CN1522762A

CN1522762A - 免佐剂抗促性腺激素释放激素多肽疫苗及制备方法

Info

Publication number: CN1522762A
Application number: CNA031319092A
Authority: CN
Inventors: 刘景晶; 徐进署; 端鹏; 朱政; 廖忠平; 吴洁; 曹荣月
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2003-06-17
Filing date: 2003-06-17
Publication date: 2004-08-25

Abstract

将重复抗原表位肽段置于抗体铰链区肽段的一端，将T辅助表位肽段置于铰链区肽段的另一端，形成铰链区两端分别连接抗原表位肽段和T辅助表位肽段的串连多肽，在氧化条件下，两段多肽形成二聚化。进一步将二聚化的多肽与源于分枝杆菌(Mycobacterium bovis)的热激蛋白HSP65化学偶联。应用这项技术，研制了一种免佐剂抗促性腺激素释放激素多肽疫苗。该疫苗不需添加佐剂，通过机体内抗促性腺激素释放激素抗体与促性腺激素释放激素结合，中和机体中的促性腺激素释放激素可以治疗促性腺激素释放激素依赖的前列腺癌、前列腺增生、乳腺癌和结肠癌，也能用于对牲畜和家禽进行生育控制。

Description

免佐剂抗促性腺激素释放激素多肽疫苗及制备方法

促性腺激素释放激素(Gonadotrophin Releasing Hormone，GnRH)是下丘脑分泌的10肽激素，该激素能调控促性腺激素合成和释放，而促性腺激素又能调控性腺甾体激素合成、精子产生、卵泡发育和排卵。最近的国内外研究资料表明，前列腺癌之所以在男性中发病率极高是由于男性中高分泌量肾上腺类固醇的存在，而肾上腺类固醇可转化为雄性激素。因此，前列腺癌的致病机理与性激素的分泌密切相关。随后的研究表明乳腺癌、结肠癌等癌症都与性激素的分泌有关。人们已经发现前列腺癌、乳腺癌、结肠癌等肿瘤上存在GnRH的特异性结合位点，这些肿瘤属于激素依赖型肿瘤。阻断GnRH的作用，能抑制这些肿瘤的生长。一些已经在临床上广泛使用的GnRH的类似物，如Buserelin(布含瑞林)、醋酸亮丙瑞林(Lupron)、醋酸那法瑞林(Synarel)、醋酸高舍瑞林(Zloadex)和Cetrorelix，都是通过阻断GnRH与肿瘤上GnRH特异性结合位点的结合，实现对肿瘤的治疗。前列腺增生时，前列腺二氢睾酮的含量急剧升高；增生的前列腺中的5-α还原酶活性的升高以及阉割以后前列腺的萎缩都显示二氢睾酮在前列腺增生中所起的重要作用。阻断GnRH，能控制二氢睾酮等甾体激素合成，从而治疗前列腺增生。阻断GnRH能抑制促性腺激素合成和释放，进而抑制甾体激素合成、精子产生、卵泡发育和排卵，因此，在畜牧业上，通过阻断GnRH能够对牲畜和家禽的生殖进行控制。在药物研究中，通过检查用药后对精子产生、卵泡发育、卵巢和子宫发育的抑制程度能够判断血浆中的GnRH被失活和被清除的程度。

用抗促性腺激素释放激素疫苗诱导机体产生抗促性腺激素释放激素抗体，也能阻断GnRH发挥作用，进而治疗上述的激素依赖型肿瘤。国外学者一般用GnRH与白喉毒素或破伤风毒素偶连，用这种偶连物诱导机体产生抗GnRH抗体，显示能用于治疗前列腺癌、前列腺增生、结肠癌和乳腺癌。在中国，白喉毒素或破伤风毒素都已经被列为计划免疫疫苗，许多人都曾经被用白喉毒素和破伤风毒素免疫过。在这些人群中使用白喉毒素或破伤风毒素偶连物时，免疫效果会减弱。用多肽疫苗没有白喉毒素或破伤风毒素偶连物类似的表位抑制问题，但如何加强多肽疫苗的免疫原性是许多疫苗研究人员追求的目标。

通常，多肽疫苗需要加入佐剂，才能激发机体产生足够强的免疫应答。许多常用的佐剂，如福氏不完全佐剂、福氏完全佐剂等仅能用于动物，不能用于人体；人体可用的佐剂目前仅有铝佐剂，而这种佐剂常常对多肽疫苗不能起到强化免疫原性的作用。

