CN1517363A - 新型人角质细胞生长因子突变体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新型人角质细胞生长因子突变体，其特征在于将102位的半胱氨酸突变为非极性氨基酸，并在N末端进行缺失突变。这种新型人角质细胞生长因子能促进角质细胞增殖和抑制成纤维细胞生长，具有抗疤痕、抗纤维化和促进表皮愈合的功能。

Description

新型人角质细胞生长因子突变体

角质细胞生长因子(Keratinocyte Growth Factor，KGF)属于FGF蛋白家族，它能促进角质细胞、毛囊细胞、粘膜上皮细胞等的增殖，因此又命名为FGF-7。人KGF由163个氨基酸组成，属于碱性蛋白，含有5个半胱氨酸，形成二对二硫键。近年又发现了KGF的亚型，命名为KGF-2，它由213个氨基酸组成，其生物作用与KGF相似。本专利所述的人角质细胞生长因子不包括KGF-2在内。FGF(Fibroblast Growth Factor)蛋白家族由十余种结构相似的蛋白组成，主要有bFGF、aFGF、KGF、KGF-2、Int-1、FGF-10、FGF-15等，它们之间具有交叉的生物作用，有相似的蛋白质结构域。目前重组人KGF和KGF-2正在临床试验治疗皮肤慢性溃疡，皮肤损伤和胃肠粘膜的损伤等疾病。

人角质细胞生长因子KGF的5个半胱氨酸分别位于1，15，40，102和106位，它们形成二对二硫键。通过对N末端23个氨酸缺失的改造即除去KGF的1和15位半胱氨酸后，其促进角质细胞生物活性不受影响，反而有增强。证明1和15个半胱氨酸形成一对二硫键，但这对二硫键与生物活性无关。通过对FGF家族蛋白的氨基酸同源性分析发现，几乎所有FGF家族蛋白在相当于KGF的第40位和106位处均保守性由半胱氨酸组成。提示KGF中40位和106位的半胱氨酸形成一对分子内二硫键，而102位半胱氨酸处于游离状态，可能形成分子间的二硫键。

已有国内外专利和文献报道了对KGF的缺失改造(Δ23KGF)和各种类似物的改造，但均未对KGF的102位半胱氨酸是否形成分子内二硫键，以及对其突变后的生物作用的影响的报道。本发明推测KGF中102位半胱氨酸不形成分子内二硫键，与人白细胞介素II和β干扰素中分别位于第125位和17位半胱氨酸不形成分子内二硫键的情况类似。这种含有不形成分子内二硫键的半胱氨酸在重组蛋白表达中易形成分子间二硫键，即同源二聚体，会明显降低表达蛋白的生物活性和稳定性。因此，将人白细胞介素II的125位半胱氨酸和人β干扰素的17位半胱氨酸突变成丝氨酸的突变体，因其生物活性和稳定性(不形成二聚体)得到了提高，两者分别被批准抗肿瘤生物治疗和多发性硬化症治疗。

本发明在于通过对人KGF的102位半胱氨酸突变为非极性氨基酸如丝氨酸，从而避免重组KGF形成分子间二硫键。同时缺失掉N末端的1和15位的半胱氨酸，形成新型的人角质细胞生长因子只保留一对分子内二硫键的突变体。我们曾构建N末端缺失23个氨基酸和第25位酪氨酸突变为半胱氨酸的突变体，即Δ23KGF(25C)，是在缺失的KGF中加入一个半胱氨酸与102个半胱氨酸形成另一对分子内二硫键的突变体。结果其促进角质细胞增强的生物活性比Δ23KGF降低80％。

本发明中含102位半胱氨酸突变的KGF的突变体中含有从N末端16-27位的氨基酸缺失，其特征表示为：Δ16-27KGF(102C→R)。这种形式的KGF突变体经重组表达制备后，具有促进角质细胞和肠上皮细胞增生的功能外，还表现出对成纤维细胞显著抑制增殖和分化的作用。这种独特的生物作用是KGF和其它已报道的KGF衍生物或突变体所不具备。

