CN1526072A - 埃-巴二氏病毒(ebv)肿瘤相关潜伏膜蛋白的胞外结构域的鉴定方法和与之反应的抗体试剂的选择方法 - Google Patents

Abstract

本发明描述了在EBV－转化的哺乳动物细胞的细胞外表面上表达的埃－巴二氏病毒(EBV)编码的膜蛋白的胞外表位的鉴定方法，对所述表位特异性的抗体试剂的筛选和制备方法，以及包含埃－巴二氏病毒编码的肿瘤细胞相关膜蛋白的胞外结构域的肽，所述肽用于免疫和治疗接种以诱导与所述结构域反应的抗体和T－细胞的用途，所述抗体试剂用于制备导向细胞，肿瘤细胞清除，以及用作诊断和抗EBV－介导的恶性细胞生长的药物的用途。

Description

埃-巴二氏病毒(EBV)肿瘤相关潜伏膜蛋白的胞外结构域的 鉴定方法和与之反应的抗体试剂的选择方法

本发明涉及埃-巴二氏病毒(EBV)编码的膜蛋白的胞外表位的鉴定方法，涉及与所述表位反应的抗体试剂的筛选方法，涉及新的肽，包括埃-巴二氏病毒(EBV)编码的潜伏和肿瘤相关膜蛋白的胞外结构域，涉及编码所述肽的核苷酸序列，包含所述核苷酸序列的载体，涉及与所述胞外结构域反应的抗体试剂，和涉及所述肽、编码所述肽的核苷酸序列和所述抗体试剂用于制备药物的用途，特别是抗EBV驱动的恶性生长，用于抗埃-巴二氏病毒感染的接种和免疫治疗，并且涉及所述抗体试剂用作用于体外和体内检测EBV转化(肿瘤)细胞诊断法的用途。此外，涉及提高这些肽和抗体试剂的诊断和治疗功效的它们的修饰。

发明背景

埃-巴二氏病毒(EBV)是普遍存在的人疱疹病毒，最初与伯基特氏淋巴瘤(BL)的非洲形式(地方性)相关发现这种病毒。接着也与鼻咽癌(NPC)相关发现了这种病毒，并且证明它是传染性单核细胞增多症(IM)的成因物质。儿童期早期通常发生感染，普遍导致亚临床表现，偶尔伴随轻度症状。但是，青春期或成年期的感染带来特征在于外周中存在非典型淋巴细胞的IM的危险。这些大批淋巴细胞是T淋巴细胞；但是，它们中包括小部分受EBV感染的B淋巴细胞。B淋巴细胞感染也可以体外完成。这样的细胞在培养物中变得被转化并且无限增殖，并且被称作″永生的″，″潜伏感染的″或者″生长转化的″。迄今为止已知，被EBV感染的所有的个体生命中保持潜伏感染。这反映在整个生命中循环外周血淋巴细胞中持续存在少数EBV-基因组阳性的转化B-细胞，并且口咽中连续而不是周期性脱落病毒。

大多数情况下，EBV感染导致淋巴增生性疾病，这些疾病可能暂时使人衰弱，但是总是良性的和自限性的。但是，在一些免疫抑制个体中，结果会不受控制地淋巴增生，导致完全恶性。主动免疫抑制个体发生这种情况，特别是接受环孢菌素A治疗的接受器官或骨髓移植的个体，或者偶然地，在感染HIV个体的情况下，或者遗传学上，受影响的携带XLP(x-连锁淋巴增生综合症)基因的雄性的情况。在这些情况下，产生的恶性肿瘤来自EBV-感染的B细胞的多克隆增殖。另外，在这样的患者中，在口腔毛状粘膜白斑病病变中可检查到病毒的不受控上皮复制。因此，免疫应答在EBV感染的控制中起着中心作用。

此外，在免疫活性个体中，EBV与恶性肿瘤正在生长的数目相关，它可以是淋巴或上皮来源的。例子是伯基特氏淋巴瘤(BL)，B-细胞非-何杰金氏淋巴瘤(B-NHL)，结节外T-/NK-细胞淋巴瘤(T/NK-NHL)，何杰金氏病(HD)，鼻咽癌(NPC))和胃腺癌(GC)(Baumforth等，J.Clin.Pathol.：Mol.Pathol.(1999)52；307-322)。

很多年来，发生伯基特氏淋巴瘤(BL)的细胞系和EBV-转化的外周血B-细胞，也称作类淋巴母细胞系(LCL)，被认为是研究EBV-介导的转化和癌发生的原型模型系统。最近几年，已经测得原型病毒株B95-8的全DNA序列。对该序列的分析得出80个以上可读框的鉴定(Baer等，Nature 310；207-211(1984))，已经体外和体内充分研究了它们的表达。

令人感兴趣的是，在人恶性肿瘤中，这些基因中只有有限的一组被激活表达，称之为潜伏基因转录物。主要地，在各种EBV-相关恶性肿瘤中发现了三种不同的潜伏基因转录模式。这些模式称为潜伏I型，II型和III型。最新的数据表明存在使该分类系统复杂化的另外的转录物(zur Hausen等，Cancer Research，60(2000)；2745-2748和欧洲专利申请No.98200655.3)。

潜伏I型特征在于埃-巴二氏病毒核抗原1(EBNA-1；BKRF1)的表达和小的非编码RNA的埃-巴二氏病毒早期RNA1和2(EBER-1和EBER-2)。最近，在表达潜伏I型模式的所有的细胞中发现了这些转录物中包括的数个小可读框中新的一组具有潜在的蛋白质编码能力的转录物(BARTs)。潜伏II型特征在于除了上述I型转录物之外另外的潜伏膜蛋白1(LMP-1；BNLF1)和LMP-2A/-2B(BNRF1)的表达。只有当病毒基因组是共价闭合的环形式时LMP2转录物才能够被表达，因为这些转录物跨越病毒基因组上的末端重复，并且当病毒基因组是其线性″裂解″状态时则不能形成。最近证明BARF1可读框中编码的跨膜蛋白在显示潜伏I型或潜伏II型表型的EBV+上皮肿瘤中优先表达(zurHausen等，Cancer Research，60(2000)；2745-2748和欧洲专利申请No.98200655.3)。潜伏III型特征在于除了II型编程转录物之外核抗原EBNA-2，EBNA-3A，EBNA-3B，EBNA-3C和EBNA-4(也分别称作EBNA-2，-3，-4，-6和-5)的表达(Baumforth等，J.Clin.Pathol.：Mol.Pathol.(1999)52；307-322，Cohen JI.New Engl.J.Med.(2000)343；481-492)。不同潜伏性相关转录程序的表达受宿主细胞参数的影响，如甲基化水平和细胞分化(Robertson KD，Curr.Top.Microbiol.Immunol.(2000)249；21-34)。近几年，利用以RNA(逆)转录为基础的技术或原位杂交和免疫组织化学染色技术，详细确定了不同的潜伏型分布与各种EBV-相关恶性肿瘤的相关性。利用这些分析类型，体内在BL肿瘤细胞中和体外在分散的来自BL的细胞系中发现I型潜伏状态(Baumforth等，J.Clin.Pathol.：Mol.Pathol.(1999)52；307-322)。在免疫活性宿主的NPC，何杰金氏淋巴瘤的EBV-阳性体，T-/NK-细胞和B-细胞非-何杰金氏淋巴瘤(T-/NK-/B-NHL)和罕见胸腺和腮腺癌中发现II型潜伏状态，而主要发生在无免疫应答个体中的前恶性肿瘤淋巴增殖和免疫母细胞杂交瘤以及在体外培养的大多数BL和LCL细胞系中发现III型潜伏状态(Baumforth等，J.Clin.Pathol.：Mol.Pathol.(1999)52；307-322)。在无免疫应答患者中还发现偶发性平滑肌肉瘤，其可以表达I型或II型模式。发现无免疫应答患者中EBV+上皮癌，如胃腺癌，鼻咽癌和罕见肝细胞癌表达I或II潜伏型，另外表达BARF1(zurHausen等，Cancer Research，60(2000)pp.2745-2748；Brink等，J.Clin.Microbiol.36(1998)pp.3461-3469和欧州专利申请No.98200655.3)。

因此，EBV-阳性肿瘤的特征在于病毒基因产物的激活表达，其中一些使得跨膜蛋白局限于肿瘤细胞的质膜。这些潜伏相关膜抗原是EBV+肿瘤细胞特异性识别的可能的靶物。

第一次感染宿主之后产生对EBV有效而终生的免疫应答。产生抗病毒结构成分(VCA和MA)和胞内核抗原(特别是EBNA)的抗体的效应B-细胞及与潜伏性III相关的核抗原(特别是EBNA3家族)及几种与病毒基因表达裂解期相关的抗原反应的效应T-细胞在该应答中占优势。T-细胞靶物衍生自蛋白酶体复合物的消化作用和接着将小的肽片段转运至MHC-I和MHC-II分子细胞表面之后EBV+细胞内部表达的蛋白质。抗体抵抗从EBV-感染细胞释放的完整的或片段蛋白质上构象和/或线性表位结构域。

认为识别潜伏-III特异性基因产物的T-细胞对于体内EBV+B-细胞潜在的赘疣的终生控制是非常重要的。认为抗MA复合体的抗体对于通过防止感染病毒体与EBV-受体即CD21结合的病毒中和是重要的。虽然在大多数EBV感染个体中可检测到抗MA复合体的抗体，它们能介导体外清除MA表达病毒产生细胞，它们对体内EBV+肿瘤细胞根除的贡献是零，因为EBV+肿瘤不表达MA。类似地，认为抗其它病毒结构蛋白质的抗体对于抗肿瘤免疫控制是没有关系的。

为了诱导并保持抗体和T-细胞应答，吞噬细胞即所谓抗原呈递细胞(APC′s)消化病毒抗原，所述细胞能在它们的细胞表面显示这些抗原，或者是免疫复合体中捕获的完整蛋白质(片段)的MHC-I/-II或者是I型，或者通过另外的表面受体。当遇到EBV抗原特异性T细胞或B细胞时，这些APC提供刺激性信号，导致产生效应B细胞和T细胞。

令人感兴趣和令人惊奇的是，在EBV-感染的个体中几乎检测不到抵抗“非自身”潜伏性相关膜蛋白LMP1和LMP2的任何抗体或T-细胞反应性。因此这些蛋白质归类为亚优势。迄今为止，还没有人很详细描述对BARF1蛋白质的应答。重要的是，迄今为止还没有人描述过与在EBV-转化的肿瘤细胞上表达的EBV编码的潜伏性相关的膜抗原的推定的胞外域反应的(天然或体外产生的)抗体。

在具有如上所述抗优势抗原缺陷细胞免疫性的免疫缺陷患者中(特别是XLP-患者，移植物接受者和HIV-感染个体)，免疫系统不能根除表达潜伏性-III表型的EBV+B-细胞，因此使得它们不受控生长，常常导致恶性寡克隆和单克隆B-细胞肿瘤。

在非-无免疫应答(免疫活性)患者中，肿瘤形成过程(发病机理)复杂得多并且大半仍然没有澄清，但是认为涉及直接生长刺激，免疫调节和这些细胞中表达的EBV基因产物诱导的编程性细胞死亡抗性，与失去调节的宿主细胞功能协同作用或者平行作用。

令人感兴趣的是，免疫活性个体产生的肿瘤表达潜伏性I型或II型基因产物，而不表达潜伏性III型基因产物。虽然表达确定的″非自身″病毒基因产物(即与潜伏性-I/-II相关的蛋白质)，宿主免疫系统不根除这些肿瘤。这可能是这些肿瘤细胞上表达的潜伏型-I/-II基因产物的亚优势的直接结果，只是诱导次最优的或不适当T-细胞免疫应答或者由于诱导局部T-细胞无效能，这是由于这些细胞分泌免疫调节物质，例如IL-10和LMP1(的片段)。或者，这可能是具有高水平编程性细胞死亡抗性的肿瘤细胞诱导和分泌的结果，例如上调A20/Bc1-2。

重要的是，携带EBV+肿瘤的免疫活性患者几乎没有明显的与潜伏性相关的膜蛋白的T-细胞或抗体应答，虽然这些应答趋向于一定程度高于健康EBV携带者(Meij等，J.Infect.Dis.(1999)179；1108-1115和Frisan等，Blood(1995)86；1493-1501)。

因此，患有EBV+肿瘤的免疫活性患者不能对″非自身″肿瘤相关病毒基因产物产生有效免疫应答。肿瘤细胞诱导的免疫调节(抑制)和肿瘤细胞编程性细胞死亡抗性可以进一步使局部T-细胞免疫应答无效。考虑到识别EBV+肿瘤细胞表面上表达的EBV特异分子(这里也称作EBV-编码的肿瘤相关的潜伏膜蛋白或者简单地称作EBV-编码的膜蛋白)的抗体试剂应该更有效并且应该不受这些局部免疫逃避机理的影响。因此，长期以来，本领域感觉到鉴定这样的EBV-编码的膜蛋白的胞外域和抗所述结构域的抗体试剂的有效性需要开发抗EBV驱动的恶性肿瘤细胞生长的药物和诊断法。

本领域描述了几种EBV-编码的肿瘤细胞相关膜蛋白；但是，还没有证明这样的膜蛋白包括胞外结构域，适合抗体相互作用。如上所述，还没有人描述过抗这样的结构域的抗体。首先以抗EBV转化的B-细胞的T-细胞应答的功能分析为基础怀疑确定的EBV编码的肿瘤细胞相关的膜蛋白的存在，并且这些假设结构操作上定义为LYDMA(淋巴细胞确定的膜抗原)(Szigeti等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1984)81；4178-4182)。接着的研究表明LYDMA反应性大多确实来自细胞表面上MHC-I分子中呈递的核抗原家族(特别是EBNA3家族)的肽片段(Burrows等，J.Exp.Med.(1990)171；345-349)。生物化学和分子分析和随后的DNA测序研究表明存在至少两种类型的潜伏性相关的膜蛋白，称作LMP1和LMP2，后者以两种形式存在，即LMP2A和LMP2B，LMP2B没有LMP2A的前119个氨基酸(Rowe，Frontiers inBioscience(1999)4；346-371)。