本发明的目的是提供一种强化多肽免疫原性的方法。

本发明的另一目的是提供一种免佐剂的抗GnRH多肽疫苗。

本发明的再一目的是提供生产该免佐剂抗GnRH多肽疫苗的方法。

本发明的还有一个目的是免佐剂抗GnRH多肽疫苗的用途。

在本发明的第一方面，提供了一种强化多肽免疫原性的方法，该方法的制作工艺流程见附图2。

这种强化多肽免疫原性方法的原理是：(1).将抗原表位多肽重复多次，可以增加抗原表位的剂量，增加整个抗原的分子量，通过二聚化之后，重复抗原表位得到倍增，从而增加抗原表位多肽的免疫原性；(2).引入T辅助表位能活化机体的Th细胞，活化的Th细胞能进一步引起表位多肽致敏的B细胞分化，生成记忆细胞和能分泌特异抗体的浆细胞；二聚化能使整个抗原分子中有两个T辅助表位；(3).IgG抗体由两个相同的半分子构成，通过铰链区中的半胱氨酸在铰链区之间形成二硫键，使两个抗体半分子二聚化成完整的抗体分子。在本发明中，人IgG1的铰链区肽段被用来使两个抗原肽段二聚化，这可以进一步增加免疫原性。(4).分枝杆菌(卡介苗)HSP65具有在位佐剂的功能，二聚化后的多肽再偶联到重组的分枝杆菌(卡介苗)HSP65上形成的疫苗，可以不需添加佐剂，诱发机体产生强烈的免疫应答。

在本发明的第二方面，提供了一种抗促性腺激素释放激素免佐剂多肽疫苗。该疫苗采用本发明的第一方面所述的方法进行设计。在疫苗分子中，(抗原表位)n等于Pro Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Glu His Trp Ser TyrGly Leu Arg Pro Gly Gly，即含有三段(但不限于)作为抗原表位的GnRH类似物肽段；为了叙述方便，在实施例中，本发明含三段GnRH的抗原表位用“(GnRH)3”表示；含一段GnRH的抗原表位用“(GnRH)1”表示。绞链区是指人IgG1(但不限于)绞链区的肽段，其氨基酸排序是Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro为了叙述方便，在实施例中，本发明所采用的绞链区肽段用“hinger”表示。在本发明中，T-辅助表位是指源于麻疹病毒(但不限于)的T辅助表位，氨基酸排列顺序是Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val Ala；为了叙述方便，以下将本发明采用的麻疹病毒的Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val Ala肽段用“MVP”表示。抗促性腺激素释放激素免佐剂多肽部分的氨基酸序列是Pro Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Glu His Trp Ser TyrGly Leu Arg Pro Gly Gly Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg LeuGlu Gly Val Ala Lys；该肽段N端的Pro有利于疫苗多肽从融合蛋白中的释放，C端的Lys能提供侧链氨基，有利于疫苗多肽与HSP65的化学偶联。为了叙述方便，以下将该疫苗多肽用“(GnRH)3-hinger-MVP”表示；用空气氧化使之二聚化后则用“di-(GnRH)3-hinger-MVP”表示。HSP65是指源于用作卡介苗的分枝杆菌来源的热激蛋白，国际基因库登录号是M17705。将二聚化的(抗原表位)n-铰链区-T辅助表位多肽与HSP65偶联，能强化多肽疫苗的免疫原性，不需添加佐剂就能激发机体产生强烈免疫应答。将二聚化的疫苗多肽进一步与HSP65偶联所获得的免佐剂抗促性腺激素释放激素多肽疫苗表示为“di-(GnRH)3-hinger-MVP-HSP65”。

在本发明的第三方面，是提供生产抗促性腺激素释放激素的重复表位二聚化多肽疫苗的方法，其技术路线详述如下：

1.(GnRH)3-hinger-MVP基因的设计

为了增加(抗原表位)n-铰链区-T辅助表位基因在大肠杆菌中的表达效率，在不改变(抗原表位)n-铰链区-T辅助表位多肽氨基酸序列的前提下，选用大肠杆菌偏爱的密码子，借助于计算机设计(抗原表位)n-铰链区-T辅助表位基因的核苷酸序列，5’端添加酸水解位点Asp-Pro相应的核苷酸序列及BamHI的识别位点，3’端添加终止密码子和HindIII的识别位点。

