CN1515906A - 自动捕获、识别细胞生物芯片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物细胞学检测技术,它是在玻璃基片上分布有多个不同区域的微阵列,在每个微阵列区域中,分别固定有可以与细胞表面生物分子特异结合有机分子。利用有机分子与细胞表面生物分子相互作用,将不同种类的细胞分离、固定在同一张芯片不同的点位上,经扫描仪扫描或显微镜观察芯片上不同位点细胞结合的情况进行处理分析,获得细胞类型的信息。这种芯片能同时检测多种类型细胞的形态,并分析其不同类型及耐药特性,可以用于胸水、腹水、尿液、血液、细针穿刺、组织匀浆等细胞学检测,具有诊断快速准确、特异性高、信息量大的特点,对临床诊断和流行病学筛查都有很大帮助。
Description
一、技术领域:本发明涉及生物细胞学检测技术,具体地讲是一种细胞芯片——自动捕获、识别细胞的生物芯片及其制备方法。
二、背景技术:
近年来,随着后基因组时代的到来,生物芯片技术得到了迅猛发展,包括基因芯片、蛋白芯片、 抗体芯片、细胞芯片、组织芯片在内的不同功能的生物芯片相继问世。基因芯片技术的研究成果应用范围最为广泛。它不但可以应用于疾病发病机理、功能基因组学等方面的基础研究,还可以用于遗传病检测、感染性疾病检测、肿瘤相关基因检测等多方面的疾病诊断。但基因芯片只能检测样品中核酸,往往由于其高成本和特殊的设备需要,限制了其在临床中的应用。蛋白、抗体芯片用于分析样品中的蛋白质种类及其含量。现有的细胞芯片是在芯片上制成微池阵列,然后在不同的微池中人为的加入不同类型的细胞,用于观察不同种类的细胞生理、生化指标的变化;另一类细胞芯片是将细胞在芯片上培养形成单细胞层,研究细胞的单生理现象,尤其有利于神经细胞神经信号产道方面的研究。目前,检测检测某些细胞的方法,如恶性肿瘤细胞的检测方法主要是原位杂交和免疫组化。原位杂交只能一次检测一个标本,当许多标本需要检测时,则需要一个一个检测,费时费力,不能进行高通量检测。而将免疫组化应用在组织芯片中弥补了这一缺陷,但组织芯片在制片过程中细胞核通常被切断,不能提供完整的信息。所以需要一种新的高通量检测细胞并且省时省钱的方法。
三、发明内容:
1、发明目的:本发明提供一种自动捕获、识别细胞生物芯片及其制备方法,其目的在于提供一种高通量检测、又能提供完整的信息、和降低检测的成本及不需要特殊设备。
2、技术方案:本发明是通过以下技术方案来加以实现的:
一种自动捕获、识别细胞的生物芯片,其特征在于:它是在玻璃基片上分布有多个不同区域的微阵列,在每个微阵列区域中,分别固定识别不同类型细胞膜表面特殊的生物分子特异性探针,同时另设有质控探针和阵列位置指示探针。
一种自动捕获、识别细胞的生物芯片的制备方法,其特征在于:配制探针点样溶液,溶液浓度为150mg/L,PH=9.5;在玻璃基片上进行点样,点的大小为50~500微米;点好的芯片于37℃下水化45分钟,然后在40℃下烘干2小时;以缓冲液及蒸馏水冲洗玻片,吹干;以封闭液封闭玻片,之后洗涤3次后,制备成成品。
一种自动捕获、识别细胞的生物芯片的使用方法,其特征在于:使用方法按如下步骤进行:
(1)洗涤细胞:取含有游离细胞的样品,用PBS洗三次,每次5分钟,调整细胞浓度在108/L;
(2).细胞杂交:将细胞悬液直接滴在芯片上,室温湿盒中杂交20分钟,中间摇动三次;
(3).杂交结果观察:用室温放置的PBS漂洗玻片,用普通光学显微镜低倍镜观察,以背景干净为宜;
(5).细胞固定:用2.5%戊二醛固定细胞5分钟;
(6).形态观察:用瑞氏染液常规染色,时间为15分钟;
(7).分群鉴定:用三色荧光染料对细胞芯片进行染色,用荧光扫描仪扫描观察、检测。
3、优点及效果:本发明设计了一种新型的细胞芯片,其原理是应用细胞膜表面特殊的生物分子,与结合在玻片上能与细胞表面特殊分子发生特异性结合,通过一次实验可以将被测细胞悬液中不同类型的细胞分离、固定在同一张玻片的不同区域。由于以玻片为介质,摆脱了硝酸纤维素膜的易脆性和不透明性,继而为后续的各种操作奠定了良好的基础。而且检测结果观察可以不需特殊设备,仅应用一台普通光学显微镜即可。如果条件允许,也可以进行杂交信号的扫描等高通量分析。
四、实施方式;