编码LMP1和LMP2的基因的序列分析表明这些蛋白质中存在几个疏水性结构域，提示LMP1包含6个跨膜结构域，LMP2A和2B包含12个这样的结构域(Rowe，Frontiers in Bioscience(1999)4；346-371)。

使用与LMP1和LMP2的提出的胞质区中的结构域反应的单克隆抗体，证明它们与EBV-感染细胞中的各种膜隔室缔合。这些研究还表明，一同位于这些膜隔室中的LMP1和LMP2优先在所谓包含微结构域或筏的鞘糖脂中(Clausse等，Virol.(1997)228；285-293)。

Khanna等(J.Exp.Med.176(1992)；169-176和Eur.J.Immunol.28(1998)；451-458)描述LMP1的肽片段是可能的HLA-相关抗原，并且归因于对MHC介导的细胞免疫应答中所述片段的推定的作用。在细胞免疫应答中，自身和非自身蛋白质被表达并且胞内裂解成肽片段，并且与HLA复合，呈递在细胞的外表面。这样的片段不能被鉴定为触发体液免疫应答的胞外表位，但是只是作为推定的HLA-相关表位发挥功能。Khanna等人没有提示LMP1片段是否是LMP1的胞内，跨结构域或胞外部分。

第三种潜伏性相关膜蛋白最近被鉴定为在EBV基因组上BARF1可读框中编码，并且最早被描述为早期基因产物(Zhang等，J.Virol.(1988)62；1862-1869)。BARF1在EBV-相关癌中特异性表达并且在EBV-相关淋巴瘤中不表达(Zur Hausen等，上文，Brink等，上文，和欧洲专利申请98200655.3)。

对BARF1基因的结构几乎没有明确。最新数据表明N-末端单一跨膜结构域将BARF1固定在质膜中，并且可能也从细胞中分泌出来(Strockbine等，J.Virol.(1998)72；4015-4021)。包含与BARF1反应性的人血清可以介导清除BARF1-表达细胞，但是与这种清除活性相关的结构域还没有被鉴定(Tanner JE，等，J.Infect.Dis.(1997)175；38-46)。

在LMP1，LMP2和BARF1的表征中，没有考虑或证实这些蛋白质是否包含实际上从细胞膜突出的外部胞外环，并且抗这样的推定的环抗体是否能产生也是未知的。

现在本发明第一次提供了EBV-转化的哺乳动物细胞的细胞外表面上表达的埃-巴二氏病毒(EBV)编码的膜蛋白的胞外表位的鉴定方法，包括步骤：

A)提供EBV基因组的至少一个可读框(ORF)的氨基酸序列，

B)确定A)的氨基酸序列中包含的至少一个推定的胞外结构域，

C)制备包括推定的B)的胞外结构域或者其部分的肽，该肽不包括全长ORF，

D)制备能与C)的肽特异性结合的抗体试剂，

E)使D)的抗体试剂与存活的EBV转化的哺乳动物细胞反应，

F)检测抗体试剂与EBV转化的哺乳动物细胞的细胞表面的特异性结合。

术语“胞外表位，在细胞外表面上表达”在这里定义是蛋白质的部分，当在天然蛋白质中存在时，它在细胞外表面呈现。因此认为所述表位是所述蛋白质的胞外部分，并且可能在触发抗所述蛋白质的体液免疫应答中起着重要的作用，这与蛋白质片段相反，蛋白质片段可能在与HLA相关的细胞外表面呈现。后一种蛋白质片段，当在天然蛋白质中存在时，可以是蛋白质的胞内，跨膜或胞外部分，或者其组合。后面这些片段可能在细胞MHC介导的免疫应答中起作用。有关细胞和体液免疫应答途径的综述，参考Roitt，I.M.，Essential Immunology，第9版(1997)，Blackwell Science Inc.New York，USA，这里引作参考。

术语″蛋白质″包括单链多肽分子及其中各个构成多肽通过共价或非共价方式连接的多个多肽复合体。术语″肽″包括长度是两个或多个氨基酸的肽，一般具有多于5，10或20个氨基酸。100个氨基酸以上的氨基序列称作“蛋白质”。

LMP1，LMP2和BARF1的氨基酸序列在前面的研究中已经确定，并且容易从Genbank和Swiss-Prot数据库(例如LMP1：BAA00948；LMP2a：AAA45884；BARF1：CAA24809)获得。

本领域技术人员能容易确定ORFs以及推定的胞外结构域，例如通过应用本领域公知的合适的计算机程序，例如GCG Wisconsin软件包(Wisconsin大学，Genetics Computer Group Inc.U.S.A.；Devereux等，1984，Nucleic Acids Research12：387)中提供的程序。

很多制备肽的方法是本领域公知的；例如利用Fmoc化学利用固相肽合成仪(例如从Applied Biosystems，USA获得的)，通过天然蛋白质的酶学或化学裂解，或者通过基因工程技术，能合成肽。根据本发明方法使用的肽可以包括推定的胞外结构域的完全序列或者其部分，只要能制备与所述肽部分特异性结合的抗体试剂(见下文)。此外，肽可以包含另外的序列，例如另外的氨基酸片段，使得肽与固相基质(例如树脂，用于柱色谱)偶联，或者可以与用于偶联载体蛋白质(例如链霉抗生物素蛋白)的另外的小的分子(例如生物素)连接。

在本领域中具有特异性肽结合能力的抗体试剂的制备方法是公知的(参见：Current Protocols in Immunology(编者J.E.Coligan等；Publ.J.Wiley & Sons，1992-2001，这里引作参考))。通过对幼稚的或产生特异性抗体的B-细胞进行筛选并且使其无限增殖，并且通过遗传工程，例如通过利用这样的B-细胞中包括的遗传信息建立表达文库，即通过克隆动物或人的所有组成成分并且在微生物中表达，或者通过完全人工构建这样的文库，用感兴趣的蛋白质对动物包括人特异性免疫之后，可以制备抗体试剂。但是，作为第一步，优选使用动物的多克隆抗血清，所述动物用针对在根据本发明方法的步骤D)中要制备的并且要在步骤E)中使用的抗体试剂的令人感兴趣的肽免疫。

“特异性结合”在这种情况下指特异的表位-抗体独特型相互作用，不包括非特异性蛋白质/蛋白质相互作用。抗体试剂与包含确定氨基酸序列的肽的结合通过抗体上的“独特位”介导。独特位作为抗体分子的可变区中构象结构域而被包含，并且由所谓互补决定区的三维折叠而产生。认为通过形成抗体骨架结构的恒定区或侧翼区的结合不是特异性的。因此，根据本发明的肽至少包括一个表位。术语表位和独特位是本领域公知的；参考Roitt I.M.，上文。特异性结合的抗体试剂的筛选和分离方法以及特异性和非特异性结合的区分方法是本领域公知的，并且可以例如包括使特异性结合完整而非特异性结合取消的条件下的洗涤程序。

术语“抗体试剂”在本领域中一般都明白，并且指能特异性结合半抗原或表位的任何分子。抗体分子由一般被称作Fv-片段的抗原结合部分，称作恒定区的结构部分，和通常称作Fc-部分，也包括几个恒定区的介导生物学功能的部分构成。抗体Fv-片段的抗原结合结构域由几种构象确定的氨基酸序列构成，所述构象确定的氨基酸序列称作互补决定区(CDR′s)，它们形成能与不同抗原分子相互作用的三维结构，抗原分子可以是半抗原，寡糖，寡核苷酸，寡肽，蛋白质或者其它分子。这样的抗原-结合结构域能以各种各样分子形式和复合体表达，同时保持它的抗原-结合性质。这样的抗体，抗原-结合结构域或Fv-分子这里统称作″抗体试剂″。

通过在抗体试剂能特异性结合存活的EBV转化的细胞的细胞外表面上呈现的表位的条件下，使这样获得的抗体试剂，例如多克隆血清或者克隆的单一抗体或者其片段，体外优选与存活的EBV转化细胞反应，能监测抗体试剂是否与EBV转化的细胞的表面特异性结合。在本领域中，确定这样的结合是否发生的的几种方法是已知的；例如其中携带与其细胞外表面结合的抗体试剂的EBV转化细胞被固定在悬浮液中或者显微镜载玻片上的原位染色技术。例如，可以使用对该抗体试剂特异性的并且与能目测的标记物偶联的二抗来结合与EBV转化细胞的细胞外表面结合的抗体试剂。对上述抗体试剂与EBV转化细胞结合的检测是所述肽为EBV感染细胞外表面上存在的一个表位的指征，因此鉴定为EBV编码膜蛋白的胞外表位。

上述制备的抗体试剂因此能与EBV转化细胞上的一个表位特异性结合。第二方面，本发明因此涉及选择能与EBV转化哺乳动物细胞外表面上表达的埃-巴二氏(EBV)编码膜蛋白的胞外表位结合的抗体试剂的方法，包括步骤：

A)提供EBV基因组的至少一个可读框(ORF)的氨基酸序列，

B)确定A)的氨基酸序列中包含的至少一个推定的胞外结构域，

C)制备包括B)的胞外结构域或者其部分的肽，该肽不包括全长ORF，

D)制备能与C)的肽特异性结合的抗体试剂，

E)使D)的抗体试剂与存活的EBV转化哺乳动物细胞反应，

F)检测抗体试剂与EBV转化的哺乳动物细胞的细胞表面的特异性结合。

G)选择F)检测的抗体试剂。

步骤A)-F)和上文对于表位的鉴定描述的一样；抗感兴趣的肽的抗体试剂能以多种不同抗体试剂的多克隆混合物存在，其中大部分对于制备的肽不是特异性的。能从抗体试剂制品筛选和分离特异性结合EBV编码表位的抗体试剂。在本领域，从不同特异性的抗体试剂的混合物筛选和分离感兴趣的抗体试剂的方法是公知的。

在优选的实施方案中，制备和筛选单特异性抗体试剂(即与相同表位结合，但是结合强度会彼此不同或者彼此与该表位上不同的位点结合)，其中在上述步骤G)中包括步骤：

G1)用步骤C)的肽免疫动物，

G2)制备包括抗体试剂的免疫动物的体液，

G3)制备包括与所述基质结合的肽的固相亲和基质，

G4)使体液和基质接触，

G5)使来自体液的抗体试剂与所述基质结合的肽特异性结合，

G6)分离与所述肽特异性结合的抗体试剂。

通过如上所述将感兴趣的肽注射给动物，优选哺乳动物，包括人，能够实施对动物的免疫。当通过这样的免疫法制备步骤D)中的抗体试剂时，步骤G1)和G2)一起与步骤D)一样。免疫会产生多克隆抗血清，其包括至少一种对感兴趣的肽(即上述表位)特异性的抗体。

如果，例如，从动物例如从兔或豚鼠或者甚至人制得作为多克隆血清的抗体试剂，能分离接受免疫的动物的B细胞，并且用于通过杂交瘤技术或者其改进技术制备单克隆抗体(Kohler和Milstein，Nature256(1975)：495-497；van Meel等，J.Immunol.Meth.80(1985)：267-276；Steenbakkers等，Human Antibodies andHybridomas4(1993)：166-173；Schmidt等，J.Immunol.Meth.255(2001)93-102)。因此，在本发明另一个实施方案中，制备和筛选单克隆抗体，其中上述步骤G)包括步骤：

G1)用步骤C)的肽免疫动物，

G2)从G1)接受免疫的动物提供生产抗体试剂的B细胞，

G3)制备包括与所述基质结合的肽的固相亲和基质，

G4)使G2)的B细胞和基质接触，

G5)使B细胞与所述基质结合的肽特异性结合，

G6)分离与所述肽特异性结合的B细胞。

步骤G1)中对动物，优选哺乳动物，包括人的免疫得到产生与所述肽特异性结合的抗体的B-细胞，从接受免疫的动物的循环系统或者确定的淋巴器官即脾，淋巴结或骨髓能获得所述B细胞。B细胞与合适的基质结合的方法以及其分离方法是本领域公知的。分离的B细胞能被用于使用上文提到的杂交瘤融合技术制备单克隆抗体。

在下面的步骤中，所述肽与用于柱色谱的固相基质例如树脂或者例如本领域的磁珠的固体珠结合，肽与固体基质结合的方法是公知的。本领域技术人员也知道本领域可获得的合适的基质。对于合适的结合，肽可以包括另外的氨基酸，例如赖氨酸残基序列段，或者有利于肽与基质结合的其末端的间隔臂。

接受免疫的动物的体液例如腹水，全血或血清中能获得多克隆抗体。

在下面的步骤中，在抗体能与结合了所述基质的肽结合的这样的条件下，体液接触步骤G2)的基质。术语“体液”也意在包括例如通过纯化步骤获得的包括来自所述体液的多克隆抗体的任何液体介质。能与基质上的肽特异性结合的抗体与之结合；通过选择合适的结合条件，或者通过使抗体与之结合的基质进行洗涤程序，其中非特异抗体被洗掉，特异抗体保持与肽结合，来消除任何可能的非特异性结合。本领域技术人员能确定合适的结合条件和洗涤条件。

例如通过上面提到的洗涤程序，和/或通过将固体基质从结合或洗涤介质中回收，能方便地分离特异性结合了肽的抗体试剂。在基质包括磁珠的情况下，通过磁力能分离结合了基质的特异抗体；在第二个步骤中，能去除抗体和肽之间的结合，得到分离形式的特异抗体。在基质包括装填在色谱柱中的树脂的情况下，在第一步骤中从柱中洗出非特异抗体和其它成分；接着通过从柱子洗脱能分离抗体。

优选地，从上面讨论的EBV编码的膜蛋白LMP1，LMP2和BARF1选择根据本发明方法提供的ORFs，其氨基酸序列是本领域公知并且公开的(GenBank登记号：LMP1：BAA00948；LMP2a：AAA45884；BARF1：CAA24809，这里引作参考)。最优选地，从选自下面的氨基酸序列中选择推定的胞外域：