2.融合伙伴基因的获得

由于(GnRH)3-hinger-MVP多肽由57个氨基酸残基构成，直接在大肠杆菌中表达易发生降解，因此采用融合表达方案。融合伙伴基因为本实验室克隆并高效表达的大肠杆菌L-天冬酰胺酶基因C-末端127肽序列(命名为L-ansB-C)，其中L-天冬酰胺酶近C-端的一个酸水解位点(Asp-Pro)已被突变成Asp-Ala；该融合伙伴基因被克隆在市售的表达质粒pET28a中，命名为pED，在L-ansB-C基因的5’端有限制性内切酶NcoI的识别位点，3’端终止密码子上游有限制性内切酶BamHI的识别位点。

3.重组基因工程菌的构建

(GnRH)3-hinger-MVP基因经BamHI、HindIII切割插入经BamHI、HindIII切割的pED中，组成融合表达的重组质粒pED-antiGnRH，重组质粒转化大肠杆菌BL21，获得重组基因工程菌。

4.工程菌发酵及重组(GnRH)3-hinger-MVP多肽的获得

以LB为基础培养基，玉米浆培养基为发酵培养基，发酵参数如下：温度36-38℃，pH6.8-7.2。发酵后离心收集工程菌，反复冻融裂解菌体，离心获得包含体，去离子水洗涤后，8mol/L尿素溶解包含体，1倍体积酒精沉淀，离心去沉淀，3倍体积酒精沉淀上清，离心，沉淀即是含(GnRH)3-hinger-MVP多肽的融合蛋白。融合蛋白用60mmol/L的盐酸水解，用NaOH调节pH值至融合伙伴的等电点pH4.6，融合伙伴沉淀析出，离心除去。离心上清再用NaOH调节pH值至抗GnRH疫苗多肽的等电点pH7.3，(GnRH)3-hinger-MVP多肽沉淀析出，离心回收。

5.(GnRH)3-hinger-MVP多肽的二聚化

将(GnRH)3-hinger-MVP多肽溶解在pH6.8的磷酸缓冲液中，通入氧气，置於4℃冰箱中缓慢搅拌72小时，用聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，可以判断所获得的di-(GnRH)3-hinger-MVP多肽的纯度和二聚化程度。

6.HSP65基因克隆、表达和制备

在免疫学研究领域，人们常常用福氏完全佐剂添加到抗原中，强化抗原的免疫原性。福氏完全佐剂中含有用作卡介苗的牛分枝杆菌。我们从牛分枝杆菌DNA中扩增到HSP65的基因，将该基因连接到表达质粒pET28a，引入大肠杆菌BL21中表达。表达的HSP65蛋白经离子交换柱层析纯化，用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以判断纯化的HSP65的纯度。

7.di-(GnRH)3-hinger-MVP多肽与重组HSP65的化学偶联

将di-(GnRH)3-hinger-MVP多肽和HSP65蛋白溶解于PBS中，向混合液中缓慢的滴加戊二醛溶液，于室温下反应，反应液于4℃对PBS透析，可以获得化学偶联的di-(GnRH)3-hinger-MVP-HSP65。

在本发明的第四方面是免佐剂抗GnRH多肽疫苗的用途，如上所述，在畜牧业上，用本发明所述的免佐剂抗GnRH多肽疫苗能对牲畜和家禽的生殖进行控制。在医学上，免佐剂抗GnRH多肽疫苗能用于治疗前列腺癌、前列腺增生、结肠癌、乳腺癌。

在本发明中，术语“二聚化”指在多肽中引入抗体绞链区肽段，通过绞链区之间形成二硫桥使两条肽链共价连接。抗体绞链区肽段含有两条肽链配对的信息，在疫苗多肽中引入绞链区肽段能使两条肽链以肽链走向相同的形式配对，通入空气很容易在两条肽链之间发生二聚化。

在本发明中，术语“绞链区”指源于人体的IgG1抗体的绞链区，也包括源于人体其他形式的抗体绞链区和源于其他动物的抗体绞链区，通常也能达到二聚化的目的。

在本发明中，术语“T辅助表位”指具有T辅助功能的肽段。在本发明中，采用源于麻疹病毒的Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val Ala肽段；该术语也包括源于其他病毒、毒素和其他生物体具有T辅助功能的肽段，在本领域内，应用各种来源的T辅助表位肽段同样能起到T辅助作用。

