘤细胞表面，通过PE转膜结构域将活性caspase－6分子导入肿瘤细胞内，诱发肿瘤细胞内凋亡通路的开放，以获得一种高效、低毒地杀伤肿瘤细胞的新方法。本发明在应用中，具有安全性、高效性和持续性等特点，可望为HER2阳性肿瘤的靶向治疗提供一种新手段。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域的基因治疗，具体涉及基因工程方法构建具有靶向活性的重组半胱天冬酶-6基因(我们把它命名为immunocaspase-6)、由所述基因编码的多肽、含有所述基因的载体及上述物质在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。
背景技术：
肿瘤是当今社会严重威胁人类健康的疾病之一，目前，临床治疗肿瘤仍局限于手术切除与放、化疗结合的传统治疗手段，存在着特异性差、治疗后易复发等缺点。目前的治疗方法不能从根本上治愈病痛，而且毒副作用大，因此疗效不尽如人意。尤其是很多研究表明HER2阳性的乳腺癌预后往往很差，还没有行之有效的治疗药物和手段。
基因治疗的出现给人们带来了新的希望。基因治疗，就是采用基因修饰的途径，改变活细胞遗传物质，以达到彻底消除疾病目的的一种全新的治疗手段。它在治疗肿瘤、病毒性疾病(如乙肝、HIV感染等)和一些遗传、代谢类疾病等的尝试中都取得了令人鼓舞的成效，显示出良好的应用前景。
目的基因和受体细胞的选择是肿瘤基因治疗的关键环节。目前用于肿瘤基因治疗的基因包括细胞因子基因，肿瘤抑制基因，“自杀”基因，以及外源毒素基因等。将上述基因转化肿瘤细胞并回输患者，或通过基因修饰淋巴细胞等免疫功能细胞，以增强机体的抗肿瘤免疫反应，或者直接杀伤肿瘤细胞。随着人们对细胞凋亡机理认识的深入，已有越来越多的研究者试图通过诱导肿瘤细胞凋亡的途径治疗肿瘤。然而，目前尚缺乏可以应用于基因治疗的，能够高效、特异地杀伤肿瘤细胞且尽可能小地对系统带来毒副作用的基因和治疗手段。
天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)，亦称半胱天冬酶，是一类细胞凋亡过程中起核心作用的蛋白酶，能够特异性识别并切割Asp-X序列。目前发现的14个caspase家族的成员除caspase-1、4、5等被证实与炎症细胞因子合成有关外，其余都直接参与介导细胞凋亡。参与凋亡的caspases又可以划分为起始caspases和效应caspases两类。
Caspase-6是效应caspase分子(Fernandes AT，et al.Cancer Res.1995；55(13)：2737-42)，是除caspase-3和caspase-7外重要的凋亡执行分子。Fernandes-Alnemri等人于1995年从人T淋巴瘤细胞系Jurkat通过PCR的方法首先分离得到了caspase-6基因，当时命名为MCH2。caspase-6基因也可以用CASP6表示，该基因编码一种34kD的蛋白。
caspase-6在细胞中以酶原的形式合成和存在。在外界或自身凋亡信号的刺激时(Faleiro L，et al.EMBO-J.1997；16(9)：2271-81)，上游caspases及粒酶B激活后于原结构域与大亚基之间及大小亚基之间被剪切，大小亚基游离并相互聚集形成有活性的二聚体形式，两个二聚体还可以再聚合成活性更强的四聚体，作用于下游与凋亡相关的底物，如PARP和lamin A等，使细胞死亡。而当没有凋亡信号刺激的时候，caspase-6不表现活性。
1998年Alnemri等(Srinivasula SM，et al.J Biol Chem.1998；273：10107-10111.)将caspase-6基因的大小亚基进行重排后，得到一个与天然活性caspase-6分子晶体结构非常相似的分子。该分子无须凋亡信号刺激，便同样具有天然caspase-6的活性，可以用作对肿瘤细胞进行高效杀伤的执行者。然而，鉴于该活性caspase-6分子不具备特异性识别靶细胞的能力，所以在肿瘤治疗的应用中存在很大的障碍。