本发明的新型人角质细胞生长因子突变体具有能抗疤痕形成，抗组织纤维化，同时促进表皮和粘膜上皮的增生或愈合。其这种治疗作用依赖于KGF突变体加入添加剂制成的药物配方。这些添加剂包括有赋形剂、缓冲剂、稳定剂、填充剂、载体等，然后用已知的制剂方法制成可用于外用和内用(注射和口服)等各种形式。其常用的有注射液、干粉、外用膏剂、乳剂、水剂、口服液、胶囊、缓释或控释等。

本发明中的KGF突变体可进一步进行化学修饰，以改变其可能的不期望的副作用，延长体内的生物半衰期等。最常见的修饰是聚乙二醇通过KGF蛋白质上的反应基因连接到KGF突变体上。

本发明实例中提供了人KGF的102位半胱氨酸突变为丝氨酸和N末端缺失24个氨基酸突变体Δ24KGF(102S)，以及第25位酪氨酸突变为半胱氨酸和N末端缺失23个氨基酸的突变体Δ23KGF(25C)的实验结果。

实例一：人角质细胞生长因子(KGF)全基因人工合成方案

根据GeneBank和文献报道的人KGF氨基酸序列(由163个氨基酸组成)，应用递归PCR方法人工合成Δ23KGF全基因序列，并将其内部含有的NdeI和EcoRI的位点改掉。在人工合成时选择了大肠杆菌或酵母偏爱密码子，以便提高重组表达水平。

Seq1：人KGF的氨基酸序列

cndmt peqma tnvnc ssper htrsy dymeg gdirv rrlfc rtqwy lridk rgkvk

gtqem knnyn imeir tvavg ivaik gvese fylam nkegk lyakk ecned cnfke

lilen hynty asakw thngg emfva lnqkg ipvrg kktkk eqkta hflpm ait

Seq2：人工合成人Δ23KGF的cDNA序列

5｀-CAT ATG TCT TAC GAC TAC ATG GAA GGT GGT GAC ATC CGT GTT CGT CGT CTG

             s   y   d   y   m   e   g   g   d   I   r   v   r   r   l

TTC TGC CGT ACC CAG TGG TAC CTG CGT ATC GAC AAA CGT GGT AAA GTT AAA GGT

 f   c   r   t   q   w   y   l   r   I   d   k   r   g   k   v   k   g

ACC CAG GAA ATG AAA AAC AAC TAC AAC ATC ATG GAA ATC CGT ACC GTT GCT GTT

 t   q   e   m   k   n   n   y   n   I   m   e   I   r   t   v   a   v

GGT ATC GTT GCT ATC AAA GGT GTT GAA TCT GAG TTC TAC CTG GCT ATG AAC AAA

 g   I   v   a   I   k   g   v   e   s   e   f   y   l   a   m   n   k

GAA GGT AAA CTG TAC GCT AAA AAA GAA TGC AAC GAA GAC TGC AAC TTC AAA GAA

 e   g   k   l   y   a   k   k   e   c   n   e   d   c   n   f   k   e

CTG ATC CTG GAA AAC CAC TAC AAC ACC TAC GCT TCT GCT AAA TGG ACC CAC AAC

 l   I   l   e   n   h   y   n   t   y   a   s   a   k   w   t   h   n

GGT GGT GAA ATG TTC GTT GCT CTG AAC CAG AAA GGT ATC CCG GTT CGT GGT AAA

 g   g   e   m   f   v   a   l   n   q   k   g   I   p   v   r   g   k

AAA ACC AAA AAA GAA CAG AAA ACC GCT CAC TTC CTG CCG ATG GCT ATC ACC

 k   t   k   k   e   q   k   t   a   h   f   l   p   m   a   i   t

TGA GAA TTC-3｀

根据以上人Δ23KGF的碱基序列，设计五条互补引物用于递归PCR扩增出双链cDNA。

用5条互补引物扩增合成的人Δ23KGF cDNA长度由435个碱基组成，其中5｀端带有NdeI酶切位点，3｀端带有终止子和EcoRI酶切位点。此KGF cDNA片段插入测序质粒P^UC57后，用DNA自动测序仪测得的碱基序列与Seq2设计的人Δ23KGF cDNA序列完全一致。