在本发明中，术语“(抗原表位)n”指抗原表位串联排列，该术语中的n指用于串联排列的抗原表位的个数，可以等于1或大于1，抗原表位之间可以直接相联，也可以有间隔的氨基酸残基。在疫苗研究中，表位之间可以在空间上相邻也可以不相邻。(抗原表位)n可以位于绞链区的N端，也可以位于C端，通常不影响疫苗多肽的二聚化，同样也能与载体蛋白偶联和激发免疫应答。

实施例

材料：

(1)菌株与质粒：

大肠杆菌(Escherichia coliAS1.357)该菌种从中国菌种保藏中心获得。宿主菌E.coli BL21和E.coliJM109是基因工程常用工具菌种，在与基因工程研究有关的实验室一般都有保存。

质粒pET28a购自Novagen公司。

卡介苗由上海生物制品公司生产，该制品中含有牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)。

(2)酶和试剂：

分子克隆工具酶和试剂、细菌基因组、质粒抽提试剂盒为普洛麦格(Promega)公司产品；

(3)培养基：

LB培养基，配方见参考文献Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T. Molecular Cloning；ALaboratory Manual 2nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。该书是基因工程技术的经典著作，在许多高校图书馆都有收藏。

玉米浆培养基含有：玉米浆25g/L，牛肉浸膏15g/L，味精10g/L。

方法

分子生物学操作方法

质粒提取、聚合酶链反应、内切酶酶切、DNA片断的回收、连接和转化大肠杆菌：在基因工程研究领域，这些都是常规操作方法，参见Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.MolecularCloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.16-340。

重组蛋白表达量的测定：参见Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；ALaboratory Manual 2nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，方法进行。

实施例1：

1.(GnRH)3-hinger-MVP多肽基因的设计、合成和克隆

根据(GnRH)3-hinger-MVP多肽基因的氨基酸序列，选用大肠杆菌偏爱的密码子，在计算机的辅助下设计出(GnRH)3-hinger-MVP多肽基因的全序列。依据该序列设计出7条寡核苷酸片段，进行化学合成。首先通过PCR法合成含单个抗原表位的疫苗多肽基因，即(GnRH)1-hinger-MVP多肽基因，将该基因克隆到pED的L-ansB-C基因的C端，转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，从转化子中抽提的质粒命名为pED-antiGnRH1。再以pED-antiGnRH1为模板，通过加端PCR的方法获得含重复抗原表位的疫苗多肽基因，即(GnRH)3-hinger-MVP多肽基因，转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，从转化子中抽提的质粒命名为pED-antiGnRH3。具体方法如下：

7条寡核苷酸如下：

P1：5′GGT CTG CGT CCG GGT GGT ACC TGC CCG CCG TGC CCT GCT CCG CTG 3′

P2：5′ATG CAC GAT AAC ACC TTT GAT TTC AGA CAG CGG AGC AGG GCA CGG 3′

P3：5′GGGG GAT CCG ACT CAG CAC TGG TCT TAC GGT CTG CGT CCG GGT GGT 3′

P4：5′GGC CAA GCT TAT TTA GCA ACA CCC TCC AGA CGA TGC ACG ATA ACA CCT TT 3′

P5：5’CCG GGT GAA CAC TGG TCT TAC GGC CTG CGC CCG GGT GAA CAC TGG

AGC TAC GGT CTG CGT 3’

P6：5’GGGGATCCG GAA CAT TGG AGC TAC GGT CTG CGT CCG GGT GAA CAC TGG

TCT 3’

P7：5’GGC CAAGCTTAT TTA GCA ACA CCC TCC AGA CGA TGC ACG ATA ACA CCT

TT 3’通过PCR获得(GnRH)1-hinger-MVP多肽基因：第一步寡核苷酸片段P1和P2按一定比例混合，二者互为引物和模板，95℃，1min，55℃，1.5min，72℃，2min，共10轮；72℃，10min。将PCR产物克隆pCR2.1，转化大肠杆菌JM109，从转化子中提取的重组质粒进行核酸的序列分析验证。再以该重组质粒为模板，用P3和P4引物进行PCR扩增，将扩增获得的PCR产物用限制性内切酶BamH1和HindIII消化，与用相同限制性内切酶消化的pED质粒连接，连接产物转化大肠杆菌BL21，所获得的转化子中含连有(GnRH)1-hinger-MVP多肽融合蛋白基因的重组质粒pED-antiGnRH1，其结构框架见图1。