SEQ ID 1  (LMP 1，胞外环1)，

SEQ ID 2  (LMP 1，胞外环2)，

SEQ ID 3  (LMP 1，胞外环3)，

SEQ ID 4  (LMP 2，胞外环1)，

SEQ ID 5  (LMP 2，胞外环2)，

SEQ ID 6  (LMP 2，胞外环3)，

SEQ ID 7  (LMP 2，胞外环4)，

SEQ ID 8   (LMP2，胞外环5)，

SEQ ID 9   (LMP2，胞外环6)，

SEQ ID 10  (BARF1，SEQ40-79)，

SEQ ID 11  (BARF1，SEQ80-154)，

SEQ ID 12  (BARF1，SEQ155-188)和

SEQ ID 13  (BARF1，SEQ188-221)。

使用上述序列发现，能选择和分离对于所述肽特异性的抗体试剂，所述肽在EBV-转化的哺乳动物细胞的细胞外表面上表达(参见实施例1-3)。因此，所述肽可以被鉴定为胞外EBV编码的表位，并且能产生对所述表位特异性的抗体试剂。例如通过用位于疏水性的所述蛋白质的推定跨膜结构域之间的具有以LMP1和LMP2的已知的氨基酸序列部分为基础的氨基酸序列的合成肽(即包括SEQ ID No.1-9任一个的肽)对兔子免疫，能产生多克隆抗体。此外，能使用包括BARF1的推定单一跨膜结构域的部分的合成肽(即包括SEQ ID No.10-13任一个的肽)。

在非常优选的实施方案中，上述本发明方法的步骤C)的肽包括两个半胱氨酸残基，位于推定的胞外域或者其部分之间，所述半胱氨酸残基被氧化，在所述半胱氨酸残基之间形成S-S键。这样的肽包括受限“强制(forced)环”形式的胞外域，模拟该结构域的天然构象，此时天然蛋白质部分在细胞膜中。能证明受限构象肽导致抗体试剂的改进的特异性结合，这样改善抗体试剂的选择和分离(参见例如实施例2-4)。肽也能包括另外的修饰作用，例如上文对于改善的与基质结合所讨论的。

除了上述其中选择和分离单特异性和单克隆抗体试剂的本发明实施方案之外，本发明具体而非常有益的实施方案提供通过使用表达文库产生的对EBV编码的膜蛋白的胞外表位特异性的单克隆抗体试剂，因此，本发明提供能结合在EBV-转化的哺乳动物细胞的细胞外表面上表达的埃-巴二氏病毒(EBV)编码膜蛋白的胞外表位的单克隆抗体试剂的制备方法，包括步骤：

1)提供包括哺乳动物遗传物质的表达文库，

2)使根据权利要求1鉴定的肽接触所述文库，

3)使肽与所述文库的生物体结合，

4)分离肽与之特异性结合的生物体，

5)制备分离的生物体的单一克隆，

6)在表达哺乳动物遗传物质的条件下培养5)的克隆，

7)分离步骤6)的表达产物。

在本领域，合适的表达文库的制备方法是公知的。表达文库是确定的一组原核或真核细胞或生物，和感染所述细胞或生物的病毒，其被利用遗传工程而加以改变而表达异源蛋白质序列例如抗体。例如，几本公开出版物中描述了人抗体文库的构建和通过噬菌体展示技术对反应性抗体试剂筛选，和重组人抗体和抗体片段的表达[McCafferty等，Nature(1990)，348：552；Griffiths等，EMBO J.(1994)13：3245；Marks等，J.Mol.Biol.(1991)222：581；de Boer等，Hum.Antibod.Hybridomas(1994)5，57-64；Vaughan等，Nature Biotech.(1996)14：309；和de Haard等，J.Biol.Chem.(1999)274：18218]。“哺乳动物遗传物质”在这里理解是与哺乳动物DNA或RNA序列的序列同源性至少60％，优选至少80％，最优选95-100％的至少50个，优选至少100个核苷酸的序列段。因此，所述材料可以是例如合成来源的及从天然来源得到的。

通过使感兴趣的即包括根据本发明上述方法鉴定的胞外域的肽与表达文库接触，实现肽与其表面上表达抗体试剂的文库中的特异克隆结合。因此，肽可以与固相结合或者优选与可选择部分例如生物素部分提供，使得通过利用例如链霉抗生物素蛋白树脂或链霉抗生物素蛋白-磁珠从文库中分离与肽结合的克隆。但是，也可以使用本领域公知的用于从文库中分离克隆的任何合适的技术(Steenbakkers等，HumanAntibodies and Hybridomas4(1993)：166-173；Sawyer等，J.Immunol.Meth.204(1997)193-203；Hoogenboom HR，Tibtech15(1997)62-70；de Haard等，Clin Diagn Lab Immunol.1998年9月；5(5)636-44)；Hanes和Pluchthun，Curr Top MicrobiolImmunol.243(1999)：107-22；Hoogenboom和Chames，Immunol.Today21(2000)371-378)。优选地，对这样分离的克隆检查与衍生肽的蛋白质的结合能力，和/或与EBV-转化的细胞的细胞外表面的结合能力，如上所述。可能需要重复肽-结合和筛选循环来实现具有期望的肽-结合活性的克隆家族的富集。Hoogenboom等，Adv.DrugDeliv.Rev.31(1998)5-31。

在具体的实施方案中，如上所述，肽以受限形式存在。

通过本领域公知的技术能制备单一克隆。因此有吸引力的技术是通过限制稀释克隆：筛选结合克隆(群体)之后，通过对宿主细胞的限制稀释培养能在群体中筛选各克隆，可以分离表达单一抗体的群体。在它们与EBV-转化的细胞上呈递的(受限)肽或者完整蛋白质表位代表的LMP1，LMP2和BARF1的胞外域结合时可以对这样的各个克隆评价它们的表位结合特性。本领域技术人员知道合适的克隆分离技术。

可以在表达哺乳动物遗传物质即编码特异抗体基因的条件下培养这样制备的克隆。所述培养条件是本领域公知的。[参见，例如：Bothman和Pluchthun，Nature Biotech.16(1998)376-380；Shusta等，NatureBiotech.16(1998)773-777；Liang等，J.Immunol.Meth.247(2001)119-130]。通过分离的克隆的表达产物的分离能获得抗体试剂，如果期望，根据本领域公知的方法进一步纯化[参见，例如，CurrentProtocols in Immunology(编者J.E.Coligan等，PUBL.J.Wiley &Sons.1992-2001)]。

优选地，上述方法中使用的表达文库是包含至少10⁹，优选至少10¹²，最优选大约10¹⁵种不同克隆的高多样性文库。本领域可获得合适的高多样性文库；例如Vaughan等Nature Biotech.14(1996)309-314描述的单链抗体噬菌体文库或者de Haard等，J.Biol.Chem.274(1999)18218-18230描述的人Fab片段。

通过使用利用高多样性表达文库(参见例如Hoogenboom和Chames，Immunol.Today(2000)，21卷8期，371-378页综述)制备的多克隆和单克隆抗体，能证明LMP1，LMP2和BARF1包括用于抗体试剂的EBV转化细胞的细胞表面暴露的和可使用的胞外结构域，因此可能是特异治疗方法的一个靶物(参见实施例3)。如实施例3所述，第一次筛选实验使用有限多样性抗体文库，主要得到与筛选肽常见的s-s受限接头结构反应的噬菌体克隆，不能筛选对单一选择的LMP1，LMP2或BARF1肽结构有有限反应性的特异克隆。

在根据本发明的单克隆抗体试剂制备的非常吸引人的实施方案中，肽是存活的EBV转化细胞外表面上表达的表位。因此，代替分离的肽，可以使用根据本发明鉴定的在它们的外表面表达一个或多个表位的存活的EBV转化细胞。因此，本发明涉及能结合在EBV-转化的哺乳动物细胞的细胞外表面上表达的埃-巴二氏病毒(EBV)编码的膜蛋白的胞外表位的单克隆抗体试剂的制备方法，包括步骤：

1)提供包括哺乳动物遗传物质的表达文库，

2)使根据本发明鉴定的在它们表面表达一个或多个肽表位的存活的EBV转化的细胞接触所述文库，

3)使细胞与所述文库的生物体特异性结合，

4)分离细胞与之特异性结合的生物体，

5)制备分离的生物体的单一克隆，

6)在表达哺乳动物遗传物质的条件下培养5)的克隆，

7)分离步骤6)的表达产物。

在该方法中，抗体噬菌体文库与存活的EBV转化B细胞接触。结合的噬菌体被洗脱出，并且能进一步筛选与对照EBV阴性B-细胞的无反应。令人吃惊的是，这样的噬菌体能与受限肽反应，而且还能较小程度与线性肽反应。从这些选择的克隆中的一些获得的可溶性Fab的免疫印迹分析表明与变性全长蛋白质的可检测免疫反应信号。实施例4详述该方法。

另一方面，本发明涉及包含至少10⁹，优选至少10¹²，最优选大约10¹⁵不同克隆的高多样性文库用于制备能结合于EBV--转化哺乳动物细胞的细胞外表面上表达的埃-巴二氏病毒(EBV)编码的膜蛋白的胞外表位的单克隆抗体试剂的应用。令人吃惊的是，使用例如上文Haard等(1999)或de Boer等(1994)描述的扩大多样性的人Fab噬菌体文库，获得与各个选择的肽反应的多个噬菌体克隆，或者是受限形式或者是线性形式，并且也与包含选择表位的完整蛋白质反应(参见实施例3)。

本发明还提供根据本发明任何上述方法可获得的，能与EBV-转化的哺乳动物细胞的细胞表面上表达的埃-巴二氏病毒(EBV)编码的膜蛋白的胞外表位结合的抗体试剂。

本发明还涉及能与选自SEQ ID No.1-13的氨基酸序列，与和SEQID No.1-13的氨基酸序列之一有至少80％优选90％更优选95％或者更多同源性的氨基酸序列特异结合的抗体试剂。因此，本发明还涉及与具有本发明的SEQ ID No.1-13的任何肽的变体，同系物或衍生物特异性结合的抗体试剂，并且涉及编码所述肽的核苷酸序列的变体，同系物或衍生物。

与本发明的氨基酸序列相关的术语″变体″或″衍生物″包括对序列的一个(或多个)氨基酸的取代，改变，修饰，置换，缺失或添加，条件是根据本发明的抗体试剂能特异性结合得到的氨基酸序列，优选至少具有和序列表中列出的多肽相同的结合特异性。本发明包括这样的变体和衍生物。

已经证明抗细胞膜中蛋白质的胞外域但是显然从细胞表面排除的抗体试剂与靶细胞表面结合并且介导多种生物学性质(Glennie MJ和Johnson PWM.Immunol.Today(2000)21；403-410)。

结合时，这样的抗体试剂可以诱导膜蛋白从细胞表面的聚集和内化或释放。或者，与细胞表面结合的抗体试剂可以结合并激活补体级联的成分，引起靶细胞溶解。类似地，细胞表面结合的抗体试剂可以结合″杀伤″-淋巴细胞上的Fc-受体并且接着激活导致靶细胞溶解的杀伤过程。此外，带有毒素分子，放射性物质或者生物学应答修饰剂的抗体试剂可以对靶细胞引入特异改变。另外，可以在细胞毒性T-细胞和″杀伤″细胞的细胞表面分子中掺入抗体试剂，从而再次使这样的细胞毒性杀伤细胞针对靶细胞。最后，在用于诊断目的的靶细胞检测和观测中可以使用带有放射性标记或者其它示踪剂分子的抗体试剂。

根据本发明的抗体试剂特别适合结合循环中的，人体内(肿瘤)组织中的和其它体外和体内可能含有EBV-感染细胞的生物学样品中的EBV+(肿瘤)细胞。

根据本发明的抗体试剂特别适合检测外周血中的，人(肿瘤)组织样品中的和其薄切片中的阳性(EBV+)肿瘤细胞，用于使基因治疗载体，″杀伤″淋巴细胞，放射性标记物，毒素和另外的生物学修饰剂定向于患者体内的和可能含有EBV-感染的(肿瘤)细胞的生物学样品中的EBV+肿瘤细胞。

术语“抗体试剂”上面定义过。根据本发明，抗体还可以包括突变，例如缺失，添加和取代突变，只要这样的突变的抗体试剂仍然能特异性结合上面提到的氨基酸序列之一。抗体试剂能被用于体内和体外结合EBV感染的细胞。

因此，本发明能鉴定作为触发体液免疫应答的表位的EBV-编码的膜蛋白LMP1，LMP2和BARF1的胞外域，并且能制备包括所述结构域的肽和抗所述胞外域的抗体试剂。

本发明在下面这方面涉及能被根据本发明鉴定的抗体试剂结合的分离的肽。通过定义，这样的肽包括至少一个与所述抗体试剂相互作用的表位，优选地，所述肽选自：

SEQ ID 1    (LMP1，胞外环1)，

SEQ ID 2    (LMP1，胞外环2)，

SEQ ID 3    (LMP1，胞外环3)，

SEQ ID 4    (LMP2，胞外环1)，

SEQ ID 5    (LMP2，胞外环2)，

SEQ ID 6    (LMP2，胞外环3)，

SEQ ID 7    (LMP2，胞外环4)，

SEQ ID 8    (LMP2，胞外环5)，

SEQ ID 9    (LMP2，胞外环6)，

SEQ ID 10   (BARF1，SEQ40-79)，

SEQ ID 11   (BARF1，SEQ80-154)，

SEQ ID 12   (BARF1，SEQ155-188)和

SEQ ID 13   (BARF1，SEQ188-221)。

根据本发明的这些肽分别构成LMP1，LMP2和BARF1的胞外域，这在实施例1中证明。上述LMP1，LMP2和BARF1的氨基酸序列的编号和SWISS PROT或GENBANK DATABASE中使用的编号一样。