近年来，caspase-6在细胞凋亡中的作用越来越被重视，人们公认它是一种细胞凋亡信号转导通路中的重要分子，也是哺乳动物细胞凋亡中的执行分子之一。caspase-6基因不同于其他凋亡诱导分子之处在于caspase-6蛋白处于凋亡调节通路的下游：(1)活性型的caspase-6可以直接作用于底物而使细胞凋亡；(2)还可以逃逸细胞内庞大的调控网络中多种凋亡调节因子的抑制作用。
发明内容
本发明提供一种具有靶向活性的重组半胱天冬酶-6基因、由所述基因编码的多肽、含有所述基因的载体及上述物质在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。本发明构建一种特异性强、活性高、免疫原性低、能持续杀伤肿瘤细胞的新型分子——具有靶向活性的重组半胱天冬酶-6基因，将其引入肿瘤，诱发肿瘤细胞内凋亡通路的开放，以获得一种高效、低毒地杀伤肿瘤细胞的新方法。
本发明的技术解决方案是：
一种具有靶向活性的重组半胱天冬酶-6基因，其具有序列表<400>1-4之一的序列。
重组半胱天冬酶-6基因编码的多肽，其具有序列表<400>5-8之一的序列。
一种表达载体，其含有重组半胱天冬酶-6基因。
重组半胱天冬酶-6基因编码的多肽在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。
一种重组逆转录病毒，将重组半胱天冬酶-6基因克隆入逆转录病毒载体，通过包装细胞包装后，分离得到逆转录病毒。
重组逆转录病毒在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。
一种重组腺病毒，将重组半胱天冬酶-6基因克隆入腺病毒载体，通过包装细胞包装后，分离得到腺病毒。
重组腺病毒在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。
本发明应用了能特异性识别并结合HER2阳性肿瘤细胞的单链抗体e23sFv基因(Chen SY，et al.Nature 1997；385：78-80)，与绿脓杆菌外毒素(PE)转膜结构域和活性caspase-6基因融合，构建一种特异性强、活性高、免疫原性低、能持续杀伤肿瘤细胞的靶向活性半胱天冬酶-6基因。该基因可以通过下列途径，达到治疗HER2阳性肿瘤的目的：(1)脂质体包裹质粒直接进行肌肉或肿瘤组织局部注射；(2)重组逆转录病毒感染患者外周血淋巴细胞，回输患者；(3)肿瘤组织局部感染重组腺病毒；(4)纯化靶向活性半胱天冬酶-6蛋白，进行肌肉、肿瘤或静脉注射。本发明兼具细胞免疫和体液免疫特点，与其它治疗策略相比具有明显的优势。本发明构建分泌型免疫靶向基因，表达分泌后产生能特异性地识别和杀伤肿瘤细胞的效应分子，无论通过以上四种中的任何一种途径进行应用时，均能在杀伤肿瘤细胞的同时产生免疫监视作用。本发明所构建的靶向活性半胱天冬酶-6基因具有以下特点：□安全性——由于在N端融合长的抗体和PE序列，因而推测这种融合蛋白在分泌后的转移过程中和进入肿瘤细胞前，由于不能正确折叠而不具有caspase-6的活性。加之；靶向活性半胱天冬酶-6效应分子通过抗体特异性地识别肿瘤细胞，而对正常组织细胞没有识别和杀伤作用。另外，靶向半胱天冬酶-6主要由人源化抗体和人自身蛋白构成，不会诱发体内强烈的排异，而且细胞发生凋亡时不引起炎症反应，所以治疗的毒副作用较小。实验中发现被修饰的淋巴细胞本身功能正常，回输这种细胞将可以持续分泌效应蛋白。动物模型的抗肿瘤应用中也发现对除了HER2阳性肿瘤组织以外的其他组织没有毒性；□高效性——半胱天冬酶-6是细胞凋亡的直接执行者，向细胞中导入活性形式的caspase-6分子能够逃逸细胞内多种抑制因素，使其对肿瘤细胞的杀伤作用更直接，且效率更高；□持续性——靶向活性半胱天冬酶-6基因由细胞中表达后，不仅可以直接作用于邻近的HER2阳性肿瘤细胞，而且可以进入血液循环系统，随着血液流动对各种组织细胞进行长期的免疫监视。本发明可望为HER2阳性肿瘤的靶向治疗提供一种新手段。
附图说明
图1为Western blot检测转染后的细胞immunocaspase-6的分泌表达。
图2为pCMV/immunocaspase-6转染的Jurkat细胞的生长曲线。