通过两轮PCR获得(GnRH)3-hinger-MVP多肽基因：在第一轮PCR反应中，以P5为上游引物，P7为下游引物，pED-antiGnRH1质粒为模板，经94℃变性4min，然后以94℃变性1min、59℃复性1min、72℃延伸1min共进行30个循环后，再72℃延伸10min，引入一段GnRH序列。在第二轮PCR反应中，以P6为上游引物，P7为下游引物，第一轮PCR产物为模板，PCR条件与第一轮PCR相同。经过两轮PCR反应得到(抗原表位)3-铰链区-T辅助表位多肽基因。将扩增获得的PCR产物用限制性内切酶BamH1和HindIII消化，与用相同限制性内切酶消化的pED质粒连接，连接产物转化大肠杆菌BL21，所获得的转化子中含(GnRH)3-hinger-MVP多肽融合蛋白基因的重组质粒pED-antiGnRH3，其结构框架见图1。进行核酸的序列分析，进一步验证GRF基因及其读码框的正确性，测序图见图3。从测序结果可以看出，三段GnRH序列、绞链区序列和源于麻疹病毒的T辅助表位序列已经串联、并与L-ansB-C基因融合。

实施例2

(GnRH)3-hinger-MVP多肽基因在大肠杆菌中的表达

将重组质粒pED、pED-antiGnRH1和pED-antiGnRH3分别转化大肠杆菌BL21。从生长有不同转化子平板上挑取单菌落种入LB液体培养基中，在37℃振荡培养过夜，按2％比例转种入新鲜的玉米浆液体培养基中，37℃培养4小时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG诱导大肠杆菌表达T7RNA聚合酶，从而表达融合蛋白。继续培养4小时，离心回收菌体，SDS-PAGE电泳再经薄层扫描显示已经实现了(GnRH)1-hinger-MVP多肽基因和(GnRH)3-hinger-MVP多肽基因的融合表达，融合蛋白表达量占细菌总蛋白的40％左右，结果见图4和图5。

实施例3

融合蛋白分离纯化及酸水解释放(GnRH)1-hinger-MVP多肽和(GnRH)3-hinger-MVP多肽

诱导表达后的工程菌经离心回收菌体，将菌体悬浮在破壁液(PBS，pH8.0，含2％Triton×100，10mmol EDTA，0.02％溶菌酶)中，在30℃搅拌90分钟，加入DNase将DNA消化至溶液不黏稠为止，离心回收沉淀，用2mol/L的尿素洗涤沉淀，再用4mol/L的尿素洗涤一次，将洗涤后的沉淀重新溶解在8mol/L尿素中，先加入一倍体积的乙醇沉淀杂蛋白，再加入二倍原体积的乙醇沉淀融合蛋白，结果见图6。将融合蛋白溶解在60mmol盐酸中，60℃保温24小时，融合蛋白被裂解成一大一小两个片段(图7)。将溶液用NaOH调pH4.6，大片段(融合伙伴)沉淀析出，离心除去。将溶液再调pH7.3，疫苗多肽析出，离心回收。

实施例4

(GnRH)1-hinger-MVP多肽和(GnRH)3-hinger-MVP多肽的二聚化

将(GnRH)1-hinger-MVP多肽和(GnRH)3-hinger-MVP多肽分别溶解在pH6.8的磷酸缓冲液中，通入氧气，置於4℃冰箱中缓慢搅拌72小时，用聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，可以判断所获得的多肽的纯度和二聚化程度，聚丙烯酰胺凝胶电泳显示获得了高纯度的di-(GnRH)1-hinger-MVP和di-(GnRH)3-hinger-MVP(图8和图9)。