在优选的实施方案中，本发明涉及包括选自SEQ ID No.1-13的氨基酸序列的分离的肽或蛋白质，不是全长LMP1，LMP2或BARF1序列，也不是与之同源性90％或更多。这意味着SEQ ID No.1-13中的任一个编码的氨基酸序列可以被例如掺入在非天然环境中，例如氨基酸序列侧翼，没有或只有部分存在于天然LMP1，LMP2或BARF1中所述序列的侧翼。例如，本发明包括其中存在LMP1，LMP2或BARF1的胞外域的任一个的杂合蛋白质。这样的杂合蛋白质可以被用作例如载体蛋白质，其能被用作主动免疫接种和免疫治疗的免疫原(参见例如实施例2)。考虑到LMP1，LMP2和BARF1和它们衍生的亚分子肽结构域在人宿主EBV-感染中天然的几乎没有免疫原性(参见例如Meij等，上文)，使LMP1，LMP2和/或BARF1序列与载体序列偶联是特异性免疫接种并且对免疫系统呈递LMP1，LMP2和BARF1序列的有效工具，并且会刺激并改善对LMP1，LMP2和BARF1的特异免疫应答。使低内源免疫原性的蛋白质，其片段或确定的肽序列与载体蛋白质例如匙孔血蓝蛋白，破伤风类毒素偶联和/或与用于改进它们的免疫原性的佐剂例如弗氏佐剂，BCG或Alum(等)混合的方法是本领域公知的。

优选地，本发明的肽或蛋白质包括少于100个氨基酸。

优选地，本发明的肽或蛋白质分子包括具有比LMP1，LMP2和BARF1蛋白质的全长氨基酸序列少的氨基酸的序列，但是分别包含SEQ IDNo.1-3，4-9和10-13之一或多个。特别是对于LMP1，优选缺失第一跨膜螺旋中存在的免疫抑制结构域LALLFWL的序列(Dukers等，J.Immunol.(2000)165；663-670)。

本发明还涉及包括与SEQ ID No.1-13的任何氨基酸序列有至少80％，优选至少90％，最优选至少95％同源性的，但不是全长LMP1，LMP2或BARF1序列，也不是与之具有90％或更高同源性的氨基酸序列的肽或蛋白质。这样的同源肽或蛋白质编码本发明氨基酸序列的变体或衍生物。

应该可以理解，本发明中使用的氨基酸序列还包括从任何来源获得的同源序列，例如相关的病毒/细菌蛋白质，细胞同源物和合成肽，以及其变体或衍生物。

在本发明中，考虑同源序列包括与这里的序列表中给出的氨基酸序列之一在至少5个，优选8个，更优选10个氨基酸的氨基酸水平上有至少80％，优选90％，最优选95％或98％同一性的氨基酸序列。虽然也可以以相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)考虑同源性，但是在本发明中，优选以序列同一性表达同源性。

用眼能进行同源性比较，或者更通常情况下，借助容易获得的序列比较程序。这些商业上可获得的计算机程序能计算两个或多个序列之间的百分同源性。

可以对连续序列计算百分同源性，即一个序列与另一个序列比对，并且一个序列中的氨基酸直接与另一个序列中的相应的氨基酸比较，一次比较一个残基。这称作“没有空位的”比对。典型地，只对相对少数目的残基进行这样的没有空位的比对(例如少于50个连续氨基酸)。

虽然这是非常简单而一致的方法，但是它不能考虑到例如本来应当相同的一对序列，一处插入或缺失会引起下面的氨基酸残基不在比对之内，因此当进行综合比对时可能导致百分同源性大大降低。结果，设计的大多数序列比较方法产生最佳比对，考虑到可能的插入和缺失，没有罚分不适当总同源性评分。通过在序列比对中插入“空位”尝试将局部同源性最大化来实现。

但是，这些更复杂的方法对比对中存在的每一个空位分配“空位罚分”，这样，对于相同数目的相同氨基酸，具有尽可能少的空位的序列比对-反映两个相比较序列之间的较高相关性-达到比具有很多空位的那些更高的评分。一般使用“有密切关系空位值”，它对空位的存在罚去相对高的值，对空位中每一个下面的残基罚去较小的分。这是最常使用的空位评分体系。高空位罚分当然产生优化的与较少空位的比对。大多数比对程序使得空位罚分被修饰。但是，当使用这样的软件用于序列比较时优选使用默认值。例如，当使用GCG WisconsinBestfit软件包(上文)时，对于氨基酸序列的默认空位罚分对于一个空位是-12，对于每一个延伸是-4。

因此最大百分同源性的计算首先要求产生最佳比对，考虑到空位罚分。进行这样的比对的合适的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit软件包，上文。能进行序列比较的其它软件的例子包括但不限于，BLAST软件包(参见http：//www.ncbi.nih.gov/BLAST/)，FASTA(Atschul等，1990，J.Mol.Biol.，403-410；例如在FASTA可实现 http：//www.2.ebi.ac.uk.fasta3在线检索)和比较工具程序组GENEWORKS。但是优选使用GCG Bestfit程序。

虽然能以同一性形式测量最后的同源性百分比，但是比对过程本身一般不以全-或无对比较为基础。取而代之的是，一般使用带比例的相似性评分矩阵，它以化学相似性或进化距离为基础对各对比较评分。通常使用的这样一种矩阵的例子是BLOSUM62矩阵-BLAST程序组的默认矩阵。GCG Wisconsin程序一般使用公共默认值或者自定义符号比较表，如果提供的话(详情参见使用者手册)。对GCG软件包优选使用公共默认值，或者在其它软件情况下，使用默认矩阵，例如BLOSUM62。

一旦软件产生一个最佳比对，就可能计算同源性％，优选序列同一性％。作为序列比较的部分，软件一般做这项工作，并且产生数字结果。

可以修饰LMP1，LMP2或BARF1的胞外域上的氨基酸序列用于本发明。一般情况下，进行保持序列结合特异性的修饰作用。可以进行氨基酸取代，例如1，2或3至10个取代，前提是被修饰序列保留与根据本发明的抗体试剂的结合特异性。氨基酸取代作用可以包括使用非天然存在的类似物，例如具有保守特征的类似物(见下表)，或D-氨基酸，或者侧链修饰的氨基酸，合成修饰的氨基酸，例如提高治疗性施用的多肽的血浆半寿期。

例如可以根据下表进行保守取代。第二栏中相同格中的氨基酸，优选第三栏中同排中的氨基酸可以彼此取代：

脂肪族	没有极性	GAP
			ILV
		极性-不带电荷		CSTM
	NQ
			极性-电荷	DE
	KR
		芳香族			HFWY

一般通过重组方法制备本发明中使用的肽，例如如上文Maniatis等所述。但是，也可以利用技术人员公知的技术例如固相合成法的合成法进行制备。本发明的肽还可以制成融合蛋白，例如有助于提取和纯化。融合蛋白配偶体的例子包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，6xHis，GAL4(DNA结合和/或转录激活结构域)和β-半乳糖苷酶。还可以方便地包括使得去除融合蛋白序列的融合蛋白配偶体和感兴趣的肽序列之间的蛋白水解酶切位点。优选地，融合蛋白不防碍感兴趣序列的肽的结合特异性。

本发明的肽和抗体试剂可以是基本上分离的形式。要明白肽/抗体试剂可以与不干扰它想要的目的的载体或稀释剂混合，而且认为是基本上分离的。本发明的肽或抗体试剂还可以是基本上纯的形式，在这种情况下，制剂中一般包括所述肽或抗体试剂，其中制剂中90％以上，例如95％，98％或99％是本发明的肽或抗体试剂。

本发明还涉及纯化的核酸序列，包括编码选自SEQ ID nos.1-13的氨基酸序列，不编码全长LMP1，LMP2或BARF1序列，并且与之同源性不是90％或更高的核酸序列。

当已知氨基酸序列时，技术人员能容易制备这样的核酸序列。为了体内和体外制备抗体试剂，核酸能够被用来容易体内和体外制备LMP1，LMP2和BARF1的胞外域的氨基酸序列。

本发明的多核苷酸包括编码本发明序列的核酸序列。技术人员明白由于遗传密码简并性的结果，各种不同的多核苷酸能编码相同的多肽。另外，要明白技术人员可以利用常规技术进行核苷酸取代作用，这种取代作用不影响本发明多核苷酸编码的肽序列，反映了任何特定宿主生物体中密码子应用，在所述生物体中表达本发明的肽。

本发明的多核苷酸包括DNA或RNA，优选DNA。它们可以是单链或双链的。它们也可以是其中包括合成的或修饰的核苷酸的多核苷酸。本领域已知很多不同类型对寡核苷酸的修饰作用。这，些包括磷酸甲酯和硫代磷酸酯主链，在分子的3′和/或5′端加吖啶或多赖氨酸链。对于本发明的目的，要明白可以用本领域可获得的任何方法修饰这里描述的多核苷酸。为了提高本发明多核苷酸的体内活性或存活时间，可以进行这样的修饰作用。

根据本发明的核苷酸序列还包括其变体，同系物和衍生物；这些定义为与编码具有SEQ ID nos.1-13的肽或者编码与之至少80％，优选90％，最优选95％同源的其变体或衍生肽的任何一个的核酸序列至少80％，优选至少90％，最优选至少95％同源的核酸序列。

与本发明的核苷酸序列相关的术语″变体″，“同系物”或″衍生物″包括对序列的一个(或多个)核酸的取代，改变，修饰，置换，缺失或添加，条件是得到的核苷酸序列编码根据本发明的抗体试剂能与之特异性结合的肽，优选和序列表中列出的序列一样至少具有相同的与所述抗体试剂的结合特异性。本发明包括这样的变体和衍生物。

在本发明的多核苷酸是双链的情况下，本发明包括双螺旋的两条链，或者是单独的或者是组合的。在多核苷酸是单链的情况下，要明白这个多核苷酸的互补序列也包括在本发明的范围内。

优选地，本发明的核酸序列(多核苷酸)被插入到重组的可复制的载体中。

术语′载体′是本领域公知的。载体可以用来在相容宿主细胞中复制核酸。因此，在另一个实施方案中，本发明通过将本发明的多核苷酸导入可复制载体，将载体导入相容宿主细胞，并且在载体复制的条件下培养宿主细胞，提供了制备本发明的多核苷酸的方法。可以从宿主细胞回收载体。合适的宿主细胞包括细菌，例如大肠杆菌，酵母，哺乳动物细胞系和其它真核细胞系，例如CHO细胞。

优选地，本发明的多核苷酸在载体中与调控序列可操作性连接，所述调控序列能提供宿主细胞表达编码序列，即载体是表达载体。术语″可操作性连接″意思是描述的成分处于允许它们以它们想要的方式发挥功能的关系中。以这样一种方式连接与编码序列″可操作性连接″的调控序列，使得在与调控序列相容的条件下实现编码序列的表达。

例如通过添加另外的转录调节元件使得调控序列指导的转录水平更加响应转录调控剂，可以来修饰调控序列。

如下所述，本发明的载体可以被转化或转染到合适的宿主细胞中，提供本发明蛋白质的表达。该方法包括在提供编码蛋白质编码序列的载体表达的条件下培养用如上所述表达载体转化的宿主细胞，并且任选地回收表达的蛋白质。

载体可以是例如提供了复制起点，任选的所述多核苷酸表达的启动子和任选的启动子的调节物的质粒或病毒载体。载体可以包含一个或多个可选择标记基因，例如细菌质粒情况下的氨苄青霉素抗性基因或者对于哺乳动物载体的新霉素抗性基因。可以使用载体例如来转化宿主细胞。

与编码本发明蛋白质的序列可操作性连接的调控序列包括启动子/增强子和其他表达调控信号。可以选择这些调控序列使之与设计在其中使用表达载体的宿主细胞相容。术于启动子是本领域公知的并且包括大小和复杂程度覆盖最小启动子至包括上游元件和增强子的启动子的核酸区。

一般从在哺乳动物细胞中发挥功能的启动子中选择启动子，但是可以使用原核启动子和在其他真核细胞中发挥功能的启动子。启动子一般来自病毒或真核生物基因的启动子序列。例如，它可以是来自其中发生表达的细胞的基因组。关于真核细胞启动子，它们可以是以普遍存在的方式发挥功能的启动子(例如a-肌动蛋白，b-肌动蛋白，微管蛋白的启动子)或者，是组织特异性方式(例如丙酮酸激酶基因的启动子)。特别优选的是对上皮细胞特异性的组织特异性启动子，例如人角蛋白启动子序列，其特异性调节和诱导正在分化的上皮细胞中不同角蛋白亚种的表达(Caldwell等，J.Virol.(2000)74；1101-1113)，和对淋巴样细胞特别是B-淋巴细胞特异性的启动子，例如免疫球蛋白重链(例如Eμ)启动子序列，它特异性调节和诱导正在分化的B-淋巴细胞中免疫球蛋白重链的表达(Longan和Longecker J.Gen.Virol.(2000)81；2245-2252)。它们也是响应特异性刺激的启动子，例如结合类固醇激素受体的启动子。也可以使用病毒启动子，例如Moloney鼠白血病病毒长末端重复(MMLV LTR)启动子，劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子或人巨细胞病毒(CMV)IE启动子。

可以诱导启动子使得在细胞寿命期间能调节异源基因的表达水平也是有利的。可诱导意思是能调节使用启动子获得的表达水平。

另外，通过加上其他调节序列例如增强子序列，可以修饰这些启动子中的任一个。也可以使用包括上述两个或多个不同的启动子的序列元件的嵌合启动子。

使用根据本发明的载体，能将编码上述胞外域之一的核酸序列带进原核或真核来源的生物宿主细胞。所述核酸序列可以被插入宿主的基因组，或者以染色体外元件存在。

为了复制载体/多核苷酸和/或表达本发明的多核苷酸编码的本发明的肽的目的，本发明的载体和多核苷酸可以被导入宿主细胞。虽然可以使用原核细胞作为宿主细胞产生本发明的肽，但是优选使用真核细胞，例如酵母，昆虫或哺乳动物细胞，特别是哺乳动物尤其是人细胞。