图3为转染pCMV(左)或pCMV/immunocaspase-6(右)的Jurkat细胞的培养上清对细胞生长影响的柱状图。
图4为Immunocaspase-6的杀伤活性与作用时间关系的柱状图。
图5为效应细胞与靶细胞比例与杀伤效果关系的柱状图。
图6为不同效应细胞对HER2阳性细胞杀伤的柱状图。
图7为Jurkat-immunocaspase-6细胞对HER2阳性细胞的杀伤活性与作用时间关系的柱状图。
图8为荧光显微镜观察Annexin-V-FITC和PI染色后的被杀伤细胞的图像。
图9为阳离子脂质体包裹pCMV/immunocaspase-6抑制肿瘤生长的柱状图。
图10为阳离子脂质体包裹pCMV/immunocaspase-6延长动物模型的生存期曲线。
图11为回输被Re-immunocaspase-6感染的外周血淋巴细胞的肿瘤生长抑制的柱状图。
图12为TUNEL染色检测肿瘤组织中的凋亡细胞的图像。
图13为回输被Re-immunocaspase-6感染的外周血淋巴细胞的治疗组动物存活期延长曲线。
图14为Ad-immunocaspase-6治疗组肿瘤生长的柱状图。
图15为TUNEL染色检测Ad-immunocaspase-6治疗组的肿瘤组织中凋亡细胞的图像。
图16为Ad-immunocaspase-6治疗组动物生存期延长曲线。
具体实施方式
1.具有靶向活性的重组半胱天冬酶-6基因的克隆，及其表达载体的构建
本发明构建的具有靶向活性的重组半胱天冬酶-6基因包括三部分，分别为抗肿瘤表面抗原HER2的单链抗体(e23sFv)，具有转膜功能的绿脓杆菌外毒素(PE)的转膜结构域和具有诱导细胞凋亡功能的活性半胱天冬酶-6(rev-caspase-6)。
(1)活性半胱天冬酶-6(rev-caspase-6)基因的克隆
①野生型半胱天冬酶-6(caspase-6)基因的获得：
提取人淋巴瘤Jurkat细胞的总RNA，反转录合成cDNA。
设计扩增caspase-6基因的引物，引物合成后稀释至终浓度20pmol/μL，进行PCR反应，获得野生型半胱天冬酶-6(caspase-6)基因，并进行序列测定证实与文献报道一致。
p1 5’ttt gaa ttc atg agc tcg gcc tcg ggg-3’
P2 5’ttt gga tcc tta att aga ttt tgg aaa ga-3’
在PCR专用的薄壁管中依次加入，反转录产物2μL、10×PCR buffer 5μL、50mM MgCl2 1.5μL、上下游引物各1μL、10mM dNTP 1μL、Taq DNA聚合酶0.5μL和H2O 38μL，进行PGR反应。PGR反应条件为：
96℃变性30秒；55℃退火45秒；72℃延伸60秒；共进行20循环
②活性半胱天冬酶-6(rev-caspase-6)基因的克隆
为了扩增出大小亚基次序颠倒的活性半胱天冬酶-6基因，应用overlap-PCR原理，设计引物，引物合成后稀释至终浓度20pmol/μL，进行PCR反应。
引物序列为：
P3：5′cca aaa tct aat agc tcg gcc tcg ggg ctc cgc 3′
P4：5′ttt tct aga tta atc tac tac atc caa agg aat 3′
P5：5’cga ggc cga gct att aga ttt tgg aaa gaa atg 3’
P6：5′ggc gcg gcc aac gca gcc tcc gtt tac acg ctg 3′
P7：5′ggc gcg gcc aac gtt gaa att gat gca gcc tcc gtt tac acg ctg3′
P8：5′agc acc cgc ggc gca gcc tcc gtt tac acg ctg 3′
P9：5′agc acc cgc ggc gtt gaa att gat gca gcc tcc gtt tac acg ctg3′