实施例5

两种di-(GnRH)1-hinger-MVP多肽和di-(GnRH)3-hinger-MVP多肽免疫原性测定

化学合成的GnRH多肽、含(GnRH)3-hinger-MVP的融合蛋白(简称为L-ansB-GnRH)、二聚化的di-(GnRH)1-hinger-MVP多肽和di-(GnRH)3-hinger-MVP多肽分别溶解在生理盐水中。将四种溶液分别与福氏完全佐剂混合(加强免疫用福氏不完全佐剂)，充分乳化，分别皮下免疫5只SD大鼠，每只大鼠注射量为65μg抗原，分4点注射，每只大鼠注射200μl。以后每隔2周加强免疫一次，共进行2次加强免疫。对照组注射相同量的生理盐水。第一次免疫后，每周从眼眶采血一次，血量为0.5-0.8ml，离心，取血清冷冻保存，备用。将血清用PBS加试剂级1％牛血清白蛋白作为抗体稀释液将血清释液450倍，用化学合成的GnRH偶联到牛血清白蛋白所获得的抗原包被96孔血清反应板，用过氧化物酶标记的兔抗大鼠IgG作为第二抗体进行ELISA测定。从结果可以看出，化学合成的GnRH和含(GnRH)3-hinger-MVP的融合蛋白都不能诱发抗GnRH特异抗体，二聚化的di-(GnRH)1-hinger-MVP多肽和di-(GnRH)3-hinger-MVP多肽均能诱发特异的抗GnRH抗体，其中含重复抗原表位的di-(GnRH)3-hinger-MVP多肽能诱发明显更强的抗GnRH特异抗体(图10)。

实施例6

分枝杆菌HSP65基因的PCR扩增、克隆和在大肠杆菌中的表达

用普洛麦格公司生产的DNA抽提试剂盒，抽提卡介苗中的细菌染色体DNA。根据文献报道的相关HSP65基因序列设计并合成一对引物，在引物的两头加入酶切位点。上游引物：5’-TTCGCCATGGCCAAGAACAATTGCGTACG-3’；下游引物：5’-TTCCGAAGCTTAGAAATCCATGCCACCCATG-3’。以提取的染色体DNA为模板进行PCR扩增。扩增产物用NcoI和HindIII酶切，与用相同酶切的pET28a载体连接。连接产物转化大肠杆菌E.coli BL21，转化子涂布于含有卡那霉素的LB平板上培养16小时。以转化子的质粒为模板，用上游引物和下游引物的PCR进行阳性克隆筛选。从阳性克隆中抽提的质粒用核苷酸自动测序仪进行测定，验证了基因克隆的正确性，该重组质粒命名为pET28-HSP65。将含重组质粒的基因工程菌单菌落种入液体培养基中37℃过夜，按2％比例转种入新鲜的玉米浆液体培养基中，37℃培养4小时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG诱导大肠杆菌表达T7RNA聚合酶，菌体经离心回收后，用SDS电泳再经薄层扫描显示重组HSP65占细菌总蛋白的30％左右，结果见图11A。

实施例7

分枝杆菌HSP65的制备

含pET28-HSP65质粒的工程菌培养在500ml摇瓶中进行。从新鲜转接的平皿中挑取单菌落接入LB液体培养基中，37℃培养至对数期作为一级种子，以2％接种量接入到含200ml玉米浆培养基的500ml摇瓶中，37℃，260rpm培养4h后，加入2％乳糖诱导4h，以5000rpm离心25min收集菌体，每1g湿菌体悬浮在1ml破壁液(PBS，pH8.0，含2％Triton×100，10mmolEDTA，0.02％溶菌酶)中，在30℃搅拌90分钟，随后边搅拌，边分批加入碾细的MnCl₂直至溶液不粘稠为止，继续搅拌30分钟。5000rpm离心15min，收集上清直接上DEAE纤维素DE52柱(2×60cm)，用PBS/NaCl梯度洗脱，分步收集进行SDS-PAGE电泳检测，HSP65在120mmol处的洗脱峰中，用SDS-PAGE电泳检查制备样品的纯度(见图11B)。

实施例8

di-(GnRH)3-hinger-MVP多肽与HSP65的偶联

HSP65蛋白10mg溶解于2ml的PBS中，并加入10mg的di-(GnRH)3-hinger-MVP多肽，使二者充分混匀，形成混合物。然后，向混合液中缓慢的滴加1ml的0.3％戊二醛(上海化学试剂公司产品)溶液，于室温下进行偶联反应生成di-(GnRH)3-hinger-MVP-HSP65。2小时后，立即加入0.25ml的1mol/L甘氨酸溶液，继续反应30min，以终止过量的戊二醛。反应液于4℃对PBS透析过夜，然后，换一次PBS液，继续透析4小时。用考马斯亮兰蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定蛋白的浓度。