应用本领域公知的各种技术，例如转染，转化和电穿孔，可以将本发明的载体/多核苷酸导入合适的宿主细胞中。对动物施用本发明的载体/多核苷酸情况下，几种技术是本领域公知的，例如用重组病毒载体例如逆转录病毒，单纯疱疹病毒和腺病毒转染，直接注射核酸和生物转化。这样一种宿主细胞可以表达编码LMP1，LMP2或BARF1的胞外域，或者其部分的氨基酸序列，产生足够量的包括所述结构域的所述结构域或蛋白质/肽，例如用于制备用于接种和免疫治疗的免疫原，或者用于制备根据本发明的抗体试剂(见下文)。例如参见Gurunathan等，Ann.rev.Immunol.(2000)18；927-974。

可以在使表达本发明的肽的合适的条件下培养宿主细胞。本发明的肽的表达可以是组成型的，使得它们能连续产生，或者可诱导，要求刺激物引发表达。在可诱导表达情况下，当要求例如对培养基加入诱导剂物质，例如地塞米松或IPTG时能引发蛋白质产生。

通过各种各样的本领域公知的技术能从宿主细胞提取本发明的肽，包括酶促，化学和/或渗透溶胞作用和物理破碎。

此外，本发明涉及用根据本发明的载体转化的细胞，优选哺乳动物细胞，更优选人细胞。术语′转化′指将外来遗传物质带给宿主细胞的任何方法。使用原核宿主细胞，本领域一般使用术语′转化′。但是，该术语还包括′转染′，将外来遗传物质带给真核特别是哺乳动物细胞时，一般使用该术语。几种已知的转染技术例如包括使用转染试剂的那些，可增强哺乳动物细胞对裸核酸构建体的摄入。这些试剂的例子包括阳离子试剂(例如磷酸钙和DEAE-葡聚糖)和脂质转染剂(例如lipofectam^TM和transfectam^TM)。典型地，核酸构建体与转染试剂混合产生组合物。然而，应该理解，术语“转化”和“转染”也指用病毒，如EBV感染(哺乳动物)细胞的过程。

在特别的实施方案中，本发明涉及导向于表达LMP1，LMP2或BARF1的细胞的导向细胞的制备方法，包括步骤：

-用根据本发明的抗体试剂的遗传信息转染细胞；

-在所述导向细胞表面表达所述抗体试剂。

这样的导向细胞能结合表达LMP1，LMP2和/或BARF1的细胞。靶细胞例如能来自原代T-，NK(天然杀伤)-淋巴细胞(携带Fc-受体的杀伤细胞或巨噬细胞)，以提高或修饰它们的靶细胞结合特异性，而不丧失特异受体传递信号功能。通过将来自抗体试剂的遗传信息掺入所述细胞中，翻译，并且将翻译产物掺入细胞表面结构中，这样被修饰的T-/NK-细胞可能能改善识别，结合和特异消除原本弱识别的和没有识别的肿瘤细胞(例子：R.J.Bolhuis和J.W.Gratama，GeneTherapy(1998)5：1153，Willemsen等，Gene Therapy(2000)7：1369；Calogero等，J.Immunotherapy(2000)23：393)。

与表达LMP1，LMP2和/或BARF1的EBV感染细胞结合时，导向细胞通过触发例如其特异溶解EBV感染细胞的溶胞作用级联而灭活受感染细胞。

在另一个有吸引力的实施方案中，本发明涉及导向于表达LMP1，LMP2或BARF1的细胞的导向病毒颗粒的制备方法，包括步骤：

-将根据权利要求1的抗体试剂的遗传信息克隆到病毒基因组中

-在所述病毒颗粒的病毒外壳上表达所述抗体。

使用抗体试剂在遗传学上影响或改变当前用于基因治疗途径的病毒的受体结合特征，它提供了具有改进的与定义的靶细胞的被动穿透结合的特异性的这样的病毒，从而改善它们的治疗特异性和效力(参见，例如：Dimitriev等，J.Virol.(2000)74：6875)。

在上述根据本发明的病毒系统中，病毒颗粒能结合在它们的细胞表面上表达LMP1，LMP2或BARF1的EBV感染细胞。这样的病毒颗粒可以遗传工程产生，它包括病毒颗粒结合和穿透EBV感染细胞时表达的毒素或任何其它生物活性分子的遗传信息，导致LMP1，LMP2或BARF1表达细胞的特异感染。

因为抗体试剂特异结合EBV+肿瘤细胞，所以这样一种试剂特别用作对携带EBV阳性肿瘤患者的诊断或治疗剂。抗体试剂可以连接放射性标记(I^131/125，锝，ea.)，毒素(蓖麻毒A，白喉毒素，ea.)，药物前体或者事实上任何生物反应修饰剂(IL-12，IP9，ea.)，从而介导改进的标记物向靶细胞的递送。这可以导致肿瘤细胞小病灶特异性增强的诊断可见性(例如当使用放射性标记时)或者消除靶细胞(例如当使用放射性标记或毒素时)或者吸引并激活免疫细胞或旁观细胞接近靶细胞(例如当使用淋巴因子时)。(例子：M.J.Glennie和P.W.M.Johnson，Immunol.Today(2000)21：403，Van Spriel等，Immunol.Today(2000)21：391；P.J.Hudson，Curr.Opinion Immunol.(1999)11：548)；Helfrich等，J.Immunol.Meth.(2000)237：131)。

根据本发明的肽，多核苷酸和抗体试剂能有利地特别在EBV感染治疗的药物中使用。根据本发明的肽能被用作药物例如疫苗中的免疫原，即作为EBV感染治疗的活性成分。对受试者施用这样一种药物时，所述受试者的免疫系统会产生抗这种肽的抗体，这种抗体也与EBV+细胞反应，所述细胞在它们的表面上表达包括所述肽序列的蛋白质。因此，能在药物中使用根据本发明的多核苷酸，特别用于治疗EBV-感染。对受试者施用时，能将多核苷酸转录和/或翻译成根据本发明的肽，其如上所述提供免疫原。还有，能在药物中使用根据本发明的抗体试剂，特别用于治疗EBV-感染。在那种情况下，抗体试剂优选偶联毒素或者其它生物修饰剂。对EBV-感染患者施用抗体试剂时，所述毒素或者修饰剂能以特定方式与个体的EBV+细胞(即EBV+肿瘤细胞)偶联，导致基本上只特异消除EBV+细胞。

本发明的肽，核酸序列和抗体试剂优选可以与各种不同的成分混合，制备本发明的药物组合物或诊断组合物或者药物。优选地，组合物与药学可接受载体或稀释剂联合，制备药物组合物(其可以人用或动物用)。合适的载体和稀释剂包括等渗盐溶液，例如磷酸盐缓冲盐水。本发明的组合物可以直接注射施用。可以配制组合物，用于肠胃外，肌内，静脉内，皮下，眼内或经皮施用。一般情况下，可以以0.01至30mg/kg体重的剂量，优选0.1至10mg/kg，更优选0.1至1mg/kg体重的剂量施用每一种抗体试剂。例如，在本领域，以375mg/m²体表面使用抗-CD20 rituximab，这等于大约10mg/kg体重(Yang等，Blood 96(2000)，4055-4063)和以1mg/kg使用抗-CD25 Daclizumab(Vicenti等，New Engl.J.Med.338(1998)，161-165)。

可以以裸核酸构建体，优选进一步包括与宿主细胞基因组同源的侧翼序列，直接施用编码根据本发明的肽的多核苷酸/载体。当作为裸核酸施用多核苷酸/载体时，施用的核酸的量一般是1微克至10毫克，优选100微克至1毫克。

优选地，本发明的多核苷酸或载体与药学可接受载体或稀释剂联合，制备药物组合物。合适的载体和稀释剂包括等渗盐溶液，例如磷酸盐缓冲盐水。可以配制组合物，用于肠胃外，肌内，静脉内，皮下，眼内或经皮施用。组合物或药物中也可以掺入转染试剂，例如上面讨论的阳离子试剂。

描述的给药途径和剂量只是为了作为指导，因为技术人员能容易确定给药的最佳途径和对于任何具体患者和症状的剂量。

特别地，本发明涉及EBV感染细胞，尤其是EBV+恶性细胞和EBV介导的疾病的诊断方法，包括步骤：

-从怀疑携带所述疾病感染的细胞的个体取细胞样品；

-使抗体试剂接触所述细胞；

-使抗体试剂与所述细胞反应，形成与EBV感染的细胞结合的抗体试剂复合体；

-检测所述复合体的存在。

样品包括体液，例如血液和分离的血白细胞制剂，腹水，脑脊髓液或胸膜液抽出物，其可以含有潜在的EBV-携带肿瘤细胞或者组织活组织检查标本或者从中获得的细胞。有利地，在分析步骤之前去除没有结合的抗体，例如通过一次或多次洗涤步骤。根据本领域公知的技术进行是否存在复合体的分析，通过，例如应用公知的免疫荧光或免疫-酶染色技术，通过例如将染色的细胞旋转放到载玻片上并且通过荧光显微镜分析它们，或者通过应用FACS-技术分析悬浮液中的染色细胞，或者通过原位应用免疫组织化学染色技术。

例如，通过患有各种EBV-相关癌症和/或急性原发EBV-感染患者固定的和渗透化处理的肿瘤组织切片中间接抗-LMP1抗体染色，可以原位观察血液中EBV+-肿瘤细胞或循环的EBV-感染细胞。或者，利用FACS-分析，可以使用抗体试剂直接目测活细胞(参见，例如Jiwa等，J.Clin.Pathol.(1995)48：438；Wagner等，Clin.Diagn.Lab.Immunol.(1995)2：696；Herzenberg等，Immunol.Today(2000)21；386)。

在另一个实施方案中，本发明涉及特异性消除来自体内的细胞表面上表达LMP1，LMP2或BARF1或者其部分的细胞的方法，包括步骤：

-从个体分离一定数目的细胞

-使分离的细胞接触根据本发明的抗体试剂

-负选择其细胞表面上表达LMP1，LMP2，或BARF1的细胞，其中其细胞表面上不表达LMP1，LMP2，或BARF1的细胞存活。用这种方法，不表达EBV特异细胞表面蛋白质的分离的细胞存活，并且从任何存在的EBV-阳性(肿瘤)细胞中′清除′。当要将存活细胞再移植给个体时，该方法是特别重要的。

负选择细胞的方法是本领域公知的；抗体试剂可以例如与例如磁珠偶联，一种溶胞功能，即介导与指导杀伤细胞到细胞表面的抗体试剂结合的细胞表面的补体沉积的功能。技术人员知道多种负选择的其它方法，根据本发明的靶细胞的体外温育也可以认为是接触和选择步骤的组合。将细胞进行溶胞作用是负选择的优选途径。

上述方法可以被用于肿瘤细胞清除，并且当从个体分离骨髓细胞时是特别有用的，所述分离的骨髓细胞要在个体接受放疗或化疗之后再次移植给所述个体。根据本发明，通过与纯化的抗体试剂温育并且接着接触补体或杀伤细胞，导致抗体试剂与它们的表面结合的那些细胞的特异消除，可以在对患者再次输入之前从肿瘤细胞清除骨髓样品(参见，例如Berkahn，J.Hematother，Stem Cell Res.(2000)9：147；Schroder等，Clin.Cancer Res.(2000)6：2521)。

参照下面的附图和实施例将进一步详细说明本发明，实施例不是为了限制本发明范围。

图1是推定的LMPl的结构的示意图；

图2是推定的LMP2的结构的示意图；

图3A-D说明免疫之前和免疫之后(加强)(A，B)兔抗-LMP1环血清(1∶100)的和来自兔血清的纯化的Ab′s(C，D)的LMP1肽-或纯化的LMP1蛋白质-包被的ELISA中测定的抗体反应性；

图3E-F说明分别使用兔抗-LMP2环2和环5血清的类似分析的结果；

图3G-I说明用从BARF1序列衍生的不同的肽免疫免疫的豚鼠血清的反应性；

图4说明用来自用图3中描述的相关肽免疫免疫的动物的不同的血清探测的全长LMP1(A)，LMP2(B)和BARF1-GST蛋白质(C)的免疫印迹；

A1：MoAb OT22CN抗-LMP1 N-末端(AA1-13)A2：R-a-LMP1环3

B1：前血清B2：K153抗-LMP2(SDS-PAGE纯化的LMP2)B3-4 &B5-6：K154 & K155如B1-2

B7：抗-LMP2环5前血清B8：抗-LMP2环5 B9-10：与LMP2环2类似。

C4：前血清C5：GP-抗-BARF1-N-末端C6：前血清C7：GP-抗-BARF1-中部

C8：前血清C9：GP-抗-BARF1-C-末端C10：兔抗-BARF1-GST

图5给出显微镜观察(200x)，说明使用抗-LMP1抗体试剂的丙酮固定的和渗透化的JY-细胞的特征性LMP1-特异染色；

图6给出柱形图，说明用第3轮和4轮(参见实施例3)的不同的LMP1-环-1，-2，-3特异肽选择的各个噬菌体-Ab克隆(每个柱形之下指明的)的肽ELISA的结果；

图7说明使用LMP1-环-1和环-3肽第三轮选择之后获得的各个克隆的DNA指纹分析的结果；

图8说明使用纯化的LMP1作为抗原的ECL-蛋白质印迹分析，分析可溶性人噬菌体产生的Fab′s；1道和2道分别代表阴性对照和阳性对照反应，是用不相关的和抗-LMP1-特异性单克隆抗体获得的。3-13道说明对于一些可溶性噬菌体Fab′s(#3，4，5，6，7，10)，在全长LMP1预期大小处检测到弱的反应带。

图9给出图表，说明在JY-细胞上筛选之后诱导的噬菌体集落的肽-ELISA反应性。

实施例

一般方法参考

虽然一般来说这里提到的技术都是本领域公知的，但是可以特别参考Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(1989)和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(1995)，John Wiley & Sons，Inc.。