实例二：Δ24KGF(102S)突变体的重组质粒构建

Δ24KGF(102S)是在人KGF的N末端缺失24个氨基酸的基础上，第102位的半胱氨酸突变成丝氨酸的新型KGF突变体。取实例1中的人工合成的人KGF cDNA片段作为模板，合成二对引物进行PCR引导的定向点突变和缺失。

Seq3：(正向)5｀-CAT ATG TAC GAC TAC ATG GAA GGT GGT GAC-3｀(用于N末端缺失)

Seq4：(反向)5｀-TTC GTT GGA TTC TTT TTT AGC GTA-3｀(用于102位点突变)

Seq5：(正向)5｀-GCT AAA AAA GAA TCC AAC GAA GAC-3｀(用于102位点突变)

Seq6：(反向)5｀-GGA TCC TCA GGT GAT AGC CAT CGG CAG-3｀

将Seq3和Seq4引物进行PCR扩增出240bp片段，将Seq5和Seq6引物进行PCR扩增出约200bp片段。然后将240bp和200bp片段混合，进行互为引物的PCR扩增，获得450bp的Δ24KGF(102S)的基因片段，其5｀端带NdeI酶切位点，3｀端带BamHI酶切位点。

带T_T启动子的大肠杆菌重组表达质粒P^ET3a，经NdeI和BamHI双酶切后，与同样酶切后的Δ24KGF(102S)基因片段连结，构建重组表达质粒P^ET-ΔK102S。此重组质粒转化宿主菌BL21(DE3，Plys)后，筛选获得表达重组Δ24KGF(102S)的菌株。

实例三：Δ23KGF(25C)突变体的重组质粒构建及表达

Δ23KGF(25C)是缺失人KGF的N末端23个氨基酸基础上，第25位酪氨酸突变成半胱氨酸的变异体。按照实例2的方法，合成以下二对引物：

Seq7：(正向)5｀-CAT ATG TCT TGC GAC TAC ATG GAA GGT GGT GAC-3｀

Seq8：(反向)5｀-GGA TCC TCA GGT GAT AGC CAT CGG CAG-3｀

以Seq2的人工合成人KGF cDNA为模板，经PCR扩增后的片段NdeI和BamHI双酶切后，同样插入P^ET3a表达质粒中。经重组子筛选，转化和表达筛选，获得表达重组Δ23KGF(25C)表达菌株。

实例四：重组人角质细胞因子突变体的纯化和鉴定

表达Δ24KGF(102S)或Δ23KGF(25C)的菌株，按1∶10接种于含氨苄青霉素的微生物培养基LB中，经37℃振荡培养至OD值0.6左右时，加入0.1mMIPTG继续诱导3-4小时。含表达的重组KGF的菌体离心收集后，用超声破菌处理(50mmTris，2mMEDTA，pH8.0缓冲液中)。离心后破菌上清，经Heparin-Sepharose FF初步纯化。含重组KGF突变体的蛋白组份对25mM柠檬酸三钠(p H6.5)和1mM EDTA透析后，再经SP-SepharoseFF精纯化可得纯度大于95％的重组KGF突变体。

重组Δ24KGF(102S)和Δ23KGF(25C)在非还原型电泳中未见二聚体，分子量约16000道尔顿，等电点大于9.5，属于碱性蛋白。

实例五：对人源性原代角质细胞增殖促进作用

按文献方法取人表皮，经消化处理后，进行原代角质细胞培养。用MTT法测定角质细胞的增殖作用。

重组Δ24KGF(102S)和Δ23KGF(25C)与重组人KGF(rhKGF)对原代人角质细胞作用72小时后的实验结果见附图1。其中重组人KGF可明显促进角质细胞的增殖，重组Δ24KGF(102S)比重组人KGF的作用强40％左右，而重组Δ23KGF(25C)仅有重组人KGF作用的20-30％。