实施例9

di-(GnRH)3-hinger-MVP-HSP65疫苗的药效研究

选用7-8周龄SD大鼠20只，实验组和对照组各10只，雌雄各半，分开饲养，体重80-110克。所有大鼠都进行卡介苗(BCG)(上海生物制品公司)的预免疫，冻干的卡介苗用PBS配制成5×10⁶CFU/ml，每只鼠腹腔注射200μl。预免疫15天后，进行第一次免疫，腹腔注射100μl(80μg)的di-(GnRH)3-hinger-MVP-HSP65，无须福氏完全佐剂乳化。以后每隔2周加强免疫一次，共进行2次加强免疫。对照组注射相同量的生理盐水。第一次免疫后，每周从眼眶采血一次，血量为0.5-0.8ml，离心，取血清冷冻保存，用实施例5描述的方法进行ELISA测定(结果见图12)。预免疫60天后处死大鼠，动脉取血，完整取出生殖器官，称重，计算两组间的差异。然后，动物的生殖器官立即用10％的福尔马林固定，常规方法进行组织切片，4μm厚度，苏木精和曙红染色，普通显微镜观察并拍照。结果明显看出，经di-(GnRH)3-hinger-MVP-HSP65免疫后，雌鼠生殖系统发育受阻(图13)，卵巢中不能产生发育正常的卵泡。雄鼠睾丸的曲精小管内生精作用减少，睾丸发育受阻，睾丸萎缩变小(图14)。表明免疫诱发的抗体阻断了大鼠体内的GnRH的作用。

附图说明：

图1，载体质粒pED、重组质粒pED-antiGnRH1和重组质粒pED-antiGnRH3

图2.免佐剂抗GnRH的二聚化多肽疫苗的制作工艺流程图。

图3.pED-antiGnRH3质粒的(GnRH)3-hinger-MVP多肽融合蛋白基因测序结果。

图4.SDS-PAGE电泳显示(GnRH)1-hinger-MVP多肽基因的融合表达.1.大肠杆菌BL21细胞全蛋白；2.载荷pED载体质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白，A箭头显示融合伙伴L-ansB-C的位置；3.载荷pET28ansB-C-GnRH1质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白。A箭头显示融合伙伴L-ansB-C的位置；B箭头显示(GnRH)1-hinger-MVP多肽与L-ans B-C形成的融合蛋白的位置。

图5.SDS-PAGE电泳显示(GnRH)3-hinger-MVP多肽基因的融合表达。1.大肠杆菌BL21细胞全蛋白；2.载荷pED载体质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白，A箭头显示融合伙伴L-ansB-C的位置；3.标准分子量蛋白；4.大肠与杆菌BL21细胞全蛋白；5.载荷pET28ansB-C-GnRH3质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白，B箭头显示(抗原表位)3-铰链区-T辅助表位多肽与L-ans B-C形成的融合蛋白的位置。

图6.SDS-PAGE电泳显示(抗原表位)_n-铰链区-T辅助表位多肽融合蛋白的纯化.1.标准分子量蛋白； 2.载荷重组质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白；3.尿素洗涤后的包涵体；4.乙醇沉淀回收的融合蛋白。

图7.SDS-PAGE电泳显示(抗原表位)_n-铰链区-T辅助表位多肽融合蛋白(右方箭头)经盐酸水解断裂成为两个片段(左方箭头)。

图8.SDS-PAGE电泳显示GnRH)1-hinger-MVP多肽经空气氧化后形成的二聚体蛋白可以被β巯基乙醇还原解聚。

图9.聚丙烯酰胺凝胶电泳显示(GnRH)3-hinger-MVP多肽经空气氧化后发生了二聚化。

图10.ELISA测定结果显示(GnRH)1-hinger-MVP多肽和(GnRH)3-hinger-MVP能诱发高滴度的抗GnRH抗体，其中(GnRH)3-hinger-MVP诱发的抗体滴度最高。

图11.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示HSP65在大肠杆菌中的高效表达(A)和分离纯化(B)多肽经空气氧化后发生了二聚化。A：1.标准分子量蛋白；2.大肠杆菌BL21细胞全蛋白；3.载荷pET28a-HSP65质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白；箭头显示HSP65的位置；B：1.载荷pET28a-HSP65质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白；2.上柱前的样品；3.分离的HSP65；箭头显示HSP65的位置。