我们研制的细胞芯片利用生物大分子间的相互作用,将能与细胞表面分子发生结合作用的生物分子,以阵列的形式固定在玻璃表面不同的位点上,通过特异结合实现对不同种类细胞自动捕捉、识别、在特定位点分别固定不同种类的细胞。尤其在恶性肿瘤中,基因的突变产生特异性蛋白质,通常这种蛋白质会在病变细胞的不同部位得以表现,所以细胞学检测在恶性肿瘤的诊断与治疗中的作用是十分重要的。
一种自动捕获、识别细胞的生物芯片,其特征在于:它是在玻璃基片上分布有多个不同区域的微阵列,在每个微阵列区域中,分别固定识别不同类型细胞的膜蛋白、膜糖类特异性探针,同时另设有质控探针和阵列位置指示探针。能够实现在阵列点原位自动捕获、识别不同类型细胞,达到筛选、定点固定细胞的目的。
根据不同细胞表面分子的特征,选择细胞调亡调控因子抗体,用于研究恶性肿瘤的预后;选择细胞表面糖蛋白抗体,用于鉴别不同类型(肿瘤)细胞及耐药性抗药研究;选择原癌基因蛋白的抗体,研究乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、食道癌、宫颈癌、涎腺癌、膀胱癌等预后及鉴别良恶型细胞;利用细胞骨架蛋白抗体,研究恶性肿瘤转移及浸润机制;利用白细胞表面分类抗原,分析血液和各种体液中细胞的种类及恶性肿瘤的鉴别;利用细胞表面膜受体抗体,鉴别不同细胞类型;利用恶性肿瘤细胞膜标志物抗体,鉴别肿瘤的类型。
由于芯片是在玻璃基片捕获并且固定细胞,因此在捕获细胞后,可以针对该细胞进行常规染色、组织化学染色、原位杂交、细胞培养、药物分析等多种后续处理,进行细胞学分析、观察。
本发明实施的具体步骤是
(1).根据需要设定点样程序,矩阵分布根据检测要求及点样方便与否安排。使用CEL公司生产的玻璃基片,用BioRobotics公司的点样仪按预先设定好的程序进行点样。按照不同要求从几十点到上千点,点的大小为50-500微米左右,点间距依点的数量而定。抗体点样溶剂为PBS水溶液pH=9.5;溶质为蛋白,抗体浓度:150mg/L,然后将点好的芯片于37℃下水化45分钟,然后在40℃下烘干2小时。以缓冲液(PBS,0.1%SDS)及蒸馏水冲洗玻片,吹干。以封闭液(1%BSA,PH=7 0.01mol/l PB)封闭玻片,之后洗涤3次。吹干备用。
上述自动捕获、识别细胞芯片的应用方法包括以下步骤(以CD3;CD4;CD8淋巴细胞检测为例):
(1).洗涤细胞:取含有游离细胞的样品,用PBS洗三次,每次5分钟,调整细胞浓度在108/L。
(2).细胞杂交:将细胞悬液直接滴在芯片上,室温湿盒中杂交20分钟,中间摇动三次。
(3).杂交结果观察:用室温放置的PBS漂洗玻片,用普通光学显微镜低倍镜观察,以背景干净为宜。
(4).细胞固定:用2.5%戊二醛固定细胞5分钟。
(5).形态观察:用瑞氏染液常规染色,时间为15分钟。
(6).分群鉴定:用CD3-Cy5+CD4-FITC+CD8-RPE三色荧光染料对细胞芯片进行染色,用Genomic Solutions公司的荧光扫描仪扫描观察。
Claims (3)
1、一种自动捕获、识别细胞的生物芯片,其特征在于:它是在玻璃基片上分布有多个不同区域的微阵列,在每个微阵列区域中,分别固定识别不同类型细胞膜表面特殊的生物分子特异性探针,同时另设有质控探针和阵列位置指示探针。
2、根据权利要求1所述的一种自动捕获、识别细胞的生物芯片的制备方法,其特征在于:配制探针点样溶液,溶液浓度为150mg/L,PH=9.5;在玻璃基片上进行点样,点的大小为50~500微米;点好的芯片于37℃下水化45分钟,然后在40℃下烘干2小时;以缓冲液及蒸馏水冲洗玻片,吹干;以封闭液封闭玻片,之后洗涤3次后,制备成成品。
3、根据权利要求1所述的一种自动捕获、识别细胞的生物芯片的使用方法,其特征在于:使用方法按如下步骤进行:
(1)洗涤细胞:取含有游离细胞的样品,用磷酸盐缓冲液洗三次,每次5分钟,调整细胞浓度在108/L;
(2).细胞杂交:将细胞悬液直接滴在芯片上,室温湿盒中杂交20分钟,中间摇动三次;
(3).杂交结果观察:用室温放置的磷酸盐缓冲液漂洗玻片,用普通光学显微镜低倍镜观察,以背景干净为宜;
(4).细胞固定:用2.5%戊二醛固定细胞5分钟;
(5).形态观察:用瑞氏染液常规染色,时间为15分钟;
(6).分群鉴定:用三色荧光染料对细胞芯片进行染色,用荧光扫描仪扫描观察、检测。
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