以P3和P4引物扩增caspase-6的大亚基基因片段(large subunit557bp)；分别以P5和P6、P7、P8、P9引物扩增caspase-6的小亚基基因片段(s(364)324bp，s(364；VEID)336bp，s(412)324bp，s(412；VEID)336bp)。分别表示融合PE转膜结构域253-412位氨基酸和253-364位氨基酸序列，小亚基与转膜结构域之间带和不带有自身识别并可能切割的氨基酸序列。以P4和P6、P7、P8、P9引物将大、小亚基的基因片段重组，获得大、小亚基次序颠倒的活性caspase-6基因(rc6s：rc6(364)857bp，rc6(364；VEID)869bp，rc6(412)857bp，rc6(412；VEID)869bp)；
□克隆PE转膜结构域基因和活性半胱天冬酶-6基因的重组体
以pCMV-e23sFv-PE40为模板，以P10和P11、P12、P13、P14引物进行PCR，扩增获得PE转膜结构域(p(364)363bp，p(364；VEID)375bp，p(412)507bp，p(412； VEID)519bp)基因片段。
再分别用5’端引物P10和3’端引物P4，通过PCR反应将四种PE转膜结构域基因序列与四种活性半胱天冬酶-6(rev-caspase-6)基因序列相连，得到PE转膜结构域基因和活性半胱天冬酶-6基因的重组体-pc6(364)1197bp，pc6(364；VEID)1209bp，pc6(412)1344bp和pc6(412；VEID)1356bp。
引物序列为：
P10：5′ttt gcg gcc gcg aaa ggc ggc agc ctg 3′
P11：5′aac gga ggc tgc gtt ggc cgc gcc ggc ctc gtc 3′
P12：5′aac gga ggc tgc atc aat ttc aac gtt ggc cgc gcc ggc ctc gtc3′
P13：5′aac gga ggc tgc gcc gcg ggt gct gaa gct gac 3′
P14：5′aac gga ggc tgc atc aat ttc aac gcc gcg ggt gct gaa gct gac3′
PCR反应条件为：
| 被扩增的基因 | 变性温度及时间 | 退火温度及时间 | 延伸温度及时间 | 循环数 |
| 1 | 95℃；30秒 | 58℃；30秒 | 72℃；45秒 | 20 |
| s(364) | 96℃；30秒 | 55℃；30秒 | 72℃；45秒 | 20 |
| s(364；VEID) | 96℃；30秒 | 55℃；30秒 | 72℃；45秒 | 20 |
| s(412) | 96℃；30秒 | 55℃；30秒 | 72℃；45秒 | 20 |
| s(412；VEID) | 96℃；30秒 | 55℃；30秒 | 72℃；45秒 | 20 |
| rc6(364) | 96℃；45秒 | 55℃；60秒 | 72℃；45秒 | 20 |
| rc6(364；VEID) | 96℃；45秒 | 55℃；60秒 | 72℃；45秒 | 20 |
| rc6(412) | 96℃；45秒 | 55℃；60秒 | 72℃；45秒 | 20 |
| rc6(412；VEID) | 96℃；45秒 | 55℃；60秒 | 72℃；45秒 | 20 |
| p(364) | 96℃；30秒 | 55℃；30秒 | 72℃；60秒 | 20 |
| p(364；VEID) | 96℃；30秒 | 55℃；30秒 | 72℃；60秒 | 20 |
| p(412) | 96℃；30秒 | 55℃；30秒 | 72℃；60秒 | 20 |
| p(412；VEID) | 96℃；30秒 | 55℃；30秒 | 72℃；60秒 | 20 |
| pc6(364) | 96℃；30秒 | 55℃；45秒 | 72℃；60秒 | 20 |
| pc6(364；VEID) | 96℃；30秒 | 55℃；45秒 | 72℃；60秒 | 20 |
| pc6(412) | 96℃；30秒 | 55℃；45秒 | 72℃；60秒 | 20 |
| pc6(412；VEID) | 96℃；30秒 | 55℃；45秒 | 72℃；60秒 | 20 |
□靶向活性caspase-6基因(immunocaspase-6)的获得及其真核表达载体的构建