图12.ELISA测定结果显示di-(GnRH)1-hinger-MVP-HSP65能诱发高滴度抗GnRH抗体。

图13.显示经di-(GnRH)3-hinger-MVP-HSP65免疫的大鼠(左)较注射生理盐水的正常大鼠(右)雌性生殖系统明显缩小。

图14.显示注射生理盐水的正常大鼠(睾丸(A)和输精管(B)中有大量的精子产生；经di-(GnRH)3-hinger-MVP-HSP65免疫的雄性大鼠睾丸(A)和输精管(B)中完全没有精子生成

Claims

1.一种制作免佐剂强免疫原性多肽疫苗的方法，其特征在于将重复抗原表位肽段置于抗体铰链区肽段的一端，将T辅助表位肽段置于铰链区肽段的另一端，形成绞链区两端分别连接抗原表位肽段和T辅助表位肽段的串连多肽，在氧化条件下，通过铰链区之间形成二硫键，使两段多肽二聚化.进一步将二聚化的多肽与源于分枝杆菌(Mycobacterium bovis)的热激蛋白HSP65化学偶联。

2.一种免佐剂抗促性腺激素释放激素多肽疫苗，该疫苗按照权利要求1所述的方法制作，其特征在于不需添加佐剂，能激发机体产生强烈免疫应答，产生高滴度的抗促性腺激素释放激素抗体，并通过阻断促性腺激素释放激素，使机体生殖细胞的发育受到显著抑制。

3.按照权利要求2所述的疫苗，其特征在于二聚化之前的疫苗多肽全长氨基酸排列顺序是ProGluHisTrpSerTyrGlyLeuArgProGlyGluHisTrpSerTyrGlyLeuArgProGlyGluHisTrpSerTyrGlyLeuArgProGlyGlyThr-Cys-Pro-Pro-

4.Cys-Pro-Ala-ProLeuSerGluIleLysGlyValIleValHisArgLeuGluGlyValAlaLys.其中GluHisTrpSerTyrGlyLeuArgProGlyGluHisTrpSerTyrGlyLeuArgProGlyGluHisTrpSerTyrGlyLeuArgProGly3段重复的促性腺激素释放激素类似物肽段、Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro是抗体绞链区肽段、LeuSerGluIleLysGlyValIleValHisArgLeuGluGlyValAla是源于麻疹病毒的T辅助表位肽段、N端的Pro便于多肽从融合蛋白上释放、C端的Lys便于多肽与载体蛋白偶联。

5.按照权利要求2所述的疫苗，其特征在于在氧化条件下两段权利要求3所述的多肽在肽段之间形成二硫键，使肽段二聚化。

6.按照权利要求2所述的疫苗，其特征在于二聚化的疫苗多肽被偶联到了源于牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)的热激蛋白HSP65上，偶联后的疫苗在不额外添加佐剂的情况下激发机体产生强烈的免疫应答。

7.一种免佐剂抗促性腺激素释放激素多肽疫苗制备方法，包括用化学合成法和PCR法合成抗促性腺激素释放激素重复表位二聚化多肽疫苗的编码序列DNA，将该DNA插入融合表达载体，在大肠杆菌中表达出融合蛋白包涵体；包涵体经洗涤、溶解、乙醇分级沉淀纯化；提纯的融合蛋白溶于稀盐酸中进行酸水解释放抗促性腺激素释放激素疫苗多肽，释放出的抗促性腺激素释放激素疫苗多肽经等电点沉淀纯化后，溶于磷酸盐缓冲液中，向该溶液中通入空气使疫苗多肽发生二聚化.二聚化的疫苗多肽被化学偶联到了源于牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)的热激蛋白HSP65上，

8.根据权利要求6所述免佐剂抗促性腺激素释放激素多肽疫苗，其特征在于免疫动物能诱发机体产生抗促性腺激素释放激素抗体，通过机体内抗促性腺激素释放激素抗体与促性腺激素释放激素结合，可以治疗促性腺激素释放激素依赖的前列腺癌、前列腺增生、乳腺癌和结肠癌，也能用于对牲畜和家禽进行生育控制。

9.根据权利要求6所述免佐剂抗促性腺激素释放激素多肽疫苗，，其特征在于可与药物载体组合制成药物组合物。

10.根据权利要求6所述免佐剂抗促性腺激素释放激素多肽疫苗，，其特征在于可与其他药物活性成分组合制成药物组合物。