实例六：对小鼠成纤维细胞增殖的抑制作用

小鼠成纤维细胞株NIH 3T3细胞，按常规方法传代和培养。取对数生长期的3T3细胞，按5×10³/ml细胞数(用含1.5％FCS的DMEM)加入96孔培养板中，培养过夜。用含1.5％FCS的DMEM稀释所测KGF的样品，继续培养72小时。加入MTT，再培养4小时后，测定405nm的OD值。

同样方法，用含10ng/ml重组人bFGF的0.5％FCS的DMEM代替上述的1.5％FCS的DMEM培养，观察重组KGF对成纤维细胞的作用与bFGF的关系。

重组Δ24KGF(102S)或Δ23KGF(25C)与重组人KGF(rhKGF)对成纤维细胞增殖作用的结果见附图2和附图3。其中重组人KGF和Δ23KGF(25C)对成纤维细胞基本上无作用(与已报道的资料结果一致)，而重组Δ24KGF(102S)可显著抑制成纤维细胞的增殖。重组Δ24KGF(102S)同样可抑制bFGF促进的成纤维细胞的生长。

实例七：对小鼠肠道粘膜的保护作用

取Balb/c小鼠若干只，雌雄各半，随机分成六组。实验组在腹腔注射5-FU(50mg/kg)前三天开始皮下注射重组KGF突变体(2.0mg/kg)，连续7天。腹腔注射5-FU继续3天。于停药后第二天取小肠进行病理观察。结果发现：重组Δ24KGF(102S)同重组人KGF一样可保护小肠粘膜损伤(与对照组比有显著差异)，而重组Δ23KGF(25C)无明显作用。

图例说明：

附图1：重组KGF突变体的原代人角质细胞增殖作用

加入的重组KGF突变体的浓度为0.1～1000ng/ml，培养72小时后用MTT法测定细胞增殖状态。结果与天然重组KGF(rhKGF)曲线作比较，重组Δ24KGF(102S)比rhKGF强40～50％，而重组Δ23KGF(25C)只有rhKGF的20～30％。

附图2：重组KGF突变体对小鼠成纤维细胞增殖的抑制作用

加入重组KGF突变体的浓度为0.1～1000ng/ml，培养72小时后用MTT法测定细胞的增殖状态，结果与对照组比较换算成百分抑制率。图中显示重组Δ24KGF(102S)可显著抑制3T3细胞的增殖，最大抑制率达90％，其半效抑制的有效浓度为75ng/ml。而Δ23KGF(25C)对3T3细胞的增殖无作用，rhKGF高浓度时可部分促进其增殖。

附图3：重组KGF突变体对在bFGF刺激小鼠成纤维细胞有丝分裂的抑制作用。

在bFGF(10ng/ml)浓度下3T3细胞具有明显的有丝分裂增殖作用，同时加入重组KGF突变体Δ24KGF(102S)(0.1～1000ng/ml)后，其b FGF的增殖作用被显著抑制。

Claims (12)

1.本发明特征在于发明一种具N末端缺失和102位半胱氨酸点突变的新型人角质细胞生长因突变体。

2.权利要求1中102位半胱氨酸点突变成非极性氨基酸R。

3.权利要求2中的R指丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。

4.权利要求1中的N末端缺失指人角质细胞生长因子N末端第16至27位的氨基酸的任何一种缺失。

5.本发明所述的新型人角质细胞生长因子突变体指权利要求2和4中形成的任何一种突变体。

6.权利要求5中的突变体的典型特征指N末端缺失24个氨基酸和102位半胱氨酸突变为丝氨酸的突变体，即△24KGF(102S)。

7.本专利所述新型人角质细胞生长因子突变体适用基因工程方法制成。

8.权利要求7中重组人角质细胞生长因子突变体N末端第1位可带有甲硫氨酸。

9.本专利所述重组形式的新型人角质细胞生长因子突变体的制备适用原核和真核表达系统。

10.权利要求9中的原核表达系统指大肠杆菌。

11.权利要求9中的真核表达系统指酵母和哺乳动物细胞。

12.本发明所述新型人角质细胞生长因子突变体可用于抗疤痕、抗纤维化的预防和治疗。

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