以Not I/Xba I酶切PE转膜结构域与活性半胱天冬酶-6(rev-caspase-6)的重组体基因，克隆入真核表达载体pCMV/e23sFv相应位点，使4种融合蛋白基因位于前导肽和抗HER2抗体e23sFv基因下游，获得插入有靶向活性caspase-6基因(immunocaspase-6(364)1965bp，immunocaspase-6(364；VEID)1977bp，immunocaspase-6(412)2112bp和immunocaspase-6(412；VEID)2124bp)的pCMV表达载体，并经测序证实。
2.靶向活性半胱天冬酶-6基因(immunocaspase-6)的表达及其对HER2阳性肿瘤细胞的特异性杀伤
应用脂质体转染的方法，将靶向活性半胱天冬酶-6基因导入体外培养的人淋巴瘤Jurkat细胞系中，转染后48小时加入800μg/ml G418进行筛选，约2周后绝大部分细胞死亡，有阳性克隆长出，进行扩大培养，便得到了能够稳定表达并分泌目的蛋白的细胞株——Jurkat-immunocaspase-6。
□Western blot方法鉴定靶向活性半胱天冬酶-6蛋白的表达与分泌
收集细胞培养上清，经过透析除盐和冻干后，以小体积溶解备用。向样品中加入SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸10分钟，离心取上清，电泳，再电转化到PVDF膜上，封闭液封闭后，加入适当稀释的caspase-6抗体，4℃孵育过夜，加入荧光素标记的二抗，37℃避光孵育1h，再加入抗荧光素的抗体，室温避光孵育1h，以NBT/BCIP显色。
参见附图1，Western blot结果发现，靶向活性半胱天冬酶-6基因(immunocaspase-6)不仅能够被表达，并且能够按照预期分泌到细胞外。
□靶向活性半胱天冬酶-6(immunocaspase-6)分子对肿瘤细胞的杀伤作用
1)稳定表达靶向活性半胱天冬酶-6的细胞培养上清对细胞的杀伤
□Jurkat-immunocaspase-6细胞培养上清对自身生长的影响
pCMV/immunocaspase-6转染的Jurkat细胞，在正常培养情况下，细胞生长良好，绘制的生长曲线与转染空载体pCMV或没有转染的Jurkat细胞相似，参见附图2。结果表明，immunocaspase-6分子对Jurkat细胞本身没有杀伤效应。
②Jurkat-immunocaspase-6培养上清对肿瘤细胞杀伤的特异性
为了检验immunocaspase-6分子对肿瘤细胞的杀伤活性的靶向性，以pCMV和pCMV/immunocaspase-6转染的Jurkat细胞的培养上清分别培养HER2阳性细胞—SKBr-3和SKOV-3细胞；HER2阴性细胞-HeLa和BT325细胞。结果，参见附图3，Jurkat-immunocaspase-6细胞的培养上清对HER2阳性细胞的生长有明显的影响，而转染pCMV的Jurkat细胞的培养上清对所有细胞均没有影响。表明，immunocaspase-6的杀伤活性是具有靶向性的，只对HER2阳性细胞有杀伤，而不影响HER2阴性细胞的生长。
③Jurkat-immunocaspase-6培养上清对肿瘤细胞杀伤与时间的关系
收集pCMV/immunocaspase-6转染的Jurkat细胞的培养上清，用于培养SKBr-3细胞，分别于1天、2天、3天、4天、5天、6天和7天进行细胞计数，参见附图4，结果表明杀伤时间越长，杀伤效果越好，说明immunocaspase-6的杀伤活性与时间呈正相关。
2)稳定表达并分泌靶向活性半胱天冬酶-6的细胞对HER2阳性细胞的杀伤活性测定
①细胞计数方法测定稳定表达靶向活性半胱天冬酶-6的细胞对不同肿瘤细胞的杀伤率
Jurkat-immunocaspase-6细胞与HER2阳性细胞(SKBr-3和SKOV-3细胞)分别以1∶1、2∶1、5∶1、10∶1于Transwell中共培养，5天后进行细胞计数，参见附图5，发现“5∶1”的比例比较合适；Jurkat-immunocaspase-6细胞与HER2阳性细胞(SKBr-3和SKOV-3细胞)共培养(5∶1)于Transwell中，5天后进行细胞计数，有明显的细胞死亡。参见附图6，四种基因作用效果相当，其中immunocaspase-6(412；VEID)杀伤作用略强。