实施例1

具有推定的胞外定位的LMP1，LMP2和BARF1衍生的肽的设计

在Genbank或Swiss-Prot数据库中检索LMP1，LMP2和BARF1的氨基酸序列。

目的在于确定和证明天然感染和转化的(肿瘤)细胞中表达的这些蛋白质上胞外域的存在。

因此，作为第一步，我们使用从编码LMP1，LMP2和BARF1蛋白质的DNA来源的氨基酸序列，并且应用GCG蛋白质分析程序(上文)通过疏水性分析确定推定的跨膜结构域的位置。

这项分析表明LMP1包含大约20个氨基酸的亲水性N-末端，接着6个疏水性结构域，形成6个重复的推定的膜内螺旋，它们通过三个短的胞内带电荷的序列连接，和三个推定的胞外域，称作LMP1环-1，-2和-3(图1)，然后接着是亲水性C-末端，含氨基酸186-386。

包含被暗示6个膜交叉的12个推定的跨膜结构域膜隔开的亲水性N-和C-末端序列并且带有6个胞外域的LMP2被称作LMP2环1-6(图2)。

对BARF1基因的分析揭示一个具有潜在的信号序列的短的N-末端结构域，接着是一个单一的短的疏水性结构域和一个大的C-末端结构域，它是具有大的和可能的糖基化胞外域的″经典″I-型跨膜蛋白的特征。

对于可能模拟胞外LMP1和LMP2环的肽的选择和合成，有下面两个策略：

1.对于LMP1根据Seq.ID1-3，对于LMP2根据Seq.ID 4-9，制备线性肽，包括相应于各个环，每一侧带有推定形成膜固定α-螺旋的起点的两个疏水性氨基酸的推定的胞外氨基酸的全部。

2.利用上面定义的线性肽的序列制备结构受限环肽，但是每一侧带有另外的半胱氨酸残基侧链，其在合成之后被氧化形成共价S-S键，由此强制肽形成环结构。

进一步合成各种肽，在N-末端有和没有另外的1-3个赖氨酸残基序列段，以有利于使用戊二醛与载体蛋白质共价偶联，或者有利于有或没有有利于肽与固定化链霉抗生物素蛋白的偶联的可裂解接头的生物素残基的共价偶联。

图1和2中分别图示说明了LMP1的环-3和LMP2的环5的合成策略的例子。

对于BARF1特异肽合成，序列选自在至少一个脯氨酸残基上插入几个带电荷的氨基酸的Seq.ID10，12和13，其联合增强了选择的序列的表面可能性。

实施例2

通过用设计的推定的胞外域-特异性肽免疫而制备与LMP1，LMP2和BARF1蛋白质的推定的胞外域反应的抗体试剂并且证明EBV-转化细胞系中这些胞外域的存在

没有天然EBV-感染的转化的(肿瘤)细胞的外表面上LMP1，LMP2和BARF1结构域存在和易接近的直接证据。

因此，我们目的首先是发明特异试剂，它会确定这样的结构域并且会证实这些结构域的功能可达性。

方法：

应用fMoc化学使用固相肽合成仪(Applied Biosystems，USA)制备肽。从树脂上酸裂解之后，用二乙基醚反覆洗涤肽并且通过RP-HPLC(Beckman System Gold)纯化。当适当时，通过氧化巯基而使肽环化。最后将肽冷冻干燥并且以1-10mg等份在4℃下贮存。

通过缓慢加热至50℃将纯化的肽溶解于二甲亚砜(DMSO)中，浓度是10mg/ml，并且在用于兔或豚鼠免疫之前在盐水中1∶10稀释。对于每一次免疫，将200微克肽与15微升的2，5％戊二醛和1.2mg纯化的匙孔血蓝蛋白(KLH)或0.5mg破伤风类毒素(TTd)在避光室温下(RT)温育至少1小时(h)。用60微升稳定缓冲液(1M甘氨酸，pH8.0)RT避光反应1小时终止偶联。向1ml最终体积加入PBS并且与等体积弗氏佐剂混合。

该制剂用于皮下注射对动物免疫(表1)。

表1：实施例中使用的动物血清一览表

动物	抗原	使用的序列	佐剂
				K97-31	TTd-LMP1-环1	Seq.ID.1	FCA/FIA
K97-54	KLH-LMP1-环1	Seq.ID.1	FCA/FIA
				K97-55	TTd-LMP1-环3	Seq.ID.3	FCA/FIA
K97-56	KLH-LMP1-环3	Seq.ID.3	FCA/FIA
				K121	LMP1(181-386)-βGal	与β半乳糖苷酶连接的LMP1的胞内结构域	FCA/FIA
K97-47	KLH-LMP2-环2	Seq.ID.5	FCA/FIA
				K97-43	KLH-LMP2-环5	Seq.ID.8	FCA/FIA
Gp-N	KLH-BARF1-AA40-79	Seq.ID.10	FCA/FIA
				Gp-M	KLH-BARF1-AA155-188	Seq.DD.12	FCA/FIA
Gp-C	KLH-BARF1-AA180-221	Seq.GD.13	FCA/FIA

K＝兔，Gp＝豚鼠，N＝N-末端，M＝中部，C＝C-末端，TTd＝破伤风类毒素，KLH＝匙孔血蓝蛋白，FC(I)A＝弗氏(In)完全佐剂

结果：

1.肽免疫动物血清中抗LMP1，LMP2和BARF1的推定的胞外域的多克隆抗体试剂：

从用各种肽第三次免疫接种之后的兔获得前血清和血清(表1)。应用ELISA测试，使用对固相包被的纯化的LMP1蛋白质或LMP1环肽(图3A-D)和通过使用来自EBV+RAJI细胞和EBV-RAMOS细胞的提取物的免疫印迹(图4A)，对血清和来自这些血清的蛋白质A纯化的抗体试剂(Ab′s)检测LMP1-蛋白质和LMP1环-肽特异反应性。这些方法与Meij等J.Infect.Dis.(1999)179：1108-1115描述的类似。

使用肽-ELISA，第三次免疫之后可见清晰的特异性抗体应答，没有见到不同环与各个超免疫血清之间的交叉反应性(图3A-D)。

抗LMP1环1的反应比抗LMP1环3的弱，这可以由这样的事实解释：代表环1的肽比代表环3的肽小。在蛋白质-A琼脂糖凝胶(Pharmacia，Uppsala，Sweden)上纯化Ab′s之后，看到抗这些肽的更高的反应性(图3C-D)。

来自接受免疫的兔的Ab′s还识别来自杆状病毒表达系统的纯化的重组LMP1(Meij等，J.Virol.Meth.(2000)90：193-204)。使用纯化的Ab′s，抗LMP1环1的反应比抗环3的弱，这与使用肽-ELISA发现的类似。

如图4所示，通过蛋白质印迹免疫染色来分析来自完整全长LMP1，LMP2和BARF1肽免疫动物的血清中Ab′ s的反应性。对杆状病毒-SF9昆虫细胞系统中表达的LMP1，LMP2蛋白质(Meij等，1999)和大肠杆菌中表达的GST-BARF1融合蛋白(没有公开数据)的部分纯化提取物组成的印迹施加抗原。

使用纯化的与LMP1环1和3反应的Ab′s的免疫印迹分析显示合适的62kD位置有清晰的泳带(图4A)，从而证明它们与全长蛋白质结合。

类似地，通过用LMP2衍生的环2和环5肽对兔免疫接种来产生LMP2环特异性抗体试剂。得到的血清和其中含有的Ab′s在ELISA和免疫印迹中表明LMP2和LMP2环特异反应性(图3 E-F和4B)。

类似地，通过用代表推定的胞外域的BARF1-衍生的肽对豚鼠免疫接种制备BARF1特异Ab′s(图3G，H，I和4C)。

这些研究结果表明，用LMP1环-1，-2，-3，LMP2环-2，-5和各种BARF1衍生的肽免疫接种得到与各个环-肽以及全长LMP1，LMP2和BARF1蛋白质特异性反应的抗体试剂。

2.固定的JY细胞中或者没有固定的存活JY细胞中LMP1和LMP2的染色

让EBV JY细胞，即B95-8感染和人原代外周血B-细胞转化产生的人B-细胞系生长至对数期，用PBS洗涤并且移至载玻片上，接着用冷的丙酮固定。

为了揭示这些细胞中存在LMP1和LMP2，并且为了证明抗-LMP1和抗-LMP2环Ab′s与EBV+细胞中的天然蛋白质结合，固定的细胞与抗环Ab′s或者与LMP1和LMP2的胞内结构域反应的对照Ab′s的合适的稀释物温育，洗涤，并且通过与HRP偶联的二抗和DAB染色来目测观察结合的抗体。

LMP1染色的例子如图5A所示，它表明LMP1的异源染色特征，已知其在胞内和质膜中聚集。还有，各个细胞的不同染色是特征性的但是还没有人解释。

为了证明用推定的LMP1，LMP2或BARF1的胞外域对动物免疫接种产生的Ab试剂是否确实与存活的EBV-转化肿瘤细胞的外表面反应，并且从而证明这些推定的胞外域的存在和可及性，对存活的EBV+JY和EBV-RAMOS细胞间接进行免疫荧光染色。该方法与Middeldorp等J.Virology(1985)54：240-244所述类似。使JY和Ramos细胞生长至对数期并且在4℃下在Hank′s缓冲液中洗涤并且与抗血清或纯化的在冰冷的Hank′s溶液中合适稀释的Ab′s在融化的冰上温育1小时，用冰冷却的盐水洗涤并且与在Hank′s溶液中稀释的猪-抗-兔-FITC温育并且再次洗涤。利用细胞离心将染色的细胞移旋转至载玻片上，用1∶1的冰冷的没有水的丙酮/甲醇的混合物固定，并且通过荧光显微镜分析。

发现抗LMP1环3的抗体在JY细胞质膜周围清晰的有亮辉的斑片状边缘，并且在RAMOS细胞周围没有反应。对LMP1环1的染色在JY-细胞上相对弱一些(没有给出数据)。可能的是，对于环1的较低强度染色是由于Ab′s抗环1的较低免疫应答或者降低的亲和性。

对于抗-LMP2环2和抗-LMP2环5抗血清获得类似结果。

这些结果第一次证明EBV转化细胞例如JY的表面上LMP1和LMP2衍生的环序列的存在和可及性。

3.应用补体溶胞作用抗-环Ab′s对靶细胞溶胞作用的诱导：

根据Middeldorp等J.Infectious Diseases(1986)153：48-55所述，在标准补体依赖性⁵¹Cr释放试验中使用纯化的抗LMP1环1和3的Ab′s。

JY和Ramos细胞生长至对数期并且在没有血清的新鲜培养基中洗涤。在培养基中以合适的稀释度加入兔抗血清或纯化的Ab′s等份，紧接着是从没有免疫的SPF-兔新鲜获得的血清，以提供补体来源。通过加入1％Triton X-100代替兔补体，由兔抗-β2微球蛋白(DAKO，Denmark)构成正对照，来自所有的被分析兔的免疫前血清构成负对照，来测定最大溶胞作用。

这些实验的结果证明来自接受免疫的动物的血清中抗LMP1环3的Ab′s毫无疑问能介导表达LMP1的JY细胞的溶胞作用。使用抗环3的Ab′s和补体使得RAMOS-细胞不易溶胞。

对于抗环1的Ab′s，结果只是阳性边界，可能与获得的低Ab-滴度有关。

这些结果证明抗-LMP1，LMP2和BARF1环-肽特异性抗体试剂确定和识别细胞表面暴露的来自天然蛋白质的结构域，并且能介导表达这些结构域的细胞的溶胞作用。

总之，这些结果还证明，用LMP1，LMP2(和BARF1)的推定的胞外域的合成的肽特异免疫能诱导抗这些蛋白质细胞表面暴露的区的免疫应答，并且这样的应答能介导暴露这些结构域的细胞的溶胞。

实施例3

通过使用合成的环-结构域特异性肽的噬菌体展示筛选制备与来自人噬菌体抗体文库的LMP1，LMP2或BARF1的推定的胞外结构域反应的人抗体试剂

用Kohler和Milstein的动物免疫和杂交瘤细胞融合技术制备小鼠和/或大鼠单克隆抗体是公知的。但是，该方法不容易产生人单克隆抗体，而人单克隆抗体是优选的用于体内(来自体内)的治疗应用的抗体试剂。因为LMP1，LMP2和BARF1蛋白质在人体内几乎不是免疫原性的(Meij等，1999)，不能向前进行对LMP1，LMP2和BARF1的胞外域特异性的人抗体的产生。

因此，通过利用实施例1和2中描述的新的特异性构建的(现在没有确定的)胞外结构域肽，来在表达在噬菌体表面上展示的作为单链抗体或者作为Fab片段的人抗体全部的噬菌体抗体文库中的特异性人抗体反应性，我们尝试了另一种方法。

只证实了用LMP1-衍生的试剂的选择。

方法：

a.文库构建：

对于这项研究，我们使用了Vaughan等(上文)描述的单链抗体噬菌体文库或者Haard等(上文)描述的人Fab片段文库。所述文库是所谓的表达文库，例如，含有多至10¹⁵种不同的噬菌体(克隆)，每一种含有人基因组的不同片段。

为了筛选LMP1-，LMP2-和BARF1-反应噬菌体，我们使用了和实施例1-2中描述的并且如图1和2所示的类似的肽合成策略。

使用线性或环状受限肽。所有的肽包含生物素部分，其通过可裂解接头与肽的N-末端连接，使得在链霉抗生物素蛋白包被的磁珠上螯合之后表位-选择的肽-结合噬菌体释放。

表2中给出了与该实施例相关的肽。

肽(AA位置)	序列
		LMP1-环1-Lin(41-56)	H2N-KKKC-YIVMSDWTGGALLVLY-C-COOH
LMP1-环2-Lin(94-108)	H2N-KKKC-LIALWNLHGQALFLG-C-COOH
		LMP1-环3-Lin(157-172)	H2N-KKKC-ALYLQQNWWTLLVDLL-C-COOH
LMP1-环1-Bio-SS-NHS	Bio-SS-NHS-KKKC-YIVMSDWTGGALLVLY-C-COOH(*)
		LMP1-环2-Bio-SS-NHS	Bio-SS-NHS-KKKC-LIALWNLHGQALFLG-C-COOH(*)
LMP1-环3-Bio-SS-NHS	Bio-SS-NHS-KKKC-ALYLQQNWWTLLVDLL-C-COOH(*)
		LMP1-Bio-环1-CIR	Bio-KKC-YTVMSDWTGGALLVLY-C-COOH*
LMP1-Bio-环2-CIR	Bio-KKC-LIALWNLGQALFLG-C-COOH*
		LMP1-Bio-环3-CIR	Bio-KKC-ALYLQQNWWTLLVDLL-C-COOH*
粗斜体字＝技术原因加入的AA′s，不包括在天然序列中。*这些肽由C-C基团的共价交联环化