Jurkat-immunocaspase-6细胞与HER2阳性细胞(SKBr-3和SKOV-3细胞)和HER2阴性细胞(HeLa和BT325细胞)共培养(5∶1)，分别于1天、2天、3天、4天、5天、6天和7天进行细胞计数。参见附图7，结果显示，Immunocaspase-6蛋白对HER2阳性细胞有杀伤活性，而不影响HER2阴性细胞的生长，杀伤活性随着杀伤时间的延长而增强。
②被杀伤细胞的凋亡特征检测
Annexin V实验——消化被杀伤肿瘤细胞成单细胞悬液，PBS洗涤，再以孵育缓冲液重悬，加入Annexin-V-FITC和PI荧光显微镜下观察，并照相，参见附图8。结果表明Immunocaspase-6对HER2阳性细胞的杀伤通过诱导凋亡实现。
3.动物实验进行靶向活性半胱天冬酶-6(Immunocaspase-6)在体内的抗肿瘤应用
挑选6-8周BALB/c裸鼠，右后肢皮下注射HER2阳性肿瘤细胞——乳腺癌SKBr-3细胞(2×106个/只)，10天左右，形成明显肿瘤后随机分组，建立HER2阳性肿瘤细胞(乳腺癌SKBr-3细胞)的裸鼠实体瘤模型。
□阳离子脂质体包裹pCMV/immunocaspase-6，对动物模型的抗肿瘤应用
阳离子脂质体(20μL/只)包裹质粒pCMV/immunocaspase-6或pCMV(10μg/只)注射入荷瘤裸鼠的后肢肌肉中，每3天追加1次，同时记录瘤体大小变化，2周后将裸鼠处死，取出瘤体及心、肺、肝、脾、肾、骨骼肌、骨、脑、胃、肠及肿瘤等组织。
另挑选6-8周的裸鼠，阳离子脂质体(20μL/只)包裹质粒pCMV/immunocaspase-6或pCMV(10μg/只)注射入荷瘤裸鼠的后肢肌肉中，每3天追加1次，2周后每1周追加1次，直至裸鼠全部死亡。
瘤体变化——实验中跟踪并记录瘤体大小变化，同时将瘤体变化数据进行分析，参见附图9，结果表明Immunocaspase-6对HER2阳性肿瘤生长有一定的抑制效果。
安全性鉴定——将心、肺、肝、脾、肾、骨骼肌、骨、脑、胃、肠及肿瘤等组织固定后，石蜡包埋，切片，进行HE染色、免疫组织化学染色和TUNEL染色，观察Immunocaspase-6的表达和组织损伤情况，从而评价抑瘤效果。以抗caspase-6的抗体进行免疫组织化学染色，结果实验组肿瘤组织显示为caspase-6阳性，而治疗组的其他组织及对照组中包括肿瘤组织在内的所有组织均显示为caspase-6阴性。HE染色的结果表明实验组的肿瘤组织中有细胞死亡的现象，而治疗组的其他组织及对照组中包括肿瘤组织在内的所有组织细胞形态正常；TUNEL染色显示肿瘤组织中有细胞发生凋亡。
裸鼠存活期——记录裸鼠存活时间，进行统计学分析，参见附图10，结果显示，实验组裸鼠存活期明显比对照组延长，且差异显著。Log Rank Test：P＝0.0289-SPSS10.0。
□逆转录病毒载体携带靶向活性半胱天冬酶-6基因对动物模型进行抗肿瘤应用
①携带immunocaspase-6基因的逆转录病毒载体的构建及其重组逆转录病毒的获得
pCMV/immunocaspase-6经Xba I酶切，Klenow酶补平后再以Hind III酶切，回收基因片段。逆转录病毒载体pLNCX载体Cla I酶切，Klenow补平后再以Hind III酶切，回收载体片段。两者连接，构建了包含immunocaspase-6基因的逆转录病毒载体，酶切鉴定正确。与空载体分别转染包装细胞PA317，G418筛选建系，收集病毒上清，病毒分别命名为Re-immunocaspase-6和Re，-70℃保存，避免反复冻融。病毒上清倍比稀释，感染NIH3T3细胞，以G418筛选2周，计数形成的克隆数。发现在104倍稀释的病毒感染后，Re-immunocaspase-6及Re组都形成了4个克隆，所以病毒滴度均为4×104cfu/mL。病毒感染体外培养的细胞系(HeLa，SKBr-3，PA317)24h后收集细胞，提取总RNA，进行Dot-blot，检测到Re-immunocaspase-6感染后细胞中有immunocaspase-6基因转录产物。说明Re-immunocaspase-6能成功感染靶细胞，目的基因在靶细胞内被表达。
②重组逆转录病毒(Re-immunocaspase-6)感染对细胞的特异性杀伤
以上得到的重组逆转录病毒感染SKBr-3、HeLa、PA317细胞，进行免疫荧光染色，检测immunocaspase-6基因的表达，及其对细胞骨架和细胞核的影响，发现所有被Re-immunocaspase-6感染的细胞均表达目的蛋白，而只有HER2阳性肿瘤细胞SKBr-3中出现了明显的细胞骨架和细胞核的改变。
③重组逆转录病毒(Re-immunocaspase-6)的抗肿瘤应用
体外分离正常人外周血淋巴细胞，扩大培养后，以重组逆转录病毒(分两组：空载体对照组Re和实验组Re-immunocaspase-6)感染细胞，再培养2天后收集细胞，RMPI 1640洗涤2次，以2×106/mL的浓度将细胞重悬。由尾静脉注射(100μL/只)入荷瘤裸鼠的外周血中，1周后追加，2周处死裸鼠。同时记录瘤体大小变化，取出瘤体及心、肺、肝、脾、肾、骨骼肌、骨、脑、胃、肠及肿瘤等组织。
另挑选6-8周的裸鼠，建立裸鼠模型后，由尾静脉注射重组逆转录病毒感染的正常人外周血淋巴细胞，每1周追加1次，直至裸鼠全部死亡。
瘤体积变化——实验中跟踪并记录瘤体大小变化，同时将瘤体变化数据进行分析，参见附图11，结果表明immunocaspase-6对HER2阳性肿瘤生长有一定的抑制作用。
安全性鉴定——收集心、肺、肝、脾、肾、骨骼肌、骨、脑、胃、肠及肿瘤等组织固定后，石蜡包埋，切片，进行HE染色、免疫组织化学染色和TUNEL染色，观察immunocaspase-6的表达和组织损伤情况，从而评价抑瘤效果。以抗caspase-6的抗体进行免疫组织化学染色，结果实验组肿瘤组织显示为caspase-6阳性，而治疗组的其他组织及对照组中包括肿瘤组织在内的所有组织均显示为caspase-6阴性。参见附图12，HE染色的结果表明实验组的肿瘤组织中有细胞死亡的现象，而治疗组的其他组织及对照组中包括肿瘤组织在内的所有组织细胞形态正常；TUNEL染色显示只有实验组的肿瘤组织中有细胞发生凋亡。
存活期变化——记录裸鼠存活时间，进行统计学分析，参见附图13，结果显示，实验组裸鼠存活期明显比对照组延长，且差异显著。Log Rank Test：P＝0.0090-SPSS10.0。
□腺病毒载体携带靶向活性半胱天冬酶-6基因对动物模型进行抗肿瘤应用
①携带immunocaspase-6基因的腺病毒载体的构建及重组腺病毒的获得
pCMV/immunocaspase-6经Xba I酶切，Klenow酶补平后再以Hind III酶切，回收immunocaspase-6基因片段；同时，腺病毒载体pShuttleCMV以Hind III、EcoR V双酶切后，回收载体片段，两者连接。pShuttle/immunocaspase-6和pShuttleCMV再分别与pAdeasy-1进行细菌BJ5183内重组，构建了腺病毒载体—pAdeasyCMV和pAdeasy/immunocaspase-6。pAdeasy/immunocaspase-6及pAdeasyCMV转染包装细胞HEK293，2周后出现明显的细胞病理性变化，收集病毒。病毒溶液稀释后感染HEK293细胞，以含DMEM的琼脂糖培养，两周左右出现明显病毒克隆，挑取病毒克隆，扩大感染后提取病毒基因组，以地高辛标记的靶向活性caspase-6基因片段探针进行Dot-blot，鉴定为阳性后，再感染HEK293细胞，收集病毒，病毒分别命名为：Ad-immunocaspase-6和Ad。扩大感染后再测定病毒滴度。计数形成的克隆数，发现在1012倍稀释的病毒感染后，Ad-immunocaspase-6形成了8个克隆，病毒滴度为8×1012cfu/mL。Ad组形成了2个克隆，病毒滴度为2×1012cfu/mL。为了检测病毒是否在包装细胞以外的其他细胞中复制，即检测病毒的安全性，以P15和P16引物扩增细胞基因组中包装病毒必须的E1A基因，结果发现在检测的细胞中，只有HEK293细胞内有E1A基因。
引物序列为：