表2：为了噬菌体筛选目的在该项研究中使用LMP1衍生的肽

(B95-8原型LMP1衍生的AA序列)

b.使用合成肽对LMP1环1-3反应噬菌体的筛选，选择，和表征：

对于从随机噬菌体库中选择性淘选LMP1-环肽结合噬菌体，RT下将LMP1环1，2和3的生物素化肽在链霉抗生物素蛋白-磁珠(Dynall，Norway)上固定30分钟。使用3％奶粉(Marvel)和10％ DMSO在PBS中将非特异性结合位点封闭1小时。在这期间还在室温下将噬菌体与3％ Marvel和10％ DMSO在PBS中温育1小时。1小时之后，一起加入噬菌体和链霉抗生物素蛋白-磁珠(有或没有固定化的肽)，并且在室温下温育1小时。接着用PBS将磁珠冲洗10次，并且通过加入50mM DTT水溶液洗脱特异性结合的噬菌体10分钟，减少可裂解的S-S接头。

第三轮和第四轮选择之后，从经选择的噬菌体群中分离46个单独的噬菌体克隆，对其进行筛选，用于制备与相应的肽或全长LMP1蛋白质反应的噬菌体-结合的或可溶性Fab′s(参见实施例2中ELISA和免疫印迹分析方法)。

如McCafferty等(Nature(1990)，348：552)，Griffiths等(EMBOJ.199413：3245)，Marks等(J.Mol.Biol.(1991)222：581)；Vaughan等，Nature Biotech.(1996)14：309-314和de Haard等J.Biol.Chem.274(1999)；18218-18230所述进行指纹分析，噬菌体制备和可溶性Fab′s制备。

结论：

1.使用合成肽作为抗原在人Fab噬菌体文库中筛选抗LMP1的胞外部分(环1，2和3)的Ab-反应性：

在第一组实验中，使用Vaughan描述的单链抗体文库来选择具有LMP1-环肽-结合活性的噬菌体。

虽然发现了不显示与链霉抗生物素蛋白对照平板任何结合的特异环-肽结合噬菌体，详细的分析表明所有的肽结合噬菌体表现出对选择程序中使用的不同的各个环化受限肽的相似反应性。使用这些肽的线性化形式没有看到反应。因此得出结论，这些肽中的共有结构，S-S键和邻接的赖氨酸基团(见表2)，负责与各个噬菌体的一般结合。事实上，带有相似3-赖氨酸S-S受限接头的不相关的肽证实所选择的噬菌体的种属特征。另外的筛选没有揭示任何肽-特异性结合。

从这些实验得出结论，Vaughan型文库或者产生具有不充分结合特征的ScAb′s或者包含太少的Ab-多样性，不能快速提供LMP1环-肽特异性结合剂的来源，接着我们变换使用如de Haard等(1999)所述具有扩展的多样性的人Fab噬菌体文库。

下面详细描述使用人Fab文库的新的选择。

由于疏水性肽的低溶解性，在10％ DMSO，3％ Marvel的PBS溶液中进行噬菌体与肽的结合。

从前面的实验清楚地看到：10％ DMSO的存在不影响噬菌体存活(没有给出数据)。

对于LMP1-环-1，进行三轮选择，对于环-2和-3，进行四轮选择。

表3总结了不同轮选择的结果。

环1肽
					轮次	投入	产出	产出/投入之比	富集
1	8.8*1012	6.4*105	7.3*10-8
					2	1.0*1013	7.4*105	7.4*10-8	1
3	1.9*1013	1.3*109	6.8*10-5	919
					环2肽
轮次	投入	产出	产出/投入之比	富集
					1	8.8*1012	1.0*104	1.1*10-9	1
2	1.6*1013	2.0*104	1.3*10-9	2
					3	1.4*1013	1.8*106	13*10-7	100
4	1.5*1013	4.8*106	3.2*10-7	3
					环3肽
轮次	投入	产出	产出/投入之比	富集
					1	8.8*1012	1.4*106	1.6*10-7
2	1.5*1013	1.5*106	1.0*10-7	1
					3	2.3*1013	8.6*108	3.7*10-5	370
4	2.0*1013	8.8*108	4.4*10-5	1

表3：使用LMP1-衍生的环-特异性合成肽的噬菌体选择不同轮的结果。

从表3清除地看到，第三轮选择发生显著的富集，再多轮选择不导致更多富集。

从第3和4轮，得到46个集落并且诱导噬菌体产生。接着，在肽-包被的ELISA中分析含有噬菌体的培养基，检查与各种肽或者作为对照物的链霉抗生物素蛋白的特异性。

通过分析它们与没有对它们选择的其它肽的结合，对不同选择获得的噬菌体集落测定交叉反应性。

图6中给出了总的ELISA结果。从图6清楚地看到，选择的噬菌体对选择肽表现出高特异性，并且与其它肽没有交叉结合，与链霉抗生物素蛋白也没有交叉结合。从环-2和环-3实施例可见与线性环肽反应的一些噬菌体克隆还可能显示与S-S环受限肽的反应性，认为它更密切地模拟了LMP1中天然环结构。

因此，这些实验证明，使用代表LMP1，LMP2和BARF1的胞外域的具体设计的环肽能从足够大的随机抗体噬菌体文库特异选择人抗体试剂。

2.选择的噬菌体对表达的人抗体试剂的表征

图7说明对选择的各个挑选的克隆I的代表性DNA-限制性酶切分析，以确定用不同的肽选择的噬菌体克隆之间克隆型差异。

结果表明不同的选择的噬菌体群中及其之间能观察到不同的指纹(克隆型)，但是如果没有碰到相同的克隆型，则与相同的环反应的噬菌体集落中肽是类似的。这最可能反映如果没有与肽抗原结合的相同的抗体独特位结构时相似的噬菌体的独立分离。

例如在与LMP1环1反应的噬菌体中，各分离的克隆1，2和4表现出非常类似的指纹图案，而克隆6和9及克隆5和10彼此之间具有类似的克隆型，但是它们彼此之间明显不同而且与克隆1，2和4明显不同。克隆3和7和11显示与以前命名的不同，但是所有的克隆类似地与LMP1环1肽反应。

类似地，用LMP1环3肽选择的克隆3，6，7，8，9和13表现出十分类似，但是与克隆1，4，5，10(等)比有不同的指纹标记。

表4总结了第三轮之后从选择的LMP1环1-3特异性克隆的总的回收。

LMP1环肽	获得的克隆	不同的指纹	可溶性Fab表达
				1	14	8	5
2	41	2	2
				3	29	14	10

表4：第三轮不同的LMP1-特异性噬菌体选择的总的特征结果

总之，DNA指纹分析揭示，使用LMP1环-1肽选择，得到8个不同克隆型的14个克隆。对LMP1环-2选择，得到仅具有两个克隆型的41个克隆，对LMP1环-3选择，得到14个不同克隆型的29个克隆。

从表4清楚地看到，抗环2反应的噬菌体的多样性低。只检测到2个不同的指纹。考虑到环2是所有的肽中最短的，这可以解释低多样性。在环2反应噬菌体克隆中，分析的6/6(100％)也与环化环2反应这一发现进一步支持这一观点。

与LMP1环3反应的噬菌体的多样性最高，这与该环尺度较大并且环的中部存在两个大的色氨酸残基非常吻合。在不同的克隆的有限评价中，3/6(50％)环3选择的噬菌体克隆还表现出与环3的环受限肽的反应性。

结果证明，从随机抗体文库可以选择不同的克隆型，它独特地表明与LMP1，LMP2或BARF1的特异胞外域的确定的反应性。

3.作为可溶性Fab抗体试剂的噬菌体-抗体试剂的表达

因为噬菌体结合的抗体试剂与未来的治疗应用不相容，因此需要获得保留原来抗原-结合特异性的纯化的抗体试剂。

因此，为了分析来自选择的噬菌体克隆的可溶性Fab-试剂(Fab′s)的可能的产物，通过大肠杆菌中噬菌体蛋白质表达的IPTG介导的诱导对不同克隆分析Fab蛋白质产物。

通过肽ELISA，对用这种方法从不同的环-肽筛选的噬菌体(如表4所示)制备的Fab′s分析与如图8所示完整LMP1蛋白质的反应性(数据没有给出)。

图8说明免疫印迹分析，它表明可溶性Fab′s与纯化的全长LMP1(弱的)反应性。

来自不同的噬菌体克隆的几种可溶性Fab′s具有抗全长LMP1蛋白质的反应性。

对于环3反应噬菌体，ELISA证明10/14(71％)遗传学不同的克隆产生可溶性Fab′s，它有抗环状环3肽的反应性，并且证明与LMP1蛋白质的可检测反应。

考虑到在优化表达的Fab′s的重折叠或者优化在不产生可溶性Fab′s的克隆中表达这方面还没有人努力过。

还有，挑选使用环2和3第四轮选择得到的产生噬菌体的集落并分析。产生特异性Fab′s并且与第三轮相比较在第四轮中的噬菌体中没有主要ELISA-反应性或遗传学差异。

这些结果证明，从使用设计的肽选择的噬菌体抗体群，能制备具有对天然全长蛋白质LMP1，LMP2和BARF1的确定的和特定的反应性的可溶性人抗体试剂。

来自实施例3的总的结果证明，使用具体设计的从LMP1，LMP2和BARF1的推定的胞外域衍生的环-结构域肽，能从抗体所有组成成分的基因克隆产生的随机抗体文库筛选不同的人抗体试剂。结果还证明这样的抗体试剂能被表达并且以可溶形式产生，与一般文库成分分离，并且这样的抗体试剂能特异结合完整的全长蛋白质。

实施例4

使用表达LMP1天然形式的完整和存活的EBV-转化类淋巴母细胞JY细胞从人抗体噬菌体文库选择与LMP1的胞外域反应的人Fab抗体试剂

作为与LMP1，LMP2和BARF1的天然胞外域反应的人抗体试剂设计中替代的或另外的选择步骤，通过直接结合EBV-感染的和转化的(肿瘤)细胞，可以选择人噬菌体抗体。

因此，我们目的在于，通过接着用完整的存活的EBV-转化B-细胞选择，通过分析环-特异肽反应性人抗体噬菌体的特异富集，证明这种可能性。

在实施例3的结果的基础上，该实施例只给出了LMP1-特异性数据。

方法

使用JY细胞对噬菌体的筛选和选择：

3*10⁶ JY-细胞/毫升置于含有10％FCS和2％Marvel的PBS中，并且在恒速搅拌下在RT下温育30分钟。同时，噬菌体在含有10％FCS和2％Marvel的PBS中在RT下温育30分钟。接着将细胞以500xg离心5分钟，并且将细胞沉淀在恒速搅拌下在RT下与噬菌体混合1小时。将细胞离心并且用PBS洗涤10x。洗涤之后将细胞重新悬浮于600微升的水中，并且通过向细胞中加入600微升的三乙胺(TEA)来洗脱噬菌体，并且在RT下温育5分钟。通过向悬浮液中加入600微升1M TRIS-HCl(pH＝7，4)将TEA中和。通过以1000xg离心5分钟分离细胞碎屑和噬菌体。在进一步使用之前在4℃下贮存含有选择的噬菌体的上清液。

结果：

为了选择与JY细胞的表面上表达的天然LMP1反应的噬菌体，使用来自对合成肽第二轮选择的噬菌体群。这些噬菌体表明没有显著富集，如表3所示。

表5总结了对于对LMP1环-1，-2和-3特异肽预选择的噬菌体群的下面轮次的选择的结果。

环1
					轮次	投入	产出	产出/投入之比	富集
3	2.4*1013	2.4*106	1.0*10-7	-
					4	1.4*1013	2.4*108	1.7*10-5	170
环2
					轮次	投入	产出	产出/投入之比	富集
3	2.0*1013	2.7*106	1.4*10-7	-
					4	2.8*1013	7.0*107	2.5*10-7	1
环3
					轮次	投入	产出	产出/投入之比	富集
3	2.0*1013	1.0*106	5.0*10-8	-
					4	1.8*1013	9.1*107	5.4*10-6	108

表5：对JY-细胞噬菌体筛选的结果

对于LMP1环1和环3，第四轮之后发现好的富集，但是对于环2没有发现富集。

这是预见到的，因为环2是最小的肽(蛋白质部分)，并且对肽的选择还给出最低水平的富集(表3)。

从对JY细胞的第四轮选择，从环1和环3噬菌体获得96个集落，诱导噬菌体产生，并且接着使用生物素-NHS-标记肽在肽ELISA中分析。

对于LMP1环-1，8/96 JY-选择的噬菌体有抗环-1肽的反应性。对于LMP1环-3，28/96 JY-选择的噬菌体有抗环-3肽的反应性，并且几个还有抗环-3环肽的反应性。

图9给出这些ELISA结果的实施例。

对于环2，没有发现预期的特异噬菌体，因为第四轮选择之后没有发现富集。

一般情况下，与使用肽噬菌体选择之后的应答相比较，肽的ELISA反应性较低(参见实施例3)。

与对LMP1环1，2和3衍生的肽结构域直接筛选的噬菌体的结合亲和性相比，存活的JY细胞的表面上表达的天然LMP1筛选的噬菌体的肽-结合亲和性被降低。这可能与合成肽和全长膜相关蛋白中天然环结构域之间的构象的小的变化有关。