P15：5’cat att atc tgc cac gga gg 3’
P16：5’gcc aca ggt cct cat ata gc 3’
PCR反应条件为：
96℃变性30秒；55℃退火45秒；72℃延伸60秒。共进行20个循环。
②重组腺病毒(Ad-immunocaspase-6)体外感染对细胞的影响
病毒感染体外培养的SKBr-3、HeLa、HEK293细胞24h后，收集细胞，提取总RNA，进行RT-PCR，扩增immunocaspase-6的部分序列，检测到Ad-immunocaspase-6感染后细胞中有immunocaspase-6基因转录产物；对感染的细胞进行免疫荧光染色，检测immunocaspase-6基因的表达，及其对细胞骨架和细胞核的影响，发现所有被Ad-immunocaspase-6感染的细胞均表达immunocaspase-6，而只有HER2阳性肿瘤细胞SKBr-3中出现了明显的细胞死亡。
③重组腺病毒(Ad-immunocaspase-6)的抗肿瘤应用
将收集的病毒进行稀释(终滴度为：1×109cfu/mL)，以重组腺病毒(分三组：空白对照组PBS、空载体对照组Ad和实验组Ad-immunocaspase-6)对荷瘤裸鼠进行瘤体直接注射，连续进行3次，记录瘤体大小变化和裸鼠存活时间。2周后每组各处死1只裸鼠，取出心、肺、肝、脾、肾、骨骼肌、骨、脑、胃、肠及肿瘤等组织。固定后，石蜡包埋，切片，进行HE染色、免疫组织化学染色和TUNEL染色，观察immunocaspase-6的表达和组织损伤情况，从而评价实验效果。
瘤体积变化——实验中跟踪并记录瘤体大小变化，同时将瘤体变化数据进行统计学分析，参见附图14，结果表明Ad-immunocaspase-6注射能抑制HER2阳性肿瘤的生长。
安全性鉴定——以抗caspase-6的抗体进行免疫组织化学染色，结果实验组肿瘤组织显示为caspase-6阳性，治疗组的其他组织及对照组中包括肿瘤组织在内的所有组织均显示为caspase-6阴性。参见附图15，HE染色的结果表明实验组的肿瘤组织中有细胞死亡的现象，而治疗组的其他组织及对照组中包括肿瘤组织在内的所有组织细胞形态正常。对实验组和对照组的肿瘤组织进行TUNEL染色，结果表明Ad-immunocaspase-6治疗组的肿瘤组织中显示有细胞发生凋亡。
存活期的变化——记录裸鼠生存时间，并对结果进行统计学分析，参见附图16，结果表明Ad-immunocaspase-6治疗组的裸鼠存活期明显比对照组延长，且差异显著。Log Rank Test：P＝0.0198-SPSS10.0。
Claims (8)
1、一种具有靶向活性的重组半胱天冬酶-6基因，其具有序列表<400>1-4之一的序列。
2、由权利要求1的基因编码的多肽，其具有序列表<400>5-8之一的序列。
3、一种表达载体，其含有权利要求1所述的重组半胱天冬酶-6基因。
4、如权利要求2所述的多肽在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。
5、一种重组逆转录病毒，其特征为：将权利要求1所述的重组半胱天冬酶-6基因克隆入逆转录病毒载体，通过包装细胞包装后，分离得到逆转录病毒。
6、如权利要求5所述的重组逆转录病毒在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。
7、一种重组腺病毒，其特征为：将权利要求1所述的重组半胱天冬酶-6基因克隆入腺病毒载体，通过包装细胞包装后，分离得到腺病毒。
8、如权利要求7的所述的重组腺病毒在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。
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| CNA2003101189544A CN1546662A (zh) | 2003-12-08 | 2003-12-08 | 具有靶向活性的重组半胱天冬酶-6基因及其抗肿瘤应用 |
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