与LMP1环1和/或环3肽反应的噬菌体的进一步分析表明很多噬菌体集落具有不同的指纹，这一点在前面对于肽选择的噬菌体发现过，并且如实施例3所示。

这些数据总结在表6中。

LMP1环肽	阳性克隆	不同的指纹
			1	8	4
2*	-	-
			3	29	5

表6：对JY细胞选择的总结。

*第五轮选择之后的结果。

这些数据表明，通过对EBV-转化细胞的表面上表达的天然LMP1，LMP2或BARF1的噬菌体选择能制备人抗体试剂。

序列表

<110>赛托-巴尔股份有限公司

<120>埃-巴二氏病毒(EBV)肿瘤相关潜伏膜蛋白的胞外结构域的鉴定方法和与之反应的抗体试剂的选择方法

<130>EBV表位-赛托-巴尔股份有限公司

<140>

<141>

<150>EP 01200321.6

<151>2001-01-30

<160>13

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>12

<212>PRT

<213>埃-巴二氏病毒

<400>1

Val Met Ser Asp Trp Thr Gly Gly Ala Leu Leu Val

  1               5                  10

<210>2

<211>11

<212>PRT

<213>埃-巴二氏病毒

<400>2

Ala Leu Trp Asn Leu His Gly Gln Ala Leu Phe

  1               5                  10

<210>3

<211>12

<212>PRT

<213>埃-巴二氏病毒

<400>3

Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu Leu Val Asp

  1               5                  10

<210>4

<211>11

<212>PRT

<213>埃-巴二氏病毒

<400>4

Ala Ala Ser Cys Phe Thr Ala Ser Val Ser Thr

  1               5                  10

<210>5

<211>20

<212>PRT

<213>埃-巴二氏病毒

<400>5

Leu Thr Trp Arg Ile Glu Asp Pro Pro Phe Asn Ser Leu Leu Phe Ala

  1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Ala

             20

<210>6

<211>9

<212>PRT

<213>埃-巴二氏病毒

<400>6

Leu Gln Leu Ser Pro Leu Leu Gly Ala

  1               5

<210>7

<211>8

<212>PRT

<213>埃-巴二氏病毒

<400>7

Leu Gly Thr Leu Asn Leu Thr Met

  1               5

<210>8

<211>18

<212>PRT

<213>埃-巴二氏病毒

<400>8

Leu Gln Thr Asn Phe Lys Ser Leu Ser Ser Thr Glu Phe Ile Pro Asn

  1               5                  10                  15

Leu Phe

<210>9

<211>11

<212>PRT

<213>埃-巴二氏病毒

<400>9

Val Met Ser Asn Thr Leu Leu Ser Ala Trp Ile

  1               5                  10

<210>10

<211>40

<212>PRT

<213>埃-巴二氏病毒

<400>10

Leu Gly Pro Glu Ile Glu Val Ser Trp Phe Lys Leu Gly Pro Gly Glu

  1               5                  10                  15

Glu Gln Val Leu Ile Gly Arg Met His His Asp Val Ile Phe Ile Glu

             20                  25                  30

Trp Pro Phe Arg Gly Phe Phe Asp

         35                  40

<210>11

<211>75

<212>PRT

<213>埃-巴二氏病毒

<400>11

Ile His Arg Ser Ala Asn Thr Phe Phe Leu Val Val Thr Ala Ala Asn

  1               5                  10                  15

Ile Ser His Asp Gly Asn Tyr Leu Cys Arg Met Lys Leu Gly Glu Thr

             20                  25                  30

Glu Val Thr Lys Gln Glu His Leu Ser Val Val Lys Pro Leu Thr Leu

         35                  40                  45

Ser Val His Ser Glu Arg Ser Gln Phe Pro Asp Phe Ser Val Leu Thr

     50                  55                  60

Val Thr Cys Thr Val Asn Ala Phe Pro His Pro

 65                  70                  75

<210>12

<211>34

<212>PRT

<213>埃-巴二氏病毒

<400>12

His Val Gln Trp Leu Met Pro Glu Gly Val Glu Pro Ala Pro Thr Ala

  1               5                  10                  15

Ala Asn Gly Gly Val Met Lys Glu Lys Asp Gly Ser Leu Ser Val Ala

             20                  25                  30

Val Asp

<210>13

<211>33

<212>PRT

<213>埃-巴二氏病毒

<400>13

Leu Ser Leu Pro Lys Pro Trp His Leu Pro Val Thr Cys Val Gly Lys

  1               5                  10                  15

Asn Asp Lys Glu Glu Ala His Gly Val Tyr Val Ser Gly Tyr Leu Ser

             20                  25                  30

Gln

Claims (30)

1.EBV-转化的哺乳动物细胞的细胞外表面上表达的埃-巴二氏病毒(EBV)编码的膜蛋白的胞外表位的鉴定方法，包括步骤：

A)提供EBV基因组的至少一个可读框(ORF)的氨基酸序列，

B)确定A)的氨基酸序列中包含的至少一个推定的胞外结构域，

C)制备包括推定的B)的胞外结构域或者其部分的肽，该肽不包括全长0RF，

D)制备能与C)的肽特异性结合的抗体试剂，

E)使D)的抗体试剂与存活的EBV转化的哺乳动物细胞反应，

F)检测抗体试剂与EBV转化的哺乳动物细胞的细胞表面的特异性结合。

2.能与EBV转化的哺乳动物细胞的细胞外表面上表达的埃-巴二氏(EBV)编码的膜蛋白的胞外表位结合的抗体试剂的选择方法，包括步骤：

A)提供EBV基因组的至少一个可读框(ORF)的氨基酸序列，

B)确定A)的氨基酸序列中包含的至少一个推定的胞外结构域，

C)制备包括B)的胞外结构域或者其部分的肽，该肽不包括全长ORF，

D)制备能与C)的肽特异性结合的抗体试剂，

E)使D)的抗体试剂与存活的EBV转化的哺乳动物细胞反应，

F)检测抗体试剂与EBV转化的哺乳动物细胞的细胞表面的特异性结合，

G)选择F)检测的抗体试剂。

3.根据权利要求2的方法，其中步骤G)中包括步骤：

G1)用步骤C)的肽免疫动物，

G2)制备包括抗体试剂的免疫动物的体液，

G3)制备包括与所述基质结合的肽的固相亲和基质，

G4)使体液和基质接触，

G5)使来自体液的抗体试剂与所述基质结合的肽特异性结合，

G6)分离与所述肽特异性结合的抗体试剂。

4.根据权利要求2的方法，其中步骤G)中包括步骤：

G1)用步骤C)的肽免疫动物，

G2)从G1)的接受免疫的动物提供生产抗体试剂的B细胞，

G3)制备包括与所述基质结合的肽的固相亲和基质，

G4)使G2)的B细胞和基质接触，

G5)使B细胞与所述基质结合的肽特异性结合，

G6)分离与所述肽特异性结合的B细胞。

5.根据前面权利要求任一项的方法，其中胞外域选自选自下面的氨基酸序列：

SEQ ID 1     (LMP1，胞外环1)，

SEQ ID 2     (LMP1，胞外环2)，

SEQ ID 3     (LMP1，胞外环3)，

SEQ ID 4     (LMP2，胞外环1)，

SEQ ID 5     (LMP2，胞外环2)，

SEQ ID 6     (LMP2，胞外环3)，

SEQ ID 7     (LMP2，胞外环4)，

SEQ ID 8     (LMP2，胞外环5)，

SEQ ID 9     (LMP2，胞外环6)，

SEQ ID 10    (BARF1，SEQ40-79)，

SEQ ID 11    (BARF1，SEQ80-154)，

SEQ ID 12    (BARF1，SEQ155-188)和

SEQ ID 13    (BARF1，SEQ188-221)。

6.根据前面权利要求任一项的方法，其中步骤C)的肽包括两个半胱氨酸残基，位于推定的胞外域或者其部分之间，所述半胱氨酸残基被氧化，在所述半胱氨酸残基之间形成S-S键。

7.能结合在EBV-转化的哺乳动物细胞的细胞外表面上表达的埃-巴二氏病毒(EBV)编码的膜蛋白的胞外表位的单克隆抗体试剂的制备方法，包括步骤：

1)提供包括哺乳动物遗传物质的表达文库，

2)使根据权利要求1鉴定的肽接触所述文库，

3)使肽与所述文库的生物体特异性结合，

4)分离肽与之特异性结合的生物体，

5)制备分离的生物体的单一克隆，

6)在表达哺乳动物遗传物质的条件下培养5)的克隆，

7)分离步骤6)的表达产物。

8.能结合在EBV-转化的哺乳动物细胞的细胞外表面上表达的埃-巴二氏病毒(EBV)编码的膜蛋白的胞外表位的单克隆抗体试剂的制备方法，包括步骤：

1)提供包括哺乳动物遗传物质的表达文库，

2)使根据权利要求1鉴定的在它们表面表达一个或多个肽表位的存活的EBV转化的细胞接触所述文库，

3)使细胞与所述文库的生物体特异性结合，

4)分离细胞与之特异性结合的生物体，

5)制备分离的生物体的单一克隆，

6)在表达哺乳动物遗传物质的条件下培养5)的克隆，

7)分离步骤6)的表达产物。

9.根据权利要求7或8的方法，其中表达文库是包含至少10⁹，优选至少10¹²，最优选大约10¹⁵个不同克隆的高多样性文库。

10.包含至少10⁹，优选至少10¹²，最优选大约10¹⁵个不同克隆的高多样性文库用于制备能结合在EBV-转化的哺乳动物细胞的细胞外表面上表达的埃-巴二氏病毒(EBV)编码的膜蛋白的胞外表位的单克隆抗体试剂的用途。

11.根据权利要求2-7的任一项的方法可获得的抗体试剂，它能结合在EBV-转化的哺乳动物细胞的细胞表面上表达的埃-巴二氏病毒(EBV)编码的膜蛋白的胞外表位。

12.能与选自SEQ ID No.1-13的氨基酸序列特异性结合的抗体试剂。

13.能与和SEQ ID No.1-13的氨基酸序列之一具有至少80％，优选90％，最优选95％或者更多同源性的氨基酸序列特异性结合的抗体试剂。

14.分离的肽，包括在EBV-转化的哺乳动物细胞的细胞外表面上表达的埃-巴二氏病毒(EBV)编码的膜蛋白的胞外表位，选自：

SEQ ID 1     (LMP1，胞外环1)，

SEQ ID 2     (LMP1，胞外环2)，

SEQ ID 3     (LMP1，胞外环3)，

SEQ ID 4     (LMP2，胞外环1)，

SEQ ID 5     (LMP2，胞外环2)，

SEQ ID 6     (LMP2，胞外环3)，

SEQ ID 7     (LMP2，胞外环4)，

SEQ ID 8     (LMP2，胞外环5)，

SEQ ID 9     (LMP2，胞外环6)，

SEQ ID 10    (BARF1，SEQ40-79)，

SEQ ID 11    (BARF1，SEQ80-154)，

SEQ ID 12    (BARF1，SEQ155-188)和

SEQ ID 13    (BARF1，SEQ188-221)。

15.分离的肽或蛋白质，包括选自SEQ ID nos.1-13的氨基酸序列，不是全长LMP1，LMP2或BARF1序列，也不是与之有90％或更高同源性。

16.根据权利要求15的肽或蛋白质，包括少于100个氨基酸。

17.肽或蛋白质，包括与SEQ ID nos.1-13的氨基酸序列的任意一个有至少80％，优选至少90％，最优选至少95％同源性的氨基酸序列，不是全长LMP1，LMP2或BARF1序列，也不是与之有90％或更高同源性。

18.纯化的核酸序列，包含编码根据权利要求14-17的任一项的肽或蛋白质的核酸序列。

19.纯化的核酸序列，包含与根据权利要求18的核酸序列至少80％，优选至少90％，最优选至少95％同源的核酸序列。

20.核酸载体，包含根据权利要求18或19的核酸序列。

21.根据权利要求20的核酸载体，其中氨基酸编码与启动子可操作性连接的核酸序列，在所述载体可以增殖的宿主生物体中发挥功能。

22.用核酸序列转化的细胞，包含根据权利要求18-21任一项的核酸序列。

23.导向于表达LMP1，LMP2或BARF1的细胞的导向细胞的制备方法，包括步骤：

-用根据权利要求11-13任一项的抗体试剂的遗传信息转染细胞；

-在所述导向细胞表面表达所述抗体试剂。

24.导向于表达LMP1，LMP2或BARF1的细胞的导向病毒颗粒的制备方法，包括步骤：

-将根据权利要求11-13任一项的抗体试剂的遗传信息克隆到病毒基因组中

-在所述病毒颗粒的病毒外壳上表达所述抗体。

25.根据权利要求11-13任一项的抗体试剂，用作携带EBV阳性肿瘤的患者的诊断试剂或治疗试剂。

26.根据权利要求11-13任一项的抗体试剂，根据权利要求14-17任一项的肽，或根据权利要求18-19任一项的核酸序列用于制备药物特别是用于治疗EBV感染的药物的用途。

27.EBV感染的细胞，尤其是EBV+恶性细胞和EBV介导的疾病的诊断方法，包括步骤：

-从怀疑携带所述疾病感染的细胞的个体获取细胞样品；

-使根据权利要求9-11任一项的抗体试剂接触所述细胞；

-使抗体试剂与所述细胞反应，形成与EBV感染的细胞结合的抗体试剂的复合体；

-检测所述复合体的存在。

28.特异性消除来自体内的细胞表面上表达LMP1，LMP2或BARF1或者其部分的细胞的方法，包括步骤：

-从个体分离一定数目的细胞，

-使分离的细胞接触根据权利要求9或11任一项的抗体试剂，

-负选择细胞表面上表达LMP1，LMP2，或BARF1或者其部分的细胞，

-其中细胞表面上不表达LMP1，LMP2，或BARF1的细胞存活。

29.根据权利要求28的方法，其中将存活细胞再移植给个体。

30.根据权利要求28或29的方法，其中从骨髓分离细胞。

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